一種植物免疫誘抗蛋白組合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物免疫誘抗蛋白組合物，具體涉及自于灰葡萄孢菌（BotrytiS cinerea)能促進植物生長和誘導植物產(chǎn)生免疫作用的蛋白組合物及其制備方法和應用，屬 于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 提高農(nóng)作物產(chǎn)量和保障國家糧食安全是我國社會穩(wěn)定、經(jīng)濟發(fā)展的基礎，也是首 要任務。長期以來由病原微生物引起的植物病害是威脅我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一。化 學防治對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展起到了巨大的推動作用，但也嚴重污染了環(huán)境、破壞了生物多樣 性、增強了病原菌的抗藥性。我國現(xiàn)已成為世界第一農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國，單位面積平均化 學農(nóng)藥的用量比世界平均用量高2. 5-5. 0倍。每年遭受殘留農(nóng)藥污染的作物面積達12億 畝，其中污染嚴重的比率達40%，特別是蔬菜、水稻、果樹和茶葉等作物。每年僅因蔬菜農(nóng)藥 殘留導致的中毒事故就達約10萬人次，每年因農(nóng)藥殘留造成的外貿(mào)損失高達約70億美元。 生物農(nóng)藥和生物肥料因其具有生產(chǎn)原料和有效成分天然，對人畜安全無毒，不污染環(huán)境，無 殘留等特點成為國內(nèi)外關注的熱點。
[0003]植物在與病原菌長期的協(xié)同進化中，逐步形成了多種抵抗病原菌入侵的機制。植 物抵抗病原菌的侵染可通過組成性防衛(wèi)機制與誘導性防衛(wèi)機制來實現(xiàn)。植物組成性防衛(wèi)機 制包括細胞壁的角質、蠟質、木質素等。誘導性防衛(wèi)機制是植物的基礎防衛(wèi)反應，它可分為 局部性的防衛(wèi)反應與系統(tǒng)性的防衛(wèi)反應。植物細胞在受到病原菌侵染以后，幾個到十幾個 小時內(nèi)在侵染位點引起過敏反應，導致植物細胞死亡，從而抑制病原菌在植物體內(nèi)繁殖與 擴散。同時病原菌激活了植物的系統(tǒng)抗性，在幾天到幾周的時間內(nèi)，可以使植物對同一種病 原菌，或其它病原菌侵染獲得很強的抗性。系統(tǒng)抗性不同于其它抗病性反應的特征在于系 統(tǒng)抗性對于病原菌的侵染具有廣譜抗性，并伴隨有一系列的抗性基因發(fā)生變化，這種抗性 較為持久。利用植物的誘導抗性防治病害和開發(fā)綠色食品，是當前生態(tài)農(nóng)業(yè)研究中一個新 的緊迫課題。而建立在該理論基礎上的植物免疫誘抗劑被認為是植物保護的新技術和新途 徑，符合我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和環(huán)境保護的重大需求。
[0004] 不僅病原微生物能誘導植物的獲得抗性，還有一類特殊化合物也能激活植物產(chǎn)生 防衛(wèi)反應，統(tǒng)稱之為蛋白質（elicitor)。蛋白質既能顯著提高植物對多種病原物的廣譜 抗性，又不會使病原物產(chǎn)生抗藥性，對環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品無污染。以此為依據(jù)，國內(nèi)外科學家研 制出了多種蛋白質類植物免疫誘抗劑。目前國際上推出的誘抗劑產(chǎn)品主要有Messenger、 Oxycom、KeyPlex、Actigard、NCI、Chitosan 等。
[0005] 1992年美國的Wei從梨火疫病菌（Erwinia amylovora)中分離到harpinEa蛋白， 該蛋白質能夠促進植物生長，誘導植物產(chǎn)生抗病性。2001年，美國康奈爾大學和EDEN生 物科技公司將harpinEa在大腸桿菌中表達，開發(fā)了新型綠色生物農(nóng)藥Messenger,登記劑 型為3%微顆粒劑。在多種大田作物、經(jīng)濟作物上應用，效果均十分明顯。這種農(nóng)藥對黃瓜 病毒病、番茄青枯病的控制效果達70%以上，防治煙蚜的效果達70%以上，作物增產(chǎn)效果達 10%~20%，是一種較為理想的環(huán)境友好型生物農(nóng)藥。
[0006] 我國已經(jīng)獲得正式登記的植物免疫誘抗劑主要有康壯素、殼寡糖和脫落酸等21 個品種，這些免疫誘抗劑已經(jīng)在我國農(nóng)作物生產(chǎn)中起到了越來越重要的作用，也受到了生 產(chǎn)者特別是出口和有機食品種植者的廣泛歡迎。
[0007] 2004年，康壯素（英文名Messenger)經(jīng)我國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所審定通過取得了農(nóng) 藥臨時登記證，首批推薦在番茄、辣椒、煙草和油菜上使用。經(jīng)過多年試驗，抗病增產(chǎn)效果顯 著。來源于細菌的harpinEa蛋白被開發(fā)成綠色農(nóng)藥Messenger，用于病害防治取得了良好 的效果，為蛋白類蛋白質在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用提供了成功的范例。
