一種液滴式樣品熒光檢測(cè)系統(tǒng)和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種液滴式樣品熒光檢測(cè)系統(tǒng)和方法，系統(tǒng)包括：激發(fā)光模塊(1)、激發(fā)光探測(cè)模塊(3)、熒光探測(cè)模塊(4)以及控制器模塊(6)，所述控制器模塊(6)連接熒光探測(cè)模塊(4)和激發(fā)光探測(cè)模塊(3)，且在激發(fā)光模塊(1)和熒光探測(cè)模塊(4)之間設(shè)有檢測(cè)通道(32)，所述檢測(cè)管路中設(shè)有待測(cè)的液滴樣品，所述激發(fā)光模塊(1)發(fā)出的光照射并激發(fā)，所述液滴樣品中含有熒光染料的液滴發(fā)出熒光，所述熒光被所述熒光探測(cè)模塊(4)接收后轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)，并發(fā)送到控制器模塊(6)。
【專利說明】一種液滴式樣品焚光檢測(cè)系統(tǒng)和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于一種液滴式樣品熒光檢測(cè)系統(tǒng)和方法，適用于數(shù)字PCR技術(shù)。

【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年代中期發(fā)展起來的 體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。它可用于基因分離、 克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究。數(shù)字PCR是近年來發(fā)展迅速的新一代定量PCR分析技術(shù)， 利用微流控技術(shù)將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模 板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有至少一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì) 給出熒光信號(hào)，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以 推算出原始溶液的核酸濃度。與傳統(tǒng)的熒光定量PCR相比，具有高靈敏度、高特異性、無需 標(biāo)準(zhǔn)定量曲線等優(yōu)點(diǎn)。數(shù)字PCR技術(shù)提出至今，相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展都非常迅速，迄今為 止，數(shù)字PCR技術(shù)主要有三類：微反應(yīng)室孔板、大規(guī)模集成微流控芯片和液滴數(shù)字PCR系 統(tǒng)。
[0003] 早期的數(shù)字PCR采用96/384孔板作為反應(yīng)單元，隨著對(duì)測(cè)試靈敏度和準(zhǔn)確度的要 求不斷提高，反應(yīng)單元的數(shù)目不斷增加，使得操作的復(fù)雜度和所需試劑量也成倍增加。大規(guī) 模集成微流控芯片技術(shù)的出現(xiàn)為數(shù)字PCR分析提供了一個(gè)低成本、小體積和高通量平行分 析的方案。液滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)源于乳液PCR技術(shù)，通過油水兩相間隔得到的以液滴為單 位的PCR反應(yīng)體系，比微孔板和集成微流控芯片系統(tǒng)更容易實(shí)現(xiàn)小體積和高通量，而且系 統(tǒng)簡(jiǎn)單，成本低，因此成為理想的數(shù)字PCR技術(shù)平臺(tái)。
