一種鉻富集植物李氏禾rapd反應體系的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鉻富集植物李氏禾RAPD反應體系的建立方法，該方法通過用CTAB法提取李氏禾的總DNA，針對模板、引物、dNTP、Taq酶四個方面的用量進行探索，從而建立李氏禾的RAPD最適反應體系，所述李氏禾RAPD反應體系中模板DNA用量為0.5μL，包含0.5μLdNTP，對應于dNTP的濃度為200μmol/L；Taq酶的最適用量為2.0U。本發(fā)明為進行RAPD分析研究重金屬鉻污染下李氏禾居群的遺傳多樣性奠定基礎，進而為進一步從分子水平上研究李氏禾耐淹耐干旱能力和重金屬富集能力與其在遺傳特性上的關系提供相關的分子生物學方面的研究數(shù)據(jù)。
【專利說明】一種鉻富集植物李氏禾RAPD反應體系的建立方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物修復【技術領域】，涉及一種鉻富集植物李氏禾RAPD反應體系的建 立方法。

【背景技術】
[0002] 植物修復技術具有技術和經(jīng)濟上的雙重優(yōu)勢，而李氏禾在水土保持和重金屬污染 修復等方面具有重要意義，其在特殊生境下的適應性也日益受到學者關注。而目前關于李 氏禾的研究還是多集中于生態(tài)和生理機制方面，在分子水平上的研究還很少。因此，采用分 子標記等分子生物學技術從分子水平上進一步揭示李氏禾富集重金屬的分子機制具有重 要意義。RAH)與其它分子標記技術相比，因其具有操作簡便快捷、DNA用量少、靈敏度高、弓丨 物具有通用性且無需預先了解物種基因組信息等優(yōu)點而被廣泛應用于遺傳圖譜構建、基因 定位和遺傳多樣性的檢測。但是RAro反應具有比較容易受到實驗條件的影響，如果設備條 件及實驗操作達不到要求，實驗結果的重復性與穩(wěn)定性就較難得到保證。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服現(xiàn)有技術中存在的缺陷，本發(fā)明提出了一種鉻富集植物李氏禾RAro反 應體系的建立方法，該方法通過用CTAB法提取李氏禾的總DNA，針對模板、引物、dNTP、Taq 酶四個方面的用量進行探索，從而建立李氏禾的RAH)最適反應體系，為進行RAH)分析研究 重金屬鉻污染下李氏禾居群的遺傳多樣性奠定基礎，進而為進一步從分子水平上研究李氏 禾耐淹耐干旱能力和重金屬富集能力與其在遺傳特性上的關系提供相關的分子生物學方 面的研究數(shù)據(jù)。其技術方案如下：
[0004] 一種鉻富集植物李氏禾RAPD反應體系的建立方法，包括以下步驟：
[0005] (1)李氏禾基因組總DNA的提取
[0006] ①取硅膠干燥后的李氏禾葉片50mg放入已滅菌L 8mL離心管，加入適量石英砂和 玻璃珠，珠磨器研磨lmin至葉片成均勻粉末；
[0007] ②加入65°C預熱的0. 8mL2 X CTAB和20 μ L巰基乙醇，混合均勻，65°C水浴3小時， 每間隔10分鐘搖勻一下，然后l〇〇〇〇rpm，離心lOmin ;
[0008] ③量取上清，加入酚、氯仿和異戊醇，酚/氯仿/異戊醇的體積比為25:24:1，顛倒 混勻，12000rpm，離心 10min ;
[0009] ④量取上清，加入氯仿和異戊醇，氯仿/異戊醇體積比為24:1，顛倒混勻，然后 12000rpm 離心 lOmin ;
[0010] ⑤小心量取上清，加入1/10體積的NaAc，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻；
[0011] ⑥加入的異丙醇，輕輕上下顛倒離心管8?10次，冰浴20min，使DNA沉淀充分；
[0012] @ 10000印111離心5?10111；[11，棄去上清,用70(%乙醇洗漆沉淀1次；
[0013] ⑧再用100%乙醇洗滌沉淀1次，倒置離心管至管內(nèi)完全干燥，加20 μ L無菌水溶 解 DNA。
[0014] ⑨取5 μ LDNA溶液進行電泳檢測，其余于-20°c放置保存；
[0015] (2)李氏禾RAPD反應隨機引物的初步篩選：確定使用引物S55作為李氏禾RAPD反 應體系優(yōu)化的引物；
[0016] (3)所述李氏禾RAPD反應體系中模板DNA用量為0. 5 μ L ;
[0017] (4)所述李氏禾RAH)反應體系中包含0. 5yLdNTP，對應于dNTP的濃度為 200 μ mol/L ；
[0018] (5)所述李氏禾RAPD反應體系中Taq酶的最適用量為2. 0U。
[0019] 進一步優(yōu)選，步驟⑵中引物的用量確定為〇.3yL，對應于引物的濃度為 120 μ mol/L。本發(fā)明的有益效果為：
