草莓生長(zhǎng)素合成限速酶FaYUC11基因及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)，公開(kāi)了一種草莓生長(zhǎng)素合成限速酶基因FaYUC11及用于調(diào)節(jié)果實(shí)大小的應(yīng)用，提供了這個(gè)基因的核酸序列以及蛋白序列。FaYUC11用于調(diào)節(jié)果實(shí)大小的方法包括：構(gòu)建FaYUC11基因的病毒誘導(dǎo)沉默載體；將沉默載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，并用微注射方法感染草莓幼綠果，建立病毒誘導(dǎo)FaYUC11基因沉默的轉(zhuǎn)基因草莓株系。該基因沉默可以導(dǎo)致果實(shí)瘦果(種子)中游離生長(zhǎng)素含量下降，果實(shí)縱橫徑增長(zhǎng)率降低，同時(shí)，影響了果實(shí)硬度和可溶性固形物含量。此基因在草莓果實(shí)大小調(diào)控方面具有很好的應(yīng)用前景，對(duì)于功能性SNP分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和優(yōu)質(zhì)大果草莓的選育具有重要意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】草莓生長(zhǎng)素合成限速酶FaYUC11基因及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及八倍體草莓生長(zhǎng)素限速酶FaYUCll基因 及應(yīng)用，以及用上述基因調(diào)控草莓果實(shí)大小的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 草莓（FragariaXananassa)屬薔薇科草莓屬植物，是重要的鮮食水果作物之一， 也是薔薇科植物重要的功能基因研究的模式物種，其果實(shí)發(fā)育相關(guān)的遺傳和分子生物學(xué)研 究越來(lái)越受到關(guān)注。其中，植物激素的調(diào)控對(duì)于果實(shí)發(fā)育和品質(zhì)形成至為關(guān)鍵。
[0003] 草莓果實(shí)屬"假果"，由花托發(fā)育而來(lái)，植物學(xué)意義的果實(shí)是點(diǎn)綴其表面的種子，后 者又稱(chēng)為瘦果。早在上個(gè)世紀(jì)中期，Nitsch就研究發(fā)現(xiàn)草莓花托的生長(zhǎng)發(fā)育受激素的調(diào)控， 主要是瘦果中合成的生長(zhǎng)素起著重要作用（Nitschl955)。授粉后若去掉草莓花托上的全部 瘦果，花托就會(huì)停止生長(zhǎng)；而去掉花托上的部分種子，則僅含有瘦果的那部分花托發(fā)育，最 后會(huì)長(zhǎng)成畸形的果實(shí)。但是，如果去掉花托上所有的種子，再用人工合成生長(zhǎng)素 NAA涂在花 托上，最后能生長(zhǎng)發(fā)育成正常的果實(shí)。
[0004] 生長(zhǎng)素是植物中最早發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)激素，至今已有近80年（Thimann and Koepfli 等1935)。目前知道生長(zhǎng)素幾乎參與了植物生命的每一個(gè)方面的調(diào)控，包括多種組織器官的 發(fā)育和形態(tài)建成以及對(duì)環(huán)境的響應(yīng)。吲哚乙酸IAA是植物中的主要生長(zhǎng)素，其合成途徑可 能因物種、器官類(lèi)型、發(fā)育階段或環(huán)境條件而有差異。近來(lái)研究表明，依賴(lài)于色氨酸的吲哚 丙酮酸途徑（IPyA pathway of IAA biosynthesis)是多種植物中的主要生長(zhǎng)素合成途徑。 草莓中的研究也表明，IPyA途徑生長(zhǎng)素合成對(duì)草莓生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要（Liu等2014)。
