一種珠子參達瑪烯二醇合成酶基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種珠子參達瑪烯二醇合成酶基因及其應(yīng)用，本發(fā)明首次利用第二代SolexaHiSeq2000進行珠子參根莖轉(zhuǎn)錄組測序及 Denovo 拼接。分析找到珠子參中編碼達瑪烯二醇合成酶（DS）的候選基因并進行體外克隆，獲得了珠子參達瑪烯二醇合成酶基因，其序列為SEQ ID NO.1所示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID NO.2所示，將珠子參達瑪烯二醇合成酶基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入珠子參，可獲得高達瑪烷皂苷含量的轉(zhuǎn)基因植株。
【專利說明】—種珠子參達瑪烯二醇合成酶基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，主要涉及珠子參中達瑪烯二醇合成酶(Dammarened1l-1I s ynthase, DS)基因的克隆和應(yīng)用，

【背景技術(shù)】
[0002]珠子參是五加科人參屬(Panax L.)植物。珠子參又名扣子七、鈕子七、珠兒參，系五加科植物珠子參[Panax japonicus C.A.Mey.var.major (Buck.) C.Y Wu et Κ.M.F eng]或習(xí)習(xí)葉三七[Panax japonicus C.A.Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) C.Y.Wu et K.M.Feng]的干燥串珠狀根莖。珠子參是中國藥典收載品種，主要分布在我國陜西、四川、湖北、云南等省。具有補肺、養(yǎng)陰、活絡(luò)、止血的功效，用于氣陰兩虛、煩熱口渴、虛勞咳嗽、跌撲損傷、關(guān)節(jié)疼痛、咳血、吐血、外傷出血等。其主要活性成分為達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷化合物，現(xiàn)代研究表明達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷化合物具有較高的生理活性，因此本專利通過研究珠子參中活性成分達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷化合物生物合成的途徑及其調(diào)控的分子機制，找出其中的關(guān)鍵酶，實現(xiàn)其基因的定位、克隆及高效表達，在分子水平上對達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷化合物生物合成進行人工調(diào)控，為進一步實現(xiàn)珠子參中達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷化合物的生產(chǎn)提供研究基礎(chǔ)。
[0003]珠子參的達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷化合物來自于異戊二烯途徑。2，3-氧化角鯊烯的環(huán)化是三萜皂苷合成下游途徑中的關(guān)鍵步驟，這一步由達瑪烯二醇合成酶(DS)催化產(chǎn)生達瑪烯二醇，達瑪烯二醇在細胞色素P450單加氧酶的催化下形成達瑪烷型皂苷三萜皂苷元——原人參二醇，原人參二醇繼續(xù)在細胞色素篇P450單加氧酶的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)樵藚⑷架赵?，最終形成不同類型的達瑪烷四環(huán)三萜皂苷。
[0004]迄今為止，關(guān)于珠子參活性成分代謝途徑的生物合成研究尚屬空白，珠子參中達瑪烯二醇合成酶(DS)基因的克隆研究也未見相關(guān)報道。本專利首次利用第二代SolexaHiSeq2000進行珠子參根莖轉(zhuǎn)錄組測序及De novo拼接。分析找到珠子參中編碼達瑪烯二醇合成酶(DS)的候選基因并進行體外克隆、表達驗證，為進一步了解該酶在珠子參植物體內(nèi)基因表達、功能與作用機制奠定了研究基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因，其序列為SEQ IDN0.1所示。該基因編碼的達瑪烯二醇合酶在達瑪烷型皂苷化合物合成途徑中起關(guān)鍵性作用。
[0006]本發(fā)明第二個目的是提供一種珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因編碼的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID N0.2所示。
[0007]本發(fā)明的最后一個目的在于提供一種珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因在提高珠子參達瑪烷型皂苷化合物含量中的應(yīng)用。
[0008]為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施:
[0009]一種珠子參達瑪烯二醇合酶基因(Dammarened1l synthase,以下簡稱DS基因)，其制備方法如下:
[0010]以珠子參CDNA 為模板，利用正向引物 Pl:5’-ATGTGGAAGCTGAAGGTTGCTCAAG-3’ 反向引物 P2:5’ -TTAAATTTTGAGCTGCTGGTGGT-3’ 進行 PCR 反應(yīng)。
[0011]反應(yīng)條件:30個PCR反應(yīng)循環(huán)，94°C變性lmin，42°C退火2min，75°C延伸3min。最后 75°C延伸 1min0
