一種采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄pcr法鑒定抗黃曲霉花生種子的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR法鑒定抗黃曲霉花生種子的方法。采用的技術(shù)方案是：將檢測花生種子和比照花生種子滅菌：侵染黃曲霉；取樣并合成cDNA；分別取cDNA樣品1μl，并分別加入相應(yīng)的引物，采用實(shí)時(shí)定量PCR儀，在每次擴(kuò)增的退火階段從62到95℃每隔0.2℃測定熒光強(qiáng)度。本發(fā)明確認(rèn)了參與抗性機(jī)制的基因，為進(jìn)一步鑒定花生種子的抗黃曲霉特性提供了方法。應(yīng)用本發(fā)明可在非田間實(shí)驗(yàn)條件下，將前期田間試驗(yàn)期的90天縮短為試驗(yàn)室條件下周期為7天的侵染試驗(yàn)，在較短的周期內(nèi)鑒定出抗黃曲霉花生品種，大大縮短了檢測時(shí)間，提高了效率，準(zhǔn)確性高。
【專利說明】-種采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR法鑒定抗黃曲霉花生種子的 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物生理病變與檢測領(lǐng)域，特別涉及一種采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR方 法，通過對(duì)感染黃曲霉的花生基因的三個(gè)應(yīng)激反應(yīng)過程的檢測，進(jìn)一步定性的鑒定花生種 子對(duì)黃曲霉的抗性。

【背景技術(shù)】
[0002] 黃曲霉毒素（aflatoxin)是由產(chǎn)毒的黃曲霉菌（Aspergillusflavus)和寄生曲 霉菌（Aspergillusparasitis)等腐生半知菌類產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是迄今發(fā)現(xiàn)的真菌 毒素中穩(wěn)定性最強(qiáng)、毒性最大的一類。黃曲霉毒素常見于糧食和飼料中，被黃曲霉毒素污染 的飼料一旦被家畜攝入，經(jīng)食物鏈的作用，延伸到人類，不同毒素的低劑量就對(duì)高等脊椎動(dòng) 物和其他動(dòng)物具有急毒性或慢毒性，其中AFB1毒性最強(qiáng)，強(qiáng)烈致癌，主要誘發(fā)肝癌。黃曲霉 毒素污染可廣泛性的發(fā)生在多種食品上，其中以玉米、花生和棉籽油最易受到污染。
[0003]目前花生真菌病害十分嚴(yán)重，不僅造成巨大的損失，更嚴(yán)重到危害人的生命健康。 對(duì)于田間生長階段，各花生產(chǎn)區(qū)、花生各生育期均可感染花生黃曲霉菌等真菌病害，一般田 間的發(fā)病率約為10 %?20 %，嚴(yán)重可達(dá)50 %?60 %;發(fā)病后，減產(chǎn)15 %，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)50 %。 該病除對(duì)產(chǎn)量影響外，出仁率和出油率也顯著下降。而對(duì)于保藏階段頑固、易感染的黃曲霉 菌產(chǎn)生的黃曲霉菌毒素更是危害巨大，由于污染嚴(yán)重而失去營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，篩選抗 黃曲霉花生種子具有極其重要的經(jīng)濟(jì)效益及環(huán)境效益。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種可在非田間實(shí)驗(yàn)條件下，在較短的周期內(nèi)鑒定出具有抗 黃曲霉特性的花生品種。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR法鑒定抗黃曲霉花生種 子的方法，方法如下：
[0006] 1)將檢測花生種子和比照花生種子滅菌：將種子浸在0. 75%的次氯酸鈉溶液中 滅菌，用無菌水沖洗，并在無菌去離子水中，室溫浸泡到含水量為30%。所述的比照花生種 子是阜花11花生種子或紅崖子四粒紅花生種子；
[0007] 2)侵染：將檢測花生種子和比照花生種子浸入含有黃曲霉的溶液中l(wèi)-3min，然 后將樣品取出移入培養(yǎng)皿中，相同條件下培養(yǎng)1-7天；所述的含有黃曲霉的溶液是：含有 4X106CFU/mL的黃曲霉的孢子懸液，孢子懸液用0. 05 %的曲拉通X-100溶液配制；優(yōu)選的， 黃曲霉是黃曲霉NRRL3357 ;
[0008] 3)取樣并合成cDNA:分別在侵染的第1天、2天、3天、4天、5天和6天取侵染的檢 測花生種子和比照花生種子，并分別制備花生種子的總RNA并合成cDNA;
[0009] 4)測定：分別取cDNA樣品1iil，并分別加入相應(yīng)的引物，引物加入的方法是：
[0010] 于第1天的cDNA樣品中加入引物P3、P8和P11各0. 3iil;
[0011] 于第2天的cDNA樣品中加入引物P3、P8和P11各0. 3iil ;
[0012] 于第3天的cDNA樣品中加入引物PI、P4、P5和P13各0. 3 ill ;
