一種用于快速鑒定辣椒實蠅的種特異性引物對、試劑盒及鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于快速鑒定辣椒實蠅的種特異性引物對、試劑盒及鑒定方法，種特異性引物對包括：上游引物FL680：TTTGGGCACCCAGAAGTCTA?CATT；下游引物RL1057：TACAGACGAGTTAGCGAGAACA。利用辣椒實蠅的mt?DNA?COⅠ中設(shè)計種特異性引物對，通過SS-PCR擴(kuò)增，如果被鑒別生物體屬于辣椒實蠅種，則能夠擴(kuò)增出一條長度為378bp的特異條帶；反之，如果被鑒別生物體不屬于辣椒實蠅種，則不能擴(kuò)增出目的條帶。具體具有以下優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)、檢測結(jié)果更加簡單、快捷，大大縮短了辣椒實蠅的鑒定周期?？梢钥焖?、準(zhǔn)確、特異性地檢測出辣椒實蠅的各個蟲態(tài)甚至殘體，具有檢測范圍大的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種用于快速鑒定辣椒實蠅的種特異性引物對、試劑盒及 鑒定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于快速鑒定辣椒實蠅的 種特異性引物對、試劑盒及鑒定方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 辣椒實妮，拉丁 學(xué)名為：Bactrocera (Bactrocera) latifrons (Hendel)，屬雙翅 目（Diptera)實妮科（Tephritidae)果實妮屬（Bactrocera)果實妮亞屬（Bactrocera)。 辣椒實蠅是農(nóng)業(yè)上的重要害蟲，其是農(nóng)業(yè)上水果和蔬菜的重要害蟲，其生活習(xí)性為：成蟲 產(chǎn)卵于果實皮下，幼蟲孵化后鉆入果內(nèi)取食，使果實變質(zhì)或腐爛，從而影響果蔬品質(zhì)。辣 椒實蠅原產(chǎn)于南亞和東南亞，目前主要分布中國、印度、馬來西亞、巴基斯坦、斯里蘭卡、泰 國、老挺等，但是近年來又在夏威夷、日本、湯加及非洲的部分區(qū)域定殖（Mwatawala M，De Meyer M, White I et al,2007 ；Mwatawala M, Makundi R, Maerere AP, DE MEYER M. ,2010 ； Rwomushana I,Ekesi S, Gordon I, Ogol CK. , 2010 ；Liquido NJ, Harris EJ, Dekker LA., 1994 ；Peck SL, McQuate GT. , 2004 ；Meeyen K, Nanork Sopaladawan P, Pramual P. ,2014)〇 國內(nèi)主要分布于臺灣及云南省的畹町和瑞麗（梁廣勤等，1989)。
[0003] 辣椒實蠅的傳播途徑為：以卵、幼蟲或蛹隨被害果傳播。隨著我國國內(nèi)、以及我國 與其他國家間貿(mào)易和旅游業(yè)的快速發(fā)展，辣椒實蠅擴(kuò)散幾率越來越高，因此，在進(jìn)出境的果 蔬中，如何快速準(zhǔn)確的鑒別其是否攜帶有辣椒實蠅疫情，從而保證我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全，具有 重要現(xiàn)實意義。
[0004] 由于對辣椒實蠅的成蟲形態(tài)鑒別遠(yuǎn)比對幼蟲、卵或蛹的鑒別容易，因此，目前的檢 疫監(jiān)管機(jī)構(gòu)，通常采用的辣椒實蠅疫情的鑒別方法為形態(tài)學(xué)鑒別方法，即：首先將截獲的 實蠅幼蟲、卵或蛹在室內(nèi)飼養(yǎng)為成蟲，然后通過觀察成蟲形態(tài)，而鑒別其是否為辣椒實蠅。 該種鑒別方法存在的主要問題為：（1)將幼蟲、卵或蛹飼養(yǎng)為成蟲，需要花費(fèi)較長的時間， 嚴(yán)重影響了果蔬進(jìn)出口貿(mào)易的通關(guān)速度；（2)如果截獲果蔬中實蠅的頭、胸、腹、翅、足等殘 體，由于無法將上述殘體飼養(yǎng)為成蟲，因此，無法準(zhǔn)確識別所截獲的殘體是否為辣椒實蠅的 殘體，具有較大的鑒別局限性。
[0005] 因此，現(xiàn)有技術(shù)中，迫切需要一種可克服形態(tài)學(xué)鑒別方法的不足、能夠快速準(zhǔn)確鑒 定辣椒實蠅的鑒別方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明提供一種用于快速鑒定辣椒實蠅的種特異性引 物對、試劑盒及鑒定方法，能夠快速準(zhǔn)確的對截獲的疑似辣椒實蠅的幼蟲、卵、蛹，以及頭、 胸、翅、腹、足等殘體進(jìn)行鑒別。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0008] 本發(fā)明第一目的為提供一種用于快速鑒定辣椒實蠅的種特異性引物對，包括上游 弓丨物FL680和下游引物RL1057 ;