[0012]最終獲得了 DS基因，其序列為SEQ ID N0.1所示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID N0.2所示。
[0013]一種珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因在提高珠子參達瑪烷型皂苷化合物含量中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程如下:
[0014]將珠子參達瑪烯二醇合成酶蛋白質(zhì)(SEQ ID N0.2所示)對應(yīng)的DS基因(優(yōu)選SEQID N0.1所示)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入珠子參，可獲得高達瑪烷皂苷含量的的轉(zhuǎn)基因植株。
[0015]本發(fā)明的所要保護的內(nèi)容還包括:
[0016]編碼SEQ ID N0.2所示氨基酸的核苷酸序列；優(yōu)選SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0017]含有本發(fā)明的珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因全序列或部分序列的重組載體，包括但不限于原核類載體pT7-Blue，真核類表達載體pYES2、pBI 121。
[0018]含有本發(fā)明的珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因全序列或部分序列的宿主細胞，包括但不限于含有上述的重組載體的宿主細胞酵母宿主菌GIL77、大腸桿菌、珠子參。
[0019]本發(fā)明的珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因的應(yīng)用，包括用所述的重組載體，如植物表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞；或者用所述含有該基因的農(nóng)桿菌與植物細胞共培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因的植物發(fā)根系；或者用所述的發(fā)根細胞再生植株；或者用所述的珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因全序列或部分序列轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因生物體，包括但不限于煙草、酵母、擬南芥、珠子參發(fā)根。
[0020]本發(fā)明中宿主細胞為原核細胞或者真核細胞。常用的原核宿主細胞包括大腸桿菌；常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、煙草細胞和其它植物細胞。
[0021]利用本發(fā)明的珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0023]本發(fā)明所提供的珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因是首次從珠子參植物中克隆制備所得，利用本發(fā)明的技術(shù)可以對珠子參等含有同類化合物的藥用植物進行基因工程改造，通過轉(zhuǎn)基因來提高植物體內(nèi)的達瑪烷皂苷化合物的含量。珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因可參與珠子參化合物的生物合成，因此本申請為珠子參達瑪烷型皂苷化合物生物合成的進一步研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
[0024]進一步添加其產(chǎn)業(yè)上積極的效果本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了達瑪烷型皂苷化合物含量增加的高產(chǎn)株，為三萜類皂苷化合物的的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支撐。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為珠子參總RNA電泳圖。
[0026]圖2為DS功能域預(yù)測分析。
[0027]圖3為DS系統(tǒng)進化樹。
[0028]圖4為表達載體pYES2-DS構(gòu)建示意圖。
[0029]圖5為酶活力檢測示意圖。
[0030]HPLC檢測酶促產(chǎn)物，圖A酶產(chǎn)物被HPLC檢測分析，檢測紫外波長為202nm，B圖為真正達瑪烯二醇HPLC分析圖

【具體實施方式】
[0031]本發(fā)明所述方案如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案，所用試劑如未特別說明，均購自生化商店。
[0032]實施例1:
[0033]珠子參轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析
[0034]1、樣品采集
[0035]珠子參植株來源于湖北恩施，分別取根莖、葉、花，果實置液氮中速凍后，在-80°C冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0036]2、珠子參總RNA的分離和檢測
