Il-10多肽抑制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種多肽及其制備方法，可采用固相合成法和生物合成法，本發(fā)明的生物合成法還涉及編碼所述多肽的核苷酸序列，包含編碼所述多肽的核苷酸序列在內(nèi)的表達(dá)載體，包含所述表達(dá)載體在內(nèi)的宿主細(xì)胞，本發(fā)明還涉及含有所說的多肽的藥物組合物，本發(fā)明還涉及這種多肽或其組合物在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其是這種多肽或含該多肽的組合物在制備預(yù)防或治療疾病時(shí)阻斷白介素10藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】丨L-10多肽抑制劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多肽及其制備方法，本發(fā)明還涉及這種多肽在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用， 尤其是利用這種多肽具有抑制白細(xì)胞介素一 10的功能，在制備預(yù)防或治療疾病時(shí)，阻斷白 介素10藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 白細(xì)胞介素一 10 (IL-10)是一個(gè)在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中具有多向性作用的細(xì) 胞因子，其功能包括了截然相反的兩個(gè)方面，免疫抑制和免疫促進(jìn)。IL-10蛋白是二聚體， 每個(gè)亞單位的長(zhǎng)度為178個(gè)氨基酸。由很多免疫細(xì)胞分泌，包括TH1，TH2和TH17亞類，調(diào) 節(jié)性T細(xì)胞（TReg)，CD8+T和B細(xì)胞。也在啟動(dòng)免疫反應(yīng)的細(xì)胞中表達(dá)，包括樹突狀細(xì)胞 (DCs)、巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等，IL-10通過抑制病原體 的免疫反應(yīng)來防止對(duì)宿主的損害。
[0003] 當(dāng)IL-10在免疫反應(yīng)啟動(dòng)階段出現(xiàn)時(shí)可中止T細(xì)胞的反應(yīng)，能抑制現(xiàn)有T細(xì)胞抗 病毒感染的能力。而且IL-10可直接作用于T細(xì)胞，限制其復(fù)制、功能分化和效能。在慢性 病毒感染和癌癥患者血清中常發(fā)現(xiàn)IL-10非常過量的表達(dá)，使針對(duì)慢性病毒感染，腫瘤免 疫反應(yīng)消失而引起嚴(yán)重后果而在丙型肝炎病毒（HCV)、乙型肝炎病毒（HBV)、免疫缺陷病毒 (HIV)和EB病毒（EBV)感染中低水平的IL-10常與病毒的清除和病毒的有效控制存在相關(guān) 性。
[0004] IL-10還與體內(nèi)自身免疫相關(guān)。自身免疫由靶向正常組織的自身抗體、自身反 應(yīng)性T細(xì)胞或它們的某些組合的發(fā)展引起。自身免疫性疾病的一個(gè)實(shí)例是全身紅斑狼瘡 (SLE)，一種全身的結(jié)締組織都成為炎性的慢性風(fēng)濕性疾病；自身抗體將正常的身體組織誤 認(rèn)為是外部侵入的物質(zhì)，攻擊正常的身體組織，引起特征性的炎癥，其中一些是有腎臟病毒 性的；SLE在女性中的發(fā)病率高于男性十倍，它可以在任何年齡段發(fā)作，但最常見的是在年 輕成年人中。體內(nèi)和體外研究都表明，阻斷IL-10產(chǎn)生可以減輕SLE的臨床表現(xiàn)【參見， Gonzalez-Amaro 等，J. Autoimmunity 11:395-402(1998)】。
[0005] 治療性地阻斷IL-10信號(hào)來增加抗病毒免疫和疫苗效果在抗病毒治療中越來越 有前景。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，阻斷白介素 10,可以清除慢性病毒感染，如果在DNA疫苗免疫時(shí)阻 斷白介素10,可以更好地清除慢性病毒感染?？ń槊缑庖邥r(shí)阻斷白介素10,可以誘導(dǎo)動(dòng)物 產(chǎn)生更強(qiáng)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，比僅僅使用卡介苗免疫，可以更好地保護(hù)免疫動(dòng)物免受結(jié)核 菌感染。