本發(fā)明涉及來自動物的抵抗物質(zhì)，具有涉及源于澤陸蛙的基因及其編碼的多于20個氨基酸的肽。

背景技術(shù)：
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抗菌肽是一類分子量小于1萬，由10-50個氨基酸組成的、具有殺滅或抑制微生物生長的活性多肽。最新研究表明：抗菌肽不但具有廣譜的抗微生物活性，同時具有“傳統(tǒng)抗生素”無法比擬的優(yōu)越性：如，除了可以直接殺滅微生物和很難誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生耐藥性外，還可以調(diào)節(jié)宿主的免疫功能、抑制炎癥反應(yīng)，間接地在感染性疾病治療中發(fā)揮作用(Nat Rev Microbiol,2012,10(4):243-254)。此外，在嚴(yán)重細(xì)菌感染時，抗菌肽還能夠中和內(nèi)毒素、減輕膿毒癥，在快速殺滅病原微生物的同時迅速停止或限制感染擴散(Antimicrob Agents Chemother,2014,58(9):5363-5371)。因此，抗菌肽有希望成為新一代抗微生物藥物。

目前，對多肽類抗微生物藥物的研制受到了日益廣泛的重視(Future Med Chem,2013，5(3)；315-337)。據(jù)國內(nèi)外文獻報道，截至目前，至少有20種從不同生物分離得到的活性多肽候選藥物進入了臨床試驗階段(Future Med Chem,2013,5(3):315-337)。如，Xoma公司研發(fā)的用于治療腦膜炎球菌血癥的孤兒藥Neuprex和Cutanea life science公司研發(fā)的用于治療紅斑痤瘡的Omiganan外用乳膏均進入三期臨床研究(Curt Protein Pept Sci,2012,13(7):611-619)；另外，Ellceutix公司研發(fā)的用于治療MRSA引起的皮膚感染藥物PMX-30063已經(jīng)進入開發(fā)臨床前研究(Expert Rev Anti Infect Ther,2014,12(12):1477-1486)。

很多兩棲類動物作為中國傳統(tǒng)中藥和民族藥物被廣泛應(yīng)用。如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)、大蹼鈴蟾(Bombina maxima)、黑斑蛙(Pelophylax nigromaculata)和澤蛙(Euphlyctis limnocharis)等。這些兩棲類動物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。已報道藥理活性有：抗微生物、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、局部麻醉、免疫調(diào)節(jié)、對心血管系統(tǒng)作用等(Dongwuxue Yanjiu,2015,36(4):183-222；Chem Rev.2015,115(4):1760-1846)?，F(xiàn)代研究表明，兩棲動物居住在陰暗潮濕細(xì)菌滋生的環(huán)境，容易受各種病原微生物感染。并且裸露的皮膚使其容易受到各種理化損害。在長期的進化過程中，兩棲動物在其皮膚內(nèi)形成了許多防御物質(zhì)，這些物質(zhì)包括抗菌肽、蛋白酶抑制劑、抗氧化多肽和凝集素樣多肽等以便抵御環(huán)境中的生物和理化損害。目前從2000多種兩棲動物的皮膚中鑒定了數(shù)千中防御多肽，并且其中有些多肽同時兼有幾種活性，如ranacyclin-B、KPHTI、HV-BBI、HJTI、hylaserpin S2、OGTI、PYR、PSKP-1、PSKP-2、BOTI、BVTI、BMTI、BPTI、pLR和BSTI等既是抗菌肽又是蛋白酶抑制劑；pleurain-A1，D1，E1，J1等既是抗氧化肽又是抗菌肽(Chem Rev.2015,115(4):1760-1846)。因此這些多功能肽是潛在的候選藥物分子。如從爪蟾(Xenopus laevis)皮膚分泌物獲得的活性多肽Magainin具廣譜抗微生物作用，同時具有抗腫瘤活性，在美國已獲準(zhǔn)作為廣譜抗菌藥物，其基因工程產(chǎn)品已經(jīng)作為抗菌藥物被microbiological biotech公司用于治療糖尿病人足部潰瘍(Curr Protein Pept Sci,2012,13(8):723-738.)。

