小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法，包括卵巢表面上皮細(xì)胞分離、早期傳代、中期傳代、晚期傳代幾個(gè)步驟，培養(yǎng)過(guò)程中的培養(yǎng)液依次采用選擇性完全培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基和部分性完全培養(yǎng)基，選擇性完全培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基均為包括胎牛血清、mEGF、以及胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉的DMEM/F12培養(yǎng)液，部分性完全培養(yǎng)基為不含mEGF的DMEM/F12培養(yǎng)液；選擇性完全培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、部分性完全培養(yǎng)基中胎牛血清的濃度依次增大，選擇性完全培養(yǎng)基中mEGF的濃度高于完全培養(yǎng)基中mEGF的濃度；本發(fā)明的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法，沒(méi)有轉(zhuǎn)入致癌基因或使用其它誘導(dǎo)因素、有效解決正常野生型小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化這一問(wèn)題。
【專利說(shuō)明】小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，尤其涉及一種小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn) 化培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病中，卵巢癌的病死率最高，其生存率僅為30 %。其主 要原因是卵巢癌的早期診斷率低，惡性程度高，易轉(zhuǎn)移，并且治療過(guò)程中易產(chǎn)生耐藥性。雖 然已有的研究表明大約80% -90%的卵巢癌起源于卵巢表面上皮細(xì)胞，但是對(duì)于卵巢表面 上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的病因及其病理學(xué)過(guò)程目前尚不清楚。為了更深入掌握上皮細(xì)胞性卵巢 癌的發(fā)生和病理學(xué)發(fā)展機(jī)制，需要了解卵巢表面上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的過(guò)程，并建立一個(gè)小 鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化的研究模型。
[0003] 雖然姚德生等人發(fā)表于《廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》2006年04期的論文"永生化正常 小鼠卵巢上皮細(xì)胞系的建立"，提供了一種分離和培養(yǎng)具有"永生化"特性的小鼠卵巢上皮 細(xì)胞（M0SEC)，但是其在論文中也指出，正常的卵巢上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)不穩(wěn)定、不宜傳 代，容易衰老停止分裂，因此該方法采用轉(zhuǎn)入溫度敏感抗原（TsAg)基因的CD1小鼠來(lái)進(jìn) 行M0SEC細(xì)胞的建立，也有相關(guān)文獻(xiàn)指出，TsAg基因?qū)τ?永生化"細(xì)胞的培養(yǎng)有決定性 的影響（P S Jat, C LCepko, R C Mulligan, and P A Sharp, Recombinant retroviruses encoding simian virus 401arge T antigen and polyomavirus large and middle T antigens. Mol Cell Biol. Apr 1986;6 (4): 1204 - 1217.)，2002 年，ARAKI Y等人利用 同樣的轉(zhuǎn)入TsAg基因小鼠培養(yǎng)出"永生化的附睪細(xì)胞系"（ARAKI Y，et al. Journal of Andrology, 2002, 23 (6) : 854-869)。雖然TsAg基因沒(méi)有致癌性，但是畢竟轉(zhuǎn)入TsAg基因的 CD1小鼠不屬于野生型的小鼠，對(duì)于卵巢表面上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的病因及其病理學(xué)過(guò)程的 研究有一定影響?，F(xiàn)有技術(shù)中缺乏有效的手段，解決正常野生型小鼠的卵巢表面上皮細(xì)胞 體外惡性轉(zhuǎn)化這一問(wèn)題。
