本發(fā)明涉及一種丁香酚組合液及制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著食品安全的話題不斷受到關(guān)注，人們對食品的質(zhì)量有了更高的要求，不但要求營養(yǎng)，還要求綠色健康。為了方便食品運(yùn)輸貯藏，人們往往在食品中添加防腐劑，如苯甲酸、山梨酸及其鹽類、對羥基甲酸酯類、丙酸鹽、二氧化硫、亞硫酸及其鹽類、硝酸鹽及亞硝酸鹽類等，已經(jīng)被普遍應(yīng)用。長期使用化學(xué)防腐劑，導(dǎo)致致癌性、致突變性和致畸性等潛在安全問題時有發(fā)生，同時會對自然界的生態(tài)環(huán)境造成不利的影響。因此，尋找廣譜、高效、低毒、安全的食品防腐劑成為食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。
金黃色葡萄球菌是人類生活中最常接觸的一種細(xì)菌之一，它在自然界中可以說無處不在，是引起食品污染以及細(xì)菌性食物中毒的重要細(xì)菌之一，食品作坊以及食品加工工廠都希望對其避而遠(yuǎn)之，其所分泌的腸毒素(ses)是引起食物中毒的最主要因素。通過李彥媚等發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌對環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，其菌體細(xì)胞可耐受70℃的溫度1h，80℃下30min不能被殺死滅活，在溫度極低的環(huán)境下不被凍死照樣生存，其所分泌的腸毒素在100℃的高溫下煮沸30min還能夠保持其免疫活性和生物活性，所以，在日常的生活中，我們是比較難做到讓金黃色葡萄球菌遠(yuǎn)離我們的食物，儼然金黃色葡萄球菌已對人類健康與食品安全構(gòu)成威脅，據(jù)了解，近年來金黃色葡萄球菌造成的食品安全事例層出不窮，據(jù)美國疾控中心報告，在美國，金黃色葡萄球菌引起的食物中毒居第二位，僅次于大腸埃希菌，占細(xì)菌性食物中毒約33％，在加拿大約占45％，在一些歐洲國家如匈牙利、芬蘭則占食物中毒事件超過50％，特別是2000年發(fā)生的“雪印奶粉”事件，有14000多人受感染，所以我們更加期待一種更安全，天然的，無毒無害能夠克制金黃色葡萄球菌的食品添加劑。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種能夠有效針對金黃色葡萄球菌的丁香酚組合液，可以使其更加廣泛地應(yīng)用到食品加工工藝、果蔬、糧油產(chǎn)品、奶制品、調(diào)味品等等領(lǐng)域當(dāng)中，讓其發(fā)揮更大作用，降低化學(xué)合成防腐劑的使用率，避免食品遭受細(xì)菌污染，保障食品安全衛(wèi)生和人類身體健康。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：1.一種丁香酚組合液，由以下體積份的原料組成：水99.8555％～99.9711％，吐溫80溶液0.01％～0.05％，丁香酚0.0189％～0.0945％。
制備上述丁香酚組合液的方法，包括步驟：向經(jīng)過高壓滅菌的、濃度為0.1％的吐溫80溶液中加入丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加水稀釋制得丁香酚組合液。
制得的丁香酚組合液可作為金黃色葡萄球菌的抑菌劑或殺菌劑；作為抑菌劑的丁香酚組合液優(yōu)選為吐溫80溶液含量為0.03％，丁香酚含量為0.0567％；作為殺菌劑的丁香酚組合液優(yōu)選為吐溫80溶液含量為0.035％，丁香酚含量為0.06615％。
本發(fā)明的有益效果是：
丁香酚組合液能抑制金黃色葡萄球菌生長，甚至丁香酚濃度更高時可作為殺菌劑使用。丁香酚組合液影響了金黃色葡萄球菌的sdh酶和mdh酶的分子結(jié)構(gòu)，使其發(fā)生了變化，從而改變了構(gòu)像，使酶活性降低。丁香酚組合液作用于金黃色葡萄球菌后，因為起細(xì)胞透性的改變，使得與蛋白合成相關(guān)的核酸類物質(zhì)外泄，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成受到抑制，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
附圖說明
圖1是實施例10中空白對照樣與丁香酚組合液測定樣的對比圖；
圖2是實施例11中空白對照樣與丁香酚組合液測定樣的對比圖。
圖1中(a)對應(yīng)未經(jīng)丁香酚組合液處理的金黃色葡萄球菌；(b)-(f)分別對應(yīng)丁香酚組合液f、e、d、c、b；圖2中(a)對應(yīng)未經(jīng)丁香酚處理的金黃色葡萄球菌；(b)-(f)分別為丁香酚組合液f、e、d、c、b。
具體實施方式
下面通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實施例1：制備丁香酚組合液a
向50份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入94.5份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99855.5份水稀釋。
實施例2：制備丁香酚組合液b
向45份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入85.05份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99868.95份水稀釋。
實施例3：制備丁香酚組合液c
向40份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入75.6份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99884.4份水稀釋。
實施例4：制備丁香酚組合液d
向35份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入66.15份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99898.85份水稀釋。
實施例5：制備丁香酚組合液e
向30份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入56.7份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99913.3份水稀釋。
實施例6：制備丁香酚組合液f
向25份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入47.25份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99927.75份水稀釋。
實施例7：制備丁香酚組合液g
