一種組蛋白去乙?；敢种苿┑暮Y選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種組蛋白去乙?；敢种苿┑暮Y選方法，包括如下步驟：將包含6個串聯(lián)重復(fù)TCF4轉(zhuǎn)錄因子的7TFP質(zhì)粒采用慢病毒轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞形成穩(wěn)定細(xì)胞株，并種植于96孔培養(yǎng)板，過夜貼壁后更換培養(yǎng)基，并加入待測樣品，取出上述培養(yǎng)板，加入細(xì)胞裂解液，取上清液，測定藥物處理前后細(xì)胞的熒光素酶基因表達(dá)強(qiáng)度，熒光素酶基因增強(qiáng)，即說明待測樣品為篩選的得到的組蛋白去乙?；敢种苿?。本發(fā)明可以有效的準(zhǔn)確的檢測出組蛋白去乙?；敢种苿鉀Q了了假陰性和假陽性的問題，降低了成本，具有簡單，高效、低成本的特點(diǎn)。
【專利說明】一種組蛋白去乙?；敢种苿┑暮Y選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種組蛋白去乙?；敢种苿┑暮Y選方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 組蛋白去乙?；福℉DAC)抑制劑是一類新型的藥物，在腫瘤、心血管等疾病的治 療中存在重要的應(yīng)用前景。一些重要的抑制劑業(yè)已進(jìn)入臨床階段研究。比如，SAHA和FK228 已經(jīng)被美國FDA批準(zhǔn)用于CTCL的治療，VPA也已進(jìn)入臨床II /III研究階段。然而，要想獲 得更多、更為有效的新型藥物，必須有更加有效的篩選方案。
[0003] 在特定的結(jié)腸癌細(xì)胞中，HDAC可影響轉(zhuǎn)錄因子TCF4的轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)采用小分子 化合物抑制HDAC活性時(shí)，TCF4的轉(zhuǎn)錄活性明顯升高，其轉(zhuǎn)錄活性可以通過報(bào)告基因（熒光 素酶或者EGFP)加以測定。對一些已知HDAC抑制劑的分析均獲得了一致的結(jié)果。此外，我 們采用RNAi技術(shù)干擾HDAC基因表達(dá)（同樣達(dá)到抑制HDAC活性的目的），TCF4的轉(zhuǎn)錄活性 也明顯升高。然而，在其它細(xì)胞如食管癌細(xì)胞中則沒有這個效應(yīng)。因此，在這個特定的結(jié)腸 癌細(xì)胞中，TCF4基因的表達(dá)可以反映出HDAC抑制劑的效應(yīng)。
[0004] 目前獲準(zhǔn)的專利或發(fā)表論文中，在對組蛋白去乙?；敢种苿┑暮Y選時(shí)直接采用 的組蛋白去乙?；富虻膯幼域?qū)動報(bào)告基因（熒光素酶）或者是采用P21基因啟動子 驅(qū)動報(bào)告基因來進(jìn)行篩選。盡管目前已知的多數(shù)抑制劑可以激活P21基因啟動子的轉(zhuǎn)錄， 但這不是全部抑制劑均有的共同之處。因此，采用P21啟動子篩選可能出現(xiàn)假陰性問題。另 夕卜，和P21啟動子一樣，采用組蛋白去乙?；富虻膯幼右部赡懿皇翘禺惖谋憩F(xiàn)，存在 假陽性的問題。因此，這些方法均有一定的局限，本發(fā)明將TCF4反應(yīng)元件分別與熒光素酶 基因（可通過法學(xué)反應(yīng)測定熒光素酶基因表達(dá)強(qiáng)度）連接構(gòu)建慢病毒報(bào)告載體，同時(shí)構(gòu)建 不含TCF4反應(yīng)元件的對照載體。將兩種報(bào)告載體通過慢病毒轉(zhuǎn)移至特定的結(jié)腸癌細(xì)胞中， 獲得穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告基因的細(xì)胞株。在對（小分子）藥物庫進(jìn)行篩選時(shí)，利用熒光素酶基因 報(bào)告體系進(jìn)行精確篩選，可獲得具有抑制HDAC活性的抑制劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是要解決臨床對組蛋白去乙?；敢种苿┑男枨?，針對現(xiàn)有篩選 利用P21基因啟動子驅(qū)動報(bào)告基因來進(jìn)行篩選，存在假陰性和假陽性的可能，旨在提供一 種組蛋白去乙酰化酶抑制劑的篩選方法，具有簡單，高效、低成本的特點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種組蛋白去乙?；敢种苿┑暮Y選方法，包括如下步驟：
[0008] 1)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞形成穩(wěn)定細(xì)胞株；
[0009] 2)將獲得的細(xì)胞株種植于96孔培養(yǎng)板，過夜貼壁后更換培養(yǎng)基，并加入待測樣 品；
