專利名稱：：實(shí)時(shí)定量PCR檢測花生金屬硫蛋白mRNA表達(dá)水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測花生金屬硫蛋白mRNA表達(dá)水平的方法，尤其涉及一種實(shí)時(shí)定量PCR檢測花生金屬硫蛋白mRNA表達(dá)水平的方法。
背景技術(shù)：
：金屬硫蛋白(metallothioneins，MTs)是一類富含Cys、通過Cys殘基上的-SH與鎘等重金屬離子螯合形成無毒或低毒的絡(luò)合物，還可以與重金屬等脅迫條件誘發(fā)產(chǎn)生的自由基、R0S發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而降低氧化損傷。植物金屬硫蛋白基因的表達(dá)行為具有多樣性和復(fù)雜性，其表達(dá)因不同物種、不同MT類型、不同組織器官、不同外界條件而表達(dá)特性各異，與植物的生長發(fā)育階段也密切相關(guān)。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號來實(shí)時(shí)監(jiān)測產(chǎn)物量的變化。SYBRGreenI實(shí)時(shí)定量PCR是PCR定量技術(shù)的一種，可以對基因擴(kuò)增的起始模板的拷貝數(shù)進(jìn)行精確的定量，還可以通過熔解曲線判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，是一種靈敏度高、特異性好的檢測技術(shù)?；ㄉ饘倭虻鞍谆蛞延醒芯勘砻髟诨ㄉ闹亟饘倜摱竞突钚匝醯那宄邪l(fā)揮作用，但MT基因表達(dá)與其發(fā)揮作用的機(jī)理仍不清楚。我們應(yīng)用SYBRGreenI實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，建立檢測花生金屬硫蛋白mRNA表達(dá)水平的方法，對于闡明MT基因表達(dá)的作用機(jī)理具有一定指導(dǎo)作用。mRNA表達(dá)水平檢測是從基因水平研究生理、病理反應(yīng)的一項(xiàng)基本技術(shù)。目前最常規(guī)的方法包括Northern雜交、核糖核酸酶保護(hù)分析法等，但常規(guī)的方法均需要消耗很長時(shí)間，而且這些方法均存在一些不足。Northern印跡法，將RNA固定在硝酸纖維素膜上后，用互補(bǔ)的，具有放射性標(biāo)記的RNA或DNA探針與其雜交。此方法需要的試劑多，RNA質(zhì)量要求高，不能檢測低豐度mRNA，敏感性低，而且在測量同一樣品不同mRNA豐度時(shí)顯得笨拙。核糖核酸酶保護(hù)分析法檢測敏感性較Northern雜交高，可同時(shí)檢測同一樣品中不同豐度mRNA，但需要利用與靶mRNA恰好互補(bǔ)的反義核酸探針，這樣如果實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生易于被核糖核酸酶切割的RNA-RNA雜交時(shí)，將出現(xiàn)問題。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號來實(shí)時(shí)監(jiān)測產(chǎn)物量的變化。主要類型有SYBR染料法、探針法和分子信號技術(shù)。綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)是成本高，效率底，耗時(shí)間等類似問題。目前最常規(guī)的方法包括Northern雜交、核糖核酸酶保護(hù)分析法等，但這些方法分別存在一些不足Northern印跡需要的試劑多，RNA質(zhì)量高，不能檢測低豐度mRNA，敏感性低而且在測量同一樣品不同mRNA豐度時(shí)顯得笨拙；核糖核酸酶保護(hù)分析法檢測敏感性較Northern雜交高，可同時(shí)檢測同一樣品中不同豐度mRNA，但需要利用與靶mRNA恰好互補(bǔ)的反義核酸探針，這樣如果實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生易于被核糖核酸酶切割的RNA-RNA雜交時(shí)，將出現(xiàn)問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明本發(fā)明利用SYBRGreenI實(shí)時(shí)定量PCR檢測金屬硫蛋白mRNA表達(dá)水平，構(gòu)建所要檢測基因標(biāo)準(zhǔn)品后，可以對該基因擴(kuò)增的起始模板的拷貝數(shù)進(jìn)行精確的定量，還可以通過熔解曲線判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，是一種靈敏度高、特異性好的檢測技術(shù)。本發(fā)明所述的實(shí)時(shí)定量PCR檢測花生金屬硫蛋白mRNA表達(dá)水平的方法包括如下步驟1.通過將從花生組織中獲得金屬硫蛋白基因與載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，作為實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品；2.提取含有目的基因的重組質(zhì)粒，計(jì)算出分子拷貝數(shù)，將重組質(zhì)粒稀釋成不同倍數(shù)，即為實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品模板；及3.提取所需組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為實(shí)時(shí)定量PCR模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，得出起始模板的拷貝數(shù)，對其mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測分析。此外，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，通過RT-PCR技術(shù)獲得步驟1)中所述金屬硫蛋白基因，且步驟1)中通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。