中國博大的多物種生物資源是結(jié)構(gòu)多樣性小分子有機化合物的重要來源，其中一些生物活性物質(zhì)早已被中醫(yī)記載和采用。很多兩棲類動物作為中國傳統(tǒng)中藥和民族藥物而廣泛應(yīng)用。澤陸蛙(Fejervarya_limoncharis)是傳統(tǒng)中藥材，其全體有清熱解毒，健脾消積功效?？捎糜谥委煱b腫、疔癤、乳癰、小兒疳積、熱痢等多種病癥。但是由于澤陸蛙個體小和捕捉困難，目前對其皮膚藥理活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究在世界范圍內(nèi)還未見報道，其作為中藥療效的物質(zhì)基礎(chǔ)仍不為人們所知。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種源于澤陸蛙皮膚的基因，該基因編碼的多肽具有具有具有抗菌、抗H5N1型病毒和抗氧化的活性。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的方案如下：

一種源于成熟澤陸蛙皮膚的基因，該基因的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述基因中第118-216位核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述多肽為由33個氨基酸組成的環(huán)肽，其第二十七半胱氨酸和第三十三位半胱氨酸形成成分子內(nèi)二硫鍵，分子量為3385.78道爾頓，等電點9.481。

上述多肽具有抗菌、抗H5N1型流感病毒和抗氧化的活性可用于制備治療微生物感染性疾病的藥物和具有抗氧化作用的美容護膚藥物。

本發(fā)明所述基因中第118-216位核苷酸編碼的多肽具有結(jié)構(gòu)簡單、人工合成方便、活性強等優(yōu)點。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明所述多肽的色譜圖。

圖2為本發(fā)明所述多肽的色譜圖。

圖3為本發(fā)明所述多肽清除DPPH和ABTS自由基“量-效”關(guān)系曲線。

具體實施方式：

為了便于理解，先將下述實施例中所涉及的基因和多肽名稱作如下說明：

下述的澤陸蛙抗菌肽即為SEQ ID NO.4所示序列第118-216位核苷酸編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；下述澤陸蛙抗菌肽的編碼基因即為SEQ ID NO.4所示的源于成熟澤陸蛙皮膚的基因。

實施例1(基因克隆)

I、澤陸蛙皮膚總RNA提?。夯铙w澤陸蛙用水清洗干凈，放入液氮中速凍4h，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10m1總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國GIBCOBRL公司產(chǎn)品)，于20m1玻璃勻漿器中勻漿30min。加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，棄除沉淀。向上清中加入等體積的異丙醇，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底的沉淀物即為澤陸蛙皮膚總RNA。

II、澤陸蛙皮膚mRNA的純化：澤陸蛙皮膚mRNA分離純化采用美國PROMEGA公司的mRNA Isolation Systems試劑盒。具體如下：取澤陸蛙皮膚總RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10min，加人3μl Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30S，棄上清，加0.5×SSC 0.3m1，至磁力架吸附30S，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30sec，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.L ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30sec，將上清移至新的試管，再加入0.15m1DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30S，移上清至上述試管，則上清中為純化的澤陸蛙皮膚mRNA。加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異丙醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10min，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中得到澤陸蛙皮膚mRNA。

III、澤陸蛙皮膚cDNA文庫構(gòu)建：采用CLONTECH公司CreatorTM SMART TM cDNA Library Construction Kit質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒。

A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)：在0.5ml無菌的離心管加入1μl澤陸蛙皮膚mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去離子水使總體積達(dá)到5μl?；靹螂x心管中的試劑并以12000rpm離心15sec，72℃保溫2min。將離心管在冰上孵育2min。在離心管中加入以下試劑2.0μl 5×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶?；旌想x心管中試劑并以12000rpm離心15sec，在42℃保溫1h。將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。

B.采用長末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD-PCR)方法擴增第二鏈：95℃預(yù)熱PCR儀。將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage 2PCR緩沖、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進行反應(yīng)。在PCR儀中按以下程序擴增：95℃20sec，95℃5sec，68℃6min，22個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進行抽提。

C.PCR產(chǎn)物用PROMEGA公司的SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進行抽提回收，步驟如下：將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。重復(fù)步驟上述步驟。12000rpm離心5min。將離心純化柱置于新的離心管中。加入30μl超純水，在室溫下靜置5min。以12000rpm離心30sec，管底溶液即為所純化過的cDNA雙鏈。

