一種降解除草劑草甘膦的抗性基因及其編碼蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種降解除草劑草甘膦的抗性基因及其編碼蛋白。該基因和蛋白是從能夠高效降解除草劑草甘膦的抗性的基因中篩選得到，該基因被命名為草甘膦氧化酶B4S7基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，該基因編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO：2所示。通過對蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)甘氨酸氧化酶突變體B3S1的編碼基因進(jìn)行DNA改組，并結(jié)合基于T7噬菌體裂解-辣根過氧物酶/鄰聯(lián)茴香胺酶偶聯(lián)活性篩選，最終獲得草甘膦氧化酶突變體B4S7。本發(fā)明初步驗證了草甘膦氧化酶B4S7基因的功能及其在草甘膦抗性作物中的應(yīng)用潛能。
【專利說明】一種降解除草劑草甘麟的抗性基因及其編碼蛋白

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種降解除草劑草甘膦的抗性基因及其編碼 蛋白，該基因被命名為草甘膦氧化酶B4S7基因，該基因和編碼蛋白是從對除草劑草甘膦具 有高效降解活性的抗性基因中獲得。本發(fā)明還涉及一種高效降解除草劑草甘膦的抗性基因 在植物除草劑草甘膦中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 草甘膦（glyphosate)是一種非選擇性的廣譜性除草劑，1970年由美國孟山都公 司（Monsanto Company, St. Louis, M0)開發(fā)而來。其商品名為Roundup，中文名農(nóng)達(dá)，自商業(yè) 化以來，草甘膦在全世界得到廣泛使用，且用量逐年增加。
[0003] 草甘膦分子式為C3H8N05P，化學(xué)名為N-磷酸亞甲基甘氨酸（N-(phosphonomethyl) glycine，GLP)，是一種甘氨酸的衍生物，相對分子量為169. 1。純品草甘膦為白色晶體，無 味，無揮發(fā)性，熔點(diǎn)高（200°C )，在水中溶解度低（1. 2%，25°C )，且難溶于無水乙醇、苯等有 機(jī)溶劑。在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中，為了增加草甘膦在水中的溶解性，提高植物對草甘膦的吸收率，從 而達(dá)到好的除草效果，常常將草甘膦加工成鹽類（如草甘膦異丙胺鹽、草甘膦鉀鹽等），并 加入一些表面活性劑和增效劑成分以提高其在植物葉片上的滲透性。
[0004] 在生物體內(nèi)，芳香族氨基酸具有重要的生物功能，其參與微生素、生物堿以及吲哚 衍生物等多種物質(zhì)的合成，在蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分裂等過程中發(fā)揮重要作用，合成量不足 則會嚴(yán)重影響植物的正常代謝及生長。莽草酸途徑是植物體內(nèi)合成芳香族氨基酸的重要 步驟，而5-稀醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate_3-phospha te synthase, EPSPS)是這一途徑的關(guān)鍵酶，其催化將磷酸稀醇式丙酮酸的（phosphoenol pyruvate，PEP)稀醇式丙酮酸部分轉(zhuǎn)移到3_磷酸莽草酸（shikimate-3-phosphate，S3P) 的5-羥基上，合成5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸。后者是形成分支酸并進(jìn)而合成芳香 族氨基酸的前體。作為磷酸烯醇式丙酮酸（PEP)的結(jié)構(gòu)類似物，草甘膦與PEP競爭EPSPS 的底物結(jié)合位點(diǎn)，造成EPSPS的活性被抑制，從而導(dǎo)致莽草酸途徑受阻，芳香族氨酸的合成 被阻斷，最終導(dǎo)致植物死亡，以此達(dá)到除草效果。因此，利用草甘膦除去雜草的同時使作物 免受除草劑危害對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。
