本發(fā)明屬于飼料添加劑領域，具體涉及阿斯巴甜在幼齡反芻動物開食料中促進動物小腸發(fā)育、增強小腸屏障功能的應用。

背景技術(shù)：

出生后到斷奶前是幼齡反芻動物消化道疾病高發(fā)階段。以羔羊為例，相關(guān)調(diào)查顯示，我國哺乳期羔羊的腹瀉率約為50％，并且這些腹瀉羔羊的死亡率高達20％，每年造成超過十億元的經(jīng)濟損失。羔羊腹瀉的發(fā)病原因非常復雜，母羊營養(yǎng)不良、羔羊補飼飼料質(zhì)量差、應激及病原微生物感染等都可能是誘發(fā)羔羊腹瀉的因素。目前都是通過應用抗生素可以治療或減緩幼齡反芻動物斷奶期間的腹瀉情況，但是，隨著抗生素的禁用以及抗生素殘留問題，尋找一種更安全、有效和經(jīng)濟的方式是社會所需的。同時，近年來許多研究表明，幼齡動物尚未發(fā)育完善的腸道屏障功能也是導致動物易感甚至發(fā)生腹瀉的重要因素。但是，到目前為止，尚無研究從防護腸道上皮屏障的角度來預防幼齡反芻動物腹瀉的發(fā)生。因此，尋找相應的營養(yǎng)調(diào)控手段促進幼齡反芻動物腸道屏障功能的發(fā)育及完善對降低幼齡反芻動物腹瀉風險具有重要意義。

阿斯巴甜分子式為：c14h18n2o5，結(jié)構(gòu)式如下：

是一種天然功能性低聚糖，不致齲齒、甜味純正、吸濕性低，沒有發(fā)黏現(xiàn)象。不會引起血糖的明顯升高，適合糖尿病患者食用。阿斯巴甜可用于糕點、餅干、面包、配制酒、雪糕、冰棍、飲料、糖果、用量按正常生產(chǎn)需要。在飼料方面，目前關(guān)于阿斯巴甜的使用都是在復合甜味劑方面的應用，沒有關(guān)于對幼齡反芻動物腸道上皮防護的報道。

發(fā)明目的

技術(shù)實現(xiàn)要素：
：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供阿斯巴甜在促進動物小腸發(fā)育、增強小腸屏障功能的應用。本發(fā)明提出了一種阿斯巴甜的新功能，可以在幼齡反芻動物開食料中作為添加劑，從防護腸道上皮屏障的角度來預防羔羊等幼齡反芻動物腹瀉的發(fā)生，促進動物小腸發(fā)育、增強小腸屏障功能。

技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述目的，如本發(fā)明所述的阿斯巴甜在促進幼齡反芻動物小腸發(fā)育、增強小腸屏障功能中的應用。

進一步地，所述阿斯巴甜在動物飼料中作為添加劑促進幼齡反芻動物小腸發(fā)育、增強小腸屏障功能中的應用。

其中，所述的飼料為開食料。

更進一步地，所述開食料中阿斯巴甜的添加量為開食料質(zhì)量的0.08-0.16％。優(yōu)選的添加量為開食料質(zhì)量的0.08％。

作為優(yōu)選，所述幼齡反芻動物為羔羊或犢牛。通常選用幼齡反芻動物為羔羊。

其中，所述的動物的生長階段為出生后到斷奶前。

本發(fā)明是所使用的的原料和儀器都是市售可得。

阿斯巴甜購自美國紐特公司

便攜式ph計(hi9024c；hannainstruments，美國)

血漿血糖試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司

glp-2熒光酶免疫試劑盒購自德國phoenixeuropegmbh

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自takara公司

q5real-timepcr儀(appliedbiosystems，美國)。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

