重組草魚IL-1β拮抗蛋白及其編碼基因、制備方法、用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組草魚IL-1β拮抗蛋白及相關技術。針對現(xiàn)有技術尚未公開過具有拮抗草魚白細胞介素1β活性的功能蛋白的相關技術，本發(fā)明首先提供了一種重組草魚IL-1β拮抗蛋白。該重組蛋白來自于通過構建表達重組草魚IL-1β拮抗蛋白成熟肽的表達質粒并將其轉入畢赤酵母菌中，篩選出可穩(wěn)定表達草魚IL-1β拮抗蛋白的轉化子，并通過誘導表達以及親和層析和分子篩層析得到。試驗證明該重組蛋白是草魚IL-1β活性抑制蛋白。本發(fā)明還提供了編碼上述重組蛋白的基因，編碼草魚IL-1β拮抗蛋白的基因全序列，編碼草魚IL-1β拮抗蛋白成熟肽的基因。本發(fā)明還公開了重組草魚IL-1β拮抗蛋白的制備方法，同時也提供了該重組蛋白在魚類抗炎藥物、免疫檢測中的應用及對應產品。
【專利說明】重組草魚IL-1 P拮抗蛋白及其編碼基因、制備方法、用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組蛋白，特別是涉及一種抑制草魚IL-10活性的重組蛋白，屬 于基因工程領域。

【背景技術】
[0002] 白細胞介素 I P (IL-1 P，Interleukin-1 P )是白細胞介素1細胞因子家族的成 員之一，是一種重要的炎癥介質和免疫因子，在機體的免疫應答中發(fā)揮著廣泛的調節(jié)作用， 如激活T細胞、B細胞和自然殺傷細胞的活性，刺激巨噬細胞分泌細胞因子和前列腺素等炎 癥介質，此外還可充當神經系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)間的傳導信號監(jiān)視生理失調和病原入侵。自從 利用同源克隆的方法從虹鱒中克隆出IL-IP基因的全長cDNA序列開始，IL-IP基因在魚 類中的研究開始受到重視。在魚類IL-I P的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-IP也具有明顯的免疫學活 性，可以活化淋巴細胞，提1?頭腎白細胞的吞噬、趨化活性，促進免疫相關基因的轉錄，提1? 抗體滴度，并且具有免疫佐劑的功能。IL-P是通過受體發(fā)揮作用的。抑制IL-IP與其受 體結合是降低其活性的一種有效方法。
[0003] 專利申請?zhí)枮?01010221742. 9、申請公布號為CN101892241A的中國發(fā)明專利申 請公開了一種草魚白細胞介素 I P (草魚IL-I P )基因和蛋白及其重組表達方法，具體提供 了草魚IL-I P基因及該基因編碼的草魚IL-I P蛋白。但現(xiàn)在技術中尚未公開過具有拮 抗草魚IL-I P活性的功能蛋白的相關技術。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是提供一種拮抗草魚（Ctenopharynodon idellus)白細胞介素 13 (IL-IP)活性的重組蛋白及其編碼基因、制備方法和用途。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種拮抗草魚IL-IP活性的重組蛋白，其技術 方案如下：
[0006] -種重組草魚IL-I 0拮抗蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No. 1所示。
[0007] 上述拮抗草魚IL-I 0活性的重組蛋白的氨基酸序列包括了具有拮抗草魚IL-I 3 活性的蛋白成熟肽的氨基酸序列以及表達質粒上含有的6個組氨酸標簽的部分氨基酸序 列。本發(fā)明將該抑制草魚IL-I P功能的重組蛋白命名為重組草魚IL-I P拮抗蛋白（重組 草魚白細胞介素 IP拮抗蛋白）。