[0004] 目前液滴式數(shù)字PCR中的檢測(cè)方法可分為誘導(dǎo)熒光檢測(cè)和顯微鏡成像兩種。由 于顯微鏡在實(shí)驗(yàn)室中的普遍應(yīng)用，顯微鏡成像法在科學(xué)研究中使用相當(dāng)廣泛。配備高速攝 像機(jī)的明場(chǎng)顯微鏡可以很方便地獲得液滴的各種參數(shù)，如形狀、大小、顏色以及其他肉眼可 觀察的參數(shù)，但其靈敏度卻相當(dāng)有限。熒光顯微鏡通過使用高靈敏CCD和特殊設(shè)計(jì)的濾光 片，具有良好的弱光捕捉能力，能夠捕捉到極其微弱的熒光，可準(zhǔn)確區(qū)分含有不同數(shù)量目標(biāo) 分子的液滴，從而大大提高其檢測(cè)靈敏度。然而受限于CCD幀速率，顯微鏡成像技術(shù)在高通 量、連續(xù)測(cè)量的商業(yè)應(yīng)用場(chǎng)合使用較少。
[0005] 誘導(dǎo)熒光檢測(cè)技術(shù)以其高速、高靈敏度的優(yōu)勢(shì)在商業(yè)化數(shù)字PCR設(shè)備中獲得廣泛 應(yīng)用。通常的熒光檢測(cè)系統(tǒng)包含熒光激發(fā)、樣品池、熒光探測(cè)等功能模塊，檢測(cè)時(shí)通過將接 收到的熒光強(qiáng)度與事先設(shè)定的數(shù)值做對(duì)比，當(dāng)熒光強(qiáng)度大于閾值時(shí)便視為存在熒光反應(yīng)。 由于激發(fā)的熒光強(qiáng)度微弱，易受環(huán)境影響，可能為熒光檢測(cè)過程中引入誤差的來源包括光 源信號(hào)強(qiáng)度、液滴頻率、液滴大小等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種液滴式樣品熒光檢測(cè)系統(tǒng)和方法，用以解 決現(xiàn)有技術(shù)中存在的檢測(cè)不精準(zhǔn)的缺點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案如下：
[0008] -種液滴式樣品熒光檢測(cè)系統(tǒng)，包括：激發(fā)光模塊（1)、激發(fā)光探測(cè)模塊（3)、熒光 探測(cè)模塊（4)以及控制器模塊￠)，所述控制器模塊（6)連接熒光探測(cè)模塊（4)和激發(fā)光探 測(cè)模塊（3)，且在激發(fā)光模塊（1)和熒光探測(cè)模塊（4)之間設(shè)有檢測(cè)通道（32)，所述檢測(cè)管 路中設(shè)有待測(cè)的液滴樣品，所述激發(fā)光模塊（1)發(fā)出的光照射并激發(fā)，所述液滴樣品中含 有熒光染料的液滴發(fā)出熒光，所述熒光被所述熒光探測(cè)模塊（4)接收后轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)， 并發(fā)送到控制器模塊（6)。
[0009] 進(jìn)一步地，優(yōu)選的結(jié)構(gòu)是，所述待測(cè)的液滴樣品存放于一儲(chǔ)液池（10)中，所述儲(chǔ) 液池（10)連接有樣品管道（11)，樣品管道（11)上設(shè)一控制閥（20)，且控制閥后的樣片管 道連接有稀釋機(jī)構(gòu)，所述稀釋機(jī)構(gòu)包括與樣品管道相連接的第一載流相通道（12)和第二 載流相通道（13)，其中，用于稀釋的連續(xù)相液體從第一載流相通道（12)和第二載流相通道 (13)中通入，并以流路聚焦的方式與樣品通道（11)合成后進(jìn)入到所述檢測(cè)通道（33)，所述 第一載流相通道（12)和第一載流相通道（13)還分別連接一動(dòng)力機(jī)構(gòu)（5)，動(dòng)力機(jī)構(gòu)（5)連 接所述控制器模塊￠)，所述控制器模塊（6)控制所述第一載流相通道（12)和第二載流相 通道（13)的連續(xù)相液體的滴入速度；其中，經(jīng)過稀釋后的液滴（33)進(jìn)入到檢測(cè)區(qū)域（16)， 并在檢測(cè)區(qū)域受所述激發(fā)光模塊（1)發(fā)出的光激發(fā)，并由熒光探測(cè)模塊（4)中的光電探測(cè) 器（31)接收并產(chǎn)生電信號(hào)。
[0010] 進(jìn)一步地，優(yōu)選的結(jié)構(gòu)是，光電探測(cè)器（31)選取光電倍增管。