[0009] 所述上游引物FL680的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0010] 所述下游引物RL1057的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011] 本發(fā)明第二目的為提供一種用于快速鑒定辣椒實蠅的試劑盒，所述試劑盒包括 SS-PCR反應(yīng)試劑和引物；所述引物包括：
[0012] 上游引物FL680的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0013] 下游引物RL1057的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0014] 優(yōu)選的，所述SS-PCR反應(yīng)試劑包括：雙蒸水8. 5ul、2XEasyTaq PCR SuperMixl2.5ul、上游引物 FL680 lul、下游引物 RL1057 lul。
[0015] 本發(fā)明第三目的為提供一種采用上述的種特異性引物對快速鑒定辣椒實蠅的方 法，包括以下步驟：
[0016] S1，設(shè)計辣椒實蠅的種特異性引物對；其中，所述辣椒實蠅的種特異性引物對包 括：上游引物FL680的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；下游引物RL1057的核苷酸序列如 SEQ ID N0:2 所示；
[0017] S2,提取被鑒定生物體的DNA，并利用通用型引物L(fēng)C01490和HC02198進(jìn)行實蠅樣 本DNA的質(zhì)量檢測；該通用型引物序列為：
[0018] LC01490 ：GGTCAACAAATCATAAAGATATTG ；
[0019] HC02198 ： TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA ；
[0020] S3,以所述被鑒定生物體的DNA為模板，使用所述辣椒實蠅的種特異性引物對對 所述被鑒定生物體的DNA進(jìn)行SS-PCR擴(kuò)增；
[0021] S4,采用電泳檢測SS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷所述SS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否含有378bp的 特征條帶，如果含有，則所述被鑒定生物體為辣椒實蠅種；反之，則所述被鑒定生物體不為 辣椒實蠅種。
[0022] 優(yōu)選的，S1中，通過以下方法設(shè)計得到辣椒實蠅的種特異性引物對：
[0023] S1. 1，選用辣椒實蠅的標(biāo)本，采用試劑盒法從所述辣椒實蠅的標(biāo)本中提取辣椒實 蠅的基因組DNA;
[0024] 通過NCBI數(shù)據(jù)庫查找辣椒實蠅已公布的登錄基因序列；通過對所述目標(biāo)序列和 所述已公布的登錄基因序列進(jìn)行比較分析，最后選定登錄號為FJ903490的基因序列，下 載該登錄號的FASTA格式的基因序列；利用Primer-Premier 5. 0設(shè)計引物，再利用Oligo 6. 44對所設(shè)計的引物進(jìn)行評價，最后利用NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的Primer-BLAST程序檢查同 源序列，通過篩選獲得所述辣椒實蠅的種特異性引物對。
[0025] 優(yōu)選的，S2中，所述被鑒定生物體的DNA具體為：來自卵生物形態(tài)的DNA、來自幼蟲 生物形態(tài)的DNA、來自蛹生物形態(tài)的DNA、來自生物殘體的DNA ;
[0026] 其中，所述生物殘體指頭、胸、腹、翅或足。
[0027] 優(yōu)選的，S3中，DNA模板的濃度為25. 21 X Krtig/ul ;
[0028] S3 中，所述 SS-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成為：2XEasyTaq PCR SuperMixl2. 5ul，模 板DNA 2ul，上游引物lul，下游引物lul，最后用雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)至25ul。
