能防治櫻桃病害的生物殺菌劑及所用菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種解淀粉芽孢桿菌菌株BA-07，為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-07，其保藏號為：CGMCC NO.8466。本發(fā)明還同時提供了上述解淀粉芽孢桿菌菌株BA-07的用途：用于制備能防治櫻桃病害(葉片細(xì)菌性穿孔病害)的生物殺菌劑。本發(fā)明還同時提供了上述能防治櫻桃病害的生物殺菌劑的制備方法。CGMCC NO. 84662013.11.11
【專利說明】能防治樓桃病害的生物殺菌劑及所用菌

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于禮桃病害防治【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說涉及生物防治領(lǐng)域中一種防治禮桃 病害的生物殺菌劑及所用菌。

【背景技術(shù)】
[0002] 禮桃（Cerasus pseudocerasus)屬于醫(yī)薇科落葉喬木果樹，在我國栽培歷史悠久， 是落葉果樹中成熟期最早的樹種之一。近年來，為了實現(xiàn)城鄉(xiāng)經(jīng)濟(jì)統(tǒng)籌協(xié)調(diào)發(fā)展和富民增 收的目標(biāo)，農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整，浙江省大力發(fā)展特色優(yōu)質(zhì)水果，禮桃的種植面積不斷增 力口、生產(chǎn)規(guī)模日益擴(kuò)大。
[0003] 禮桃在果品中成熟期最早，被譽為"春果第一枝"，其果實色澤鮮艷，晶室美麗，營 養(yǎng)豐富，外觀和內(nèi)在品質(zhì)俱佳，被譽為"果中極品"，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值，含有維生素A、B、C 及巧、磯、鐵等礦物質(zhì)元素。尤其鐵元素的含量每百克禮桃中可達(dá)到59毫克，居水果首位。
[0004] 但是，近年來隨著禮桃種植面積的不斷擴(kuò)大，各種病害也相繼發(fā)生，且有逐年加重 的趨勢。穿孔病是禮桃樹上最常見的葉部病害之一，發(fā)病率高，危害嚴(yán)重。其發(fā)病部位病斑 部分組織脫落，形成穿孔。在沿海、沿湖和排水不良的果園及多雨年份發(fā)生嚴(yán)重。易造成大 量落葉，減少營養(yǎng)積累，影響花芽的形成，導(dǎo)致當(dāng)年減產(chǎn)，果實品質(zhì)差。而且對第二年的產(chǎn)量 和品質(zhì)也有較大影響。當(dāng)前國內(nèi)外對禮桃穿孔病的治理主要是W增強(qiáng)果園管理和傳統(tǒng)農(nóng) 藥防治為主，農(nóng)藥的廣泛使用對防治有害生物和提高農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益都起到了不可忽視的作 用。
[0005] 但是隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，農(nóng)藥對果品和果園環(huán)境的污染越來越嚴(yán)重，病蟲 害防治與農(nóng)藥污染的矛盾已成為果樹生產(chǎn)中亟待解決的問題。同時，隨著人們對食品安全 和環(huán)境保護(hù)意識的增強(qiáng)，化學(xué)類殺菌劑的使用范圍也越來越受到限制。因此從可持續(xù)發(fā)展 的角度出發(fā)，開發(fā)新型、高效且安全的有機(jī)、綠色的生物殺菌劑具有重大的社會意義和廣闊 的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種防治禮桃穿孔病害的生物殺菌劑。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種解淀粉芽抱桿菌菌株BA-07,為解淀粉芽 抱桿菌炬acillus am}doliquefaciens)BA-07,其保藏號為；CGMCC NO. 8466。
[0008] 本發(fā)明還同時提供了上述解淀粉芽抱桿菌菌株BA-07的用途：用于制備能防治禮 桃病害的生物殺菌劑。
[0009] 作為本發(fā)明的解淀粉芽抱桿菌菌株BA-07的用途的改進(jìn)：所述禮桃病害為葉片細(xì) 菌性穿孔病害。
[0010] 本發(fā)明還同時提供了能防治禮桃病害的生物殺菌劑的制備方法，包括W下步驟：
[0011] 1)、斜面菌種：