[0005] 僅包括兩步反應(yīng)的IPyA途徑又稱(chēng)為T(mén)AA/YUC途徑：色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶TAA/TAR催 化下由色氨酸產(chǎn)生卩引哚丙酮酸（indole-3-pyruvic acid，IPyA),之后YUC家族黃素單加氧 酶將 IPyA 轉(zhuǎn)變?yōu)?IAA (Mashiguchi 等 2011 ;Abu_Zaitoon 等 2012 ;Stepanova 等 2011)。趙 云德等2001最早報(bào)道了從擬南芥中鑒定出YUC，為色氨酸依賴(lài)生長(zhǎng)素合成限速步驟的關(guān)鍵 酶。近年來(lái)，在包括擬南芥、水稻、玉米、矮牽牛、番茄和草莓等多種植物中發(fā)現(xiàn)來(lái)自TAA/YUC 途徑的生長(zhǎng)素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育很重要。這些研究支持一個(gè)論點(diǎn)，YUC在植物中廣泛存在、高 度保守，經(jīng)由YUC催化合成生長(zhǎng)素可能是植物中生長(zhǎng)素的主要來(lái)源。
[0006] 病毒誘導(dǎo)基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS)是一種操作簡(jiǎn)單、快 速便捷的基因功能鑒定方法。將帶有目的基因片段的病毒載體侵染植物，植物細(xì)胞會(huì)自發(fā) 識(shí)別入侵病毒的威脅，然后利用自身的防衛(wèi)機(jī)制來(lái)抵御并且摧毀病毒和病毒載體上的目的 基因，從而引起目的基因在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)生降解甚至是消除（Lange等2013 Jurkayastha 和Dasgupta2009)。多種植物中都有VIGS基因沉默體系用于研究相應(yīng)基因功能的成功報(bào) 道，特別是有針對(duì)性的研究植物繁殖器官中的特異基因，從而理解植物果實(shí)的發(fā)育與品質(zhì) 形成機(jī)理。廣為運(yùn)用的VIGS沉默載體是雙鏈RNA病毒-煙草脆裂病毒（TRV) (Liu等2002)， 草莓中已成功應(yīng)用（Jia等2011)。
[0007] 果樹(shù)作物的傳統(tǒng)雜交育種周期漫長(zhǎng)。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)可顯著縮短育種周 期，提高育種效率。當(dāng)前，分子標(biāo)記輔助育種對(duì)于加速果樹(shù)傳統(tǒng)雜交育種選育進(jìn)程的重要性 越來(lái)越突顯。新型分子標(biāo)記中的功能性分子標(biāo)記（functional markers，F(xiàn)Ms)，以與表型相 關(guān)的功能基因基序中的功能性單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP)為基礎(chǔ)而開(kāi)發(fā)出，其優(yōu)勢(shì)在于來(lái) 自控制表型的序列模體，與目標(biāo)基因緊密連鎖，可以在多種不同遺傳背景下直接應(yīng)用，能更 有效準(zhǔn)確地篩選和追蹤已知基因。積極鑒定農(nóng)藝性狀相關(guān)基因功能，可為功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā) 和分子育種工作提供重要材料和手段。
[0008] 我國(guó)的草莓生產(chǎn)在總面積和總產(chǎn)量上稱(chēng)得上"草莓大國(guó)"，但與"世界草莓強(qiáng)國(guó)"美 國(guó)、西班牙等相比仍存在一定差距，自育優(yōu)質(zhì)大果草莓品種占世界草莓良種的比例很低，且 平均單產(chǎn)顯著較低。揭示草莓果實(shí)大小調(diào)控分子機(jī)制，對(duì)于果實(shí)大小、重量等相關(guān)功能標(biāo)記 開(kāi)發(fā)和輔助選育適合我國(guó)栽培環(huán)境和消費(fèi)習(xí)慣的大果草莓新種質(zhì)，具有重要意義。
[0009] 參考文獻(xiàn)：
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【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0020] 本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)節(jié)草莓果實(shí)膨大的生長(zhǎng)素合成限速酶FaYUCll基 因及其應(yīng)用。