[0029] 優(yōu)選的，所述SS-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：93?95 °C預(yù)變性4?6min ;93?95 °C 變性35?45s ;退火溫度50?60°C，25?35s ;72°C延伸0. 5?1. 5min ;20?30個循環(huán)， 最后72°C延伸7?lOmin停止反應(yīng)。
[0030] 優(yōu)選的，所述SS-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性40s ;退火溫 度55°C，30s ;72°C延伸l.Omin ;25個循環(huán)，最后72°C延伸8min停止反應(yīng)。
[0031] 優(yōu)選的，S4中，所述采用電泳檢測SS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷所述SS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是 否含有378bp的特征條帶，具體為：
[0032] S4. 1，提取 SS-PCR 擴(kuò)增后的 5ul SS-PCR 產(chǎn)物；
[0033] S4. 2,在含DNA染色劑的1. 5%的瓊脂糖凝膠多功能電泳儀上，對所述5ulSS-PCR 產(chǎn)物120V電泳30min ;
[0034] S4. 3,利用凝膠成像分析儀檢測電泳后是否擴(kuò)增出378bp的特征條帶。
[0035] 本發(fā)明提供的用于快速鑒定辣椒實蠅的種特異性引物對、試劑盒及鑒定方法，在 辣椒實蠅的基因組DNA中設(shè)計種特異性引物對，通過SS-PCR擴(kuò)增，如果被鑒別生物體屬于 辣椒實蠅種，則能夠擴(kuò)增出一條長度為378bp的特異條帶；反之，如果被鑒別生物體不屬于 辣椒實蠅種，則不能擴(kuò)增出目的條帶。具體具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0036] (1)種特異性引物對更加特異，擴(kuò)增效率更高，結(jié)果判斷更加直觀、便捷；
[0037] (2)檢測結(jié)果更加簡單、快捷，6-8小時內(nèi)即可完成檢測與鑒定，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定 中，需要飼養(yǎng)15天得到成蟲再進(jìn)行鑒定；可見，本發(fā)明大大縮短了辣椒實蠅的鑒定周期；
[0038] (3)本發(fā)明提供的種特異性引物對，可以快速、準(zhǔn)確、特異性地檢測出辣椒實蠅的 各個蟲態(tài)甚至殘體，具有檢測范圍大的優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 圖1為本發(fā)明比較例一提供的電泳檢測結(jié)果圖；
[0040] 圖2為本發(fā)明比較例五提供的電泳檢測結(jié)果圖；
[0041] 圖3為本發(fā)明比較例六提供的電泳檢測結(jié)果圖；
[0042] 圖4為本發(fā)明試驗例一提供的電泳檢測結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0043] 本發(fā)明提供的用于快速鑒定辣椒實蠅的種特異性引物對、試劑盒及鑒定方法，能 夠快速可靠的對截獲的疑似辣椒實蠅的幼蟲、卵、蛹，以及頭、胸、翅、足等殘體進(jìn)行鑒別。具 有檢測結(jié)果可靠、對辣椒實蠅特異性高的優(yōu)點(diǎn)。
[0044] 以下通過具體的比較例或試驗例，證明本發(fā)明提供的種特異性引物對的特異性和 可靠性：
[0045] 比較例一
[0046] (1)本發(fā)明設(shè)計的種特異性引物序列如下所示：
[0047] 上游引物 FL680 : TTTGGGCACCCAGAAGTCTACATT ;
[0048] 下游引物 RL1057 :TACAGACGAGTTAGCGAGAACA。
[0049] (2)選取試驗樣：
[0050] 本發(fā)明所選取的陰性對照樣，均為不同種類的實蠅，與辣椒實蠅屬于近緣種范圍， 具體選取下列陰性對照樣，分別為：
[0051] 陰性對照樣 1-番石槽實妮 Bactrocera (Bactrocera) correcta (Bezzi)
[0052] 陰性對照樣 2_ 桔小實妮 Β· (Β· ) dorsails (Hendel)
[0053] 陰性對照樣 3-顏帶實蠅 B. (B. ) cilifer (Hendel)
[0054] 陰性對照樣 4_ 鎊實妮 Β· (Β· ) rubigina (Wang&Zhao)
[0055] 陰性對照樣 5-瑞麗果實蠅 Β· (B. )ruiliensis Wang, Long et Zhang, sp. nov.