[0008] 目前國內(nèi)外已從灰葡萄孢菌中分離出許多能夠引起植物產(chǎn)生抗病反應的蛋白質。 但是將灰葡萄孢菌蛋白蛋白質作為植物免疫誘抗劑應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的實例，還未見報道。
[0009] 如2001年V. Repka,等從灰葡萄孢菌中分離了一種蛋白質，該蛋白質主要成分是 蛋白質和糖，它可以引起植物的氧化爆發(fā)和病程相關蛋白的積累，提1?苯丙烷途徑相關酶 的活性（V. R印ka?等，Vitis，2001，40 (4) :205-212) ;2011 年 Mohamed El Oirdi 等從灰葡 萄孢菌中分離了一種胞外多糖，通過SA信號轉導途徑可以有效地誘導番茄對灰霉病的抗 性（Mohamed El Oirdi?等，The Plant Cell, 2011，23:2405-2421)。
[0010] 申請人也從灰葡萄孢菌中先后分離了三種蛋白類蛋白質Pebci、PebC2和BcGSl， 它們的分子量分別為36kDa、14kDa和80kDa。其中PebCl、PebC2來源于灰葡萄孢菌的菌絲 體，二者的共同特征是能促進小麥幼苗生長、增加小麥抗旱性、誘導番茄對灰霉病的系統(tǒng)抗 性，顯著提高番茄體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶（PAL)、過氧化物酶（POD)和多酚氧化酶（PPO)的活 性。但是這兩種蛋白質不能引起煙草的過敏反應，不能提高煙草對煙草花葉病毒病的抗性； BcGSl是來源于灰葡萄孢菌胞外的一種分泌蛋白，它既可以促進小麥幼苗生長、增加小麥抗 旱性、誘導番茄對灰霉病的系統(tǒng)抗性，也可以引起煙草的過敏反應，顯著提高煙草抗花葉病 毒病的能力。PebCl、PebC2和BcGSl三種蛋白質的共同特征是均具有耐熱性，在沸水浴中 加熱30分鐘仍可以保持生物活性。
[0011] 利用灰葡萄孢菌來源的三種蛋白質的生物功能及其理化性質，開發(fā)研制灰葡萄孢 菌植物免疫誘抗蛋白植物保護產(chǎn)品，既可以充分利用每種蛋白質的生物功能，全面提高植 物對多種病蟲草害的防治效果，又可以在生產(chǎn)工藝中減少純化步驟，節(jié)約生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明旨在從灰葡萄孢菌中分離提取能夠誘導植物產(chǎn)生抗性作用的免疫蛋白，促 進植物的生長發(fā)育，抵抗病蟲草害對作物造成的危害，提高作物產(chǎn)量及品質，延長蔬菜水果 的保鮮期等。
[0013] 本發(fā)明的技術方案如下：
[0014] 一種植物免疫誘抗蛋白組合物，其中，有效成分包括分子量分別為36kDa、14kDa 和80kDa的三種活性蛋白質PebCl、PebC2和BcGSl中至少兩種蛋白質的混合物。
[0015] 優(yōu)選的，所述的活性蛋白質PebCl、PebC2和BcGSl在組合物中所占的質量百分數(shù) 均為大于零小于百分之百；更優(yōu)選的，所述的活性蛋白質PebCl、PebC2和BcGSl的質量比為 0- 100 : 0-100 : 0-100;更優(yōu)選的，所述的活性蛋白質PebCl、PebC2和BcGSl的質量比為 1- 100 : 1-100 : 1-100。
[0016] PebCl、PebC2和BcGSl為從灰葡萄孢菌中提取分離的可以誘導植物產(chǎn)生免疫作用 的活性蛋白質。
[0017] 發(fā)明人經(jīng)試驗證明，上述植物免疫誘抗蛋白組合物具有以下功能：
[0018] 1、具有促進植物生長、誘導植物產(chǎn)生免疫抗性的功能；
[0019] 2、具有誘導植物產(chǎn)生抗逆性的功能，其中，所述抗逆功能為抗旱性、耐鹽堿性和/ 或耐寒性；
[0020] 3、可用于植物的病蟲草害的防治；所述病蟲草害的防治為植物的真菌、細菌、病毒 病害的防治，對植物害蟲的趨避作用，對植物雜草具有競爭力生長優(yōu)勢；
[0021] 4、可用于蔬菜水果的保鮮；尤其對番茄、黃瓜、草莓、葡萄、蘋果保鮮效果更佳；
[0022] 5、在制備加工生物農(nóng)藥、生物肥料、保鮮劑方面的用途；
[0023]6、可加工成種衣劑、可濕性粉劑、水分散粒劑、水劑、水乳劑、微乳劑、懸浮劑、粉 劑、微粒劑、生物液態(tài)肥、生物固態(tài)肥、生物凝膠肥。
[0024] 制備上述植物免疫誘抗蛋白組合物中活性蛋白質PebCl、PebC2和BcGSl的方法， 包括以下步驟：
[0025] 首先將灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea)接種于PDA固體平板上，25°C培養(yǎng)1周， 挑取菌落邊緣處接種于200mL盛有察式液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，25°C、180r/min培養(yǎng) 4-5天，得到灰葡萄孢菌的發(fā)酵液，發(fā)酵液抽濾得到灰葡萄孢菌菌絲體和濾液兩個組分，將 菌絲體置于研缽中加液氮研磨成粉末，迅速加入pH為7. 0、濃度為20mmol/L的HEPES緩沖 液，混合均勻后，沸水浴20min，在高速冷凍離心機上12000r/min離心15min，收集上清