[0005] 使作物獲得草甘膦抗性，進(jìn)而免受除草劑的危害的一個重要手段便是利用基因工 程技術(shù)，將能夠降解草甘膦的基因?qū)胫参矬w內(nèi)從而獲得除草劑抗性作物。
[0006] 在自然環(huán)境中，草甘膦可以被一些土壤微生物徹底分解，且對微生物群落影響較 小。從上世紀(jì)八十年代開始，不斷有微生物和基因被報道能夠降解除草劑草甘膦，而且所報 道的基因均來源于微生物，到目前為止尚未發(fā)現(xiàn)植物來源的草甘膦降解基因Ouke 2011)。 研宄表明，除草劑草甘膦的降解途徑主要有兩種：（1)斷裂草甘膦的C-N鍵生成胺甲基膦 酸（AMPA)和乙醛酸（glyoxylate) ;(2)斷裂草甘膦的C-P鍵生成肌氨酸和無機(jī)磷（Duke 2011)。其中，以C-N裂解途徑為主。能斷裂C-N鍵從而降解草甘膦的酶有草甘膦氧化還原 酶（glyphosate oxidoreductase，GOX)和甘氨酸氧化酶（glycine oxidase, GO)兩種。G0X 于二十世紀(jì)八十年代為Monsanto公司所發(fā)現(xiàn)并闡明其作用機(jī)制（Barry et al. 1995)，其在 有氧條件下將除草劑草甘膦氧化，與此同時輔因子FAD被還原，形成還原態(tài)的FAD及乙醛酸 和胺甲基磷酸之間的希夫堿（shiff base)，隨后希夫堿水解產(chǎn)生乙醛酸和胺甲基磷酸，還 原態(tài)的FAD被氧氣再氧化，同時氧絡(luò)黃素環(huán)作為中間體催化另一分子草甘膦生成乙醛酸和 胺甲基磷酸。由于野生型G0X對草甘膦的活性并不高，Barry等人對G0X的編碼基因進(jìn)行 了體外定向進(jìn)化以期提高G0X對草甘膦的氧化活性。利用易錯PCR方法對該基因進(jìn)行隨機(jī) 突變，并通過草甘膦抗性平板篩選突變體，最終獲得一株活性提高10倍的突變體v. 247,其 對草甘膦的親和力明顯提高（Km由野生型的20mM-30mM變?yōu)?. 6mM)。目前G0X已經(jīng)用于一 些抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因作物，如小麥（Triticum aestivum L.)、甜菜（Beta vulgaris L.)、蘿 卜（Brassica rapa L.)，但其均是與CP4EPSP合酶基因一同使用。
[0007] 甘氨酸氧化酶（GO)是另外一種能夠通過斷裂C-N鍵降解草甘膦的酶。GO是一 種四聚體黃素氧化酶，每個單體與一分子FAD非共價性地結(jié)合（Job et al. 2002 Job et al.2002)，其對焦磷酰硫胺素（維生素&)的生物合成起著很重要的作用（Settembre et al. 2003)。與G0X類似，GO氧化降解草甘膦，生成氨甲基磷酸和乙醛酸，所不同的是，GO催 化氧化草甘膦的反應(yīng)會同時產(chǎn)生H 202，這主要是因為兩者的氧化機(jī)制不同，GO采取的是一 種質(zhì)子轉(zhuǎn)移機(jī)制。就序列相似性而言，GO與G0X的氨基酸序列相似性僅18. 1 %，而與D-氨 基酸氧化酶序列相似性更高，且與D-氨基酸氧化酶在氧化性質(zhì)上更為相似。同時，GO具有 廣泛的底物選擇性，其對甘氨酸及甘氨酸的結(jié)構(gòu)類似物具有一定的氧化活性，使這些物質(zhì) 發(fā)生脫胺氧化，生成相應(yīng)的a-酮酸和過氧化氫。草甘膦作為甘氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，同樣能 被甘氨酸氧化酶所氧化分解，這使得甘氨酸氧化酶在草甘膦抗性作物的應(yīng)用及發(fā)展上表現(xiàn) 出巨大的潛力。2009年，Pedotti等人基于枯草芽孢桿菌甘氨酸氧化酶（BsuGO)的晶體結(jié) 構(gòu)，利用理性設(shè)計的方法對該酶進(jìn)行了體外定向改造。通過對11個氨基酸位點(diǎn)分別進(jìn)行定 點(diǎn)飽和突變，并將有益突變疊加，獲得一株對草甘膦親和性提高175倍（Km值達(dá)到0. 