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      一種預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法

      文檔序號:488518閱讀:307來源:國知局
      一種預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法
      【專利摘要】本發(fā)明為動物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域,涉及綿羊遺傳育種及分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)。一種預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法,包括:根據(jù)綿羊吲哚胺2,3-二氧化酶1(IDO1)基因序列設(shè)計一對引物;從綿羊血液中提取基因組DNA,利用上述引物INF和引物INR對綿羊的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增;PCR擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Nhe Ⅰ酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離,根據(jù)電泳分離結(jié)果進(jìn)行基因型判定;構(gòu)建基因型效應(yīng)統(tǒng)計模型;依據(jù)基因型將綿羊群體分為三種類型,選擇AA基因型個體進(jìn)行組群,完成綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記。本發(fā)明操作方便、經(jīng)濟實用、是一種更有效、準(zhǔn)確的綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法,可提高選種的準(zhǔn)確性。
      【專利說明】一種預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法

      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明屬于動物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域,屬于綿羊遺傳育種及分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù), 具體涉及綿羊一般抗病力遺傳標(biāo)記的篩選和應(yīng)用,特別是涉及一種預(yù)示綿羊一般抗病力的 分子標(biāo)記方法。

      【背景技術(shù)】
      [0002] 當(dāng)前,綿羊育種的主要目的是根據(jù)特定的育種目標(biāo),充分提升肉用、毛用等特定 的生產(chǎn)性能,以獲得最大的生產(chǎn)經(jīng)濟效益。隨著集約化飼養(yǎng)方式的普及,以及選育程度的 提高,對綿羊重要經(jīng)濟性狀施加選擇壓的加大,綿羊抗病力隨之降低,導(dǎo)致疾病發(fā)生率的增 力口,尤其是傳染性疾病。目前,對畜禽疾病的控制措施主要采用疫苗接種和抗生素類藥物治 療,然而,由于病菌類型繁多且變異較快,免疫接種、藥物治療、衛(wèi)生隔離等防治手段不能完 全有效控制疾病的流行,抗生素的濫用也會導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品攜帶大量殘留藥物,造成食品污 染,對人類的健康產(chǎn)生不良影響,嚴(yán)重影響現(xiàn)代畜牧業(yè)健康、可持續(xù)的發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計,由疾病 造成的經(jīng)濟損失約占畜牧業(yè)產(chǎn)值的12-15%,這一巨大的經(jīng)濟損失主要是由于綿羊死亡、生 產(chǎn)效率降低、醫(yī)藥費用增加、管理費用增加及產(chǎn)品損失造成的。因此,在培育高產(chǎn)綿羊品種 的同時,尋找一條安全可靠且經(jīng)濟可行的疾病防治控制途徑已是當(dāng)務(wù)之急。