此外，腫瘤組織局部注射Toll樣受體9配體CpG，腹腔注射抗白介素 10受體抗體， 可以抑制腫瘤生長(zhǎng)；病毒樣顆粒免疫時(shí)阻斷白介素10,可以提高病毒樣顆粒疫苗誘導(dǎo)的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)。疫苗多肽疫苗結(jié)合Toll樣受體4配體脂多糖LPS免疫時(shí)阻斷IL-10信號(hào)， 也可以抑制人乳頭瘤病毒E7抗原轉(zhuǎn)化的TC-1腫瘤細(xì)胞在小鼠中的生長(zhǎng)。免疫時(shí)阻斷白介 素10提高疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)，清除病毒感染，抑制腫瘤生長(zhǎng)的可能機(jī)理是，阻斷了白介 素10對(duì)抗原提呈細(xì)胞、特別是樹突狀細(xì)胞的抑制作用。
[0006] IL-10受體是由IL-10R1和IL-10R2亞單位組成的二類細(xì)胞因子家庭成員， IL-10R1是唯一的配體連接亞單位。IL-10R2是信號(hào)傳導(dǎo)的亞單位，與其他細(xì)胞因子 (IL-22, IL-26, IL-28和IL-29)所共有。因此最近認(rèn)為使用特定的分子、抗IL-10或抗 IL-10受體的抗體來阻斷IL-10R1與IL-10結(jié)合是解決這個(gè)問題的可行方法。美國(guó)先靈公 司申請(qǐng)的200480040148. 2及其兩份分案申請(qǐng)201010004581. 8、201010004582. 2均涉及白 細(xì)胞介素-10抗體。但臨床使用級(jí)的抗體（如單克隆抗體）由于高成本生產(chǎn)和復(fù)雜的管理 批準(zhǔn)程序等原因尚未投入臨床使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的就是為了提高一種與IL-10配體連接亞單位IL-10R1易于結(jié)合、從 而據(jù)此機(jī)制來抑制IL-10生物學(xué)功能的多肽。
[0008] 本發(fā)明還公開了這種多肽的制備方法。
[0009] 本發(fā)明還公開了這種多肽在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0010] PharmaR&D計(jì)算模型和模擬方法已成為藥物研發(fā)程序的整體組分之一。以結(jié)構(gòu)為 基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)方法（Structure-based drug design, SBDD)迅速得到發(fā)展和廣泛應(yīng)用?？?在靶分子（如相關(guān)的蛋白/受體的疾?。⑺幬锖蜻x分子和獲得更可靠的模型等方面提供 非常好的前景，如連接位置（蛋白與受體連接位置）、互相作用機(jī)制（蛋白與受體結(jié)合，氫 鍵連接，庫(kù)侖相互作用和某一殘端側(cè)鏈的螯合的方式），相互作用力（破壞蛋白與受體間共 價(jià)或非共價(jià)鍵所需的最小能量）和復(fù)合物的穩(wěn)定性（例如溫度和PH改變的影響，其他分子 或離子存在的影響等）。通過分析這些數(shù)據(jù)，構(gòu)建候選多肽，并用生物學(xué)檢測(cè)方法來進(jìn)一步 驗(yàn)證。隨著計(jì)算能力的增強(qiáng)以及高分辨率量子加速X線晶體學(xué)獲得更準(zhǔn)確的蛋白/受體結(jié) 構(gòu)，基于尋找理想的候選肽的SBDD方法由于其易于合成，低毒性和無公害吸引了越來越多 研究者的興趣。
[0011] 本發(fā)明應(yīng)用分子動(dòng)力學(xué)模擬模型用AMBER12系列程序來模擬分析體內(nèi)外IL-10和 IL-10R1相互作用，鑒定結(jié)合區(qū)域和作用力。然后以目標(biāo)QM/MM模擬方法獲得的生物學(xué)信息 為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)若干個(gè)多肽序列。理想的多肽在計(jì)算模擬中具有阻斷IL-10和IL-10R1之間信 號(hào)的能力，模擬方法顯示在生理狀態(tài)下IL-10R1與多肽更易于結(jié)合，據(jù)此機(jī)制來抑制IL-10 的生物學(xué)功能。
[0012] 根據(jù)上述原理，本發(fā)明經(jīng)過計(jì)算，設(shè)計(jì)并提供了一種多肽序列（氨基酸序列），是 在端部具有SEQ ID No :1所不的氣基酸序列：
[0013] SEQ ID No : 1 :FFKKF FKKFF KKFFK Κ-0Η，即
[0014] NH3-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-C 00H.