[0010] 3)取出上述培養(yǎng)板，加入細(xì)胞裂解液，取上清液，測定藥物處理前后細(xì)胞的熒光素 酶基因表達(dá)強(qiáng)度，熒光素酶基因增強(qiáng)，即說明待測樣品為篩選的得到的組蛋白去乙?；?抑制劑。
[0011] 所述的質(zhì)粒為7TFP質(zhì)粒，包含6個串聯(lián)重復(fù)TCF4轉(zhuǎn)錄因子；
[0012] 所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染采用慢病毒轉(zhuǎn)移的方式；
[0013] 所述的宿主細(xì)胞為結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116,同時(shí)還可以為EK293細(xì)胞或SW480細(xì)胞；
[0014] 所述的結(jié)腸癌細(xì)胞株可以穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因；
[0015] 本發(fā)明所述的結(jié)腸癌細(xì)胞中，組蛋白去乙?；敢种苿┡cTCF4基因表達(dá)呈負(fù)相 關(guān)，即當(dāng)高表達(dá)HDAC時(shí)，TCF4轉(zhuǎn)錄活性降低，而當(dāng)HDAC活性被抑制后，TCF4轉(zhuǎn)錄活性顯著 增加。
[0016] 本發(fā)明的有益效果為：
[0017] 1)特異性，在特定的結(jié)腸癌細(xì)胞中，HDAC與TCF4基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)：即抑制HDAC 后TCF4的轉(zhuǎn)錄活性明顯上升，而對TCF4的轉(zhuǎn)錄活性檢測可以采用其特異的反應(yīng)元件來驅(qū) 動報(bào)告基因來加以展示。因此，我們的篩選方案具有特異性。
[0018] 2)成本低，由于陽性藥物可改變熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)強(qiáng)度至上百倍，因此在檢 測時(shí)可將十個藥物分別處理細(xì)胞后合并檢測，仍可以有效判斷是否存在陽性藥物。合并檢 測可以達(dá)到降低成本的目的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1抑制劑對TCF4轉(zhuǎn)錄活性的影響；
[0020] 圖2嘌呤霉素篩選的細(xì)胞克??；
[0021] 圖3基因組DNA中7TFP整合的PCR證實(shí)。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù) 本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同變化與改型，均落在本發(fā)明的 保護(hù)范圍內(nèi)。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c（NaB)的篩選方法，用曲古柳菌素（TSA)作為陽 性對照。
[0025] 實(shí)驗(yàn)材料：7TFP質(zhì)粒來自Addgene，其序列60-161為TCF4反應(yīng)元件。
[0026] 試驗(yàn)方法：分別將質(zhì)粒7TFP通過慢病毒轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞形成穩(wěn)定細(xì) 胞株TCF4+LUC，將所獲得的TCF4+LUC細(xì)胞種植于96孔板，IO 4細(xì)胞/孔，過夜貼壁后更換培 養(yǎng)基，加入含NaB (濃度分別為0. 2, I. 0和5. OmM)和TSA (濃度分別為0. 1，0. 4和I. 0 μ M) 進(jìn)行處理24小時(shí)，以未加藥物處理的細(xì)胞為對照。取出培養(yǎng)板，吸取培養(yǎng)基，加入細(xì)胞裂解 液，37°裂解30分鐘后取裂解液上清進(jìn)行測定。采用化學(xué)發(fā)光方法測定熒光素酶活性。
[0027] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)過測定發(fā)現(xiàn)熒光素酶活性明顯增強(qiáng)，說明TCF4的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，根 據(jù)當(dāng)高表達(dá)HDAC時(shí)，TCF4轉(zhuǎn)錄活性降低，而當(dāng)HDAC活性被抑制后，TCF4轉(zhuǎn)錄活性顯著增 加的機(jī)理，表示抑制劑NaB和TSA對組蛋白去乙?；福℉DAC)具有很好的抑制作用，其對 TCF4轉(zhuǎn)錄活性抑制影響如圖1。
[0028] 實(shí)施例2慢病毒的包裝及細(xì)胞感染