其中，通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后的擴(kuò)增程序如下95°C變性2分鐘；95°C15秒_58°C15秒_72°C20秒本步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號收集40個(gè)循環(huán)；通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，然后在紫外燈下切下目的基因條帶，用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，即獲得純化的AhMT基因片段。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，步驟1)中所述載體為PMD18-T載體，其與金屬硫蛋白基因片段以摩爾比13110進(jìn)行連接，連接反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明另外的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，步驟2)中所述實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的總體系為25111:上、下游引物0.5111，模板2111，2\3￥81PremixExTaq12.5yl及滅菌雙蒸水，其中所述SYBRPremixExTaq含有TaqDNA聚合酶、dNTP、SYBRGreenI染料。通過紫外分光光度計(jì)測量質(zhì)粒的A260的值，通過Mr和阿伏伽德羅常數(shù)計(jì)算出分子拷貝數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，步驟2)中所述實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的程序包括第一步預(yù)變性；第二步熒光收集，95°C15秒-58°C15秒_72°C20秒本步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號收集40個(gè)循環(huán)；第三步融解曲線分析65°C30秒逐步升至95°C，每隔0.2°C收集一次熒光。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明步驟3中利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)基因表達(dá)水平檢查分析僅需1小時(shí)，且能夠同時(shí)檢測大量樣品，方法簡單容易操作，結(jié)果分析更快捷方便。附圖簡要說明圖1.花生AhMT2a基因的擴(kuò)增產(chǎn)物其中DNA標(biāo)記物(DL2000)。圖2.pMD18-T/AhMT2a重組載體的鑒定其中DNA標(biāo)記物(DL2000)A:pMD18-T/AhMT2a重組載體的菌落PCR鑒定B:PMD18-AhMT2重組載體的雙酶切鑒定。圖3.pMD18-T/AhMT2a的擴(kuò)增動(dòng)力曲線(a)和回歸曲線(b)。圖4.pMD18-T/AhMT2a的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。具體實(shí)施例方式結(jié)合上述說明書附圖，將對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明本發(fā)明涉及一種實(shí)時(shí)定量PCR檢測花生金屬硫蛋白mRNA表達(dá)水平的方法包括如下步驟1、檢測標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從花生組織中獲得金屬硫蛋白基因(AhMT)，與pMD18_T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，作為實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品。具體方法如下(1)從lOOmg花生組織中提取總RNA，通過紫外分光光度計(jì)和凝膠電泳確定RNA的純度和濃度。采用MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。擴(kuò)增程序如下95°C變性2分鐘；95°C15秒_58°C15秒_72°C20秒本步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號收集40個(gè)循環(huán)；通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，然后在紫外燈下切下目的基因條帶，用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，即獲得純化的AhMT基因片段。(2)重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆篩選及鑒定將PMD18-T載體與AhMT基因片段以適當(dāng)比例(摩爾比13110)進(jìn)行連接，連接反應(yīng)時(shí)間為4h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，采用氨芐青霉素抗性LB瓊脂糖平板初次篩選和菌落PCR再次篩選的方法確定陽性菌落，在氨芐青霉素抗性LB培養(yǎng)液中擴(kuò)增陽性菌落，然后從菌液中提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，最后將菌液送去測序進(jìn)行再次驗(yàn)證。