[0020] 本發(fā)明建立的李氏禾優(yōu)化反應體系可以應用于李氏禾RAH)分析，檢測其多態(tài)性 位點和是否存在重金屬敏感片段等，為進一步了解李氏禾種群的遺傳分化和遺傳多樣性， 研究其重金屬超富集機理提供參考數(shù)據(jù)。另外，從近期來看，植物修復技術的研究集中的一 個方面是分子生物學和基因工程技術的應用，即將自然界中超積累植物的耐重金屬、超累 積基因移植到生物量大生長速率快的植物中去，以克服天然超累積植物的缺陷，提高植物 修復效率使其實用化。因此，本研究也期望能為從分子水平研究李氏禾的耐重金屬、超累積 基因提供了一些數(shù)據(jù)或參考。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為李氏禾總DNA電泳圖譜，注：泳道1-7為李氏禾樣品的基因組總DNA ;泳道 Μ 為 DNAMarker(λ DNA/EcoRI+HindIII);
[0022] 圖2為不同模板DNA用量的擴增結果，泳道1-6分別代表0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、 0· 6μ L的DNA用量；
[0023] 圖3為不同引物用量的擴增結果，泳道1-6分別代表0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、 0·6μ?的DNA/引物用量；
[0024] 圖4為不同dNTP濃度的擴增結果，泳道1-6分別代表0. 5、1.0、1.5、2. 0、2. 5、 3. OyL 的 dNTP 用量；
[0025] 圖5為不同Taq酶濃度的擴增結果，泳道1-6分別代表0· 5、1·0、1· 5、2·0、2· 5、 3.0yL的Taq酶用量；
[0026] 圖6為引物S55 (CATCCGTGCT)對李氏禾7個樣品的RAH)擴增結果，泳道1-7為李 氏禾的7個總DNA樣品擴增產(chǎn)物。

【具體實施方式】
[0027] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細地說明。
[0028] 1材料與方法
[0029] 1. 1 材料
[0030] 1. 1. 1植物材料
[0031] 植物材料為李氏禾的新鮮葉片，采自桂林市桃花江、雁山以及漓江邊三個不同的 地方，提取該植物基因組DNA前先將葉片用硅膠干燥并在-70°C的低溫下保存。
[0032] 1. 1. 2主要實驗試劑與溶液
[0033] 2XCTAB 提取緩沖液（2 % CTAB、1. 4mol/LNaCl、20mmol/LEDTA、100mmol/ LTris-Cl，pH8. 0) ; β -巰基乙醇；酚/氯仿/異戊醇（25:24:1);氯仿/異戊醇（24:1);異 丙醇；3mol/LNaAc (ρΗ5· 2) ;75 % 乙醇；無水乙醇；1 XTAE 緩沖液（40mmol/LTris、20mmol/ LHAc、lmmol/L EDTA，ρΗ8·0);瓊脂糖（Takara) ;TaqDNA聚合酶（寶生物工程大連有限公 司）；Lambda DNA/EcoR I +HindIIlMarker (華美生物工程有限公司）
[0034] 1. 1. 3主要儀器設備與用品
[0035] 普通冰箱；HVE-50型高壓滅菌鍋（日本Hirayama) ;TlThermocyler型擴增儀（德 國BIOMETRA) ;LEGENDMICR017高速離心機（美國賽默飛世爾）；DYY-12型三恒多用電泳儀 (北京六一）；DYCP-34A型電泳槽（北京六一）；規(guī)格分別為ΙΟΟΟμΙ^ΟΟμ?,ΙΟμ?的微量 移液器（日本NichipetEX)及其相應的吸頭（江蘇海門三和儀器廠）；復日FR-980凝膠成 像儀（上海復日科技）；MRS-1200048U型掃描儀（上海中晶科技）。
[0036] 1. 2 方法
[0037] 1. 2. 1李氏禾基因組總DNA的提取與檢測
[0038] (1)李氏禾基因組總DNA的提取
[0039] 李氏禾的基因組總DNA的提取采用CTAB法，參照林光美等的DNA提取方法，略有 改進，具體操作過程如下：
[0040] ①取硅膠干燥后的李氏禾葉片50mg放入已滅菌L 8mL離心管，加入適量石英砂和 玻璃珠，珠磨器研磨lmin至葉片成均勻粉末；
[0041] ②加入65°C預熱的0. 8mL2 X CTAB和20 μ L巰基乙醇，混合均勻，65°C水浴3小時， 每間隔10分鐘搖勻一下，然后l〇〇〇〇rpm，離心lOmin ;
[0042] ③量取上清，加入酚、氯仿和異戊醇，酚/氯仿/異戊醇的體積比為25:24:1，顛倒 混勻，12000rpm，離心 10min ;
[0043] ④量取上清，加入氯仿和異戊醇，氯仿/異戊醇體積比為24:1，顛倒混勻，然后 12000rpm 離心 10min ;