[0004] 除此之外，現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于小鼠卵巢上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法，與野生型的小 鼠卵巢上皮細(xì)胞也有所不同，例如姚德生等人分離培養(yǎng)的M0SEC細(xì)胞，其通過(guò)免疫組化反 應(yīng)檢驗(yàn)為CK-19陽(yáng)性、Vimentin陰性，而正常情況下M0SEC是一類包被卵巢表面的單層立 方-長(zhǎng)方形的上皮-間質(zhì)雙性細(xì)胞，其隨著排卵而周期性破潰增殖，對(duì)排卵過(guò)程中卵巢表面 破潰及排卵后卵巢表面修復(fù)具有重要作用（NELLY AUERSPERG et al. Endocrine Reviews 2001，22(2) :255 - 288 ;NUZHATAHMED et al. Cell. Physiol. 2007(213) :581 - 588)，因而既 表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物上皮細(xì)胞標(biāo)志物角化蛋白（keratin)(如keratin7, 8, 18,及19),又持 續(xù)表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin)、N-cadherin及a -平滑肌蛋白，理論上M0SEC 細(xì)胞免疫組化反應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果為Vimentin陽(yáng)性。另外，1984年Nishita等人將二甲基苯蒽 (DMBA)涂抹于大鼠卵巢表面并縫合，以用于卵巢癌的模型建立，36周后，近50%動(dòng)物出現(xiàn) 卵巢腫瘤，但DMBA同時(shí)誘導(dǎo)了輸卵管、子宮內(nèi)膜及子宮頸腫瘤。由此，DMBA誘導(dǎo)的卵巢癌 模型不具有特異性，尚不可確定卵巢癌為原位癌，存在諸多缺陷。
[0005] 有鑒于上述的缺陷，本設(shè)計(jì)人，積極加以研究創(chuàng)新，開(kāi)發(fā)出一種小鼠卵巢表面上皮 細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種沒(méi)有轉(zhuǎn)入致癌基因、獲得永生化 特性的TsAg基因或使用其它誘導(dǎo)因素，有效解決正常野生型小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外 惡性轉(zhuǎn)化這一問(wèn)題的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法。
[0007] 本發(fā)明的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0008] 1)卵巢表面上皮細(xì)胞分離：取6-8周齡未生育過(guò)的健康雌性C57BL/6小鼠的卵 巢，沖洗并剝離殘留的輸卵管、脂肪組織及卵巢被膜后，利用胰酶消化分離其卵巢表面上皮 細(xì)胞，然后加入完全培養(yǎng)基以終止胰酶消化過(guò)程，離心棄上清液后再次加入選擇性完全培 養(yǎng)基并移入培養(yǎng)皿中在培養(yǎng)箱中孵育，孵育第2天避免移動(dòng)培養(yǎng)皿，孵育第3天根據(jù)細(xì)胞生 長(zhǎng)情況采用半量換液法更換培養(yǎng)液，當(dāng)卵巢表面上皮細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，使用免疫熒光法 檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志物角化蛋白（Pan-keratin)的表達(dá)，當(dāng)其陽(yáng)性率達(dá)95%以上且鵝卵石樣 立方上皮細(xì)胞達(dá)80-85%以上時(shí)，進(jìn)行下一步驟；
[0009] 2)早期傳代：接種代數(shù)小于15代的卵巢表面上皮細(xì)胞，使用半量換液法按2 :3至 3 :2比例傳代，傳代時(shí)間間隔5-7天，培養(yǎng)液采用選擇性完全培養(yǎng)基；
[0010] 3)中期傳代：接種代數(shù)在16至84代之間的卵巢表面上皮細(xì)胞，16-60代按1 :2至 1:4比例傳代，60代后按1 :5至1 :8比例傳代，傳代時(shí)間間隔為3-5天，培養(yǎng)液采用完全培 養(yǎng)基；
[0011] 4)晚期傳代：接種代數(shù)大于85的卵巢表面上皮細(xì)胞，按1 :8至1 :10比例傳代，傳 代時(shí)間間隔為3-5天，培養(yǎng)液采用部分性完全培養(yǎng)基。
[0012] 所述選擇性完全培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基均為包括胎牛血清（FBS)、mEGF、以及胰島 素 -轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉（Insulin-Transferrin-Selenium)的DMEM/F12培養(yǎng)液，所述部 分性完全培養(yǎng)基為包括胎牛血清、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉且不含mEGF的DMEM/F12 培養(yǎng)液；所述選擇性完全培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、部分性完全培養(yǎng)基中胎牛血清的濃度依次增 大，所述選擇性完全培養(yǎng)基中mEGF的濃度高于完全培養(yǎng)基中mEGF的濃度。
