一種作物糊粉層特異表達(dá)啟動子PosAL1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種作物糊粉層特異表達(dá)啟動子PosAL1及其應(yīng)用。本發(fā)明還提供了含有該啟動子的表達(dá)盒、作物表達(dá)載體、宿主菌和轉(zhuǎn)化子。具體而言，本發(fā)明將上述啟動子應(yīng)用在作物基因工程中。本發(fā)明提供的啟動子可以特異地驅(qū)動外源基因在作物穎果糊粉層中表達(dá)，從而可有效用于種子品質(zhì)和萌發(fā)特性的基因工程改良。用于改善作物穎果糊粉層的性狀。
【專利說明】—種作物糊粉層特異表達(dá)啟動子PosALI及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)和作物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體而言，本發(fā)明涉及一種作物糊粉層特異表達(dá)啟動子及其應(yīng)用，該啟動子能夠在作物基因工程中驅(qū)動目標(biāo)基因在穎果糊粉層中特異表達(dá)，從而可在不影響其他組織部位生理活動的情況下達(dá)到通過改變糊粉層結(jié)構(gòu)特性改良種子品質(zhì)或萌發(fā)能力的目的。

【背景技術(shù)】
[0002]啟動子作為轉(zhuǎn)錄水平上一個重要的調(diào)控元件，通過和眾多轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合進(jìn)而決定了基因的表達(dá)模式與表達(dá)強(qiáng)度。深入研究啟動子的結(jié)構(gòu)、功能、作用模式等對于回答分子生物學(xué)中的一些基本理論問題具有重大意義。如何讓外源基因在植物體內(nèi)定向、高效、穩(wěn)定的表達(dá)是植物基因工程研究的出發(fā)點(diǎn)和落腳點(diǎn)。用組織特異表達(dá)啟動子來驅(qū)動目的基因表達(dá)可有效的避免用組成型表達(dá)啟動子所帶來的一些諸如代謝負(fù)擔(dān)之類的負(fù)面效應(yīng)。
[0003]主要的單子葉主糧作物如水稻和小麥的表層胚乳會形成糊粉層，在穎果發(fā)育過程中，糊粉層將灌漿物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到胚和胚乳細(xì)胞內(nèi)部；籽粒萌發(fā)時，分泌水解酶水解胚乳細(xì)胞中貯藏的淀粉和蛋白從而發(fā)揮重要的水解功能，同時糊粉層細(xì)胞也是種子中主要積累脂類、蛋白、維生素、鐵鋅元素的部位，因此，糊粉層細(xì)胞是作物基因工程改良的主要靶點(diǎn)。要精確操縱糊粉層細(xì)胞的生理生化活性，糊粉層特異表達(dá)啟動子將至關(guān)重要，但目前僅有少量的特異啟動子的報(bào)道，如大麥LTP2啟動子和玉米AL9啟動子，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足分子設(shè)計(jì)育種的需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種驅(qū)動外源基因特異的在作物糊粉層特異表達(dá)的啟動子、獲得含有該啟動子序列的轉(zhuǎn)化子以及該啟動子的應(yīng)用。其中，本文中所涉及的“作物”是指單子葉作物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種作物糊粉層特異表達(dá)啟動子，所述作物糊粉層特異表達(dá)啟動子包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ IDNo:1所示的DNA序列為來源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的序列，本文中稱為PosALl或啟動子PosALl。具體而言,本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)日本晴水稻(Oryzasativa L cv.Nipponbare)中L0C_0s03g49190基因前包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在內(nèi)的1960bp的DNA序列具有驅(qū)動目標(biāo)基因在作物糊粉層特異表達(dá)的作用。并且分離克隆得到了序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。
[0006]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的作物糊粉層特異表達(dá)啟動子的DNA序列為SEQ ID No:1所示的序列，即PosALl或啟動子PosALl。
[0007]另一方面，本發(fā)明提供一種作物糊粉層特異表達(dá)啟動子，其DNA序列與SEQ IDNo:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者,所述作物糊粉層特異表達(dá)啟動子為在SEQID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物；或者所述作物糊粉層特異表達(dá)啟動子具有與SEQ ID No:1所示的DNA序列雜交的產(chǎn)物。這些作物糊粉層特異表達(dá)啟動子序列與SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驅(qū)動目標(biāo)基因在作物中表達(dá)。
[0008]另一方面，本發(fā)明還提供一種包含上述作物糊粉層特異表達(dá)啟動子的表達(dá)盒。
[0009]又一方面，本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含上述的作物糊粉層特異表達(dá)啟動子，在所述重組表達(dá)載體中，所述作物糊粉層特異表達(dá)啟動子連接于待表達(dá)的基因序列的上游；優(yōu)選地，所述待表達(dá)的基因?yàn)镚us基因，所述重組表達(dá)載體為pCAMBIA1391-PosALl，該重組表達(dá)載體為將SEQ ID No:1所示的序列即PosALl或啟動子PosALl構(gòu)建于pCAMBIA1391中得到的重組表達(dá)載體，本文中稱為pCAMBIAl391-P0SAL1。
[0010]或者待表達(dá)基因可以為任何對作物的糊粉層性狀具有改善能力的基因。通過本發(fā)明的啟動子驅(qū)動該基因在糊粉層中特異性地集中表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)改善作物糊粉層相應(yīng)性狀的功能。