      [0003] 疾病的發(fā)生一般是動物的遺傳背景與其環(huán)境之間相互作用的結(jié)果,若綿羊在遺傳 方面對某些疾病存在易感性,采用的治療方法可能不能完全治愈環(huán)境條件所引發(fā)的疾病。 在這種的情況下,抗病育種的作用就顯得尤為重要,針對綿羊的抗病力進(jìn)行選擇性育種已 成為一種更為有效的可取代常規(guī)治療的方法。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同品種、同品種不同個體之 間存在著抗病力的遺傳差異,這種遺傳差異是由遺傳變異引起的,從而構(gòu)成了機體對疾病 抗性選擇的遺傳基礎(chǔ)。因此,可以借助現(xiàn)代分子遺傳育種學(xué)方法針對綿羊抗病力進(jìn)行選擇, 以提高機體的免疫力和抗病力。
      [0004] 抗病力也受遺傳和環(huán)境的共同作用,抗病力根據(jù)遺傳基礎(chǔ)的不同可以分為一般抗 病力和特殊抗病力。一般抗病力不限于某一種病原體,它受多基因和環(huán)境共同的影響,病原 體的抗原性差異對一般抗病力的影響很小。特殊抗病力是指綿羊?qū)δ撤N特定疾病或病原體 的抗性,主要受一個主效基因控制,同時也可能不同程度的受其它基因位點(包括調(diào)控元 件)和環(huán)境因素的影響,特殊抗病力可以通過特殊病原體直接攻毒試驗進(jìn)行測定。由于一 般抗病力體現(xiàn)了機體對疾病的整體防御能力,是維持機體在不良環(huán)境中生存和生產(chǎn)的必要 條件,因此確定綿羊一般抗病力的遺傳標(biāo)記已成為培育具有一般抗病力綿羊的關(guān)鍵因素。 研究表明,提1?機體的整體免疫機能可以提1? 一般抗病力,因此,機體的固有免疫在提1? 一 般抗病力中就顯得尤為重要。
      [0005] 動物在長期的進(jìn)化過程中形成了比較完善的免疫系統(tǒng),以抵御外來病原微生物的 感染和侵襲,同時清除體內(nèi)衰老死亡的細(xì)胞,維持機體穩(wěn)定狀態(tài)。研究表明,免疫應(yīng)答可作 為抗病力的間接指標(biāo),免疫力強的個體表現(xiàn)出較強的抗病力,在明確免疫性狀遺傳特性的 基礎(chǔ)上進(jìn)行多向選育,有望培育出一般抗病力較強的綿羊品種(系)。細(xì)胞因子在機體免疫 應(yīng)答中發(fā)揮著重要的輔助作用,細(xì)胞因子的分泌水平是機體免疫應(yīng)答能力和一般抗病力的 重要標(biāo)志。研究表明,IFN-α和IFN-Y具有免疫調(diào)節(jié)和抗病毒、抗腫瘤的作用,在動物先 天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,能直接反映動物正常狀態(tài)下的免疫狀態(tài)。IgG是人和動物 血清中含量最高的免疫球蛋白,在動物體內(nèi)不僅含量高而且持續(xù)時間長,可發(fā)揮抗菌、抗病 毒、抗毒素等免疫學(xué)活性。IL-Iβ是單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子,參與免疫反應(yīng)與 炎癥反應(yīng)。IL-2是體內(nèi)最主要、最強的T細(xì)胞生長因子,是機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的核心物 質(zhì),在細(xì)胞及體液免疫中均有重要的調(diào)節(jié)作用,可促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖和分化,促進(jìn) 多種細(xì)胞因子及其受體的表達(dá)。IL-5能夠促進(jìn)B細(xì)胞增殖與分化,誘導(dǎo)IgA的合成。IL-6 能夠促進(jìn)IL-2及其受體的表達(dá),在免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)、造血調(diào)節(jié)中起重要作用。IL-8具 有趨化作用和炎癥反應(yīng)作用,趨化和激活中性粒細(xì)胞和趨化嗜堿性粒細(xì)胞。IL-IO是一個抗 炎性因子,參與機體天然免疫調(diào)節(jié),可以抑制巨噬細(xì)胞、Thl細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,促進(jìn)B細(xì)胞 增殖和抗體生成,促進(jìn)胸腺和肥大細(xì)胞增殖。IL-12協(xié)同IL-2促進(jìn)細(xì)胞毒T細(xì)胞(TC)、NK 和LaK細(xì)胞分化,誘導(dǎo)Thl細(xì)胞、抑制Th2細(xì)胞和促進(jìn)B細(xì)胞Ig產(chǎn)生,在細(xì)胞免疫和I型細(xì) 胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫中起作用。