[0056] 陰性對照樣 6_ 瘤胚實蠅 B. (B. ) tuberculata(Bezzi)
[0057] 陰性對照樣 7_ 楊桃實妮 Β· (B. ) carambolae Drew&Hancock
[0058] 陰性對照樣 8_ 普通果實妮 B. (Zeugodacus) caudate (Fabricius)
[0059] 陰性對照樣 9_ 瓜實蠅 B. (Z. ) cucurbitae (Coquillett)
[0060] 陰性對照樣11-南瓜實蠅B. (Z. ) tau (Walker)
[0061] 陰性對照樣 12-具條實蠅 B. (Z. ) scutellata(Hendel)
[0062] 陰性對照樣 13-近黑顏實蠅 Β· (Z. ) parater (Zhao&Lin)
[0063] 陰性對照樣 14-黑膝實蠅 Β· (Z. ) scutellaris (Bezzi)
[0064] 陰性對照樣 15-漠寡鬃實妮、B. (Asiadacus)modica(Hardy)
[0065] 陰性對照樣 16-何氏華實妮 B. (Sinodacus)hochii (Zia)
[0066] 陰性對照樣 I7-麥實妮 Carpomya vesuviana Costa
[0067] 陰性對照樣 18-瓜棍腹實妮 Dacus (Callantra) longicornis Wiedemann
[0068] 陰性對照樣 19-腿端黑實妮 B. atrifemur Drew&Hancock
[0069] 陰性對照樣 20-黑顏實蠅 B. diaphora Coquillett
[0070] 陰性對照樣 21-五指山實妮 Β· (Β· ) wuzhishana Lin et Yang, sp. nov
[0071] 選取陽性對照樣為：陽性對照樣10-成蟲形態(tài)的辣椒實蠅；
[0072] (3)DNA提取：分別對陰性對照樣1-9、11_21，以及陽性對照樣10提取DNA。其中， DNA提取方法為試劑盒提取方法。
[0073] (4) SS-PCR擴(kuò)增：分別以所提取的陰性對照樣1-9和11-21，以及陽性對照樣10的 DNA為模板，使用辣椒實蠅的種特異性引物對對各個樣品的DNA進(jìn)行SS-PCR擴(kuò)增。
[0074] SS-PCR 反應(yīng)體系組成為：2XEasyTaq PCR SuperMix 12. 5ul，模板 DNA 2ul，上游 引物lul，下游引物lul，最后用雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)至25ul。
[0075] SS-PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性40s ;退火溫度55°C，30s ;72°C延 伸1. Omin ;25個循環(huán)，最后72°C延伸8min停止反應(yīng)。
[0076] (5)電泳檢測：提取步驟（4)的擴(kuò)增產(chǎn)物5ul ;用含DNA染色劑的1. 5%的瓊脂糖凝 膠多功能電泳儀上，對各擴(kuò)增產(chǎn)物120V電泳30min ;利用凝膠成像分析儀觀察電泳后的檢 測結(jié)果圖。檢測結(jié)果如圖1所示，其中，M:50bp DNALadder，l :番石榴實蠅，2 :桔小實蠅，3 : 顏帶實蠅，4 :銹實蠅，5 :瑞麗果實蠅，6 :瘤脛實蠅，7 :楊桃實蠅，8 :普通果實蠅，9 :瓜實蠅， 10 :成蟲形態(tài)的辣椒實蠅，11 :南瓜實蠅，12 :具條實蠅，13 :近黑顏實蠅，14 :黑膝實蠅，15 : 滇寡鬃實蠅，16 :何氏華實蠅，17 :棗實蠅，18 :瓜棍腹實蠅，19 :腿端黑實蠅，20 :黑顏實蠅， 21 :五指山實蠅。
[0077] 從檢測結(jié)果圖可以看出，陰性對照樣1-9和11-21均沒有出現(xiàn)378bp的特征條帶。 而陽性對照樣10出現(xiàn)378bp的特征條帶。
[0078] 基于同樣的檢測方法，僅改變陽性對照樣10,將陽性對照樣10分別替換為：幼蟲 形態(tài)的辣椒實蠅、卵形態(tài)的辣椒實蠅、蛹形態(tài)的辣椒實蠅、辣椒實蠅的頭部位、辣椒實蠅的 胸部位、腹部位、辣椒實蠅的翅部位和辣椒實蠅的足部位，進(jìn)行上述的鑒定試驗，所得到的 電泳檢測圖均與圖1相同。
[0079] 因此，通過本比較例，一方面，本發(fā)明提供的種特異性引物對，在實驗涉及的實蠅 種類范圍內(nèi)，能夠特異性的鑒定辣椒實蠅，具有較強(qiáng)的特異性；另一方面，由于辣椒實蠅的 各個蟲態(tài)甚至殘體均出現(xiàn)378bp的特征條帶，說明本發(fā)明提供的種特異性引物對，可以快 速、準(zhǔn)確、特異性地檢測出辣椒實蠅的各個蟲態(tài)甚至殘體，具有檢測范圍大的優(yōu)點(diǎn)。
[0080] 比較例二