[0021] 技術(shù)方案為，一種草莓生長(zhǎng)素合成限速酶FaYUCll基因，含有如SEQ ID No. 1所示 的核苷酸序列。優(yōu)選的，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0022] 這種基因來(lái)源于八倍體草莓，編碼生長(zhǎng)素的吲哚丙酮酸合成途徑（IPyA pathway of IAA biosynthesis)中的限速酶-YUCCA類(lèi)黃素單加氧酶（FMO)，含有如SEQ ID No. 2所 示的氨基酸序列。優(yōu)選的，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0023] 上述的基因可用于調(diào)控草莓果實(shí)中的吲哚乙酸（IAA)含量和果實(shí)大小，該基因的 沉默不但可以導(dǎo)致草莓果實(shí)中游離IAA含量下降，還使草莓果實(shí)膨大受到抑制。
[0024] 本發(fā)明利用RT_PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)和病毒誘導(dǎo)基因沉默VIGS (Virus-induced gene silencing)技術(shù)從八倍體草莓中克隆并鑒定了一種新的草莓果實(shí)大小調(diào)控基因 FaYUCll， 該基因編碼生長(zhǎng)素的B引哚丙酮酸合成途徑（IPyA pathway of IAA biosynthesis)中的限 速酶-YUCCA類(lèi)黃素單加氧酶（FMO)。該基因的沉默不但可以導(dǎo)致草莓果實(shí)中游離IAA含量 下降，還使草莓果實(shí)膨大受到抑制。本發(fā)明提供這個(gè)基因的核酸序列以及蛋白序列，同時(shí)還 涉及該基因在草莓果實(shí)大小調(diào)控中的用途。
[0025] 根據(jù)前述的應(yīng)用，將草莓生長(zhǎng)素合成限速酶FaYUCll基因的非保守區(qū)域構(gòu)建到 PTRV2載體的2X35S啟動(dòng)子的下游，形成內(nèi)含子（Intron)隔開(kāi)的雙向發(fā)夾結(jié)構(gòu)，通過(guò)微注 射法轉(zhuǎn)化草莓，并鑒定轉(zhuǎn)基因草莓。FaYUCll基因沉默后，草莓果實(shí)膨大被抑制并且草莓果 實(shí)中游離IAA含量下降。
[0026] 使草莓生長(zhǎng)素合成限速酶FaYUCll基因沉默的方法，是構(gòu)建沉默表達(dá)載體，并與 農(nóng)桿菌混合后侵染草莓。具體步驟為：根據(jù)草莓生長(zhǎng)素合成限速酶FaYUCll基因的CDS序 列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)，如SEQ ID No. 3和No. 4所示。
[0027] 其全長(zhǎng)正向引物 OF 為：5 ' -AAAATGGAGAACAATGTGTTTGGGA-3 ' ；
[0028] 反向引物 OR : 5，-GGACTAGACCTCTCTTGCAGCAT-3，。
[0029] 以八倍體"久香"草莓瘦果cDNA為模版，利用上述引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得FaYUCll 基因全序列；將PCR產(chǎn)物克隆至pUCm-T載體上，經(jīng)測(cè)序正確。
[0030] 根據(jù)草莓YUC全家族序列比對(duì)結(jié)果，選擇FaYUCll基因特異區(qū)域，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出 253bp的基因特異引物對(duì)，如SEQ ID No. 5和No. 6所示。
[0031] 正向引物 RiF: 5 ' -TTCTGCTCTCTGCCGATGAT-3 ' ；
[0032] 反向引物 RiR :5，-CTCCAGTCGCAATTACCAAG-3，。
[0033] 以前面所獲得全長(zhǎng)基因的T質(zhì)粒為模版，利用RiF和RiR引物對(duì)，通過(guò)PCR擴(kuò)增 獲得FaYUCll基因的253bp片段，利用體外重組方法分兩步克隆進(jìn)pBSK-in載體（Duan等 2008)的Intron兩端，形成了帶有2個(gè)FaYUCll基因片段的重組質(zhì)粒pBSK-in-dYUCll，其 中2個(gè)YUCll基因片段方向相反，且中間為一個(gè)內(nèi)含子Intron隔開(kāi)。具體為：該基因片段 首先克隆到PUCm-T載體上，再將含有該FaYUCll基因片段的pUCm-T質(zhì)粒經(jīng)PstI和BamHI 雙酶切，通過(guò)體外重組將基因片段轉(zhuǎn)移進(jìn)入用相同組合酶切的PUCm-T質(zhì)粒上；再次用PstI 和Sail酶切含有FaYUCll基因片段的pUCm-T質(zhì)粒，將切下的基因片段通過(guò)體外重組轉(zhuǎn)移 進(jìn)入用NsiI和Sail線性化的已含有一個(gè)FaYUCll基因片段的pBSK-in載體。