      [0006] 卩引哚胺2, 3二氧化酶(indoleamine-2, 3_diogenase,ID0)是一種細(xì)胞內(nèi)含亞鐵 血紅素的酶,是肝臟以外唯一可催化色氨酸分子中吲哚環(huán)氧化裂解,是沿犬尿酸途徑分解 代謝的限速酶。近年來,研究發(fā)現(xiàn),IDO或其相關(guān)代謝產(chǎn)物的表達(dá)細(xì)胞主要分布于胸腺髓 質(zhì)和次級淋巴器官的T細(xì)胞區(qū),且都特異性地表達(dá)在巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)上。IDO廣泛表達(dá)于免疫系統(tǒng),包括胸腺、胎盤、消化道粘膜、眼前房、附睪等免疫 耐受或免疫特惠部位,特別在一些抑制性抗原遞呈細(xì)胞上表達(dá)上調(diào),如某些單核巨噬細(xì)胞 和樹突狀細(xì)胞(DC)的亞群。在移植免疫的研究中,IDO對T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì) 胞和樹突狀細(xì)胞均有免疫調(diào)節(jié)作用。IDO的表達(dá)可以降低機體的免疫應(yīng)答反應(yīng),保護細(xì)胞和 組織移植物,參與同種異體移植免疫耐受,在維持周邊免疫耐受、自身免疫性疾病、器官移 植、腫瘤免疫和妊娠免疫中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。
      [0007]IDO廣泛分布于人和其他哺乳類動物肝外組織,正常狀態(tài)下呈低水平表達(dá),在炎癥 或感染過程中,IDO的表達(dá)顯著增加。細(xì)胞因子Y-干擾素(IFN-Y)是最強的IDO表達(dá)誘 導(dǎo)物,腫瘤壞死因子a(TNF-α)、腫瘤壞死因子β(TNF-β)與脂多糖(LPS)也能在一定程 度上誘導(dǎo)IDO的產(chǎn)生。
      [0008] 目前,國內(nèi)外主要開展了人類IDO基因的多態(tài)性與疾病的抗性/易感性的相關(guān) 研究,證明IDO基因rs9657182位點與高加索人IFN-α誘導(dǎo)的抑郁癥有關(guān)。IDO基因 IVS3+562delC、IVS6+61G-A和IVS9+2431G-A位點突變不是導(dǎo)致伊朗人重復(fù)自發(fā)性流 產(chǎn)的原因。IDO基因的突變影響Treg功能,能誘發(fā)自身免疫性疾病。而對于IDO基因的多 態(tài)性與綿羊疾病的抗性/易感性的相關(guān)研究沒有報道。
      [0009]近年來,基因SNP檢測方法和相關(guān)儀器的研發(fā)進(jìn)展很快,已報道并建立了多種SNP檢測方法。Taqman方法是針對SNP位點變異設(shè)計特異性的探針,探針標(biāo)記成本較高,導(dǎo)致 檢測成本也較高。DHPLC技術(shù)和質(zhì)譜分析均需要用到高效液相色譜儀與質(zhì)譜儀,設(shè)備昂貴, 難以大規(guī)模應(yīng)用。單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)技術(shù)很難滿足自動化的需要,難以大規(guī)模應(yīng) 用。等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)目前已很少使用。DNA芯片由于高通量等優(yōu)點 在SNP檢測中得到大量應(yīng)用,但在進(jìn)行多位點同時檢測時條件難以控制、可重復(fù)性差,易出 現(xiàn)假陽性及假陰性結(jié)果。微測序作為一種基于陣列的突變分析,目前還面臨著如何降低假 陰性率和祀核苷酸序列組成的變異等關(guān)鍵問題。高溫連接酶檢測反應(yīng)(ligasedetection reaction,LDR)是近幾年的一種新型基因多態(tài)性檢測方法,結(jié)果可靠,但還需進(jìn)一步驗證。 SNaPshot法基于熒光標(biāo)記單堿基延伸原理的分型技術(shù),通常適用于10-30個SNP位點分析。 DNA測序法相對準(zhǔn)確,價格較貴。高分辨率熔解曲線法(HRM)是近幾年興起的SNP研究工具 該方法,無需設(shè)計探針,成本低,但結(jié)果準(zhǔn)確度較低。而限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)檢測 準(zhǔn)確性高,費用低,特別適合單位點的檢測。因此,本專利針對IDOl基因的多態(tài)性位點,建 立一種能準(zhǔn)確預(yù)測綿羊一般抗病力的PCR-RFLP分子標(biāo)記選擇方法。