[0081] 本比較例與比較例一唯一的不同在于：
[0082] SS-PCR反應(yīng)條件為：93°C預(yù)變性4min ;95°C變性45s ;退火溫度50°C，25s ;72°C延 伸1. 5min ;20個循環(huán)，最后72°C延伸7min停止反應(yīng)。
[0083] 試驗結(jié)果與比較例一相同，S卩：陰性對照樣1-20均沒有出現(xiàn)378bp的特征條帶。 而陽性對照樣1-8均出現(xiàn)378bp的特征條帶。
[0084] 比較例三
[0085] 本比較例與比較例一唯一的不同在于：
[0086] SS-PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性6min ;93°C變性35s ;退火溫度60°C，35s ;72°C延 伸0. 5min ;30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin停止反應(yīng)。
[0087] 試驗結(jié)果與比較例一相同，S卩：陰性對照樣1-20均沒有出現(xiàn)378bp的特征條帶。 而陽性對照樣1-8均出現(xiàn)378bp的特征條帶。
[0088] 比較例四
[0089] 采用以下8種樣品：樣品1和樣品2均為飼養(yǎng)后獲得的成蟲；樣品3和樣品4均 為幼蟲；樣品5和樣品6均為卵；樣品7和樣品8均為飼養(yǎng)后獲得的蛹；其中，樣品1、2、7、 8為通過飼養(yǎng)得到的對應(yīng)蟲態(tài)；樣品3、4、5、6為檢疫監(jiān)管機(jī)構(gòu)截獲的樣品；
[0090] 分別從樣品1-樣品8提取DNA ;然后，采用與比較例一相同的SS-PCR擴(kuò)增和電泳 檢測方法，檢測結(jié)果為：樣品1、樣品3、樣品5和樣品7均出現(xiàn)378bp的特征條帶；而樣品2、 樣品4、樣品6和樣品8均沒有出現(xiàn)378bp的特征條帶。因為，采用本發(fā)明提供的鑒定方法， 鑒定結(jié)論為：樣品1為辣椒實蠅的成蟲、樣品3為辣椒實蠅的幼蟲、樣品5為辣椒實蠅的卵、 樣品7為辣椒實蠅的蛹。而樣品2、樣品4、樣品6和樣品8均不為辣椒實蠅的不同蟲態(tài)。
[0091] 將樣品飼養(yǎng)為成蟲，然后觀察成蟲的形態(tài)，得出以下結(jié)論：樣品3、樣品5和樣品7 飼養(yǎng)得到的成蟲均為辣椒實蠅。而樣品4飼養(yǎng)得到的成蟲為南瓜實蠅；樣品6飼養(yǎng)得到的 成蟲為黑膝實蠅；樣品8飼養(yǎng)得到的成蟲為具條實蠅。因此，通過成蟲飼養(yǎng)，驗證了本發(fā)明 提供的基于種特異性引物對鑒定方法的準(zhǔn)確性和可靠性。
[0092] 由此可見，本發(fā)明提供的鑒定方法，不受蟲態(tài)的限制。
[0093] 比較例五
[0094] 采用比較例一的鑒定方法，僅改變試驗材料種類，進(jìn)行種特異性驗證。得到如圖2 所示的電泳檢測圖，其中，M :50bp DNA Ladder，1-24代表被檢測樣品的種類，具體為：
[0095] 1 :泰國辣椒實蠅（1);
[0096] 2 :泰國辣椒實蠅（2);
[0097] 3 :老撾辣椒實蠅（1);
[0098] 4 :老撾辣椒實蠅⑵；
[0099] 5 :老撾辣椒實蠅⑶；
[0100] 6 :馬來西亞辣椒實蠅（1);
[0101] 7 :馬來西亞辣椒實蠅（2);
[0102] 8 :馬來西亞辣椒實蠅（3);
[0103] 9:印度辣椒實蠅（1);
[0104] 10:印度辣椒實蠅⑵；
[0105] 11:日本辣椒實蠅（1);
[0106] 12 :日本辣椒實蠅（2);
[0107] 13 :日本辣椒實蠅（3);
[0108] 14 :桔小實蠅；
[0109] 15 :顏帶實蠅；
[0110] 16:番石榴實蠅；
[0111] 17:銹實蠅；
[0112] 18:瑞麗果實蠅；
[0113] 19 :楊桃實蠅；
[0114] 20:普通果實蠅；
[0115] 21:瓜實蠅；
[0116] 22:南瓜實蠅；
[0117] 23:具條實蠅；
[0118] 24:空白對照（ddH20)。
[0119] 其中，上述樣品名稱中，括號中數(shù)字的含義代表該樣品被截獲的批次；如：11 :日 本辣椒實蠅（1)，代表第1批次截獲的日本辣椒實蠅；12 :日本辣椒實蠅（2)，代表第2批次 截獲的日本辣椒實蠅；13 :日本辣椒實蠅（3)，代表第3批次截獲的日本辣椒實蠅。
[0120] 由圖2可以看出，樣品1-13,為來自不同國家不同批準(zhǔn)的辣椒實蠅，其均出現(xiàn)了 378bp的特征條帶；而對于其他種類的實蠅，即樣品14-24,均沒有出現(xiàn)378bp的特征條帶。
[0121] 通過本比較例，進(jìn)一步驗證了本發(fā)明上游引物FL680和下游引物RL1057的種特異 性。
[0122] 比較例六