[0044] ⑤小心量取上清，加入1/10體積的NaAc，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻；
[0045] ⑥加入的異丙醇，輕輕上下顛倒離心管8?10次，冰浴20min，使DNA沉淀充分；
[0046] @ 10000印111離心5?10111；[11，棄去上清,用70(%乙醇洗漆沉淀1次；
[0047] ⑧再用100%乙醇洗滌沉淀1次，倒置離心管至管內(nèi)完全干燥，加20 μ L無菌水溶 解 DNA。
[0048] ⑨取5 μ LDNA溶液進行電泳檢測，其余于-20°C放置保存；
[0049] (2)李氏禾基因組總DNA的質(zhì)量檢測
[0050] 李氏禾基因組總DNA的質(zhì)量檢測采用瓊脂糖凝膠電泳法，具體過程如下：
[0051] ①制膠：將0. 8g瓊脂糖倒入含有l(wèi)OOmLIXTAE電泳緩沖液的三角瓶中，在微波爐 中經(jīng)高溫使瓊脂糖沸騰，混勻，冷卻至60°C左右，倒入制膠器中。待膠凝固后，將制備好的瓊 脂糖凝膠放入加有足夠的1 X TAE電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1?2mm。
[0052] ②點樣：使用10 μ L規(guī)格的微量移液器將混有溴酚藍上樣液的待測DNA樣品依次 加入到點樣孔上，同時將MarkerDNA加上作為對照。
[0053] ③電泳：接通電源，使凝膠的上樣端靠近電泳槽的負極，以5V/cm的電壓進行電 泳，待溴酚藍移動到凝膠的2/3處時，關閉電源，停止電泳。
[0054] ④檢測：將電泳后的凝膠放入溴化乙錠染液中進行染色，然后放到電泳凝膠成像 系統(tǒng)上進行拍照，保存。
[0055] 1.2. 2李氏禾RAPD反應體系的優(yōu)化及建立
[0056] (1)李氏禾RAPD反應隨機引物的初步篩選
[0057] 本研究中所用的10堿基隨機引物均為上海生工生物工程技術服務有限公司合 成。從10個隨機引物（引物序列見表1)中進行初步篩選，進行擴增實驗，選取擴增效果好， 條帶清晰且反應穩(wěn)定性比較高的隨機引物作為本研究中優(yōu)化RAH)反應體系的引物。
[0058] 表1引物序列
[0059] Table 1 Primer sequence
[0060]

【權利要求】
1. 一種鉻富集植物李氏禾RAPD反應體系的建立方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 李氏禾基因組總DNA的提取 ① 取硅膠干燥后的李氏禾葉片50mg放入已滅菌1. 8mL離心管，加入適量石英砂和玻璃 珠，珠磨器研磨lmin至葉片成均勻粉末； ② 加入65°C預熱的0. 8mL2 X CTAB和20 μ L巰基乙醇，混合均勻，65°C水浴3小時，每間 隔10分鐘搖勻一下，然后l〇〇〇〇rpm，離心lOmin ; ③ 量取上清，加入酚、氯仿和異戊醇，酚/氯仿/異戊醇的體積比為25:24:1，顛倒混勻， 12000rpm，離心 lOmin ; ④ 量取上清，加入氯仿和異戊醇，氯仿/異戊醇體積比為24:1，顛倒混勻，然后 12000rpm 離心 lOmin ; ⑤ 小心量取上清，加入1/10體積的NaAc，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻； ⑥ 加入的異丙醇，輕輕上下顛倒離心管8?10次，冰浴20min，使DNA沉淀充分； @ 10000印111離心5?10111；[11，棄去上清，用70%乙醇洗漆沉淀1次； ⑧ 再用100 %乙醇洗滌沉淀1次，倒置離心管至管內(nèi)完全干燥，加20 μ L無菌水溶解 DNA ； ⑨ 取5 μ LDNA溶液進行電泳檢測，其余于-20°C放置保存； (2) 李氏禾RAPD反應隨機引物的初步篩選：確定使用引物S55作為李氏禾RAPD反應 體系優(yōu)化的引物； (3) 所述李氏禾RAPD反應體系中模板DNA用量為0. 5 μ L ; (4) 所述李氏禾RAPD反應體系中包含0.5 μ LdNTP，對應于dNTP的濃度為200 μ mol/ L ； (5) 所述李氏禾RAPD反應體系中Taq酶的最適用量為2. 0U。
2. 根據(jù)權利要求1所述的鉻富集植物李氏禾RAPD反應體系的建立方法，其特征在于， 步驟⑵中引物的用量確定為0.3 μ L，對應于引物的濃度為120 μ mol/L。
【文檔編號】C12Q1/68GK104099417SQ201410328224
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權日:2014年7月10日
【發(fā)明者】蔡湘文, 李惠敏, 高崇輝, 林珍銘 申請人:桂林理工大學