[0008] 本發(fā)明重組草魚IL-I P拮抗蛋白來自于：通過構建表達重組草魚IL-I P拮抗蛋 白成熟肽的表達質粒并將其轉入畢赤酵母菌中，篩選出可穩(wěn)定表達草魚IL-I P拮抗蛋白 的轉化子，并通過誘導表達以及親和層析和分子篩層析得到高純度的重組草魚IL-I P拮 抗蛋白。
[0009] 本發(fā)明還提供上述重組草魚IL-I P拮抗蛋白的編碼基因，其技術方案如下：
[0010] 一種編碼上述Seq ID No. 1所示的重組蛋白的基因，其堿基序列如Seq ID No. 2 所示。
[0011] 上述編碼重組草魚IL-I 0拮抗蛋白的基因包括了編碼草魚IL-I 0拮抗蛋白成 熟肽的堿基序列和一段來源于表達質粒的包含6個組氨酸標簽的堿基序列。本發(fā)明將該 重組草魚IL-I P拮抗蛋白的編碼基因命名為重組草魚IL-I P拮抗基因。其中，編碼草魚 IL-I P拮抗蛋白成熟肽的基因的獲取是利用同源克隆及3'-和5'-RACE技術，從草魚中克 隆得到一種編碼草魚IL-I P拮抗蛋白的基因全序列（如Seq ID No. 3所示），再通過生物 信息學技術預測編碼草魚IL-I P拮抗蛋白成熟肽的基因（如Seq ID No. 4所示）。基于 此，本發(fā)明分別提供一種編碼草魚IL-I P拮抗蛋白的基因全序列與一種編碼草魚IL-I 3 拮抗蛋白成熟肽的基因，具體是：
[0012] 一種編碼草魚IL-I P拮抗蛋白的基因全序列，其堿基序列如Seq ID No. 3所示。
[0013] 一種編碼草魚IL-I P拮抗蛋白成熟肽的基因，其堿基序列如Seq ID No. 4所示。
[0014] 本發(fā)明進一步提供含有上述重組草魚IL-I 3拮抗蛋白編碼基因的重組表達載 體。
[0015] 上述重組表達載體為質粒，優(yōu)選為商品化酵母表達質粒，進一步優(yōu)選為pPICZa質 粒。該重組表達載體在多克隆區(qū)插入了編碼草魚IL-I P拮抗蛋白成熟肽的堿基序列。 [0016] 本發(fā)明進一步提供含有上述重組草魚IL-I P拮抗蛋白編碼序列的轉化子。
[0017] 上述轉化子的受體細胞為真核細胞，優(yōu)選為畢赤巴斯德酵母（Pichia.paSt 〇riS) GS115菌株。該轉化子包含草魚IL-I P拮抗蛋白編碼序列的表達質粒，在誘導條件下可以 大量穩(wěn)定表達重組草魚IL-I 3拮抗蛋白。
[0018] 本發(fā)明還提供上述重組草魚IL-I P拮抗蛋白的制備方法，包括重組蛋白基因的 克隆、重組蛋白成熟肽重組表達質粒的構建、畢赤酵母菌的轉化、陽性轉化菌的篩選、酵母 菌的誘導表達方法、重組蛋白的分離與純化方法、重組蛋白的生物活性鑒定等，其技術方案 如下：
[0019] 一種重組草魚IL-I P拮抗蛋白的制備方法，其特征在于：依如下步驟實施：
[0020] 步驟S1、合成編碼草魚IL-I P拮抗蛋白成熟肽的編碼基因，其堿基序列如Seq ID No. 4所示；
[0021] 步驟S2、將上述蛋白成熟肽編碼基因克隆到表達質粒上，得到重組表達載體；
[0022] 步驟S3、將重組表達載體轉化至宿主細胞畢赤巴斯德酵母（Pichia. pastoris)， 構建重組工程菌，經誘導表達后對獲得的總蛋白進行分離純化，獲得重組草魚IL-I 3拮抗 蛋白。
[0023] 本發(fā)明重組草魚IL-I 0拮抗蛋白能夠顯著抑制草魚頭腎淋巴細胞中草魚重 組IL-I 3所誘導的各種促炎癥因子的高表達且具有劑量依賴效應，具有抑制草魚重組 IL-I P功能的生物學活性?；诖耍景l(fā)明重組草魚IL-I P拮抗蛋白可以應用在在魚類， 特別是草魚抗炎癥藥物中。
[0024] 本發(fā)明同時提供利用重組草魚IL-I 0拮抗蛋白制成的多克隆抗體，其技術方案 如下：
[0025] -種多克隆抗體，其特征在于：利用本發(fā)明重組草魚IL-I 0拮抗蛋白制成。