[0013] 于第4天的cDNA樣品中加入引物P1和P13各0. 3iil;
[0014] 于第5天的cDNA樣品中加入引物P9和P10各0. 3iil;
[0015] 于第6天的cDNA樣品中加入引物P4、P5、P9和P10各0. 3iil;
[0016]然后，采用實(shí)時(shí)定量PCR儀，在每次擴(kuò)增的退火階段從62到95°C每隔0. 2°C測定 熒光強(qiáng)度；
[0017] 引物和參比引物actin的序列是：

【權(quán)利要求】
1. 一種采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR法鑒定抗黃曲霉花生種子的方法，其特征在于方法如 下： 1) 滅菌：將檢測花生種子和比照花生種子滅菌； 2) 侵染：將檢測花生種子和比照花生種子浸入含有黃曲霉的溶液中l(wèi)_3min，然后將種 子取出移入培養(yǎng)皿中，相同條件下培養(yǎng)1-7天； 3) 取樣并合成cDNA :分別在侵染的第1天、2天、3天、4天、5天和6天取侵染的檢測花 生種子和比照花生種子，并分別制備花生種子的總RNA并合成cDNA ; 4) 測定：分別取cDNA樣品1 yl，并分別加入相應(yīng)的引物，引物加入的方法是： 于第1天的cDNA樣品中加入引物P3、P8和P11各0. 3iil ; 于第2天的cDNA樣品中加入引物P3、P8和P11各0. 3iil ; 于第3天的cDNA樣品中加入引物P1、P4、P5和P13各0. 3iil ; 于第4天的cDNA樣品中加入引物P1和P13各0. 3 ill ; 于第5天的cDNA樣品中加入引物P9和P10各0. 3 ill ; 于第6天的cDNA樣品中加入引物P4、P5、P9和P10各0. 3 ill ; 然后，采用實(shí)時(shí)定量PCR儀，在每次擴(kuò)增的退火階段從62到95°C每隔0. 2°C測定熒光 強(qiáng)度； 引物和參比引物actin的序列是： PI ：F:acaccaaccgtctttttaccaaa ；R:ggccaattgggaacacaaac P3 ：F:tgtttgggtgattgctcatgag ；R:aaccaaccatgtcatcaacaagtt P4：F:catgaagctctatgttggtctcaag ；R:atggccttcatggcttcaaa P5 ：F:caagtgcaatgtcgttggt ；R:ccatggaggttagagggtttga P8 ：F:acatcactcacaggaccatgct ；R:gccactggccattgagttaag P9 ：F:tcggcatgcgaattgtagtc ；R:caaacggatgaaccttcacaca P10 ：F:atggcataactgaaggcagtct ；R:ttgtattgtgtctttgaacaccttg Pll ：F:gccactggccattgagctaa ；R:cactcacaggaccatgctcttc P13 ：F:gggtggtaaggccgactgt ；R:tgaatgggagctggctcaa actin ：F:gttccactatgttcccaggca ；R:cttcctctctggtggtgctaca PCR擴(kuò)增體系： 20 yl反應(yīng)體系：cDNA 1 yl ;引物；2倍緩沖液10 yl ;ddH20余量； 20. ii 1 參比體系：cDNA 1 ii 1 ;引物 actin 0? 3 ii 1 ;2 倍緩沖液 10 ii 1 ;ddH20 8. 7 ii 1 ; PCR擴(kuò)增條件：95°C初始變性10s，然后45個(gè)循環(huán)如下：95°C 10s，60°C 10s，72°C20s。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR法鑒定抗性花生種子的方法，其 特征在于：所述的滅菌是：將花生種子浸在0. 75%的次氯酸鈉溶液中滅菌，用無菌水沖洗， 并在無菌去離子水中，室溫浸泡到含水量為30%。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR法鑒定抗性花生種子的方法，其 特征在于：所述的比照花生種子是阜花11花生種子或紅崖子四粒紅花生種子。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR法鑒定抗性花生種子的方法，其 特征在于所述的含有黃曲霉的溶液是：含有4X 106CFU/mL的黃曲霉的孢子懸液，孢子懸液 用0.05%的曲拉通X-100溶液配制。
5.如權(quán)利要求4所述的一種采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR法鑒定抗性花生種子的方法，其 特征在所述的黃曲霉是黃曲霉NRRL 3357。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104328191SQ201410620042
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月5日
【發(fā)明者】張慧麗, 陳林, 張麗男, 蔣坤 申請人:遼寧大學(xué)