[0013] 進(jìn)一步的，接種代數(shù)在15代之前的卵巢表面上皮細(xì)胞，每次傳代時(shí)使用胰酶溶液 的消化時(shí)間為30-45s，所述胰酶溶液中胰酶濃度為0. 1%且不含EDTA。
[0014] 進(jìn)一步的，所述選擇性完全培養(yǎng)基為包括3-4 %胎牛血清（FBS)、1-1. 2 %青霉 素-鏈霉素（Penicillin-Streptomycin)、8_10ng/ml mEGF、1-1. 2%膜島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞 硒酸鈉（Insulin-Transferrin-Selenium)的 DMEM/F12 培養(yǎng)液。
[0015] 進(jìn)一步的，所述完全培養(yǎng)基為包括6-8%胎牛血清（FBS)、1-1. 2%青霉素-鏈霉 素（Penicillin-Streptomycin)、2_4ng/ml mEGF、1-1. 2 %膜島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉 (Insulin-Transferrin-Selenium)的 DMEM/F12 培養(yǎng)液。
[0016] 進(jìn)一步的，所述部分性完全培養(yǎng)基為包括8-10 %胎牛血清（FBS)、1-1. 2 %青 霉素-鏈霉素（Penicillin-Streptomycin)、1-1. 2%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉 (Insulin-Transferrin-Selenium)的 DMEM/F12 培養(yǎng)液。
[0017] 進(jìn)一步的，所述卵巢表面上皮細(xì)胞分離步驟完成后,進(jìn)行免疫熒光鑒定和/或免 疫組化鑒定之后，當(dāng)鑒定結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)后進(jìn)行早期傳代步驟。
[0018] 進(jìn)一步的，所述免疫熒光鑒定包括以下步驟：
[0019] 1)第2代的卵巢表面上皮細(xì)胞用胰酶消化、接種后孵育，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)， 棄培養(yǎng)基后漂洗，隨后使用固定液固定細(xì)胞、以及封閉液封閉處理；
[0020] 2)加入一抗抗角化蛋白（pan anti-cytokeratin)處理一段時(shí)間后漂洗，加入二 抗山羊抗小鼠IgG處理一段時(shí)間后漂洗，加入DAPI染色一段時(shí)間后漂洗，隨后采用用抗淬 滅劑封固；
[0021] 3)顯微鏡下觀察，計(jì)算細(xì)胞陽(yáng)性率。
[0022] 進(jìn)一步的，所述免疫組化鑒定包括以下步驟：
[0023] 1)同批次的未處理過(guò)的完整小鼠卵巢和用胰酶消化過(guò)的小鼠卵巢分別放到甲醛 中過(guò)夜；
[0024] 2)用石蠟包被卵巢后切成組織切片，隨后置于檸檬酸鈉緩沖液中煮沸處理后漂 洗；
[0025] 3)滴加正常山羊血清封閉液處理一段時(shí)間后甩去多余液體，隨后滴加一抗抗角化 蛋白（pan anti-cytokeratin)處理一段時(shí)間后漂洗，滴加二抗山羊抗小鼠IgG處理一段時(shí) 間后漂洗；
[0026] 4)經(jīng)過(guò)DAB顯色處理、蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分化、PBS漂洗、脫水、透明、封片處理 后，顯微鏡下鑒定。
[0027] 借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)通過(guò)調(diào)節(jié)M0SEC生長(zhǎng)關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 血清及mEGF的濃度而純化原代M0SEC，實(shí)現(xiàn)連續(xù)增殖傳代，解決了 "C57BL/6健康小鼠卵 巢表面上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)生長(zhǎng)極慢，不易培養(yǎng)，生長(zhǎng)不穩(wěn)定，傳代到約20代時(shí)，常常發(fā)生 老化，停止分裂"這一難題；2)本發(fā)明未采用任何致突變或致癌物、也未誘導(dǎo)永生化而轉(zhuǎn)入 TsAg基因或致癌基因建立了 M0SEC惡性轉(zhuǎn)化模型，是一種無(wú)毒性的無(wú)外來(lái)因素誘導(dǎo)的自發(fā) 惡性轉(zhuǎn)化模型，一次實(shí)驗(yàn)使用5-6只小鼠即可獲得較高純度及數(shù)量的M0SEC細(xì)胞；3)為更 深入了解上皮細(xì)胞性卵巢癌的發(fā)生和病理學(xué)發(fā)展機(jī)制，提供了一種新的卵巢癌實(shí)驗(yàn)研究模 型，建立了一個(gè)小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)惡性轉(zhuǎn)化模型，為卵巢癌早期診斷標(biāo) 志物篩選及預(yù)防卵巢癌發(fā)生發(fā)展提供了解決方案。