      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種操作方便、經(jīng)濟實用、更為有效、準(zhǔn)確的綿羊一般抗病 力的分子標(biāo)記方法,為提高綿羊一般抗病力和免疫應(yīng)答能力提供了一種有效的分子標(biāo)記育 種手段,可輔助選育適應(yīng)性和抗病力強的優(yōu)質(zhì)種羊,加速育種進(jìn)程,提高選種的準(zhǔn)確性。 [0011] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
      [0012] 一種預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法,其特征主要包括以下步驟:
      [0013] (1)所述根據(jù)綿羊吲哚胺2, 3-二氧化酶I(IDOl)基因序列設(shè)計一對引物:
      [0014] INF: 5 ' -TGCTGCTGAATTTCTCCAGG-3 ' ;
      [0015] INR: 5 '-CACCTTGGATTGCCGGCTTGCAGGAATCATGATGTA@TAG-3 ' ;
      [0016] 為符合force-RFLP的檢測分析,根據(jù)限制性內(nèi)切酶NheI識別序列GCTAGC,在下 游引物INR中強制引入GC堿基突變,即IDOl基因編碼區(qū)1076和1077位的AA兩個堿基 突變?yōu)镚C堿基,引入的突變堿基以框表示,從而形成NheIforced-RFLP-PCR檢測分析。 IDOl基因外顯子9的引物INF如序列表中SEQIDNO: 1所示,引物INR如序列表中SEQID N0:2所示;
      [0017] (2)從綿羊血液中提取基因組DNA,利用上述引物INF和引物INR對綿羊的基因組 DNA進(jìn)行PCR擴增;
      [0018] (3)PCR擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NheI酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳 分離,根據(jù)電泳分離結(jié)果進(jìn)行基因型判定,基因型判定的標(biāo)準(zhǔn)為:電泳呈現(xiàn)一條帶,大小為 232bp,則綿羊IDOl基因編碼區(qū)1072位點發(fā)生突變,PCR產(chǎn)物不能被限制性內(nèi)切酶NheI 切開,將其命名為AA基因型;電泳呈現(xiàn)兩條帶,大小為232bp和191bp,則綿羊IDOl基因編 碼區(qū)1072位點處于雜合狀態(tài),PCR產(chǎn)物不能被限制性內(nèi)切酶NheI完全切開,將其命名為 AG基因型;電泳呈現(xiàn)一條帶,大小為191bp,則綿羊IDOl基因編碼區(qū)1072位點無突變,PCR 產(chǎn)物能被限制性內(nèi)切酶NheI完全切開,將其命名為于GG基因型;
      [0019] (4)根據(jù)實驗綿羊群體特點,構(gòu)建基因型效應(yīng)統(tǒng)計模型:Υ=μ+G+B+A+S+F+e,其 中μ為群體均值,G為基因型效應(yīng),B為品種效應(yīng),A為年齡效應(yīng),S為性別效應(yīng),F(xiàn)為場別 效應(yīng),e為隨機誤差;利用JMP4. 0統(tǒng)計軟件將基因型效應(yīng)與綿羊免疫指標(biāo)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分 析,并估計性狀的最小二乘均值,分析結(jié)果表明,IDOl基因編碼區(qū)1072位點突變引起的基 因型效應(yīng)與綿羊外周血中IFN-α、IL-2和IL-12水平極顯著相關(guān)(P〈0. 01);多重比較結(jié)果 表明,AA和AG基因型個體的IFN-α和IL-2水平均極顯著高于GG基因型個體,AA基因型 個體的IL-12水平極顯著高于AG和GG基因型個體;
      [0020] (5)依據(jù)基因型將綿羊群體分為三種類型,選擇AA基因型個體進(jìn)行組群,從而實 現(xiàn)綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記輔助育種,即完成綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法;