[0015] 其中，氨基酸K(賴氨酸，Lys)可以為R(精氨酸，Arg)全部替代；替代后，多肽序 列（氨基酸序列）端部的氨基酸序列為SEQ ID No :2 :FFRRF FRRFF RRFFR R-0H。
[0016] 這種替代也可以部分取代，包括一個(gè)替代、兩個(gè)替代、三個(gè)替代、四個(gè)替代和五個(gè) 替代，替代的氨基酸可以是任何位置。包括SEQ ID N0 :1和2的所有片段序列，如FFKKF FKKFF KK-〇H,FFKKF FKKFF KKFF-〇H,FFKKF FKKFF-0H, FFRRF FRRFF RRFF-〇H,FFRRF FRRFF RR等。
[0017] 本發(fā)明多肽的氨基酸序列優(yōu)選為：SEQ ID No :1 :FFKKF FKKFF KKFFK Κ-0Η,即
[0018] NH3-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-C 00H;或者
[0019] 優(yōu)選為 SEQ ID No :2 :FFRRF FRRFF RRFFR R-OH ;即
[0020] NH3-Phe-Phe-Arg-Arg-Phe-Phe-Arg-Arg-Phe-Phe-Arg-Arg-Phe-Phe-Arg-Arg-C 00H〇
[0021] 模擬結(jié)果：SEQ ID N〇:l、2多肽可以與IL-10R1受體結(jié)合，并形成較IL-10更為穩(wěn) 定的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。
[0022] 1、設(shè)計(jì)多肽SEQ ID No :1，2和IL-10R1受體的相互作用
[0023] 分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果顯示通過長(zhǎng)時(shí)間的模擬SEQ ID No :1，2與IL-10R1所形成復(fù) 合物的代表構(gòu)型的主鏈構(gòu)型根平均方差均在2A以下，而且，勢(shì)能也逐漸下降并趨于平穩(wěn)， 說明已經(jīng)形成了穩(wěn)定的構(gòu)型。
[0024] 2.復(fù)合物解離能的比較
[0025] 在此，我們引入解離能的定義及計(jì)算方法。解離能，ED，為解離IL-10R1與IL-10或 設(shè)計(jì)多肽序列所形成復(fù)合物形成單體所需要的能量，具體計(jì)算公式如下，
[0026] Ed = Ecx-Er = Ep
[0027] 其中，ED為解離能（負(fù)值表示需要從外界吸收能量），Ecx、Ep Ep依次為復(fù)合物、 IL-10R1、IL-10或設(shè)計(jì)多肽序列的勢(shì)能。
[0028] 計(jì)算結(jié)果如表1所示，相對(duì)于IL-10與IL-10R1形成的復(fù)合物，SEQ ID N0 :1、2多 肽與IL-10R1所形成的復(fù)合物均需要更多的能量才能被解離。由此可以從理論上證明，設(shè) 計(jì)多肽與IL-10R1形成的復(fù)合物更穩(wěn)定，所以具有與IL-10R1優(yōu)先結(jié)合的能力，從而抑制了 IL-10,而且SEQ ID N0 :1的效果更好。
[0029] 表1IL-10或設(shè)計(jì)多肽序列與IL-10R1形成復(fù)合物解離能
[0030]

【權(quán)利要求】
1. 一種多肽，所述的多肽末端SEQ ID No :1所示的氨基酸序列，其中氨基酸K為R全 部、部分替代或者不取代： SEQ ID No :1 :FFKKF FKKFF KKFFK K-0H。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，所述的多肽為SEQ ID No :1所示的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，所述的多肽為SEQ ID No :2所示的氨基酸序列： SEQ ID No :2 :FFRRF FRRFF RRFFR R-0H。
4. 一種權(quán)利要求1 一 3所述多肽的制備方法，其特征在于采用固相合成法合成。
5. -種權(quán)利要求1 一 3所述多肽的制備方法，其特征在于采用生物方法合成。
6. -種核苷酸序列，其特征在于編碼權(quán)利要求1 一 3所述的氨基酸序列。
7. -種表達(dá)載體，其包含編碼權(quán)利要求6所述的核苷酸序列。
8. -種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于其是大腸桿菌。
10. -種組合物，包括權(quán)利要求1 一 3的多肽和藥學(xué)上可接受的載體。
11. 權(quán)利要求1 一 3所述多肽在制備預(yù)防或治療疾病時(shí)阻斷白介素10藥物中的應(yīng)用。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為在制備具有免疫刺激作用藥 物中的應(yīng)用。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為在制備具有刺激T細(xì)胞 免疫作用藥物中的應(yīng)用。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于與Toll樣受體配體聯(lián)合使用。
15. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于在增強(qiáng)預(yù)防性疫苗的預(yù)防疾病的效果的 應(yīng)用。
16. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于在制備增強(qiáng)治療性疫苗治療疾病的效果 的應(yīng)用。
17. 權(quán)利要求10所述的組合物在制備預(yù)防或治療疾病時(shí)阻斷白介素10藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104231054SQ201410441333
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】劉曉松, 王天放, 王躍建 申請(qǐng)人:王躍建, 王天放, 劉曉松