2.SYBRGreenI實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法的建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制提取含有目的基因的重組質(zhì)粒，通過紫外分光光度計(jì)測量質(zhì)粒的A260的值，根據(jù)Mr和阿伏伽德羅常數(shù)計(jì)算出分子拷貝數(shù)，將重組質(zhì)粒稀釋成不同倍數(shù)即為實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品模板。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的總體系為25yl上、下游引物0.5ii1，模板2ii1，2XSYBRPremixExTaq12.5ii1(含有TaqDNA聚合酶、dNTP、SYBRGreenI染料等成分)及滅菌雙蒸水。反應(yīng)程序如下第一步預(yù)變性95°C變性2分鐘；第二步熒光收集95°C15秒-58°C15秒_72°C20秒本步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號收集40個(gè)循環(huán)；第三步融解曲線分析65°C30秒逐步升至95°C，每隔0.2°C收集一次熒光。反應(yīng)后得到Cp值，利用LightCyclersoftwarei05熒光定量分析軟件自動(dòng)繪制動(dòng)力擴(kuò)增曲線和回歸曲線，用熔解曲線分析實(shí)驗(yàn)的特異性。3.樣品的檢測提取所需組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為實(shí)時(shí)定量PCR模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，方法同上。由得出Cp值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得出起始模板的拷貝數(shù)，對其mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測分析。實(shí)施例1材料與方法1.1材料高積累鎘花生品種XA004和低積累鎘花生品種XD011，均由山東省花生研究所提供。實(shí)時(shí)熒光定量采用德國羅氏公司LightCyclerf.O實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，配有該公司提供的LightCyclersoftware4.05熒光定量分析軟件。SYBRGreenI熒光定量試劑盒、MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒和pMD18-T載體連接試劑盒購于寶生物工程有限公司。植物RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購于美國OMEGA生物技術(shù)公司。T0P10感受態(tài)細(xì)胞購于北京天根生物公司。PCR引物合成和質(zhì)粒測序由南京金思特生物公司完成。1.2方法1.2.1營養(yǎng)液培養(yǎng)花生幼苗花生種子先經(jīng)75%乙醇處理1分鐘，再用0.1%的氯化汞進(jìn)行消毒處理15分鐘，最后用去離子水反復(fù)沖洗3-4遍備用。恒溫25°C浸種12h，將吸脹后的種子，擺放于小的塑料盆中的尼龍網(wǎng)上，每盆20粒，用Hongland營養(yǎng)液在人工氣候箱下培養(yǎng)，白天28V16小時(shí)，黑夜26°C8小時(shí)。每兩天換一次營養(yǎng)液。營養(yǎng)液培養(yǎng)6天后，幼苗用于實(shí)驗(yàn)。1.2.2重組質(zhì)粒pMD18_T/AhMT2a的構(gòu)建應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從花生幼苗組織中獲得AhMT2a基因片段，與pMD18_T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T/AhMT2a，作為實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)的定量模板。(l)AhMT2a基因片段的制備利用RNA提取試劑盒，從lOOmg花生幼葉中總RNA，通過紫外分光光度計(jì)測量A260/A280的比值，確定RNA的純度和濃度。采用MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。AhMT2a基因引物上游引物5，-GAAGGTGCTGAAATGGGTGT-3，，下游引物5，-CAATTGGATTTGCCTGAGGT-3，；擴(kuò)增程序如下95°C變性2分鐘；95°C15秒_58°C15秒_72°C20秒本步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號收集40個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增片段為229bp。通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，然后在紫外燈下切下目的基因條帶，用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，即獲得純化的AhMT2a基因片段。(2)重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆篩選及鑒定將pMDIS-T載體與AhMT2a基因片段以適當(dāng)比例(摩爾比13110)進(jìn)行連接，連接反應(yīng)時(shí)間為4h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，采用氨芐青霉素抗性LB瓊脂糖平板初次篩選和菌落PCR再次篩選的方法確定陽性菌落，在氨芐青霉素抗性LB培養(yǎng)液中擴(kuò)增陽性菌落，然后從菌液中提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，最后將菌液送去測序進(jìn)行再次驗(yàn)證。