      [0021] 其中步驟⑵中PCR擴增條件為94 °C變性5min;94°C30sec,60°C30sec, 72°C30sec,35 個循環(huán);72°C延伸 5min;4°C保溫。
      [0022] 其中步驟(3)中限制性內(nèi)切酶NheI所識別的堿基序列為GCTAGC。
      [0023] 所述瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物,所使用的瓊脂糖凝膠濃度為2. 5% -3%。
      [0024] 本發(fā)明為從抗病育種方面提高綿羊一般抗病力和免疫應(yīng)答提供了有效的分子標(biāo) 記。
      [0025] 本發(fā)明的優(yōu)點體現(xiàn)在:
      [0026] (1)本發(fā)明為綿羊抗病育種工作的分子標(biāo)記輔助選擇提供了一個更加高效、準(zhǔn)確 的分子遺傳標(biāo)記,為提高綿羊一般抗病力提供了一種有效的分子標(biāo)記育種手段,用該遺傳 標(biāo)記對綿羊一般抗病力進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇,開展綿羊的抗病育種,提高綿羊的免疫應(yīng)答能 力,可以更加有效的減少綿羊遺傳性疾病的發(fā)生,降低諸多疾病的發(fā)病率,提高綿羊的環(huán)境 適應(yīng)性,增加放牧和舍飼養(yǎng)殖條件下的綿羊存活率。
      [0027] (2)使用1個變異位點作為標(biāo)記,應(yīng)用forcedPCR-RFLP為主要檢測方法,具有成 本低、實用性強、準(zhǔn)確性高、更易操作的優(yōu)點,為加速改善綿羊的抗病分子遺傳育種工作奠 定了基礎(chǔ),從而加快育種進(jìn)程。
      [0028] (3)本發(fā)明的檢測方法操作簡單,檢測費用低,準(zhǔn)確性高,并可以實現(xiàn)自動化的直 接檢測,本發(fā)明將在綿羊的抗病育種中發(fā)揮重要作用。

      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0029] 圖1為IDOl基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖;其中M為pUC19DNA/MspI(Hpa II)marker,C泳道為空白對照;1-7泳道為不同綿羊個體IDOl基因PCR產(chǎn)物。
      [0030] 圖2為IDOl基因PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI酶切,酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電 泳圖;其中M為pUC19DNA/MspI(HpaII)marker,第 1,3,7,9,12,15泳道為66基因型; 第4,8,10,14泳道為AG基因型;第2, 5,6,11,13,16泳道為AA基因型。

      【具體實施方式】
      [0031] 實施例:下面實施例對本發(fā)明做更詳細(xì)地描述:
      [0032] 一、綿羊IDOl基因第9外顯子變異位點的檢測分析
      [0033] 1、樣品采集
      [0034] 采用一次性注射器從綿羊頸靜脈抽取約ImL的血液,注入經(jīng)高壓滅菌并裝有約 2004 1^2%無菌EDTA(Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)抗凝劑的 1.5mL離心管 中,輕輕搖勻,記錄羊號,-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0035] 2、藥品和酶
      [0036] 三輕甲基氨基甲燒(Tris),SigmaChemicalsCo;Tris飽和酚、EDTA-Na2 北京鼎 國生物技術(shù)發(fā)展中心;蛋白酶K(ProteinaseK),MERCKCo;dNTP(dATP;dTTP;dCTP;dGTP)、 Taq酶(配套IOXTaqbuffer, 25mmol/LMg2+),大連寶生物公司;瓊脂糖(AgaroseH)、 pUC19DNA/Msp(HpaII)Marker,生工生物工程(上海)有限公司;限制性內(nèi)切酶NheI, Fermentas(MBI)公司。
      [0037] 3、主要儀器