[0037]對_80°C保存的各類樣本于液氮中充分研磨，然后采用優(yōu)化的Trizol法對樣本進行總RNA的提取，全過程保證在低溫條件下進行，加入一定濃度的PVP溶液(聚乙烯吡咯烷酮)，并適當(dāng)加大巰基乙醇的濃度，離心去除PVP和巰基乙醇后，采用高濃度NaAc溶液析出RNA，DNase去除殘留DNA完成RNA的純化。用1.0%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性(圖1)，用Nanodrop2000核酸定量儀測定A260、A280比值和濃度，RNA樣本置于_80°C冰箱備用。
[0038]3、轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)
[0039]用oligo(dT)的磁珠從總 RNA 中富集 mRNA,接加入 fragmentat1n buffer 將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板,用六堿基隨機引物(random hexamers)合成第一條cDNA鏈,然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈,在經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并被EB緩沖液洗脫之后進行末端修復(fù)、加poly (A)并連接測序接頭，瓊脂糖凝膠電泳分離并選擇片段大小，PCR擴增構(gòu)建測序文庫，利用第二代SolexaHiSeq2000進行RNA測序，及De novo拼接。
[0040]4、候選基因初步篩選
[0041]通過GO注釋，Blast比對分析以及MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)等軟件分析初步篩選到達瑪烯二醇合成酶的候選基因。
[0042]實施例2:
[0043]珠子參達瑪烯二醇合成酶相關(guān)基因的克隆
[0044]分析候選基因讀碼框范圍，的設(shè)計克隆候選基因全長序列，其克隆方法如下:
[0045]以以珠子參根莖cDNA文庫為模板，利用正向引物Pl:5’ -ATGTGGAAGCTGAAGGTTGCTCAAG-3’ 反向引物 P2:5’ -TTAAAITTTGAGCTGCTGGTGGT-3’ 進行PCR反應(yīng)。
[0046]反應(yīng)條件:30個PCR反應(yīng)循環(huán)，94°C變性lmin，42°C退火2min，75°C延伸3min。最后 75°C延伸 1min0
[0047]鏈接到克隆載體pMD18-T上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞E.coli DH5 α中，步驟如下:
[0048]a)從_80°C超低溫冰箱中取100 μ L感受態(tài)細胞懸液，解凍后置于冰上；
[0049]b)加入5 μ L連接產(chǎn)物，用移液器輕輕吹打混勻，冰上放置30min ；
[0050]c) 42°C熱激90s，迅速置冰上5min ；
[0051]d)向EP管中加入ImL LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，37°C 200rpm45min ；
[0052]e)搖菌后取100 μ L菌液涂布于含抗生素的平板上，37°C培養(yǎng)箱過夜；
[0053]f)挑取單菌落于4mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm振蕩培樣過夜選取陽性克隆送樣測序。
[0054]至此獲得了珠子參達瑪烯二醇合成酶基因，其序列為SEQ ID N0.1所示。
[0055]實施例3:
[0056]DS基因的生物信息學(xué)分析
[0057]本發(fā)明涉及的珠子參達瑪烯二醇合成酶(DS)基因全長cDNA的長度為2310bp，其序列為SEQ ID N0.1所示，含有I個開放閱讀框編碼769個氨基酸的蛋白，編碼的蛋白質(zhì)序列為SEQ ID N0.2所不。將珠子參全長cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundant GenBank CDS translat1n+PDB+Swissprot+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進行檢索。該基因具有典型IS0PREN-C2_like superfamily的結(jié)構(gòu)域。如圖2
[0058]實施例4:
[0059]DS基因功能的研究
[0060]1、表達載體的構(gòu)建
[0061]以珠子參根莖cDNA文庫為模板，利用正向引物Pl:5’ -GGTACCATGTGGAAGCTGAAGGTTGCTCAAG-3’ 反向引物 P2:5’ -CTCGAGTTAAATTTTGAGCTGCTGGTGGT-3’ 進行 PCR 反應(yīng)，取 5ul擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，半小時后照相，觀察膠圖，擴增片段為2322bp。以KpnI和XhoI酶切擴增產(chǎn)物2小時，利用回收試劑盒(Takara公司，中國)純化酶切產(chǎn)物。同時利用KpnI和XhoI酶在37°C下酶切pYES2載體2小時，加入5ul溴酚藍進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察膠圖，并利用試劑盒回收5856bp片段