1.2.3SYBRGreenI實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法的建立標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制提取重組質(zhì)粒PMD18T_AhMT2a，通過紫外分光光度計(jì)測量質(zhì)粒的A260值，根據(jù)Mr和阿佛加德羅常數(shù)計(jì)算出分子拷貝數(shù)，將重組質(zhì)粒(即實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品)稀釋成1012U0nU010U09U08U07copy/mLo實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的總體系為25iU，其中包括上、下游引物各0.5yl(引物序列同前)，重組質(zhì)粒模板2iU，2XSYBRPremixExTaq12.5ii1(含有TaqDNA聚合酶、dNTP、SYBRGreenI染料等成分)。反應(yīng)條件是95°C預(yù)變性2min后進(jìn)入循環(huán)，94V變性15s，58°C退火15s，72°C延伸20s，共45個(gè)循環(huán)。熒光域值的設(shè)置為315個(gè)循環(huán)左右的熒光信號強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。循環(huán)結(jié)束后，LightCyclersoftware4.05熒光定量分析軟件自動(dòng)繪制擴(kuò)增動(dòng)力曲線和回歸曲線。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的特異性分析通過熔解曲線分析實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物的純度以判斷實(shí)驗(yàn)的特異性。熔解曲線測定的方法是將實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物從65°C緩慢而均勻地升溫至95°C，溫度每秒升高0.2°C讀1次熒光值，由LightCyclersoftware^05熒光定量分析軟件自動(dòng)繪制熔解曲線。1.2.4花生幼苗AhMT2amRNA表達(dá)水平的檢測培養(yǎng)兩個(gè)不同品種花生幼苗，方法同1.2.1。觀察不同品種花生幼苗不同營養(yǎng)器官AhMT2amRNA表達(dá)水平上的差異。按前述方法提取花生幼苗不同營養(yǎng)器官的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。為了避免由于起始細(xì)胞數(shù)目不同而引起的差異，用紫外分光光度計(jì)分別測定各個(gè)營養(yǎng)器官提取的總RNA濃度及反轉(zhuǎn)錄的cDNA濃度，最后將同濃度cDNA樣品作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)條件同1.2.3，最后利用利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中AhMT2acDNA的精確拷貝數(shù)。1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0軟件，對不同營養(yǎng)器官的樣本采用一維方差分析及多重性分析比較，對不同品種同器官的樣本比較采用獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)，取P<0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果與分析2.1花生重組質(zhì)粒pMD18_T/AhMT2a的構(gòu)建從花生幼苗組織中提取總RNA進(jìn)行RT-PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR擴(kuò)增出的產(chǎn)物與目的片段大小一致如圖1所示，該片段純化后用于構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T/AhMT2a。將pMD18-T載體與AhMT2a基因片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，采用氨芐青霉素抗性LB瓊脂糖平板初次篩選陽性克隆進(jìn)行菌落PCR，然后在氨芐青霉素抗性LB培養(yǎng)液中擴(kuò)增陽性菌落，然后從菌液中提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示，PCR產(chǎn)物符合AhMT2a基因片段的預(yù)期大小。同時(shí)測序鑒定也說明序列完全正確，結(jié)果表明重組質(zhì)粒pMD18-T/AhMT2a構(gòu)建成功。2.2SYBRGreenI實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法的建立以重組質(zhì)粒pMD18_T/AhMT2a進(jìn)行不同濃度稀釋作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。從擴(kuò)增動(dòng)力曲線和回歸曲線如圖3所示，可以看出熒光信號的強(qiáng)度和質(zhì)粒的初始拷貝數(shù)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2>0.99，線性范圍從1071012。熔解曲線分析如圖4所示，熔解曲線峰比較單一，沒有雜峰，無非特異性信號干擾，表明實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物純度較高，反應(yīng)具有良好的特異性。