5mM)、 催化效率（(keat/Km)提高 210 倍的突變體 G51S/A54R/H244A(Pedotti et al. 2009)。其中， Ser51的側(cè)鏈羥基和Arg54的胍基基團(tuán)與草甘膦分子的磷酸基團(tuán)發(fā)生靜電相互作用從而穩(wěn)定 了草甘膦與酶的結(jié)合，優(yōu)化了酶活性中心的構(gòu)象，提高了酶與底物草甘膦的親和性。Ala 244 的替換雖未改變酶對底物的轉(zhuǎn)化數(shù)，卻促進(jìn)了酶分子活性位點(diǎn)的構(gòu)象重排，從而協(xié)同提高 了 BsuGO突變體對草甘膦的催化活性。該G51S/A54R/H244A突變體基因已轉(zhuǎn)入紫花苜蓿 (Medicago sativa)獲得了草甘膦抗性（Pollegioni et al.2011)。因此，以甘氨酸氧化酶 作為定向進(jìn)化的靶標(biāo)，利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)在實驗室條件下對其進(jìn)行進(jìn)化改造，提高其對 除草劑草甘膦的底物特異性和降解活性對于今后草甘膦抗性作物的應(yīng)用和推廣具有十分 重大的意義。
[0008] 我國是世界上最大的發(fā)展中國家，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)在國民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位，而除草 劑的應(yīng)用對作物產(chǎn)量和品質(zhì)帶來的危害與不利影響直接制約了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，同時對人 類健康造成嚴(yán)重威脅。另外，我國關(guān)于抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的研宄起步晚，而外國大型生物 公司已經(jīng)獲得一些草甘膦抗性基因并構(gòu)建了嚴(yán)密的知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)體系。因此，通過篩選和 改良的方法獲得能夠較好降解草甘膦的基因，解除除草劑對作物生長的抑制作用對于我國 及世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種通過定向進(jìn)化技術(shù)得到的草甘膦氧化酶突變體B4S7 及該基因在除草劑草甘膦中的應(yīng)用。該基因通過對草甘膦氧化酶B3S1進(jìn)行進(jìn)一步定向 進(jìn)化改造，結(jié)合基于17噬菌體裂解細(xì)胞的高通量篩選方法獲得。該草甘膦氧化酶突變體 B4S7的基因全長為lllObp，編碼369個氨基酸。將該編碼基因連接到pGEX-6p-l(購自美 國GE Healthcare公司）質(zhì)粒載體上，形成重組質(zhì)粒pGEX-6p-B4S7。隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 至E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞（購自美國Invitrogen公司），通過GST親和層析系統(tǒng)純 化獲得B4S7蛋白，利用鄰聯(lián)茴香胺/辣根過氧化物酶偶聯(lián)法測定其對草甘膦的氧化活性。 結(jié)果表明，草甘膦氧化酶B4S7對底物草甘膦的1= 0. 10mM，轉(zhuǎn)換數(shù)kMt= 3.62min_1，催 化效率kMt/Km= 3. 62X lOlT 1 ? mirT、因此，B4S7具有很高的的草甘膦抗性，在草甘膦 抗性作物方面具有很大的潛在應(yīng)用價值。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案（技術(shù)路線見圖1):