[0011] 進(jìn)一步地，優(yōu)選的結(jié)構(gòu)是，所述激發(fā)光模塊（1)包含：至少一個(gè)激發(fā)光源（21)、準(zhǔn) 直透鏡（22)、濾光片（23)、分光鏡（24)和聚焦透鏡（25);由激發(fā)光源（21)發(fā)射出的光經(jīng) 過準(zhǔn)直鏡（22)后，又通過濾光片（23)濾除激發(fā)光波長(zhǎng)范圍外的光線，經(jīng)分光鏡（24)分光， 一部分光束作為監(jiān)測(cè)光束進(jìn)入設(shè)于分光鏡（24) -側(cè)的所述激發(fā)光檢測(cè)模塊（3)，另一部分 光束被反射后經(jīng)過聚焦透鏡（25)進(jìn)入到所述待測(cè)芯片的檢測(cè)區(qū)域，并照射檢測(cè)通道中的 液滴后發(fā)出熒光。
[0012] 進(jìn)一步地，優(yōu)選的結(jié)構(gòu)是，所述激光光源（21)設(shè)置為多個(gè)，所述激發(fā)光模塊（1)中 還設(shè)有合束鏡，且每個(gè)激光光源（21)的前方都設(shè)置有濾光片（23)，所述合束鏡設(shè)于濾光片 (23)和分光鏡（24)之間，多個(gè)激光光源（21)發(fā)出的光經(jīng)過各自對(duì)應(yīng)的濾光片（23)濾光 后，經(jīng)合束鏡將光束合成，并且，各激發(fā)光源對(duì)應(yīng)的濾光片（23)的波長(zhǎng)范圍互不重疊。
[0013] 進(jìn)一步地，優(yōu)選的結(jié)構(gòu)是，所述熒光檢測(cè)模塊（4)，具體包含：濾光片（29)、透鏡 (30)和至少一組光電探測(cè)器（31)，檢測(cè)通道中的液滴后發(fā)出的熒光經(jīng)濾光片（29)后，又進(jìn) 入至所述透鏡（30)聚焦，并最終進(jìn)入到光電探測(cè)器（31)，由光電探測(cè)器（31)接收后轉(zhuǎn)換成 數(shù)字信號(hào)。
[0014] 進(jìn)一步地，優(yōu)選的結(jié)構(gòu)是，所述熒光檢測(cè)模塊（4)的光軸與激發(fā)光模塊（1)的光軸 不平行，所述熒光檢測(cè)模塊（4)的光軸與激發(fā)光模塊（1)的光軸之間的角度選取60°或垂 直。
[0015] 進(jìn)一步地，優(yōu)選的結(jié)構(gòu)是，所述激發(fā)光探測(cè)模塊（3)，包括：濾光片（26)、聚焦透鏡 (27)和光電探測(cè)器（28)，激發(fā)光在經(jīng)過分光鏡后的監(jiān)測(cè)光束經(jīng)過濾光片（26)、聚焦透鏡 (27)后進(jìn)入光電探測(cè)器（28)，所述光電探測(cè)器（28)將其轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，并傳給控制模塊 (6)。
[0016] 一種液滴式樣品熒光檢測(cè)方法，基于以上液滴式樣品熒光檢測(cè)系統(tǒng)，包括：
[0017] 通過激發(fā)光檢測(cè)模塊調(diào)整光源強(qiáng)度至指定強(qiáng)度I ;
[0018] 將樣品從儲(chǔ)液池中吸入至充滿樣品通道，隨后吸入載運(yùn)液滴的分散相，并檢測(cè)液 路穩(wěn)定后熒光探測(cè)模塊接收到的光強(qiáng)平均值作為背景熒光，設(shè)其強(qiáng)度為F tl ;
[0019] 檢測(cè)稀釋后的樣品液滴的熒光強(qiáng)度，在此過程中控制器模塊通過激發(fā)光探測(cè)模塊 和熒光探測(cè)模塊收集激發(fā)光強(qiáng)度、液滴流速和液滴直徑等參數(shù)；
[0020] 根據(jù)時(shí)間-熒光強(qiáng)度曲線查找峰值，并利用上述參數(shù)識(shí)別有效液滴并校正測(cè)得的 熒光強(qiáng)度，根據(jù)每個(gè)液滴的峰值熒光強(qiáng)度與事先設(shè)定或自動(dòng)調(diào)整識(shí)別的閾值對(duì)比確認(rèn)液滴 是否帶有熒光；分別統(tǒng)計(jì)熒光液滴與無熒光液滴的個(gè)數(shù)并根據(jù)泊松分布公式：

【權(quán)利要求】