[0026] 上述多克隆抗以本發(fā)明重組草魚IL-IP拮抗蛋白為抗原，采用領域內常規(guī)方法 即可制備得到。例如，以本發(fā)明所得重組草魚IL-I P拮抗蛋白為抗原，取新西蘭大白兔多 點多次免疫，免疫刺激完成后，取2?3ml耳緣靜脈靜脈血制備血清，采用用ELISA法檢測 抗體效價。取抗體效價最高的白兔內頸總動脈取血，血清經過濾器除去多余的脂肪后，采用 protein A親和柱進行親和純化即可得。
[0027] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：（1)提供了一種重組草魚IL-I P拮抗蛋 白及其制備方法，該重組蛋白是草魚IL-I P活性抑制蛋白。（2)提供了編碼草魚IL-I @拮 抗蛋白成熟肽的編碼基因序列。（3)提供了編碼重組草魚IL-I P拮抗蛋白的基因序列及包 含該基因序列的重組表達載體與轉化子。（4)提供了草魚IL-I P拮抗蛋白的編碼基因全序 列。（5)提供了該重組蛋白在魚類抗炎藥物、免疫檢測中的應用及對應產品。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1是實施例五所得重組蛋白的SDS-PAGE以及WB圖。
[0029] 圖2是重組草魚IL-I 0拮抗蛋白的功能鑒定圖。

【具體實施方式】
[0030] 下面結合實施例，對本發(fā)明的技術方案作進一步的描述。
[0031] 實施例一
[0032] 草魚白細胞介素 IP (草魚IL-1P)拮抗蛋白的編碼基因克隆。
[0033] 利用同源克隆技術根據保守序列中設計簡并引物IL-IRa F、IL_lRa R(表1)從草 魚頭腎免疫細胞組織中克隆得到具有抑制草魚IL-I P活性的蛋白的cDNA部分序列。
[0034] PCT反應體系如下：

【權利要求】
1. 一種重組草魚IL-Ιβ拮抗蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No. 1所示。
2. -種編碼權利要求1所述的重組蛋白的基因，其喊基序列如Seq ID No. 2所不。
3. -種編碼草魚IL-Ιβ拮抗蛋白的基因全序列，其堿基序列如Seq ID No. 3所示。
4. 一種編碼草魚IL-Ιβ拮抗蛋白成熟肽的編碼基因，其堿基序列如Seq ID No. 4所 /_J、1 ο
5. -種重組表達載體，其特征在于：是將權利要求4所述的基因克隆到表達載體上獲 得。
6. -種轉化子，其特征在于：是將權利要求5所述的重組表達載體轉化至受體細胞中 獲得。
7. 根據權利要求6所述的轉化子，其特征在于：所述受體細胞是畢赤巴斯德酵母 (Pichia. pastoris)〇
8. -種權利要求1所述的重組草魚IL-1 β拮抗蛋白的制備方法，其特征在于：依如下 步驟實施： 步驟S1、合成編碼草魚IL-Ιβ拮抗蛋白成熟肽的編碼基因，其堿基序列如Seq ID No. 4所示； 步驟S2、將上述蛋白成熟肽編碼基因克隆到原核表達載體pPICZa質粒上，得到重組表 達載體； 步驟S3、將重組表達載體轉化至宿主細胞畢赤巴斯德酵母（Pichia. pastoris)，構建 重組工程菌，經誘導表達后對獲得的總蛋白進行分離純化，獲得重組草魚IL-1 β拮抗蛋 白。
9. 一種多克隆抗體，其特征在于：利用權利要求1所述的重組草魚IL-1 β拮抗蛋白 制成。
10. 根據權利要求1所述的重組草魚IL-Ιβ拮抗蛋白在魚類抗炎癥藥物中的應用。
【文檔編號】C12N1/19GK104277119SQ201410492340
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月23日 優(yōu)先權日:2014年9月23日
【發(fā)明者】周紅, 楊瀟, 汪新艷, 張安英 申請人:電子科技大學