[0034] 進(jìn)一步用KpnI酶和SacI酶雙酶切pBSK-in-dYUCll重組質(zhì)粒，將FaYUCll基因片 段的雙向發(fā)夾結(jié)構(gòu)克隆至煙草脆裂病毒PTRV2 (Liu等2002)的2 X 35S啟動(dòng)子后病毒CP蛋 白的下游，獲得pTRV2-dYUCl 1重組載體即沉默載體?；旌虾袩煵荽嗔巡《镜腞NAl和RNA2 的農(nóng)桿菌，采用農(nóng)桿菌微注射法處理草莓小綠果，經(jīng)過(guò)連續(xù)拍照觀察，結(jié)合TRV病毒RNA1/2 特異引物和FaYUCll的RT-PCR檢測(cè)篩選，最終獲得病毒誘導(dǎo)FaYUCll沉默的草莓果實(shí)。
[0035] 本發(fā)明首次利用病毒誘導(dǎo)基因沉默方法，構(gòu)建FaYUCll的煙草脆裂病毒沉默載 體，并利用微注射方法轉(zhuǎn)化到草莓，改變果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育，從而影響草莓產(chǎn)量和品質(zhì)。對(duì)于詳 細(xì)闡明草莓果實(shí)膨大的激素調(diào)控機(jī)理具有重要的理論價(jià)值，并且可以通過(guò)對(duì)該基因及其等 位基因的單核苷酸多態(tài)性研究為基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)出果實(shí)大小相關(guān)的功能性分子標(biāo)記，在草莓分 子育種和大果優(yōu)質(zhì)草莓選育中也具有重要意義。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中所構(gòu)建目標(biāo)基因的病毒誘導(dǎo)沉默載體（pTRV2_dYUCll載 體）圖譜。
[0037] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中病毒陽(yáng)性株系的RT-PCR鑒定結(jié)果。采用TRV2特異引物 對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)，其中泳道1為八倍體草莓"久香"的果實(shí)，泳道2為CKl不含 目標(biāo)基因片段的TRV農(nóng)桿菌注射的久香果實(shí)，泳道3為RiYUCll目標(biāo)基因沉默載體農(nóng)桿菌 注射的久香果實(shí)。
[0038] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中FaYUCll基因沉默的qRT-PCR鑒定結(jié)果，為草莓生長(zhǎng)素 合成基因 FaYUCll在對(duì)照（CKl)久香草莓及2個(gè)病毒誘導(dǎo)基因沉默株系中的表達(dá)?？v坐標(biāo) 為real-time PCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)檢測(cè)該基因在對(duì)照CKl或病毒誘導(dǎo)基因沉默株系中 的相對(duì)表達(dá)量（相對(duì)于未注射病毒沉默載體的野生型）。
[0039] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中病毒誘導(dǎo)基因沉默后果實(shí)表型分析，為對(duì)照（CK1，不含目 標(biāo)基因插入的病毒空載體轉(zhuǎn)化）和2個(gè)病毒誘導(dǎo)基因沉默株系（RiYUCl 1-2和RiYUCl 1-3) 果實(shí)處理34天后的形態(tài)。與對(duì)照相比，病毒誘導(dǎo)基因沉默果實(shí)膨大明顯受抑制，而對(duì)照果 實(shí)膨大正常。
[0040] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中病毒誘導(dǎo)基因沉默株系與對(duì)照草莓瘦果中自由IAA的含 量差異。縱坐標(biāo)顯示通過(guò)GC-MS方法所測(cè)定的草莓瘦果中的IAA含量。
[0041] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例4中病毒誘導(dǎo)沉默株系和對(duì)照的果實(shí)縱、橫徑增長(zhǎng)比例的差 異?？v坐標(biāo)顯示微注射前后縱、橫徑變化相比于注射前的比值。