[0028] 上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1為本發(fā)明的原代小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞標(biāo)志物Pan-keratin、DAPI及其相結(jié) 合的鑒定不意圖；
[0030] 圖2為本發(fā)明小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法中胎牛血清與mEGF 濃度對(duì)細(xì)胞純化的影響；
[0031] 圖3為本發(fā)明中早期傳代的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞示意圖及其放大后的示意圖；
[0032] 圖4為本發(fā)明中中期傳代的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞示意圖及其放大后的示意圖；
[0033] 圖5為本發(fā)明中晚期傳代的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞示意圖及其放大后的示意圖；
[0034] 圖6為本發(fā)明中早期、中期、晚期傳代的M0SEC生長(zhǎng)曲線示意圖；
[0035] 圖7為本發(fā)明的晚期傳代的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化灶示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施 例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0037] 實(shí)施例一
[0038]本發(fā)明一較佳實(shí)施例所述的一種小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法， 包括以下步驟
[0039] 1)卵巢表面上皮細(xì)胞分離：在超凈臺(tái)下，取4-6只6-8周齡未生育過(guò)的健康雌性 〇578176小鼠的卵巢，放置在含400幾/1111青霉素-鏈霉素、1-2%胎牛血清$85)的緩沖 液（PBS) (1000ml 雙蒸水，NaCl 8. 0g，KC1 0? 2g，Na2HP04 ? 12H20 3. 48g，KH2P040. 2g，PH 為7. 4)緩沖液中；然后用上述無(wú)菌的胎牛血清（FBS)的緩沖液輕輕沖洗卵巢3次，剝離殘 留的輸卵管、脂肪組織及卵巢被膜，將剝離后的卵巢放置在裝有胰酶（0.25%胰酶+EDTA， 37°C預(yù)熱）的1.5ml EP管中，在37°C含有5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中消化，為使卵巢表面充分 接觸胰酶，應(yīng)盡量使卵巢分離開(kāi)來(lái)；30min后，從培養(yǎng)箱中取出1. 5ml EP管，上下?lián)u動(dòng)10次 左右，取出卵巢并將其轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝有胰酶（0. 25%胰酶+EDTA)的1. 5ml EP管中進(jìn)行第 二次消化，在原1. 5ml EP管中加入完全培養(yǎng)基（6-8%胎牛血清（FBS)、1-1. 2%青霉素-鏈 霉素（Penicillin-Streptomycin)、2_4ng/ml mEGF、1-1.2% 膜島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸 鈉（Insulin-Transferrin-Selenium))終止消化，將包含有上皮細(xì)胞的液體離心（1000r/ min，5min)，棄上層液，加入lml選擇性完全培養(yǎng)基（包括3-4 %胎牛血清、1-1. 2 %青霉 素-鏈霉素、8-10ng/ml mEGF、l-l. 2%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉的DMEM/F12培養(yǎng)液） 緩慢吹打6-10次，收集含小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞的懸液，移入35mm培養(yǎng)皿，在37°C含有 5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中孵育。第二次消化的步驟與第一次相同，通過(guò)多次消化取得卵巢表 面上皮細(xì)胞，一方面能保持卵巢的形態(tài)，防止因失去被膜而松散的卵巢在消化過(guò)程中發(fā)生 碎裂，分離出卵巢內(nèi)部的間質(zhì)等雜質(zhì)細(xì)胞，另一方面簡(jiǎn)化操作的難度，使M0SEC分離相對(duì)簡(jiǎn) 便。