D.酶切、連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：在微量離心管中加入1μl Takara pMD18-T載體、4μl澤陸蛙cDNA雙鏈溶液，全量為5μl。加入5μl的連接酶緩沖混合物。16℃反應(yīng)2h。全量(10μl)加入至100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min。42℃加熱90Sec后，再在冰中放置1分鐘。加入37℃孵育過的LB培養(yǎng)基890μl，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60min。取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)16h，形成單菌落。每個LB平皿用5m1LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30％甘油凍存。構(gòu)建的cDNA大約含1×10⁶個單獨克隆。

Ⅳ、澤陸蛙抗菌肽基因克隆篩選：擴增引物長度為25個核苷酸，其序列為5’ATGTTCACCTTGAAGAAATCCCTG 3’(SEQ ID NO.2)，PCR另一擴增引物為CLONTECH公司SMART^TMcDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列為5’ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3’(SEQ ID NO.3)。PCR反應(yīng)在如下條件下進行：94℃30sec，50℃45sec和72℃2.5min，35個循環(huán)。

首先滴定構(gòu)建的細(xì)菌cDNA文庫，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)菌濃度(大約5000個細(xì)菌/毫升和30個細(xì)菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μ1),37℃過夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細(xì)菌培養(yǎng)液，有16個樣品進行PCR鑒定，交叉陽性孔細(xì)菌樣品進入第二輪篩選。

Ⅴ、澤陸蛙抗菌肽基因序列測定和結(jié)果：提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測定核苷酸序列，使用儀器為美國Applied Biosystems 373A全自動核苷酸序列測定儀，測序引物為BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M和BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47，BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M序列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’(SEQ ID NO.5)，BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’(SEQ ID NO.6)?；驕y序結(jié)果自5’端至3’端序列如SEQ ID NO.4所示。

澤陸蛙抗菌肽基因核苷酸的序列表為：序列長度為219個堿基；序列類型：核酸；鏈數(shù)：單鏈；拓?fù)鋵W(xué)：直鏈狀；序列種類：cDNA；來源：澤陸蛙皮膚。

根據(jù)澤陸蛙抗菌肽的基因推斷編碼由功能的成熟活抗菌肽為第118-216位核苷酸，氨基酸序列為：GFSSLFKAGAKYLLKQVGKAGAQQLACKAANNC(見序列SEQ ID NO.1)

實施例2(澤陸蛙抗菌肽的制備)

Ⅰ、澤陸蛙抗菌肽的制備方法：根據(jù)澤陸蛙抗菌肽的基因推斷編碼有功能的成熟抗菌肽氨基酸序列后用自動多肽合成儀合成多肽。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。純化時A液體為0.05％TFA+2％CH₃CN，B液為0.05％TFA+90％CH₃CN，B液濃度梯度為15min內(nèi)28-43％，檢測波長為220nm，多肽出現(xiàn)在9.833分鐘。

Ⅱ、分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry,FAB-MS)，以甘油:間硝基芐醇:二甲亞砜(1:1:l，V:V:V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發(fā)射電壓為25Kv。

Ⅲ、純化的澤陸蛙抗菌肽用高效液相色譜(HPLC)方法鑒定其純度，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。

澤陸蛙抗菌肽是中國兩棲類動物澤陸蛙抗菌肽基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量3385.78道爾頓，等電點9.481，多肽全序列一級結(jié)構(gòu)為：GFSSLFKAGAKYLLKQVGKAGAQQL ACKAANNC，其第二十七半胱氨酸和第三十三位半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。

實施例3(澤陸蛙抗菌肽的活性實驗)

Ⅰ、抑制細(xì)菌生長能力測定

抗菌活性檢測采用杯碟法，細(xì)菌培養(yǎng)基為普通瓊脂培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)基為改良沙保氏(Sabousand)培養(yǎng)基分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底內(nèi)均勻攤布，凝固后，另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，分別在每皿中加入5m1菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離均勻放入已消毒的不銹鋼杯6個。第一個鋼杯加入0.1-0.3mg/ml濃度的待測化合物溶液0.l ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小。抑菌圈l0mm以上的作為最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)。細(xì)菌菌株來源于廣東省微生物研究所，此試驗重復(fù)四次，取平均值，結(jié)果如表1所示，合成的澤陸蛙抗菌肽能顯著的抑制細(xì)菌生長。