2.3花生幼苗AhMT2amRNA表達(dá)水平的檢測花生幼苗不同營養(yǎng)器官提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR得出的Cp值，然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中AhMT2acDNA的精確拷貝數(shù)，結(jié)果如表1所示，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，得出兩品種不同營養(yǎng)器官的AhMT2amRNA表達(dá)具有顯著性差異，其中根>葉>莖，且同一營養(yǎng)器官低積累鎘花生品種XD011的AhMT2amRNA表達(dá)均顯著的低于高積累鎘花生品種XA004(P<0.01)。熔解曲線分析得出峰比較單一，沒有雜峰，無非特異性信號干擾，故該反應(yīng)具有良好的特異性，表明了結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。表1.花生幼苗不同部位AhMT2a基因mRNA表達(dá)水平的差異<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求一種實(shí)時(shí)定量PCR檢測花生金屬硫蛋白mRNA表達(dá)水平的方法，其包括如下步驟1)通過將從花生組織中獲得金屬硫蛋白基因與載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，作為實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品；2)提取含有目的基因的重組質(zhì)粒，計(jì)算出分子拷貝數(shù)，將重組質(zhì)粒稀釋成不同倍數(shù)，即為實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品模板；及3)提取所需組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為實(shí)時(shí)定量PCR模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，得出起始模板的拷貝數(shù)，對其mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測分析。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過RT-PCR技術(shù)獲得步驟1)中所述金屬硫蛋白基因。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中步驟1)中通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后的擴(kuò)增程序如下95°C變性2分鐘；95°C15秒-58°C15秒_72°C20秒，本步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號收集40個(gè)循環(huán)；通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，然后在紫外燈下切下目的基因條帶，用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，即獲得純化的AhMT基因片段。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中步驟1)中所述載體為PMD18-T載體，其與金屬硫蛋白基因片段以摩爾比13110進(jìn)行連接，連接反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟2)中所述實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的總體系為25μ1上、下游引物0.5μ1，模板2μ1，2XSYBRPremixExTaq12.5μ1及滅菌雙蒸水，其中所述SYBRPremixExTaq含有TaqDNA聚合酶、dNTP、SYBRGreenI染料。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟2)中通過紫外分光光度計(jì)測量質(zhì)粒的A260的值，并計(jì)算出分子拷貝數(shù)。8.根據(jù)權(quán)利要求1、6或7中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟2)中所述實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的程序包括第一步預(yù)變性；第二步熒光收集，95°C15秒-58°C15秒_72°C20秒，本步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號收集40個(gè)循環(huán)；第三步融解曲線分析65°C30秒逐步升至95°C，每隔0.2°C收集一次熒光。全文摘要一種實(shí)時(shí)定量PCR檢測花生金屬硫蛋白mRNA表達(dá)水平的方法，其包括如下步驟1)通過將從花生組織中獲得金屬硫蛋白基因與載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，作為實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品；2)提取含有目的基因的重組質(zhì)粒，計(jì)算出分子拷貝數(shù)，將重組質(zhì)粒稀釋成不同倍數(shù)，即為實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品模板；及3)提取所需組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為實(shí)時(shí)定量PCR模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，得出起始模板的拷貝數(shù)，對其mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測分析。文檔編號G01N21/64GK101818205SQ20101017313公開日2010年9月1日申請日期2010年5月5日優(yōu)先權(quán)日2010年5月5日發(fā)明者萬書波,單世華,張廷婷,李春娟,楊志藝,閆彩霞申請人:山東省花生研究所