[0029] 將7TFP質(zhì)粒利用PstI (35)和NheI (174)雙酶切再后利用核酸酶切平自連，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌，利用PCR方法篩選獲得去除TCF4反應(yīng)元件從而獲得對照質(zhì)粒7TFP-Con。
[0030] 常規(guī)方法培養(yǎng)包裝細(xì)胞人胚腎293FT。將其種植于6孔板，待60%滿底時(shí)進(jìn)行脂 質(zhì)體轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒組合八:71卩卩+?]\?2丄+?8?412 ;8:71卩?-(：〇11+?]\?2丄+?8?412。三種質(zhì)粒按 1: 1:1混合進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集培養(yǎng)上清液（含慢病毒顆粒）備用。
[0031] 常規(guī)方法培養(yǎng)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞。將其種植于6孔板，待60%滿底時(shí)加入含病毒 的上清液感染4小時(shí)，換液后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。將培養(yǎng)基更換為含嘌呤霉素（2 μ g/mL)的 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞克隆團(tuán)塊出現(xiàn)圖2。培養(yǎng)單個細(xì)胞克隆，分別命名為TCF4+Luc 細(xì)胞和Con-Luc細(xì)胞，各四個克隆株。為了證實(shí)慢病毒介導(dǎo)的外源DNA整合，提取細(xì)胞基因 組DNA進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒感染后所獲得的HCT116細(xì)胞能擴(kuò)增出特異條帶圖3。
[0032] 實(shí)施例3已知HDAC抑制劑的效應(yīng)
[0033] 分別將TCF4+Luc細(xì)胞和Con-Luc細(xì)胞種植于96孔板，待60 %滿底時(shí)加入 TSA(IyM)處理24小時(shí)。去培養(yǎng)基后裂解細(xì)胞測定熒光素酶活性。以每個細(xì)胞的TSA/N確 定細(xì)胞對藥物的反應(yīng)性，結(jié)果顯示TCF4+Luc細(xì)胞均可被TSA激活，而Con-Luc細(xì)胞無顯著 反應(yīng)，如表1所示：
[0034] 表1熒光素酶活性測定
[0035]

【權(quán)利要求】
1. 一種組蛋白去乙?；敢种苿┑暮Y選方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞形成穩(wěn)定細(xì)胞株； 2) 將獲得的細(xì)胞株種植于96孔培養(yǎng)板，過夜貼壁后更換培養(yǎng)基，并加入待測樣品； 3) 取出上述培養(yǎng)板，加入細(xì)胞裂解液，取上清液，測定藥物處理前后細(xì)胞的熒光素酶基 因表達(dá)強(qiáng)度，熒光素酶基因增強(qiáng)，即說明待測樣品為篩選的得到的組蛋白去乙酰化酶抑制 劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑的篩選方法，其特征在于：所 述的質(zhì)粒為HFP質(zhì)粒，包含6個串聯(lián)重復(fù)TCF4轉(zhuǎn)錄因子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組蛋白去乙?；敢种苿┑暮Y選方法，其特征在于：步 驟（1)所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染采用慢病毒轉(zhuǎn)移的方式。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組蛋白去乙?；敢种苿┑暮Y選方法，其特征在于：所 述的宿主細(xì)胞為結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、細(xì)胞EK293或SW480。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種組蛋白去乙?；敢种苿┑暮Y選方法，其特征在于：所 述的結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116用于穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的用途。
【文檔編號】C12Q1/02GK104388538SQ201410672070
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】章波, 龐學(xué)利, 黃鋼, 何剛, 徐小峰, 宋敏 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)