[0123] 采用比較例二的鑒定方法，僅改變試驗材料種類，進(jìn)行種特異性驗證。得到如圖3 所示的電泳檢測圖，其中，M :50bp DNA Ladder，1-9代表被檢測樣品的種類，具體為：
[0124] 1-幼蟲形態(tài)的泰國辣椒實蠅；
[0125] 2-卵形態(tài)的泰國辣椒實蠅；
[0126] 3-蛹形態(tài)的泰國辣椒實蠅；
[0127] 4-泰國辣椒實蠅的頭部位；
[0128] 5-泰國辣椒實蠅的翅部位；
[0129] 6-幼蟲形態(tài)的馬來西亞辣椒實蠅；
[0130] 7-卵形態(tài)的馬來西亞辣椒實蠅；
[0131] 8-蛹形態(tài)的馬來西亞辣椒實蠅；
[0132] 9:空白對照 ddH20。
[0133] 由圖3可以看出，樣品1-8,為來自不同國家不同蟲態(tài)的辣椒實蠅，其均出現(xiàn)了 378bp的特征條帶。
[0134] 通過本比較例，進(jìn)一步驗證了本發(fā)明上游引物FL680和下游引物RL1057的種特異 性。
[0135] 試驗例一
[0136] 本試驗例用于檢測SS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度。
[0137] 選擇條帶最亮的DNA模板，利用核酸蛋白分析儀測得DNA模板濃度為25. 21ng/ul， 將其按10'1〇_2、1〇_3倍梯度稀釋，然后在比較例一其他檢測條件均不變的條件下，將DNA 模板濃度采用 25. 21*10〇ng/ul、25. 21*10-1叩/111、25· 21*l(T2ng/ul、25· 21*l(T3ng/ul 進(jìn)行 對照試驗；電泳檢測結(jié)果如圖4所示，其中：M :50bp DNA Ladder ;
[0138] 1 :25. 21*10°ng/ul的DNA模板濃度檢測條件
[0139] 2 :25. 的DNA模板濃度檢測條件
[0140] 3 :25. 21*10_2ng/ul的DNA模板濃度檢測條件
[0141] 4 :25. 21*10_3ng/ul的DNA模板濃度檢測條件
[0142] 5:空白對照 ddH20
[0143] 從圖4可以看出，DNA模板濃度的最低檢測率值為25. 21*10_2ng/ul ;最適DNA模 板濃度為25. 21*10-1叫/111。
[0144] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于快速鑒定辣椒實蠅的種特異性引物對，其特征在于，包括上游引物FL680 和下游引物RL1057 ; 所述上游引物FL680的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 所述下游引物RL1057的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2. -種用于快速鑒定辣椒實蠅的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括SS-PCR反應(yīng)試 劑和引物；所述引物包括： 上游引物FL680的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 下游引物RL1057的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于快速鑒定辣椒實蠅的試劑盒，其特征在于，所述SS-PCR 反應(yīng)試劑包括：雙蒸水 8. 5ul、2XEasyTaq PCR SuperMix 12. 5ul、上游引物 FL680 lul、下 游引物 RL1057 lul。
4. 一種采用權(quán)利要求1所述的種特異性引物對快速鑒定辣椒實蠅的方法，其特征在 于，包括以下步驟： S1，設(shè)計辣椒實蠅的種特異性引物對；其中，所述辣椒實蠅的種特異性引物對包括：上 游引物FL680的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；下游引物RL1057的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 52, 提取被鑒定生物體的DNA，并利用通用型引物L(fēng)C01490和HC02198進(jìn)行實蠅樣本 DNA的質(zhì)量檢測；該通用型引物序列為： LC01490 ：GGTCAACAAATCATAAAGATATTG ； HC02198 ：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA ； 53, 以所述被鑒定生物體的DNA為模板，使用所述辣椒實蠅的種特異性引物對對所述 被鑒定生物體的DNA進(jìn)行SS-PCR擴(kuò)增； 54, 采用電泳檢測SS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷所述SS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否含有378bp的特征 條帶，如果含有，則所述被鑒定生物體為辣椒實蠅種；反之，則所述被鑒定生物體不為辣椒 實蠅種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的種特異性引物對快速鑒定辣椒實蠅的方法，其特征在于，S1 中，通過以下方法設(shè)計得到辣椒實蠅的種特異性引物對： S1. 