向20份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入37.8份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99942.2份水稀釋。
實施例8：制備丁香酚組合液h
向15份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入30.24份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加9954.76份水稀釋。
實施例9：制備丁香酚組合液i
向10份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入18.9份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99971.1份水稀釋。
實施例10：對金黃色葡萄球菌的mic測定
采用96孔板微量稀釋法和瓊脂平板稀釋法。取96孔板，第一列為空白對照樣，僅加入mh肉湯200μl。第2～10列為丁香酚組合液測定樣，首先，每列的第一個孔加入mh肉湯100μl，第2～5個孔加入100μl金黃色葡萄球菌懸液；然后在第2～10列的第1～5個孔分別加入丁香酚組合液,使每個孔最終比例分別符合丁香酚組合液a～i的配比，同時每個孔的菌濃度為5*105cfu/ml。同時設(shè)置陽性對照。37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。以陽性對照中細(xì)菌生長呈渾濁和空白對照透明為前提，觀察其他孔內(nèi)渾濁情況。按下列標(biāo)準(zhǔn)比較：0.無可見生長；1.輕微模糊；2.濁度明顯減少(約50％)；3.濁度輕微減少；4.濁度無明顯改變。本試驗藥物取1.(輕微模糊)或2.(濁度明顯減少)為判定終點(diǎn)。同時，以620nm的波長在酶標(biāo)儀上讀取吸光度，以備計算。
以抑菌率為90％的濃度為mic，采用瓊脂平板稀釋法，取10μl菌懸液分別置于含丁香酚組合b、丁香酚組合c、丁香酚組合d，丁香酚組合e，丁香酚組合f的平板中，瓊脂未凝固前搖勻，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，實驗重復(fù)3次，以平板未見菌落的最低藥物濃度為mic，實驗重復(fù)3次。
實施例11：對金黃色葡萄球菌的mbc測定
以抑菌率為99％的濃度為mbc，從96孔板微量稀釋法未見細(xì)菌生長各孔,接種至無菌瓊脂，搖勻，37℃培養(yǎng)24h，未見菌落生長的為mbc，實驗重復(fù)3次。
實施例12：丁香酚組合液對金黃色葡萄球菌體內(nèi)mdh和sdh酶活性的影響
將金黃色葡萄球菌接分別接入lb培養(yǎng)基和含丁香酚組合液e的lb培養(yǎng)基，150rpm震蕩培養(yǎng)24h，4000r/min離心培養(yǎng)液10min收集菌體，并用ph7.3的pbs緩沖液洗滌菌體3次，每組設(shè)置3個平行樣。加入與菌體等體積的2mg/ml的溶菌酶溶液，攪拌后置于37℃水浴鍋中，當(dāng)菌體開始發(fā)粘時取出，按照1ml菌體加6mlpbs緩沖液，10000r/min低溫離心10min,取出上清液備用。按照考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，以小牛血清蛋白對照。按照試劑盒說明書方法進(jìn)行檢測。
測定mdh：340nm處進(jìn)行比色，雙蒸水調(diào)零后，加入50μl上清液，取已預(yù)溫好的1ml工作液迅速沖入0.5cm的石英比色皿中，于20s時讀吸光度od1值，反應(yīng)1min后，即80s讀取吸光度od2值，記錄δod＝od1值-od2值，空白對照取50μl雙蒸水，加入1ml工作液，其他操作與測定相同，于20s時讀吸光度a1值，反應(yīng)1min后，即80s讀取吸光度a2值，記錄記δa＝a1值-a2值以備計。
測定sdh：600nm處進(jìn)行比色，蒸餾水調(diào)零后，加入100μl上清液，取已預(yù)溫好的2.6ml工作液迅速沖入1cm的比色皿中，于5s時讀吸光度od1′值，反應(yīng)1min后，即65s,讀取吸光度od2′值，記錄δοd′＝od1′值-od2′值，以備計算。
結(jié)果：1)如圖1所示，與陽性對照相比，丁香酚組合液b、c、d、e、f對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，其中最合適的比例為e，與瓊脂平板稀釋法一致，同時用96孔板法計算出來的抑菌率為90％；如圖2所示，在丁香酚組合b、c、d對金黃色葡萄球菌有殺菌作用，其中最適比例為丁香酚d，同時用96孔板法計算出來的抑菌率為99％。不同成分比例的丁香酚組合液作對金黃色葡萄球菌的抑制作用存在依賴；
2)丁香酚組合液對金葡菌體內(nèi)mdh酶活力的影響：對照組培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的mdh酶活力17.151u/mgprot，丁香酚組培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的mdh為8.214u/mgprot，通過配對樣品t檢驗分析，p＜0.01，說明丁香酚組合對照組的mdh酶活性具有極顯著差異；丁香酚組與對照組相比，細(xì)菌體內(nèi)mdh酶活性降低；
3)丁香酚組合液對金葡菌體內(nèi)sdh酶活力的影響：對照組培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的sdh酶活力為4.00u/ml，丁香酚組培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的sdh為2.400u/ml，通過配對樣品t檢驗分析，p<0.05，說明丁香酚組合對照組的sdh酶活性差異顯著；丁香酚組與對照組相比，細(xì)菌體內(nèi)sdh酶活性降低。
丁香酚組合液e能抑制金黃色葡萄球菌生長，能對金黃色葡萄球菌具有殺菌作用為丁香酚組合液d。從酶活力的角度分析，可能的作用機(jī)理是丁香酚組合液影響了這兩個酶的分子結(jié)構(gòu)，使其發(fā)生了變化，從而改變了構(gòu)像，使酶活性降低。最后，從丁香酚組合液對金葡菌蛋白濃度的影響結(jié)果表現(xiàn)，丁香酚組合液能夠抑制部分蛋白質(zhì)的合成。從蛋白質(zhì)合成的角度來分析作用機(jī)理，可能的作用機(jī)理是丁香酚組合液對蛋白質(zhì)作用于金黃色葡萄球菌后，因為起細(xì)胞透性的改變，使得與蛋白合成相關(guān)的核酸類物質(zhì)外泄，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成受到抑制，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。