      [0038] IcyclerPCR儀(Bio-Rad公司)、Gel2000 凝膠成像系統(tǒng)、UltrospeclOOO紫外分 光光度計、Sigma3K30高速冷凍離心機、Milli-Q超純水儀、Bio-Rad穩(wěn)壓電泳儀及配套電泳 槽。
      [0039] 4、引物的設(shè)計與合成
      [0040] 根據(jù)綿羊IDOl基因(GenBank登錄號:NM_001141953)第9外顯子序列以及限制 性內(nèi)切酶NheI識別序列GCTAGC,設(shè)計上游引物INF和下游引物INR,引物由生工生物工程 (上海)有限公司合成:
      [0041] INF: 5,-TGCTGCTGAATTTCTCCAGG-3,;
      [0042] INR: 5 ' -CACCTTGGATTGCCGGCTTGCAGGAATCATGATGTAGCTAG-3 '。
      [0043] 5、綿羊基因組DNA的小量提取
      [0044] 方法一:
      [0045] (1)取20μL抗凝血液,加入500μL血細(xì)胞裂解液,加入蛋白酶K至終濃度為 100-200μg/mL,混勻55°C消化12h,直至溶液中不再有粘稠的團塊。
      [0046] (2)將溶液冷卻至室溫,加入5MNaCl至終濃度I. 5M,混勻lOmin。加入等體積酚 /氯仿,反復(fù)顛倒離心管混勻lOmin。
      [0047] (3) 12,OOOrpm,室溫離心lOmin。取上清,加等體積氯仿混勻lOmin。
      [0048] (4) 12,OOOrpm,室溫離心lOmin。取上清2倍體積無水乙醇沉淀DNA。
      [0049] (5)將DNA挑出放到I. 5mL離心管中,用70%乙醇洗1次。
      [0050] (6) 7, 5OOrpm,室溫離心δη?η,棄上清。
      [0051] (7)將DNA干燥后溶于200μLTE中。
      [0052] 方法二:
      [0053] (1)將20μL全血加入裝有700μLIXSET的I. 5mL離心管中,輕輕混勻。
      [0054] (2)加入蛋白酶K(10mg/mL)至終濃度100-200μg/μL和10%的SDS至終濃度 0· 5%,55°C消化 12h。
      [0055] (3)待消化完全后,加入等體積的Tris飽和酚,來回顛倒,使其混勻。
      [0056] (4) 12,OOOrpm離心lOmin,用剪去尖端的吸頭將上層水相小心移入另一個離心管 中,棄去有機相。重復(fù)第三和第四步驟一次。
      [0057] (5)向水相中加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液(體積比為24 :23 :1),混合 lOmin。12,OOOrpm,離心IOmin,移出水相到另一個離心管。
      [0058] (6)向水相中加入等體積的氯仿、異戊醇混合液(23 :1),來回顛倒混合lOmin, 12,OOOrpm,離心lOmin,移出水相到另一個離心管。
      [0059] (7)向水相中加入1/10體積NaAc(3M,pH5. 2)和2倍體積的無水乙醇,來回顛倒, 沉淀DNA。
      [0060] (8)將DNA挑出放到I. 5mL離心管中,用70%乙醇洗1次。
      [0061] (9)7, 500rpm離心5min。小心倒掉管中乙醇,將倒置在濾紙上,讓乙醇流盡,置于 空氣中干燥。
      [0062] (10)加入200yL的TE,置50°C水浴中過夜溶解DNA。溶解后貯存于-20°C備用。
      [0063] 方法三:
      [0064] 根據(jù)生工生物工程(上海)有限公司的Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒說明書 (SK8252)或其他生物技術(shù)公司的基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。
      [0065] 6、PCR反應(yīng)
      [0066] (1)以綿羊基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴增,目的基因PCR產(chǎn)物大小為232bp。PCR 擴增產(chǎn)物中綿羊基因組序列如SEQ3所示。
      [0067] 25μL反應(yīng)體系中包含以下溶液或試劑:
      [0068] IOXPCRreactionbuffer 2. 5μL dNTPMixture(各 2. 5mM) 2. 0μL 引物INF(10μΜ) 0.5UL 引物INR(10μΜ) 0.5PL EX-Taq(5U/μL) 0. 25μL