1. 一種液滴式樣品熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，包括：激發(fā)光模塊（I)、激發(fā)光探測(cè)模 塊（3)、熒光探測(cè)模塊⑷以及控制器模塊（6)，所述控制器模塊（6)連接熒光探測(cè)模塊（4) 和激發(fā)光探測(cè)模塊（3)，且在激發(fā)光模塊（1)和熒光探測(cè)模塊（4)之間設(shè)有檢測(cè)通道（32)， 所述檢測(cè)管路中設(shè)有待測(cè)的液滴樣品，所述激發(fā)光模塊（1)發(fā)出的光照射并激發(fā)，所述液 滴樣品中含有熒光染料的液滴發(fā)出熒光，所述熒光被所述熒光探測(cè)模塊（4)接收后轉(zhuǎn)換成 數(shù)字信號(hào)，并發(fā)送到控制器模塊（6)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的液滴式樣品熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述待測(cè)的液滴樣 品存放于一儲(chǔ)液池（10)中，所述儲(chǔ)液池（10)連接有樣品管道（11)，樣品管道（11)上設(shè)一 控制閥（20)，且控制閥后的樣片管道連接有稀釋機(jī)構(gòu)，所述稀釋機(jī)構(gòu)包括與樣品管道相連 接的第一載流相通道（12)和第二載流相通道（13)，其中，用于稀釋的連續(xù)相液體從第一載 流相通道（12)和第二載流相通道（13)中通入，并以流路聚焦的方式與樣品通道（11)合成 后進(jìn)入到所述檢測(cè)通道（33)，所述第一載流相通道（12)和第一載流相通道（13)還分別連 接一動(dòng)力機(jī)構(gòu)（5)，動(dòng)力機(jī)構(gòu)（5)連接所述控制器模塊￠)，所述控制器模塊（6)控制所述 第一載流相通道（12)和第二載流相通道（13)的連續(xù)相液體的滴入速度；其中，經(jīng)過稀釋后 的液滴（33)進(jìn)入到檢測(cè)區(qū)域（16)，并在檢測(cè)區(qū)域受所述激發(fā)光模塊（1)發(fā)出的光激發(fā)，并 由熒光探測(cè)模塊（4)中的光電探測(cè)器（31)接收并產(chǎn)生電信號(hào)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的液滴式樣品熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，光電探測(cè)器（31)選 取光電倍增管。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的液滴式樣品熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述激發(fā)光模 塊（1)包含：至少一個(gè)激發(fā)光源（21)、準(zhǔn)直透鏡（22)、濾光片（23)、分光鏡（24)和聚焦透 鏡（25);由激發(fā)光源（21)發(fā)射出的光經(jīng)過準(zhǔn)直鏡（22)后，又通過濾光片（23)濾除激發(fā)光 波長(zhǎng)范圍外的光線，經(jīng)分光鏡（24)分光，一部分光束作為監(jiān)測(cè)光束進(jìn)入設(shè)于分光鏡（24) - 側(cè)的所述激發(fā)光檢測(cè)模塊（3)，另一部分光束被反射后經(jīng)過聚焦透鏡（25)進(jìn)入到所述待測(cè) 芯片的檢測(cè)區(qū)域，并照射檢測(cè)通道中的液滴后發(fā)出熒光。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的液滴式樣品熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述激光光源（21) 設(shè)置為多個(gè)，所述激發(fā)光模塊（1)中還設(shè)有合束鏡，且每個(gè)激光光源（21)的前方都設(shè)置有 濾光片（23)，所述合束鏡設(shè)于濾光片（23)和分光鏡（24)之間，多個(gè)激光光源（21)發(fā)出的 光經(jīng)過各自對(duì)應(yīng)的濾光片（23)濾光后，經(jīng)合束鏡將光束合成，并且，各激發(fā)光源對(duì)應(yīng)的濾 光片（23)的波長(zhǎng)范圍互不重疊。