[0062]二者經(jīng)連接酶在16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，在含有氨芐霉素的LB平板上篩選重組子。含DS克隆的pYES2質(zhì)粒經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切電泳鑒定和DNA序列分析，保存且有正確目標(biāo)的重組質(zhì)粒PYES2-DS用于表達轉(zhuǎn)化。該表達載體命名為PYES2-DS (圖 4)。
[0063]2、蛋白的誘導(dǎo)表達
[0064]以PYES2-DS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化突變酵母宿主菌GIL77，在缺少尿嘧啶的完全合成培養(yǎng)基SC-U (20ug/ml麥角固醇，13ug/ml血紅素，5mg/mlTween80)上30°C震蕩培養(yǎng)2d，收集細胞在不含葡萄糖的SC-U培養(yǎng)基(20ug/ml麥角固醇，13ug/ml血紅素,5mg/mlTween80, 2%半乳糖)上30°C培養(yǎng)1h.收集細胞懸浮于0.1Μ，ρΗ7.0的磷酸鉀溶液中添加3%葡萄糖和血紅素30°C培養(yǎng)24h?；厥站w，分離微粒體，純化蛋白。
[0065]3、酶促反應(yīng)鑒定
[0066]體外酶促反應(yīng)以2，3-氧鯊烯(501111101171)作為反應(yīng)底物，向體系中加TritonX-100 (lmg πιΓ1)，1mmol L^1Tris (pH6.0), 0.2mmo1 L-1EDTA, 2ug 純化蛋白。25°C條件下劇烈搖晃30min，后加入Iml 40% KOH終止酶促反應(yīng)。
[0067]HPLC分析其酶促產(chǎn)物。色譜柱為硅膠柱(4.6mmX250mm);流動相為磷酸鹽緩沖液(50mM, pH 4.5)和乙腈(90:10, v/v),流速 lmL/min ;檢測波長 220nm ;柱溫 40。。。如圖 5。
[0068]將酶促產(chǎn)物與真正達瑪烯二醇做HPLC分析，如圖5所示，兩種物質(zhì)HPLC峰一致，則可證明，酶促產(chǎn)物是達瑪烯二醇。
[0069]實施例5:
[0070]DS在珠子參中進行真核表達及轉(zhuǎn)基因珠子參發(fā)根中三萜類皂苷化合物含量的測定
[0071]轉(zhuǎn)基因用的受體材料珠子參采自湖北恩施
[0072]采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，根據(jù)珠子參達瑪烯二醇基因的全長cDNA序列(SEQ IDN0.1)，在擴增編碼區(qū)的正反方向引物上引入限制性內(nèi)切酶位點(視選用的載體而定)，以便構(gòu)建植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入珠子參，篩選轉(zhuǎn)基因植株檢測其達瑪烷型皂苷的含量。
[0073]以實施例2中獲得的含有DS基因編碼區(qū)(SEQ ID N0.1所示)的pMD18_T Vector的質(zhì)粒為模版，在上述構(gòu)建的正向引物前引入BamH I酶切位點，在反向引物前引入Sac I酶切位點，正向引物 Pl:5’ GGATCCATGTGGAAGCTGAAGGTTGCTCAAG3’:反向引物 P2:5’ GAGCTCTTAAATTTTGAGCTGCTGGTGGT3’進行PCR擴增后，TA克隆，提取質(zhì)粒。以BamH I和Sac I酶切擴增產(chǎn)物4h，利用回收試劑盒(Takara公司，中國)純化酶切產(chǎn)物。同時利用BamH I和Sac I酶在37°C下酶切pBI121載體4h，在16°C下利用T4連接酶連接產(chǎn)物過夜，在保證閱讀框正確的前提下將珠子參DS基因的編碼區(qū)克隆到植物表達載體PBI121上，將酶切鑒定好的表達載體PBI121-DS轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，遺傳轉(zhuǎn)化珠子參。
[0074]利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的珠人參的遺傳轉(zhuǎn)化，所需的材料和操作步驟如下:
[0075](I)發(fā)根農(nóng)桿菌A4，使用前自冰箱中取出，用YEB培養(yǎng)基傳代2次，菌種在使用前接種于YEB液體培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)過夜。
[0076](2)取珠子參細嫩葉片，洗凈后置于70%酒精中浸泡lmin，棄酒精，加入2%次氯酸鈉消毒lOmin，期間搖動數(shù)次，棄去消毒液，用無菌水漂洗4?5次，置于無菌濾紙上晾干，用無菌刀片將珠子參葉片切成5mmX5mm小片，置于預(yù)培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上，在(23±1)°C暗箱培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2d。
[0077](3)經(jīng)過夜培養(yǎng)的發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液離心后，菌體沉淀用1/2MS重懸，置于4°C中2h后取出。將預(yù)培養(yǎng)過的珠子參葉片浸泡于1/2MS重懸的菌液中5min，用無菌濾紙吸去多余菌液，放入含250-500mg/L卡那霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基中，(23±1) °C黑暗條件下培養(yǎng)，每2周轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中I次，待長出毛狀根后分離毛狀根，轉(zhuǎn)移至含250-500mg/L卡那霉素的無激素1/2MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2周轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中至無菌為止，然后再轉(zhuǎn)移至不含卡那霉素的無激素1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0078]轉(zhuǎn)基因株的篩選利用real-time PCR進行:
[0079]提取具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化珠子參植株的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，半定量所用引物為珠子參達瑪烯二醇合酶基因特異引物(正向引物5’ -ACAGCACGATGATTGG-3’;反向引物5’ -GGGTATGAGGGTAGTAGAG-3’)，反應(yīng)程序為94°C時3分鐘，94°C變性30秒，61°C退火30秒，72 °C延伸45秒，25個循環(huán)；循環(huán)完成后72°C延伸5分鐘。用珠子參的act in基因做為內(nèi)參基因，正向引物 5’ -GGAAAAGATTTGGCATC-3’，反向引物 5’ -GGGCGTAACCCTCATA-3，。對珠子參的野生型和轉(zhuǎn)化系在相同生長狀態(tài)下進行目的基因表達水平的分析。最終選擇相對于野生型植株，基因表達量的Fold-change值高于4倍以上(P〈0.01)的轉(zhuǎn)化植株作為陽性株進行后續(xù)的研究
[0080](4)把在固體培養(yǎng)基上的毛狀根繼代培養(yǎng)物接種于裝有150ml無激素1/2MS液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，培養(yǎng)溫度、光照、轉(zhuǎn)速等培養(yǎng)條件與愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)條件相同，培養(yǎng)25d后，將毛狀根從培養(yǎng)基中取出放入冷凍干燥機中進行干燥，然后稱重，貯存-80°C中備用。
[0081](5)過表達珠子參達瑪烯二醇基因的轉(zhuǎn)基因珠子參發(fā)根的達瑪烷型皂苷元含量的HPLC檢測
[0082]轉(zhuǎn)基因珠子參發(fā)根中達瑪烷型皂苷的含量的檢測可使用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，本發(fā)明具體采用以下步驟:
[0083]發(fā)根系樣品的前處理，用液氮將樣品研磨成粉末，各取0.1g放入茄形瓶中，加入4ml左右的甲醇，將裝有樣品的茄形瓶固定在蛇形冷凝管上，置于80°C的水浴鍋上，回流提取12h，將茄形瓶取出，吸出甲醇提取液，并用少量甲醇洗滌樣品粉末二至三次，一并轉(zhuǎn)入容量瓶中，定容至5ml，用0.45um有機系濾膜過濾后，即可用于HPLC進樣檢測。
[0084]采用美國Thermo Fisher公司液質(zhì)聯(lián)用儀(LCQ Fleet)的高效液相色譜儀,檢測轉(zhuǎn)基因發(fā)根中皂苷元原人參二醇(PPD)和原人參三醇(PPT)的含量，色譜柱為Hypersil0DS2C18柱(250nmX4.6mm，5um)，色譜條件如下:流動相為甲醇-水(90:10)流速1.0ml/min，柱溫25°C，檢測波長203nm。
[0085]以非轉(zhuǎn)基因珠子參發(fā)根系為對照，對照組和轉(zhuǎn)基因組均檢測10株，比較其達瑪烷型皂苷的平均含量。
[0086]檢測結(jié)果表明:與對照組相比，過表達珠子參達瑪烯二醇基因的轉(zhuǎn)基因珠子參中，原人參二醇皂苷(PPD)的含量平均提高了 2.3倍，原人參三醇皂苷(PPT)的含量提高了 3.6倍。
[0087]由此證明，珠子參達瑪烯二醇基因?qū)Υ龠M珠子參達瑪烷型皂苷含量的提高有顯著作用，珠子參達瑪烯二醇基因可用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高珠子參達瑪烷型皂苷含量的研究和產(chǎn)業(yè)化中，具有一定的應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1.一種分離的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其序列為SEQID N0.1所示。
4.含有權(quán)利要求2所述核苷酸序列的植物表達載體。
5.含有權(quán)利要求4所述植物表達載體的轉(zhuǎn)基因植株。
6.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述的基因在提高植物達瑪烷型皂苷含量中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述的基因在提高珠子參達瑪烷型皂苷含量中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述的基因在提高珠子參總皂苷含量中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/82GK104293755SQ201410476575
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】陳平, 張紹鵬, 楊濤, 朱聞君, 陳燕, 曾萬勇, 伍翀, 王如峰, 鄧琛, 陳超, 霍夢蕊 申請人:陳平, 張紹鵬, 楊濤, 朱聞君, 陳燕, 曾萬勇, 伍翀, 王如峰, 霍夢蕊, 鄧琛, 陳超