[0012] 將保藏號為；CGMCC NO. 8466 的解淀粉芽抱桿菌炬acillus amyloliquefaciens) BA-07在PDA斜面上于27. 5?28. 5°C培養(yǎng)46?50h(較佳為28°C培養(yǎng)4她）；
[001引備注；取出后于4C冰箱中保存，嚴(yán)防雜菌污染；
[0014] 2)、平板活化：
[0015] 將上述PDA斜面培養(yǎng)所得（保存）的菌種接種到平板培養(yǎng)基上，所述平板培養(yǎng)基 為PDA培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為27. 5?28. 5°C培養(yǎng)46?50h(較佳為28C培養(yǎng)4她），且于相 同條件下重復(fù)傳代培養(yǎng)兩次（即，共培養(yǎng)2次）；
[0016] 3)、液體發(fā)酵種子：
[0017] W NB培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基；
[0018] 將活化所得的菌種接種到裝有NB培養(yǎng)基的搖瓶中，于27. 5?28. 5C (較佳為 28C )、150?25化pm(較佳為2(K)巧m)振蕩器中培養(yǎng)22?26h(較佳為2化）；得液體發(fā)酵 種子；
[0019] 4)、液體發(fā)酵
[0020] 將上述液體發(fā)酵種子W 2% (體積％ )的接種量接種于NB培養(yǎng)基中，在27. 5? 28. 5°C (較佳為28C )、150?250巧111(較佳為200巧111)振蕩器中培養(yǎng)22?26h(較佳為 2化），得發(fā)酵液；
[0021] 備注說明；步驟3)和步驟4)均為"有氧無菌培養(yǎng)"，即，滿足"透氣"的條件；
[0022] 5)、離也過濾：
[0023] 將上述步驟4)所得的發(fā)酵液在7000?9000巧m條件下離也9?Ilmin (較佳為 SO(K)巧m條件下離也IOmin)，去除沉淀得到上清液，所得上清液為能防治禮桃病害的生物 殺菌劑。
[0024] 在本發(fā)明中，PDA培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基均屬于常規(guī)培養(yǎng)基。例如，NB培養(yǎng)基為：牛 肉膏3g，蛋白腺lOg，氯化軸Sg,水IOOOml,調(diào)抑7. 0-7. 2,12rC滅菌20min。
[00巧]本發(fā)明所用的解淀粉芽抱桿菌BA-07,保藏名稱為解淀粉芽抱桿菌炬acillus amyloliquefaciens)，保藏號為；CGMCC NO. 8466,保藏日期：2013年11月11日；保藏單位： 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中也，保藏地址；北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號，中科院微生物研究所。
[0026] 本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)勢：
[0027] 1、生物殺菌劑微生物易于培養(yǎng)，生長周期短；
[0028] 2、生物殺菌劑的生產(chǎn)較易，方便收集；
[0029] 3、生物殺菌劑對環(huán)境友好、無污染，不影響人類健康。
[0030] 4、本發(fā)明所得的生物殺菌劑防治禮桃病害（葉片細(xì)菌性穿孔病害）效果佳。
[0031] 本發(fā)明的能防治禮桃病害的生物殺菌劑實際使用時，其用法和用量具體如下；將 生物殺菌劑（上清液）與無菌水按照1 ;1〇?50的體積比混合后，在每年5-6月（或者當(dāng) 新生葉片出現(xiàn)水潰狀半透明淡褐色小病斑時）進(jìn)行噴灑。一般而言，每畝使用作為有效成 分的生物殺菌劑5?15L。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0033] 圖1為生物殺菌劑與所用菌菌液（IO6C即/ml)對禮桃穿孔病菌的平板抑制效果對 比圖。
[0034] 圖2為生物殺菌劑與所用菌菌液（l〇6CFU/ml)對禮桃穿孔病菌的體外平板抑制效 果。
[0035] 圖3為不同濃度生物殺菌劑對禮桃穿孔病菌的體外平板抑制效果。
[0036] 圖4為生物殺菌劑及所用菌菌液（IO6C即/ml)對禮桃穿孔病害防治效果。
[0037] 圖5為不同濃度生物殺菌劑對禮桃穿孔病害防治效果。

【具體實施方式】
[0038] 實施例1、一種防治禮桃病害的生物殺菌劑，其制備方法為依次進(jìn)行W下步驟：
[003引 1)、斜面菌種：