本發(fā)明所使用的阿斯巴甜是一種經(jīng)濟有效的甜味劑，本發(fā)明提出了一種阿斯巴甜的新功能，可以在幼齡反芻動物開食料中作為添加劑，從防護腸道上皮屏障來預防羔羊等幼齡反芻動物腹瀉的發(fā)生，提高羔羊等幼齡反芻動物的成活率；本發(fā)明所使用的阿斯巴甜可通過甜味受體等一系列信號途徑刺激glp-2的分泌，之后與glp-2r受體結(jié)合后，激活erk1/2信號通路，從而促進緊密連接蛋白的表達，增強小腸上皮的屏障功能，通過調(diào)節(jié)幼齡反芻動物細胞周期蛋白和相關(guān)依賴性激酶的表達推動細胞周期進程促進小腸上皮的發(fā)育、增強小腸屏障功能，有利于幼齡反芻動物斷奶前期腸道健康，減弱斷奶應激。

附圖說明

圖1為阿斯巴甜添加對羔羊體重變化的影響關(guān)系圖；

圖2為阿斯巴甜添加對羔羊小腸上皮細胞周期蛋白mrna相對表達量的影響關(guān)系圖；

圖3為阿斯巴甜添加對羔羊小腸上皮緊密連接蛋白mrna相對表達量的影響關(guān)系圖；

圖4為阿斯巴甜添加對羔羊小腸上皮gcg、glp-2r、igf-1及igf-1rmrna相對表達量的影響關(guān)系圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明。

實施例1

試驗選擇12只體況良好，胎次一致，體重相近的新生羔羊(湖羊)，隨機分為對照組和甜味劑(阿斯巴甜)處理組，每組6只。10日齡時，羔羊開始補飼開食料，每天早晨8點和下午5點各喂一次。14日齡時，開始在試驗組羔羊開食料中添加開食料質(zhì)量0.08％的阿斯巴甜，試驗期間，羔羊跟隨母羊自由哺乳和飲水，自由采食苜蓿和燕麥干草，每周監(jiān)測羔羊體重變化。試驗開始前，兩組羔羊的體重沒有顯著差異(6.18±0.47vs.5.80±0.26kg，p＝0.504)。阿斯巴甜購自美國紐特公司。開食料依據(jù)湖羊開食料營養(yǎng)需要標準(ny/y816-2004；中國農(nóng)業(yè)部,2004)設計開食料配方，組成見表1。

表1試驗開食料組成與營養(yǎng)水平

實施例2

實施例2采用是相同的開食料配合和試驗方法，不同之處在于試驗對象為體重相近的新生犢牛，處理組開食料中添加開食料質(zhì)量0.16％的阿斯巴甜。

實施例3

試驗期間每周監(jiān)測實施例1的對照組和試驗組羔羊體重變化，結(jié)果如圖1所示。在整個試驗期間兩組羔羊體重無顯著差異。

實施例4

取實施例1的羔羊42日齡時，早晨飼喂兩小時后進行屠宰，屠宰前頸靜脈采血，血液在1000g4℃離心15min儲存在-20℃用于血常規(guī)檢測。屠宰后立即分離瘤胃和小腸并稱重，收集有代表性的瘤胃內(nèi)容物測定ph值，測定完ph值后的瘤胃內(nèi)容物四層紗布過濾收集瘤胃液，-20℃保存待測揮發(fā)性脂肪酸濃度。采集具有代表性的十二指腸、空腸和回腸組織在冰的磷酸緩沖溶液里清洗3次后，剪成0.5cm×0.5cm的小碎塊裝入凍存管置于液氮保存，用于后續(xù)rna的提取。

實施例5

檢測甜味劑阿斯巴甜添加對羔羊各器官重量的影響：

在羔羊42日齡時屠宰采樣，羔羊屠宰后立即分離各器官并稱重，結(jié)果如表2所示。

表2.甜味劑添加對羔羊各器官重量的影響

注：數(shù)據(jù)以平均值±標準誤形式表示，n＝5

由表2可知，甜味劑阿斯巴甜添加顯著提高了羔羊空腸重和盲腸重，對瘤胃濕重、瘤胃干重、瓣胃濕重、瓣胃干重、十二指腸重、回腸重、結(jié)腸重及肝臟重無顯著性影響。上述結(jié)果說明：甜味劑阿斯巴甜提高了空腸的重量，對小腸發(fā)育有促進作用。