【具體實(shí)施方式】
[0042] 以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0043] 實(shí)施例IFaYUCll基因的分離和病毒誘導(dǎo)基因沉默載體構(gòu)建
[0044] 根據(jù)二倍體森林草莓YUC全家族基因序列信息（Liu等2014)，在八倍體栽培草莓 果實(shí)（分花托和瘦果）中解析全家族基因基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FaYUCll是該家 族唯一在瘦果中高表達(dá)成員，且其動(dòng)態(tài)表達(dá)模式和瘦果中生長(zhǎng)素積累動(dòng)態(tài)模式一致。
[0045] 根據(jù)森林草莓同源基因的序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，正向引物OF :
[0046] 5，-AAAATGGAGAACAATGTGITTGGGA-3，；反向引物 OR :
[0047] 5' -GGACTAGACCTCTCTTGCAGCAT-3'，分別如 SEQ ID No. 3 和 4 所示。
[0048] 以野生型久香草莓果實(shí)cDNA為模版，采用全式金高保真酶（來(lái)自北京TransGene 公司）用上述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得FaYUCll全序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示，其所編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0049] 按照TranStart聚合酶擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物連接克隆 到pUCm-Τ載體上，經(jīng)測(cè)序鑒定得到與目的基因完全相同的序列，如SEQ ID No. 1。
[0050] 之后，再根據(jù)久香草莓YUC全家族成員的序列比對(duì)結(jié)果，選取靠5'端的基因 特異區(qū)域，設(shè)計(jì)了干涉引物對(duì)，正向引物：5' -TTCTGCTCTCTGCCGATGAT-3'和反向引物： 5' -CTCCAGTCGCAATTACCAAG-3'，分別如 SEQ ID No. 5 和 6 所示。
[0051] 以所獲得全長(zhǎng)基因質(zhì)粒為模版，利用上述所設(shè)計(jì)干涉引物對(duì)，PCR擴(kuò)增獲得了 253bp的基因片段。該基因片段首先克隆到pUCm-T載體上，然后再經(jīng)過(guò)兩次體外重組轉(zhuǎn)移 到pBSK-in載體的intron序列兩端，最后經(jīng)KpnI和SacI雙酶切點(diǎn)整合進(jìn)病毒RNA2質(zhì)粒 PTRV2中，得到pTRV2-dYUCll病毒誘導(dǎo)基因沉默載體。載體圖譜見(jiàn)圖1。
[0052] 其中，中間載體pBSK-in-dYUCll的構(gòu)建過(guò)程為：首先將含有FaYUCll基因片段 (253bp)的pUCm-T質(zhì)粒經(jīng)PstI和BamHI雙酶切，通過(guò)體外重組將基因片段轉(zhuǎn)移進(jìn)入用相同 組合酶切的pUCm-Τ質(zhì)粒（上海生工生物工程有限公司）上。之后，再次用PstI和Sail酶 切含有FaYUCll基因片段的pUCm-T質(zhì)粒，將切下的基因片段通過(guò)體外重組轉(zhuǎn)移進(jìn)入用NsiI 和Sail線性化的已含有一個(gè)目標(biāo)基因片段的pBSK-in載體，就得到了含有2個(gè)FaYUCll基 因片段的重組質(zhì)粒pBSK-in-dYUCll，其中2個(gè)YUCll基因片段方向相反，且中間被一個(gè)內(nèi)含 子（Intron)隔開(kāi)。
[0053] 實(shí)施例2病毒誘導(dǎo)基因沉默草莓的獲得
[0054] 進(jìn)一步用KpnI酶和SacI酶雙酶切pBSK-in-dYUCll重組質(zhì)粒，將FaYUCll基因片 段的雙向發(fā)夾結(jié)構(gòu)克隆至煙草脆裂病毒PTRV2 (Liu等2002)的2 X 35S啟動(dòng)子后病毒CP蛋 白的下游，獲得pTRV2-dYUCll重組載體?；旌虾袩煵荽嗔巡《镜腞NAl和RNA2的農(nóng)桿菌。