1，選用辣椒實蠅的標(biāo)本，采用試劑盒法從所述辣椒實蠅的標(biāo)本中提取辣椒實蠅的 基因組DNA ; 通過NCBI數(shù)據(jù)庫查找辣椒實蠅已公布的登錄基因序列；通過對所述目標(biāo)序列和所述 已公布的登錄基因序列進(jìn)行比較分析，最后選定登錄號為FJ903490的基因序列，下載該登 錄號的FASTA格式的基因序列；利用Primer-Premier 5.0設(shè)計引物，再利用Oligo 6. 44對 所設(shè)計的引物進(jìn)行評價，最后利用NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的Primer-BLAST程序檢查同源序列， 通過篩選獲得所述辣椒實蠅的種特異性引物對。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的種特異性引物對快速鑒定辣椒實蠅的方法，其特征在于，S2 中，所述被鑒定生物體的DNA具體為：來自卵生物形態(tài)的DNA、來自幼蟲生物形態(tài)的DNA、來 自蛹生物形態(tài)的DNA、來自生物殘體的DNA ; 其中，所述生物殘體指頭、胸、腹、翅或足。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的種特異性引物對快速鑒定辣椒實蠅的方法，其特征在于，S3 中，DNA模板的濃度為25. 21 X KTng/ul ; S3中，所述SS-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成為：2XEasyTaq PCR SuperMixl2.5ul，模板 DNA 2ul，上游引物lul，下游引物lul，最后用雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)至25ul。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的種特異性引物對快速鑒定辣椒實蠅的方法，其特征在于，所 述SS-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：93?95°C預(yù)變性4?6min ;93?95°C變性35?45s ;退火 溫度50?60°C，25?35s ;72°C延伸0· 5?L 5min ;20?30個循環(huán)，最后72°C延伸7? lOmin停止反應(yīng)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的種特異性引物對快速鑒定辣椒實蠅的方法，其特征在于，所 述SS-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性40s ;退火溫度55°C，30s ;72°C延 伸1. Omin ;25個循環(huán)，最后72°C延伸8min停止反應(yīng)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的種特異性引物對快速鑒定辣椒實蠅的方法，其特征在于，S4 中，所述采用電泳檢測SS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷所述SS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否含有378bp的特征 條帶，具體為： S4. 1，提取SS-PCR擴(kuò)增后的5ul SS-PCR產(chǎn)物； S4. 2,在含DNA染色劑的1. 5%的瓊脂糖凝膠多功能電泳儀上，對所述5ulSS-PCR產(chǎn)物 120V 電泳 30min ; S4. 3,利用凝膠成像分析儀檢測電泳后是否擴(kuò)增出378bp的特征條帶。
【文檔編號】C12N15/11GK104152571SQ201410424469
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月26日
【發(fā)明者】黃振, 郭瓊霞, 婁定風(fēng), 鄧裕亮, 陳韶萍, 黃可輝 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心