[0040]孵育第2天避免移動(dòng)培養(yǎng)皿，利于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，同時(shí)能夠維持細(xì)胞周?chē)奈h(huán) 境穩(wěn)定，孵育第3天根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況采用半量換液法更換培養(yǎng)液，當(dāng)卵巢表面上皮細(xì)胞 密度達(dá)80-85%時(shí)，使用免疫熒光法檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志物Pan-keratin的表達(dá)，當(dāng)其陽(yáng)性率 達(dá)95%以上且鵝卵石樣立方上皮細(xì)胞達(dá)80%以上時(shí)，進(jìn)行下一步驟；小鼠卵巢表面上皮細(xì) 胞是一類既表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物Pan-keratin,又表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin的細(xì)胞， 采用Pan-keratin、DAPI及其相結(jié)合的免疫熒光鑒定，其結(jié)果參見(jiàn)圖1 ;
[0041] 2)早期傳代：接種代數(shù)小于15代的卵巢表面上皮細(xì)胞，使用半量換液法按2 :3至 3 :2比例傳代，傳代時(shí)間間隔5-7天，培養(yǎng)液采用選擇性完全培養(yǎng)基，傳代第2天均盡量避 免移動(dòng)培養(yǎng)皿，利于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，同時(shí)能夠維持細(xì)胞周?chē)奈h(huán)境穩(wěn)定；此時(shí)卵巢表面上 皮細(xì)胞形態(tài)多為立方樣上皮細(xì)胞，細(xì)胞核呈規(guī)則橢圓形，細(xì)胞的染色體數(shù)目多為40條，早 期傳代后的卵巢表面上皮細(xì)胞其效果如圖3所示；
[0042] 3)中期傳代：接種代數(shù)在16至84代之間的卵巢表面上皮細(xì)胞，使用全部換液的 方式60代之前按1 :2比例傳代，60代后按1 :5至1 :8比例傳代，傳代時(shí)間間隔為3-5天， 培養(yǎng)液采用完全培養(yǎng)基；此時(shí)，卵巢表面上皮細(xì)胞形態(tài)為立方形與細(xì)長(zhǎng)梭形細(xì)胞夾雜存在， 出現(xiàn)較多多核細(xì)胞，核仁增多，細(xì)胞的染色體數(shù)目多為二倍體或三倍體，平板克隆形成能力 明顯提高，但是還沒(méi)有軟瓊脂克隆形成能力；中期傳代后的卵巢表面上皮細(xì)胞其效果如圖 4所示；
[0043] 4)晚期傳代：接種代數(shù)大于85的卵巢表面上皮細(xì)胞，使用全部換液的方式按1 : 10比例傳代，傳代時(shí)間間隔為3-5天，培養(yǎng)液采用部分性完全培養(yǎng)基，此時(shí)，卵巢表面上皮 細(xì)胞形態(tài)多呈細(xì)長(zhǎng)梭形，細(xì)胞的染色體數(shù)目多為超四倍體，具有軟瓊脂克隆形成能力；晚期 傳代后的卵巢表面上皮細(xì)胞其效果如圖5所示。
[0044] 選擇性完全培養(yǎng)基為包括3-4%胎牛血清、1-1. 2%青霉素-鏈霉素、8-10ng/ 111111￡6?、1-1.2%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉的01^11/^12培養(yǎng)液 ；完全培養(yǎng)基為包括 6-8%胎牛血清、1-1.2%青霉素-鏈霉素、2-4叩/111111￡6?、1-1.2%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒 酸鈉的DMEM/F12培養(yǎng)液；部分性完全培養(yǎng)基為包括8-10%胎牛血清、1-1. 2%青霉素-鏈 霉素、1-1. 2%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉的DMEM/F12培養(yǎng)液；選擇性完全培養(yǎng)基、完全 培養(yǎng)基、部分性完全培養(yǎng)基中胎牛血清的濃度依次增大，選擇性完全培養(yǎng)基中mEGF的濃度 高于完全培養(yǎng)基中mEGF的濃度。
[0045] 上述步驟中，選擇C57BL/6小鼠是由于其為近交系小鼠，近交系小鼠的特征是：基 因位點(diǎn)的純合性、遺傳組成的同源性、表型一致性、長(zhǎng)期遺傳穩(wěn)定性、遺傳特征的可分辨性 及遺傳組成的獨(dú)特性等，即具有相同的遺傳組成和遺傳特性；區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的CD1小鼠， 體現(xiàn)在：1)CD1小鼠是美國(guó)二個(gè)研究所從遠(yuǎn)交系ICR小鼠中培育出的小鼠，遠(yuǎn)交系小鼠的特 征是：遺傳組成具有很高的雜合性、攜帶大量的隱性有害基因、具有較強(qiáng)的繁殖力和生產(chǎn)成 本低等，即具有遺傳異質(zhì)性；2)從轉(zhuǎn)入TsAg基因的CD1小鼠中分離的細(xì)胞具有永生化細(xì)胞 的特征，即可獲得長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)和傳代。