      [0069] 去禺子水 18. 25μL 基因組DNA(50ng/uL) LOpL
      [0070] (2)將上述溶液混合并按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。
      [0071] MO變性5min;94°C3〇sec,6(TC3〇sec,72°C3Osec,35 個循環(huán);72°C延伸 5min。
      [0072] (3)反應(yīng)結(jié)束后,使用2 %瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物(5?10μL)進(jìn)行電泳檢測,電 泳結(jié)果見圖1。
      [0073] 7、IDOl基因的RFLP分析
      [0074] 應(yīng)用Fermentas(MBI)限制性內(nèi)切酶NheI進(jìn)行酶切,酶切體系為10μL,反應(yīng)體 系及條件如下:
      [0075] NheI內(nèi)切酶(IOU/μL) 0. 5μL IOXBufferTangoIpL PCR產(chǎn)物 5μL 加去離子水至 IOuL
      [0076] 將上述反應(yīng)液混勻,于37°C水域中消化3?5h,消化之后將全部反應(yīng)液進(jìn)行2. 5% 瓊脂糖凝膠電泳,檢測PCR產(chǎn)物酶切效果及片段多態(tài)性。
      [0077] 8、IDOl基因變異位點的分析
      [0078] IDOl基因232bp的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI酶切,經(jīng)2. 5 %瓊脂糖凝膠電 泳分離,檢測出IDOl基因外顯子中的C. 1072G>A的堿基轉(zhuǎn)換變異位點,根據(jù)酶切電泳圖譜 對不同基因型綿羊個體進(jìn)行命名,分別為AA基因型(232bp)、AG基因型(232bp和191bp) 和GG基因型(191bp)三種基因型(圖2)。
      [0079] 二、綿羊一般抗病力指標(biāo)的測定:
      [0080] 采集不同品種健康的343只10月齡羔羊前腔靜脈血2mL,其中薩??搜?2只 (26?,36早),多胎薩??搜?18只(36?,82早),哈薩克羊64只(25?,39早),湖羊 59只(13?,46早),多胎薩福克羊和哈薩克羊Fl雜交羔羊40只(以下簡稱薩哈Fl;7古, 33早)。常規(guī)方法分離血清,于2500r/min離心15min,取上清分裝。應(yīng)用綿羊IgG、IFN-a、 IFN-γ、IL-Iβ、IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10 和IL-12ELISA檢測試劑盒(上海藍(lán)基生 物科技有限公司,中國)進(jìn)行免疫應(yīng)答指標(biāo)測定,嚴(yán)格按照試劑盒說明書處理血清樣本,將 標(biāo)準(zhǔn)品做5個濃度稀釋梯度,在酶標(biāo)儀(Model550,美國Bio-Rad) 450nm波長處檢測吸光度 (0D值),然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清中IgG、IFN-α、IFNi、IL-Ιβ、IL-2、IL-5、IL-6、 IL-8、IL-10 和IL-12 的濃度。
      [0081] 三、綿羊IDOl基因第9外顯子多態(tài)性及其與一般抗病力指標(biāo)間的關(guān)系分析及抗性 標(biāo)記確定。
      [0082] 分別對薩??搜?、多胎薩??搜颉⒐_克羊、湖羊和薩哈Fl綿羊IDOl基因第9外 顯子PCR-RFLP帶型進(jìn)行統(tǒng)計分析,并進(jìn)行基因型頻率和等位基因頻率的計算(表1)。
      [0083] 表1綿羊IDOl基因C. 1072G>A位點的基因型頻率和基因頻率
      [0084]

      【權(quán)利要求】