[0055] 將含有目標(biāo)基因病毒誘導(dǎo)沉默表達(dá)載體以及空pTRVl和pTRV2載體的GV3101農(nóng) 桿菌接種于含50yg/mL Kan、10yg/mL Rif和50yg/mL Gen的5mL YEP培養(yǎng)基中28°C培養(yǎng) 過(guò)夜，次日按照1 :50的比例接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基（YEP，含有10mM/L MES、20yM/L AS、50yg/ 11^1^11、1(^8/11^1^€和5(^8/11^6611)中，281：搖菌至對(duì)數(shù)期（00值0.6-0.8)，50001·/!^!! 離心IOmin收集菌體，再用侵染緩沖液（含有10mM/L MES、100yM/L AS、10mM/L MgCl2)重 懸菌體，并調(diào)節(jié)菌液濃度至〇D值為I. 2-1. 5間，28°C放置3h后用于接種草莓果實(shí)（以智 能人工溫室中的"久香"草莓小綠果為材料）。然后將含有PTRVl的GV3101菌液與含有 pTRV2-dYUCll的GV3101菌液按1:1體積混勻，使用微注射方法將混合的菌液，從果實(shí)頂部 注入，控制環(huán)境溫度在25-28°C，保證病毒有效侵染。
[0056] 實(shí)施例3病毒誘導(dǎo)基因沉默草莓的鑒定
[0057] 為了檢測(cè)煙草脆裂病毒是否成功侵染草莓，分別提取野生型和注射病毒原始載體 以及重組的FaYUCll的病毒誘導(dǎo)沉默載體的草莓果實(shí)總RNA，利用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合 成 cDNA。
[0058] 按照J(rèn)ia等2011文獻(xiàn)提供煙草脆裂病毒RNA2的特異引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，來(lái)鑒 定病毒侵染的草莓果實(shí)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒原始載體和FaYUCll的 重組病毒載體侵染的草莓果實(shí)能擴(kuò)增出病毒特異條帶（如圖2)，而野生型草莓中無(wú)此目的 條帶。初步確定，煙草脆裂病毒已通過(guò)微注射方法侵染了草莓果實(shí)。
[0059] 進(jìn)一步地，在所選構(gòu)建病毒沉默載體的片段下游，設(shè)計(jì)FaYUCll新的特異引物對(duì)。 正向引物：5' -GGAAAGGTGAAAAGGGCGT-3' ；反向引物：
[0060] 5' -GACCTCTCTTGCAGCATTAC-3，。
[0061] 通過(guò)RT-PCR在轉(zhuǎn)錄水平鑒定病毒誘導(dǎo)基因沉默的效果。取兩個(gè)用重組病毒誘導(dǎo) 的FaYUCll基因沉默株系進(jìn)行驗(yàn)證，分別用RiYUCl 1-2和RiYUCl 1-3表示。
[0062] 結(jié)果表明，相比于注射含原始病毒質(zhì)粒農(nóng)桿菌的果實(shí)，部分微注射含F(xiàn)aYUCll重 組的病毒誘導(dǎo)沉默質(zhì)粒農(nóng)桿菌的果實(shí)中發(fā)生了 FaYUCll的不同程度轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物積累水平下 降，如圖3。
[0063] 實(shí)施例4病毒誘導(dǎo)基因沉默草莓表型分析
[0064] 將原始病毒侵染草莓果實(shí)和野生型同發(fā)育時(shí)期的草莓果實(shí)相比較，發(fā)現(xiàn)含原始 TRV病毒的農(nóng)桿菌注射后果實(shí)頂部有輕微凹陷，此外果實(shí)膨大和基本形態(tài)未受到明顯影響。 進(jìn)一步的表型分析發(fā)現(xiàn)，注射重組病毒載體農(nóng)桿菌的草莓果實(shí)膨大受到抑制，部分果實(shí)經(jīng) 過(guò)一個(gè)月的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有變大，仍然處于小綠果階段，另外有部分果實(shí)膨大所受的抑制要 輕微些，如圖4。
[0065] 通過(guò)GC-MS方法測(cè)定草莓果實(shí)種子（瘦果）中的IAA，可以明顯看出病毒誘導(dǎo) FaYUCll沉默的草莓果實(shí)不僅膨大受到抑制，生長(zhǎng)素含量也明顯下降，如圖5。進(jìn)一步通過(guò) 果實(shí)縱橫徑測(cè)定，與微注射含病毒農(nóng)桿菌之前的果實(shí)大小數(shù)據(jù)相比較，可以明顯看出重組 FaYUCll的病毒誘導(dǎo)沉默載體注射的草莓果實(shí)比原始病毒載體注射果實(shí)的縱橫徑增長(zhǎng)比例 小，如圖6。