[0040] 將保藏號為；CGMCC NO. 8466 的解淀粉芽抱桿菌炬aciIlus amyloliquefaciens) BA-07在PDA斜面上培養(yǎng)4她（培養(yǎng)溫度為28°C )，于4°C冰箱中保存，嚴(yán)防雜菌污染；
[0041] 2)、平板活化：
[0042] 將上述PDA斜面保存的菌種接種到平板培養(yǎng)基上，所述平板培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。 培養(yǎng)條件為于28C下培養(yǎng)4她，相同條件下重復(fù)傳代培養(yǎng)兩次（即，共培養(yǎng)2次）。
[0043] 3)、液體發(fā)酵種子：
[0044] W NB培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基。
[0045] 將活化所得的菌種1環(huán)接種到裝有50ml NB液體培養(yǎng)基（牛肉膏3g，蛋白腺lOg， 氯化軸5g，調(diào)抑7. 0-7. 2,水1000ml，12rC滅菌20min)的搖瓶中，于28°C、200rpm條件下培 養(yǎng)24小時；得液體發(fā)酵種子。
[0046] 4)、液體發(fā)酵
[0047] 將液體發(fā)酵種子W 2% (體積％ )的接種量接種于NB培養(yǎng)基（于搖瓶中），在 28 °C、200巧m振蕩器中培養(yǎng)24小時；獲得發(fā)酵液（發(fā)酵產(chǎn)物）。
[0048] 目P，液體發(fā)酵種子與NB培養(yǎng)基的體積比為2%。
[0049] 5)、離也過濾：
[0050] 將上述步驟4)所得的發(fā)酵液離也（轉(zhuǎn)速為8000巧m，時間為IOmin)，去除沉淀得 到上清液，所述上清液為能防治禮桃病害的生物殺菌劑。
[0051] W下實驗中，所用菌菌液均指實施例1步驟5)發(fā)酵液離也所得的沉淀并用無菌水 調(diào)節(jié)其濃度為l〇6C即/ml,生物殺菌劑均指實施例1步驟5)所得的上清液。
[0052] 實驗1、生物殺菌劑及所用菌菌液炬acillus amyloliquefaciens)對穿孔病菌的 體外平板抑制
[005引 （1)將禮桃細(xì)菌性穿孔病菌狂anthomonas campestri pv. prunU按照常規(guī)方法進(jìn) 行活化；
[0054] (2)將融化的PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，制備9個平板。3個一組共分3組；
[005引 做挑取活化好的禮桃細(xì)菌性穿孔病菌于無菌水中混勻，測其OD值約為0.5。吸 取100 U L上述菌液到制備好的平板中，用涂布棒將菌液涂勻涂開；
[0056] (4)用綴子夾取牛津杯置于平板中也（牛津杯不宜插入培養(yǎng)基太深也不宜太 淺）；
[0057] 妨各吸取200 y L所用菌菌液和生物殺菌劑于牛津杯中，分別放到3個平板中，作 為處理；吸取200 y L無菌水于牛津杯中，分別放到3個平板中，作為對照；
[005引 做在28 C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（有氧）2天；
[0059] (7)拍照并測量抑菌圈直徑。
[0060] 所得結(jié)果如圖1與圖2所示。
[0061] 實驗2、不同濃度生物殺菌劑對穿孔病菌的體外平板抑制
[0062] 將生物殺菌劑分別稀釋2倍與3倍，然后各吸取200 U L生物殺菌劑、200 U L稀釋 2倍后的生物殺菌劑、200 y L稀釋3倍后的生物殺菌劑于牛津杯中，分別放到3個平板中， 作為處理；吸取200 UL無菌水于牛津杯中，分別放到平板中，作為對照。
[0063] 其余內(nèi)容等同于實驗1。
[0064] 備注說明；生物殺菌劑與無菌水按照1:1的體積比混合，即為將生物殺菌劑稀釋2 倍；生物殺菌劑與無菌水按照1:2的體積比混合，即為將生物殺菌劑稀釋3倍。
[0065] 所得結(jié)果如圖3所示。根據(jù)圖3,我們可W得知，與未經(jīng)生物殺菌劑處理相比，生物 殺菌劑原液、稀釋2倍、稀釋3倍生物殺菌劑處理均能顯著抑制禮桃穿孔病菌的生長，抑菌 圈直徑分別為對照的4倍、4. 1倍和3倍。
[0066] 實驗3、生物殺菌劑與所用菌菌液對禮桃穿孔病害的體內(nèi)防治
[0067] (1)菌液制備：挑取活化好的禮桃細(xì)菌性穿孔病菌于無菌水中混勻，測其OD值約 為 0. 5。
[006引 似將禮桃枝條分為3組，每組10個，每個枝條挑選新生的已經(jīng)展開的3個葉片， 共90個。
[0069] (3)將接種針浸入制備好的菌液，在挑選好的葉片上刺孔，形成直徑約為0. 5cm的 圓形。
[0070] 每次刺之前要重新浸菌液。W此作為對照組。