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的液滴式樣品熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述熒光檢測(cè)模塊 (4)，具體包含：濾光片（29)、透鏡（30)和至少一組光電探測(cè)器（31)，檢測(cè)通道中的液滴 后發(fā)出的熒光經(jīng)濾光片（29)后，又進(jìn)入至所述透鏡（30)聚焦，并最終進(jìn)入到光電探測(cè)器 (31)，由光電探測(cè)器（31)接收后轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的液滴式樣品熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述熒光檢測(cè)模塊 (4)的光軸與激發(fā)光模塊（1)的光軸不平行，所述熒光檢測(cè)模塊（4)的光軸與激發(fā)光模塊 (1)的光軸之間的角度選取60°或垂直。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的液滴式樣品熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述激發(fā)光探測(cè)模 塊⑶，包括：濾光片（26)、聚焦透鏡（27)和光電探測(cè)器（28)，激發(fā)光在經(jīng)過分光鏡后的監(jiān) 測(cè)光束經(jīng)過濾光片（26)、聚焦透鏡（27)后進(jìn)入光電探測(cè)器（28)，所述光電探測(cè)器（28)將 其轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，并傳給控制模塊（6)。
9. 一種液滴式樣品熒光檢測(cè)方法，基于權(quán)利要求1-8所述的液滴式樣品熒光檢測(cè)系 統(tǒng)，其特征在于，包括： 通過激發(fā)光檢測(cè)模塊調(diào)整光源強(qiáng)度至指定強(qiáng)度I ; 將樣品從儲(chǔ)液池中吸入至充滿樣品通道，隨后吸入載運(yùn)液滴的分散相，并檢測(cè)液路穩(wěn) 定后熒光探測(cè)模塊接收到的光強(qiáng)平均值作為背景熒光，設(shè)其強(qiáng)度為Ftl ; 檢測(cè)稀釋后的樣品液滴的熒光強(qiáng)度，在此過程中控制器模塊通過激發(fā)光探測(cè)模塊和熒 光探測(cè)模塊收集激發(fā)光強(qiáng)度、液滴流速和液滴直徑等參數(shù)； 根據(jù)時(shí)間-熒光強(qiáng)度曲線查找峰值，并利用上述參數(shù)識(shí)別有效液滴并校正測(cè)得的熒光 強(qiáng)度，根據(jù)每個(gè)液滴的峰值熒光強(qiáng)度與事先設(shè)定或自動(dòng)調(diào)整識(shí)別的閾值對(duì)比確認(rèn)液滴是否 帶有熒光；分別統(tǒng)計(jì)熒光液滴與無熒光液滴的個(gè)數(shù)并根據(jù)泊松分布公式：
計(jì)算獲得樣品中所含目標(biāo)分子個(gè)數(shù)，其中λ為平均每液滴中目標(biāo)分子個(gè)數(shù)，H為熒光 反應(yīng)呈陽性的液滴個(gè)數(shù)，C為液滴總數(shù)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的液滴式樣品熒光檢測(cè)方法，其特征在于，若液滴直徑與過去 一段時(shí)間內(nèi)的有效液滴直徑平均值之比在〇. 95-1. 05內(nèi)，則認(rèn)為是有效液滴，并納入最終 結(jié)果統(tǒng)計(jì)，否則認(rèn)為其不是有效液滴。
【文檔編號(hào)】C12M1/34GK104388307SQ201410682234
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】劉聰, 黎海文 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所