[0046] 上述步驟中，培養(yǎng)液選用DMEM/F12而非通常使用的DMEM或a-MEM培養(yǎng)基，是由 于其含有特定的氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽及其它成分。對(duì)比〇1^11^12、01^11及〇-|^11三種 培養(yǎng)基成分，結(jié)果顯示DMEM/F12其氨基酸種類中多加入L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半 胱氨酸、L-脯氨酸，維生素中多加入維生素B12,無(wú)機(jī)鹽中多加入硫酸根、銅、鐵、鋅的成分， 并且加入了次黃嘌呤、亞油酸、硫辛酸、腐胺及胸腺嘧啶脫氧核苷等DMEM及a -MEM中未添 加的成分，且所含的相同營(yíng)養(yǎng)素成分的比例也是不同的，如氯化膽堿、泛酸鈣、煙酰胺及維 生素B6不再是簡(jiǎn)單的1:1:1:1比例，進(jìn)行了細(xì)微的調(diào)整；這些成分的添加一方面保證了 M0SEC能夠長(zhǎng)期生長(zhǎng)，另一方面防止上皮細(xì)胞老化；若使用含3-4% FBS，8-10ng/ml mEGF， 1-1. 2 %胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉-A的DMEM選擇性完全培養(yǎng)基，長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中MOSEC 細(xì)胞沒(méi)有生存下來(lái)，即使在晚期M0SEC已發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，使用DMEM培養(yǎng)基配制的部分性完 全培養(yǎng)基或DMEM完全培養(yǎng)基，細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生改變，不能保持增殖狀態(tài)。
[0047] 經(jīng)過(guò)上述方法培養(yǎng)獲得的惡性轉(zhuǎn)化小鼠卵巢上皮細(xì)胞（M0SEC)，其實(shí)現(xiàn)了連續(xù)傳 代，且在體外惡性轉(zhuǎn)化，其生長(zhǎng)特性曲線如圖6所示，其晚期細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶較為明顯，參見(jiàn)圖 7,其中圖7A為早期M0SEC細(xì)胞，圖7B為中期M0SEC細(xì)胞，圖7C為晚期M0SEC細(xì)胞。其早 期、中期及晚期M0SEC染色體核型分析如表1所示。應(yīng)當(dāng)指出的是，與現(xiàn)有技術(shù)的"永生化" 不同，"惡性轉(zhuǎn)化"不僅具有無(wú)限增殖能力，還能在軟瓊脂上形成克?。ㄥ^著獨(dú)立性生長(zhǎng)）， 也能在裸鼠皮下成瘤。使用早期、中期、晚期M0SEC細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)早 期細(xì)胞接種裸鼠沒(méi)有形成腫塊，中期細(xì)胞雖然形成腫塊但是病理診斷為非典型性增生，在 腫塊組織中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，而晚期細(xì)胞接種裸鼠形成較大的腫塊，病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)許多 腫瘤細(xì)胞，晚期MOSEC細(xì)胞的成瘤率可達(dá)80%，具體對(duì)比數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表2。
[0048] 表1早期、中期及晚期M0SEC染色體核型分析
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 卵巢表面上皮細(xì)胞分離：取6-8周齡未生育過(guò)的健康雌性C57BL/6小鼠的卵巢，沖 洗并剝離殘留的輸卵管、脂肪組織及卵巢被膜后，利用胰酶消化分離其卵巢表面上皮細(xì)胞， 然后加入完全培養(yǎng)基以終止胰酶消化過(guò)程，離心棄上清液后再次加入選擇性完全培養(yǎng)基 并移入培養(yǎng)皿中在培養(yǎng)箱中孵育，孵育第2天避免移動(dòng)培養(yǎng)皿，孵育第3天根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng) 情況采用半量換液法更換培養(yǎng)液，當(dāng)卵巢表面上皮細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，使用免疫熒光法檢 測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志物角化蛋白的表達(dá)，當(dāng)其陽(yáng)性率達(dá)95%以上且鵝卵石樣立方上皮細(xì)胞達(dá) 80-85%以上時(shí)，進(jìn)行下一步驟； 2) 早期傳代：接種代數(shù)小于15代的卵巢表面上皮細(xì)胞，使用半量換液法按2 :3至3 :2 比例傳代，傳代時(shí)間間隔5-7天，培養(yǎng)液采用選擇性完全培養(yǎng)基； 3) 中期傳代：接種代數(shù)在16至84代之間的卵巢表面上皮細(xì)胞，16-60代按1 :2至1:4 比例傳代，60代后按1 :5至1 :8比例傳代，傳代時(shí)間間隔為3-5天，培養(yǎng)液采用完全培養(yǎng) 基； 4) 晚期傳代：接種代數(shù)大于85的卵巢表面上皮細(xì)胞，按1 :8至1 :10比例傳代，傳代時(shí) 間間隔為3-5天，培養(yǎng)液采用部分性完全培養(yǎng)基。 