[0066] 結(jié)果證明，該基因沉默可以導(dǎo)致果實(shí)瘦果（種子）中游離生長(zhǎng)素含量下降，果實(shí)縱 橫徑增長(zhǎng)率降低，同時(shí)，影響了果實(shí)硬度和可溶性固形物含量。此基因在草莓果實(shí)大小調(diào)控 方面具有很好的應(yīng)用前景，對(duì)于功能性SNP分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和優(yōu)質(zhì)大果草莓的選育具有重 要意義。
[0067] 雖然，以上已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本 發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此， 在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所作的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 草莓生長(zhǎng)素合成限速酶FaYUCll基因，其特征在于，含有SEQ ID No. 1所示的核苷酸 序列。
2. 草莓生長(zhǎng)素合成限速酶FaYUCll基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所 /_J、i 〇
3. 權(quán)利要求1或2所述草莓生長(zhǎng)素合成限速酶FaYUCll基因在調(diào)控果實(shí)大小方面的應(yīng) 用。
4. 權(quán)利要求1或2所述草莓生長(zhǎng)素合成限速酶FaYUCll基因用于調(diào)控果實(shí)中吲哚乙酸 的含量。
5. -種草莓生植物合成限速酶，其特征在于，含有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
6. 權(quán)利要求5所述草莓生植物合成限速酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所 /_J、i 〇
7. 權(quán)利要求5所述草莓生植物合成限速酶，其特征在于，由權(quán)利要求1或2所述基因編 碼。
8. 權(quán)利要求1或所述草莓生長(zhǎng)素合成限速酶FaYUCll基因沉默的方法，其特征在于，構(gòu) 建沉默表達(dá)載體，并與農(nóng)桿菌混合后侵染草莓。
9. 權(quán)利要求8所述草莓生長(zhǎng)素合成限速酶FaYUCl 1基因沉默的方法，其特征在于，所述 沉默表達(dá)載體的構(gòu)建方法為： 以SEQ ID No. 5和No. 6的序列為引物，F(xiàn)aYUCll基因全長(zhǎng)序列為模板，獲得253bp的 FaYUCll基因片段； 該基因片段首先克隆到pUCm-T載體上，再將含有該FaYUCll基因片段的pUCm-T質(zhì)粒 經(jīng)PstI和BamHI雙酶切，通過(guò)體外重組將基因片段轉(zhuǎn)移進(jìn)入用相同組合酶切的pUCm-T質(zhì) 粒上； 再次用PstI和Sail酶切含有FaYUCll基因片段的pUCm-T質(zhì)粒，將切下的基因片段通 過(guò)體外重組轉(zhuǎn)移進(jìn)入用Nsil和Sail線性化的已含有一個(gè)FaYUCll基因片段的pBSK-in載 體，得到含有2個(gè)FaYUC 11基因片段的重組質(zhì)粒pBSK-in-dYUC 11，其中2個(gè)YUC11基因片段 方向相反，且中間為一個(gè)內(nèi)含子隔開(kāi)； 進(jìn)一步用Kpnl酶和SacI酶雙酶切pBSK-in-dYUCll重組質(zhì)粒，將FaYUCll基因片段 的雙向發(fā)夾結(jié)構(gòu)克隆至煙草脆裂病毒PTRV2的2X35S啟動(dòng)子后病毒CP蛋白的下游，獲得 pTRV2-dYUCll重組載體，即為沉默表達(dá)載體。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK104388443SQ201410663152
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】段可, 謝為發(fā), 高清華, 張玲 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院