[0011]另一方面，本發(fā)明還提供一種宿主菌，所述宿主菌包含本發(fā)明提供的上述作物糊粉層特異表達(dá)啟動子、上述表達(dá)盒、或上述重組表達(dá)載體；優(yōu)選地，所述宿主菌為根癌農(nóng)桿菌。
[0012]另一方面，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)化子，所述轉(zhuǎn)化子包含本發(fā)明提供的上述作物糊粉層特異表達(dá)啟動子、上述表達(dá)盒、上述重組表達(dá)載體、或上述宿主菌。其中，所述轉(zhuǎn)化子優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、愈傷組織或植株。
[0013]再一方面，本發(fā)明提供上述作物糊粉層特異表達(dá)啟動子在培育轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括將本發(fā)明提供的上述作物糊粉層特異表達(dá)啟動子連接于載體的待表達(dá)的基因序列上游(例如，將所述啟動子序列置于/插入目標(biāo)基因之前)，從而構(gòu)建重組表達(dá)載體，將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到作物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育。
[0014]并且優(yōu)選地，所述應(yīng)用可以用于改良作物生長特性，所述作物為單子葉作物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[0015]本發(fā)明中所提供的啟動子的DNA序列為(與序列表中SEQ ID No:1中相同):
[0016]aatcactac2 caataWtt ,gfa^cccaal tlcaagactt accgalcall lgtgcaggag60
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aagccgglct gcLagccalg agcLagctac tacctcaaga galgtaggag lagcagcclg1140
caccaglgca gatggtgaaL tgccaactgg Ucacgctci ccccUcagc ccagagLact1200
[0017]

【權(quán)利要求】
1.一種作物糊粉層特異表達(dá)啟動子PosALl，其特征在于，所述作物糊粉層特異表達(dá)啟動子PosALl包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的作物糊粉層特異表達(dá)啟動子PosALl，其特征在于，所述作物糊粉層特異表達(dá)啟動子PosALl的DNA序列為SEQ ID No:1所示的序列。
3.一種作物糊粉層特異表達(dá)啟動子PosALl，其特征在于，所述作物糊粉層特異表達(dá)啟動子PosALl的DNA序列與SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性； 或者，所述作物糊粉層特異表達(dá)啟動子PosALl為在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物； 或者，所述作物糊粉層特異表達(dá)啟動子PosALl具有與SEQ ID No:1所示的DNA序列雜交的產(chǎn)物。
4.一種表達(dá)盒,其特征在于,所述表達(dá)盒包含權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的作物糊粉層特異表達(dá)啟動子PosALl。
5.—種重組表達(dá)載體,其特征在于,所述重組表達(dá)載體包含權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的作物糊粉層特異表達(dá)啟動子，在所述重組表達(dá)載體中，所述作物糊粉層特異表達(dá)啟動子連PosALl接于載體中待表達(dá)的基因序列的上游。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述待表達(dá)的基因?yàn)镚us基因，所述重組表達(dá)載體為pCAMBIAl391-PosALl，其中pCAMBIA1391為作物雙元表達(dá)載體；或者所述待表達(dá)基因是具有改善糊粉層性狀功能的基因。
7.一種轉(zhuǎn)化子，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化子包含權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的作物糊粉層特異表達(dá)啟動子PosALl、權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒、或根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的重組表達(dá)載體。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的作物糊粉層特異表達(dá)啟動子PosALl在培育轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括:將根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的作物糊粉層特異表達(dá)啟動子連接于載體中待表達(dá)的基因序列上游，從而構(gòu)建重組表達(dá)載體；將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到作物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用用于作物基因工程改良，所述作物為單子葉作物:水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥。
【文檔編號】C12N15/113GK104073492SQ201410326191
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月9日
【發(fā)明者】魏鵬程, 楊劍波, 李莉, 秦瑞英, 李 浩 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所