[0011] 以 pGEX-6p-B3Sl、pGEX-6P-B3S4、pGEX-6p-B3S6 和 pGEX-6p-B4S7 質(zhì)粒為突變模板 (Zhan et al. 2013)，進(jìn)行DNA shuffling構(gòu)建突變體文庫。將所獲得的突變基因片段連接 到pGEX-6p-l質(zhì)粒載體（圖6)上，將形成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli (簡 稱：E. coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞形成突變體文庫。用滅菌的牙簽挑取單克隆至含600 yL液 體LB培養(yǎng)基（含lOOyg/ml氨節(jié)青霉素）的96深孔板，37°C條件下振蕩培養(yǎng)。菌體生長 至對數(shù)期時加入IPTG (異丙基--D-硫代半乳糖苷，終濃度0. ImM)和17噬菌體（購自美 國Merck Millipore公司），28°C條件下振蕩培養(yǎng)6h，使蛋白表達(dá)與釋放同步進(jìn)行。吸取裂 解后的上清159 y L加入到96微孔板中，隨后加入20 y L草甘膦、20 y L 0. 32mg/mL鄰聯(lián)茴 香胺和1 y L 5unit/mL辣根過氧物酶，混合均勻后于25°C條件下反應(yīng)8h，利用全波長酶標(biāo) 儀測定450nm的吸光值，挑選00 45(|高于對照（B3S1，模板中活性最高者）的克隆子，降低底 物草甘膦的濃度進(jìn)行復(fù)篩和驗證。最終從10000個克隆子中獲得四個活性提高的突變體， 酶活測定結(jié)果表明，突變體B4S7對草甘膦的活性最高，而對甘氨酸的底物親和性進(jìn)一步降 低，因此，根據(jù)底物偏愛性將其命名為草甘膦氧化酶。
[0012] 與現(xiàn)有發(fā)明相比，本發(fā)明所獲得的草甘膦氧化酶B4S7對草甘膦的Km= 0. 10mM，低 于已報道的其它甘氨酸氧化酶以及草甘膦氧化還原酶，轉(zhuǎn)化數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)kMt= 3. eZmin-1，催 化效率kMt/Km= 3. 62X 10 4M~ 1 ? mirT \說明該酶具有較高的草甘膦降解活性，尤其是其 對草甘膦的親和性很高，即在草甘膦濃度很低時該酶就能發(fā)揮其活性降解草甘膦，從而降 低作物體內(nèi)的草甘膦殘留量，這對于草甘膦抗性作物具有十分重要的意義。通過測定pH對 酶活性的影響發(fā)現(xiàn)：草甘膦氧化酶B4S7的最適pH為8. 5,即在pH 8. 5時具有最高活性；當(dāng) pH小于7時，B4S7的活性下降；在pH 7. 0-11. 0的條件下，B4S7能維持的80%以上的活性。 因此，B4S7能很好地適應(yīng)中性及堿性條件，這也適合于其在植物體內(nèi)表達(dá)。通過測定溫度對 酶活性的影響發(fā)現(xiàn)：在0-30°C之間，B4S7的酶活性可以保持80%以上；溫度大于30°C時， B4S7的酶活性開始下降；溫度高于40°C時，酶活性急劇下降。因此，B4S7在低溫及中溫條 件下能保持較高活性，這也滿足植物正常生長的溫度范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 序列表SEQ ID NO: 1為本發(fā)明所獲得的草甘膦氧化酶B4S7基因的核苷酸序列 (l-1110bp)，序列長度為lllObp。其對應(yīng)的編碼序列（即CDS)也是l-1110bp，共編碼369 個氨基酸。
[0014] 序列表SEQIDN0:2為草甘膦氧化酶B4S7基因編碼的蛋白質(zhì)序列。
[0015] 圖1: 一種降解草甘膦的抗性基因的獲得流程圖。
[0016] 圖2 :重組質(zhì)粒pGEX-6p-B3Sl的質(zhì)粒圖譜。
[0017] 圖3 :重組質(zhì)粒pGEX-6p-B3S4的質(zhì)粒圖譜。
[0018] 圖4 :重組質(zhì)粒pGEX-6p-B3S6的質(zhì)粒圖譜。
[0019] 圖5 :重組質(zhì)粒pGEX-6p-B3S7的質(zhì)粒圖譜。
[0020] 圖6:表達(dá)載體pGEX-6p-l的質(zhì)粒圖譜。
[0021] 圖7:本發(fā)明的重組質(zhì)粒pGEX-6p-B4S7圖譜。