表1.澤陸蛙抗菌肽抑制細(xì)菌生長活性

Ⅱ、對五種不同H5N1假病毒的進入抑制能力測定

H5N1假病毒的制備與藥物處理：細(xì)胞用含10％小牛血清、1％谷氨酰胺、2％青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞以3x10⁵/ml密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2ml，37℃、5％CO₂培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞密度達(dá)到80％左右時，按照PEI轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟操作。在一支無菌小管中加入15μl PEI轉(zhuǎn)染試劑和200μl不含血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基，混勻室溫靜置5min。往PEI-DMEM混合液中加入3μg pNL4-3.luc.R-E-,1μg HA,1μg NA質(zhì)粒，混勻室溫靜置30min，以便形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞中，輕輕轉(zhuǎn)動六孔板，使其分布均勻。5％CO₂，37℃培養(yǎng)10h，將培養(yǎng)液更換成含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h，2000rpm離心5min收集細(xì)胞培養(yǎng)，含假病毒的上清液在96孔板中被稀釋到每孔1ng/p24濃度后分別與2倍稀釋到不同濃度的澤陸蛙抗菌肽和陽性對照藥物CL385319在37℃孵育30min。

假病毒進入的抑制作用檢測：1X10⁴個/孔MDCK細(xì)胞以接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h。將上述孵育好的假病毒混合液分別加入到含MDCK細(xì)胞的96孔板中在37℃繼續(xù)培養(yǎng)48h。吸走培養(yǎng)上清，用PBS洗兩次細(xì)胞，每孔加50μl裂解液，震蕩20min，待細(xì)胞裂解后吸取40μl裂解物到白板，加入熒光素酶顯色底物(Promega,Madison,WI,US)，在多功能酶標(biāo)儀(Genios Pro,Tecan,US)上檢測化學(xué)發(fā)光值，判斷藥物抑制病毒進入的活性?；衔镆种坡?％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100,其中E代表實驗組的化學(xué)發(fā)光值，P代表陽性也就是不加藥物只加病毒的化學(xué)發(fā)光值，N代表陰性對照組的化學(xué)發(fā)光值。化合物的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)作為化合物抗病毒活性的指標(biāo)，通過Calccusyn軟件計算得出。如表3所示，澤陸蛙抗菌肽對各種不同H5N1假病毒均有很好的抑制活性。

表2.澤陸蛙抗菌肽抗H5N1禽流感假病毒感染的抑制活性

Ⅲ、抗氧化能力測定

1)DPPH自由基清除能力的測定

利用DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)自由基清除率測定法研究抗氧化多肽。配制濃度為1×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。將2ml，0.1mM的DPPH無水乙醇溶液加入到含有2ml不同酶解樣品的潔凈試管中，混勻。室溫下放置30min后，于517nm處測定吸光度，吸光值越小，表明自由基清除能力越強。

清除率(％)＝【1-(A_i-A_j)/A₀】*100％

式中，A₀為2ml，0.1mM的DPPH無水乙醇溶液+2ml的樣品試劑，空白對照，A_i為2ml,0.1mM的DPPH無水乙醇溶液+2ml的樣品，A_j為2ml的無水乙醇+2ml的樣品。

2)ABTS自由基清除活性的測定

以去離子水將ABTS溶解，使ABTS濃度達(dá)到7mmol/L，加入過硫酸鉀，使過硫酸鉀的濃度為2.45nmol/L。之后將該溶液在室溫下置于暗處過夜12～16h。將生成的ABTS自由基溶液用磷酸緩沖液(PBS，0.2mol/L，pH 7.4)稀釋，使其在734nm下的吸光值為0.70。取0.1ml酶解液與2.9ml ABTS自由基液混合，搖勻30秒鐘，暗處反應(yīng)10分鐘，然后在734nm下測定反應(yīng)液的吸光值。以蒸餾水代替水解液作空白。

清除率(％)＝(A_i-A_j)/A₀*100％

式中，A₀為2.9ml ABTS試劑與0.1ml蒸餾水混合液的吸光值，A_j為2.9ml ABTS+0.1ml的酶解液混合液的吸光值。