[0071] (4)取步驟（3)所得的已經(jīng)刺孔的兩組葉片，用移液槍分別吸取20y L生物殺菌劑 和所用菌菌液涂于圓形針刺面積上，作為實驗組。
[0072] (5)隔日觀察禮桃葉片穿孔病害的發(fā)生狀況，測量病斑直徑并記錄病害發(fā)生數(shù)。
[0073] 所得結(jié)果如圖4所示。
[0074] 實驗4、不同濃度生物殺菌劑對禮桃穿孔病害的體內(nèi)防治
[0075] 將生物殺菌劑分別稀釋10倍與100倍，然后用移液槍分別吸取20 U L生物殺菌劑 (原液）、20 U L稀釋10倍后的生物殺菌劑、20 U L稀釋100倍后的生物殺菌劑涂于圓形針 刺面積上，作為實驗組。其余內(nèi)容等同于實驗3。
[0076] 所得結(jié)果如圖5所示。
[0077] 根據(jù)圖5,我們得出，與未經(jīng)生物殺菌劑處理相比，生物殺菌劑原液、稀釋10倍、稀 釋100倍生物殺菌劑處理均能顯著抑制禮桃穿孔病害的發(fā)生，生物殺菌劑原液的抑制效果 最好；其病害發(fā)生率為16%，病斑直徑為1. 3mm ;分別為對照的1/6和1/4。
[007引 對比例1、
[0079] 選用W下現(xiàn)有的解淀粉芽抱桿菌：
[0080] 解淀粉芽抱桿菌A，來源為中國普通微生物菌種保藏中也，保藏號；AS 1. 1131 ; [00則解淀粉芽抱桿菌B，來源為廣州巧仕路生物科技有限公司，商品代號；JW50 ;
[0082] 解淀粉芽抱桿菌C，來源為中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中也，保藏號；CICC 21269。
[0083] 將解淀粉芽抱桿菌A、解淀粉芽抱桿菌B、解淀粉芽抱桿菌C分別替代本發(fā)明的解 淀粉芽抱桿菌炬acillus amyloliquefaciens)BA-07,按照實施例1所述方法制備獲得相 應(yīng)的上清液（生物殺菌劑）；按照上述實驗1和實驗3進(jìn)行實驗（僅檢測生物殺菌劑原液）。 所得結(jié)果如下表1所示。
[0084] 表 1
[0085]

【權(quán)利要求】
1. 解淀粉芽孢桿菌菌株BA-07,其特征在于：為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)BA_07,其保藏號為：CGMCC N0.8466。
2. 如權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌菌株BA-07的用途，其特征在于：用于制備能 防治櫻桃病害的生物殺菌劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌菌株BA-07的用途，其特征在于：所述櫻桃 病害為葉片細(xì)菌性穿孔病害。
4. 能防治櫻桃病害的生物殺菌劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 、斜面菌種： 將保藏號為：CGMCC NO. 8466 的解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)BA_07 在PDA斜面上于27. 5?28. 5°C培養(yǎng)46?50h ; 2) 、平板活化： 將上述PDA斜面培養(yǎng)所得的菌種接種到平板培養(yǎng)基上，所述平板培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基； 培養(yǎng)條件為27. 5?28. 5°C培養(yǎng)46?50h，且于相同條件下重復(fù)傳代培養(yǎng)兩次； 3) 、液體發(fā)酵種子： 以NB培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基； 將活化所得的菌種接種到裝有NB培養(yǎng)基的搖瓶中，于27. 5?28. 5°C、150?250rpm 振蕩器中培養(yǎng)22?26h ;得液體發(fā)酵種子； 4) 、液體發(fā)酵： 將上述液體發(fā)酵種子以體積比為2 %的接種量接種于NB培養(yǎng)基中，在27. 5?28. 5°C、 150?250rpm振蕩器中培養(yǎng)22?26h，得發(fā)酵液； 5) 、離心過濾： 將上述步驟4)所得的發(fā)酵液在7000?9000rpm條件下離心9?llmin，去除沉淀得到 上清液，所得上清液為能防治櫻桃病害的生物殺菌劑。
【文檔編號】C12R1/07GK104357352SQ201410586377
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】劉霞, 呂成敏, 方媛, 郭威 申請人:浙江師范大學(xué)