所述選擇性完全培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基均為包括胎牛血清、mEGF、以及胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋 白-亞硒酸鈉的DMEM/F12培養(yǎng)液，所述部分性完全培養(yǎng)基為包括胎牛血清、胰島素-轉(zhuǎn)鐵 蛋白-亞硒酸鈉且不含mEGF的DMEM/F12培養(yǎng)液；所述選擇性完全培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、部 分性完全培養(yǎng)基中胎牛血清的濃度依次增大，所述選擇性完全培養(yǎng)基中mEGF的濃度高于 完全培養(yǎng)基中mEGF的濃度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法，其特征在 于：接種代數(shù)在15代之前的卵巢表面上皮細(xì)胞，每次傳代時(shí)使用胰酶溶液的消化時(shí)間為 30-45s，所述胰酶溶液中胰酶濃度為0. 1%且不含EDTA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法，其特征 在于：所述選擇性完全培養(yǎng)基為包括3-4%胎牛血清、1-1. 2 %青霉素-鏈霉素、8-10ng/ 111111￡6?、1-1.2%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉的01^11/^12培養(yǎng)液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法，其特征 在于：所述完全培養(yǎng)基為包括6-8%胎牛血清、1-1.2%青霉素-鏈霉素、2-4叩/111111￡6?、 1-1.2%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉的01^11作12培養(yǎng)液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法，其特征在 于：所述部分性完全培養(yǎng)基為包括8-10%胎牛血清、1-1. 2%青霉素-鏈霉素、1-1. 2%胰島 素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉的DMEM/F12培養(yǎng)液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法，其特征在 于：所述卵巢表面上皮細(xì)胞分離步驟完成后，進(jìn)行免疫熒光鑒定和/或免疫組化鑒定之后， 當(dāng)鑒定結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)后進(jìn)行早期傳代步驟。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法，其特征在 于：所述免疫熒光鑒定包括以下步驟： 1)第2代的卵巢表面上皮細(xì)胞用胰酶消化、接種后孵育，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，棄培 養(yǎng)基后漂洗，隨后使用固定液固定細(xì)胞、以及封閉液封閉處理； 2) 加入一抗抗角化蛋白處理一段時(shí)間后漂洗，加入二抗山羊抗小鼠IgG處理一段時(shí)間 后漂洗，加入DAPI染色一段時(shí)間后漂洗，隨后采用用抗淬滅劑封固； 3) 顯微鏡下觀察，計(jì)算細(xì)胞陽(yáng)性率。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法，其特征在 于：所述免疫組化鑒定包括以下步驟： 1) 同批次的未處理過(guò)的完整小鼠卵巢和用胰酶消化過(guò)的小鼠卵巢分別放到甲醛中過(guò) 夜； 2) 用石蠟包被卵巢后切成組織切片，隨后置于檸檬酸鈉緩沖液中煮沸處理后漂洗； 3) 滴加正常山羊血清封閉液處理一段時(shí)間后甩去多余液體，隨后滴加一抗抗角化蛋白 處理一段時(shí)間后漂洗，滴加二抗山羊抗小鼠IgG處理一段時(shí)間后漂洗； 4) 經(jīng)過(guò)DAB顯色處理、蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分化、PBS漂洗、脫水、透明、封片處理后， 顯微鏡下鑒定。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104328082SQ201410545022
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】李冰燕, 張鶴美, 張?jiān)隼? 王萍, 劉利芝, 胡志勇 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)