[0022] 圖8 :草甘膦氧化酶B4S7酶學(xué)動力學(xué)示意圖。圖8中的A圖：草甘膦氧化酶B4S7 的米氏方程曲線圖，橫坐標(biāo)為草甘膦底物濃度，縱坐標(biāo)為酶反應(yīng)速度；圖8中的B圖：草甘 膦氧化酶B4S7的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，橫坐標(biāo)為底物濃度倒數(shù)值，縱坐標(biāo)為反應(yīng)速 度倒數(shù)值。
[0023] 圖9:草甘膦氧化酶B4S7的酶學(xué)性質(zhì)圖。圖中標(biāo)記說明：圖9中的A圖：草甘膦氧 化酶B4S7最適pH曲線圖，橫坐標(biāo)為不同pH的緩沖液，縱坐標(biāo)為相對活性；圖9中的B圖： 顯示草甘膦氧化酶B4S7對pH耐受性，橫坐標(biāo)為不同pH緩沖液，縱坐標(biāo)為相對活性；圖9 中的C圖：草甘膦氧化酶B4S7最適溫度曲線圖，橫坐標(biāo)為不同溫度梯度，縱坐標(biāo)為相對活 性；圖9中的D圖：草甘膦氧化酶B4S7對溫度耐受性圖，橫坐標(biāo)為不同的處理溫度，縱坐標(biāo) 為相對活性。
[0024] 圖10 :轉(zhuǎn)入B4S7基因的大腸桿菌在200mM草甘膦中的生長曲線圖。橫坐標(biāo)為菌 體生長時間，縱坐標(biāo)為菌體的濃度。

【具體實施方式】：
[0025] 以下是本發(fā)明的實施方式的舉例，是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不是對本發(fā)明的 限制。
[0026] 實施例1利用DNAshuffling技術(shù)構(gòu)建突變體文庫
[0027] 本發(fā)明以來自蠟狀芽孢桿菌甘氨酸氧化酶（BceGO)的突變體B3S1、B3S4、B3S6和 B3S7為模板（Zhan et al. 2013)，參照Stemmer報道的DNA改組方法并運(yùn)用超聲波法處理 DNA片段，進(jìn)行DNA shuffling(Stemmer 1994;Miller et al.2002)，將有益突變位點(diǎn)重組， 實現(xiàn)對蠟狀芽孢桿菌甘氨酸氧化酶的進(jìn)一步改良，從而獲得具有更好的草甘膦降解活性的 草甘膦氧化酶，為草甘膦抗性作物的應(yīng)用打下堅實基礎(chǔ)，并降低草甘膦在植物體內(nèi)的殘留 量，使得植物在解除草甘膦對其生長抑制的同時減少通過食物鏈環(huán)節(jié)對人類健康的威脅。
[0028] 具體步驟如下所述：
[0029] (一）模板基因的擴(kuò)增
[0030] 抽提 pGEX-6p-B3Sl (圖 2)、pGEX-6p-B3S4(圖 3)、pGEX-6p-B3S6(圖 4)和 pGEX-6p-B3S7 (圖5)質(zhì)粒（Zhan et al. 2013)，分別作為模板，以質(zhì)粒載體pGEX-6p-l (圖 6,購自美國GE Healthcare公司）的通用引物（6p_F/R)和TaqDNA聚合酶進(jìn)行不同突變體 GO 基因（thiO，GenBank acession number:KC203486)的擴(kuò)增。引物序列及 PCR 反應(yīng)體系 如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的草甘膦氧化酶B4S7基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示。
2. -種分離的草甘膦氧化酶B4S7編碼蛋白，其蛋白質(zhì)序列如序列表SEQ ID NO :2所 不〇
3. 權(quán)利要求1所述的基因在抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求2所述的編碼蛋白在抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/53GK104450750SQ201410738357
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】劉子鐸, 姚佩, 張利莉, 吳高兵, 林擁軍, 洪玉枝 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)