      1. 一種預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法,其特征主要包括以下步驟: (1) 根據(jù)綿羊吲哚胺2, 3-二氧化酶1 (ID01)基因序列設(shè)計一對引物: INF:5' -TGCTGCTGAATTTCTCCAGG-3' ; INR:5, -CACCTTGGATTGCCGGCTTGCAGGAATCATGATGTAGCTAG-3,; (2) 從綿羊血液中提取基因組DNA,利用上述引物INF和引物INR對綿羊的基因組DNA 進(jìn)行PCR擴增; (3) PCR擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Nhe I酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分 離,根據(jù)電泳分離結(jié)果進(jìn)行基因型判定,基因型判定的標(biāo)準(zhǔn)為:電泳呈現(xiàn)一條帶,大小為 232bp,則綿羊ID01基因編碼區(qū)1072位點發(fā)生突變,PCR產(chǎn)物不能被限制性內(nèi)切酶Nhe I 切開,將其命名為AA基因型;電泳呈現(xiàn)兩條帶,大小為232bp和191bp,則綿羊ID01基因編 碼區(qū)1072位點處于雜合狀態(tài),PCR產(chǎn)物不能被限制性內(nèi)切酶Nhe I完全切開,將其命名為 AG基因型;電泳呈現(xiàn)一條帶,大小為191bp,則綿羊ID01基因編碼區(qū)1072位點無突變,PCR 產(chǎn)物能被限制性內(nèi)切酶Nhe I完全切開,將其命名為于GG基因型; (4) 根據(jù)實驗綿羊群體特點,構(gòu)建基因型效應(yīng)統(tǒng)計模型:Y= y+G+B+A+S+F+e,其中y 為群體均值,G為基因型效應(yīng),B為品種效應(yīng),A為年齡效應(yīng),S為性別效應(yīng),F(xiàn)為場別效應(yīng), e為隨機誤差;利用JMP4. 0統(tǒng)計軟件將基因型效應(yīng)與綿羊免疫指標(biāo)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,并 估計性狀的最小二乘均值,分析結(jié)果表明,ID01基因編碼區(qū)1072位點突變引起的基因型效 應(yīng)與綿羊外周血中IFN-a、IL-2和IL-12水平極顯著相關(guān)(P〈0.01);多重比較結(jié)果表明, AA和AG基因型個體的IFN- a和IL-2水平均極顯著高于GG基因型個體,AA基因型個體的 IL-12水平極顯著高于AG和GG基因型個體; (5) 依據(jù)基因型將綿羊群體分為三種類型,選擇AA基因型個體進(jìn)行組群,從而實現(xiàn)綿 羊一般抗病力的分子標(biāo)記輔助育種,即完成綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記。
      2. 如權(quán)利要求1所述的預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法,其特征在于其中步驟 (2)中 PCR擴增條件為 94°C變性 5min ;94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 30sec,35 個循環(huán);72°C 延伸5min ;4°C保溫。
      3. 如權(quán)利要求1或2所述的預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法,其特征在于其中步 驟⑶中限制性內(nèi)切酶Nhe I所識別的堿基序列為GCTAGC。
      4. 如權(quán)利要求1或2所述的預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法,其特征在于所述瓊 脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物,所使用的瓊脂糖凝膠濃度為2. 5%?3%。
      5. 如權(quán)利要求3所述的預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法,其特征在于所述瓊脂糖 凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物,所使用的瓊脂糖凝膠濃度為2. 5%?3%。
      【文檔編號】C12Q1/68GK104357548SQ201410498552
      【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月25日
      【發(fā)明者】楊華, 楊永林, 鐘發(fā)剛, 趙文娟, 康立超 申請人:新疆農(nóng)墾科學(xué)院
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