實施例6

對實施例4的血液進行血常規(guī)檢測以及瘤胃內(nèi)容物測定ph值，考察甜味劑阿斯巴甜對羔羊瘤胃和血液參數(shù)的影響，結(jié)果如表3所示。

血常規(guī)分析的血漿血糖試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；glp-2熒光酶免疫試劑盒購自德國phoenixeuropegmbh。血糖和glp-2試劑盒的測量范圍分別是3.89～6.11mmol/l和0-10000pg/ml。

瘤胃生理參數(shù)測定，用便攜式ph計(hi9024c；hannainstruments,美國)測定瘤胃ph值。氣相色譜測定(gc-14b,島津,日本；毛細管柱:30m×0.32mm×0.25mm膜厚度)vfa濃度，參照秦為琳.(應用氣相色譜測定瘤胃揮發(fā)性脂肪酸方法的研究改進.南京農(nóng)業(yè)大學學報,1982(4):110-116)的方法(柱溫＝110℃,汽化室溫度＝180℃,檢測器＝180℃)。

表3甜味劑添加對羔羊瘤胃參數(shù)和血液參數(shù)的影響

如表3所示，甜味劑添加對羔羊瘤胃丁酸濃度、其他揮發(fā)性脂肪酸濃度和血漿glp-2濃度有升高的趨勢；對瘤ph、總揮發(fā)性脂肪酸濃度、乙酸濃度、丙酸濃度、乙丙比和血漿葡萄糖濃度無顯著性影響。上述結(jié)果說明：甜味劑阿斯巴甜促進了羔羊自身glp-2的分泌。

實施例7

甜味劑阿斯巴甜添加對羔羊小腸上皮mrn相對表達量的影響。

rna的提取和cdna的合成：提取實施例4得到小腸上皮總rna，使用nanodrop分光光度計檢測rna的濃度和純度。所有樣品的吸收比例(260/280nm)都在1.8～2.0之間，證明rna純度較高。用1.4％的瓊脂糖膠檢測rna的完整性。將所有的rna濃度調(diào)整到1μg/μl，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。利用購自takara公司含基因組rna酶的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cdna的合成。

引物的合成和實時定量pcr：利用q5real-timepcr儀(appliedbiosystems，美國)對目的基因及內(nèi)參基因gapdh、18srrna進行定量，gapdh引物序列參照wang等(wanga,guz,heidb,etal.identificationandcharacterizationofthebovinegprotein-coupledreceptorgpr41andgpr43genes1[j].journalofdairyscience,2009,92(6):2696-2705.)，實時定量pcr分析所用引物采用primer5.0軟件自行設計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物sqeidno.1-36，如表4所示。sybr購自takara公司，反應條件為：95℃30s預變性，95℃5s，60℃30s，重復40個循環(huán)，95℃，15s；60℃，1min；95，15s。反應體積20μl：10.4ulsybr，10umol/l上下游引物各0.4ul，2ul樣品cdna以及6.8ul無菌水。所有樣品設3個重復。目的基因的相對表達量以管家基因gapdh作為內(nèi)參進行校正，數(shù)據(jù)分析采用2^-△△ct的方法。

表4擴增引物序列

結(jié)果以平均值±標準誤(means±se)進行表示。數(shù)據(jù)采用spss20.0中的獨立樣本t檢驗進行顯著性分析。采用graphpadprism6.01(www.graphpad.com)軟件分析目的基因的mrna表達量。p<0.05表示差異顯著。

甜味劑阿斯巴甜添加對羔羊小腸上皮細胞周期蛋白mrna相對表達量的影響：細胞周期的推進主要受細胞周期蛋白(cyclins)及其相關(guān)的激酶(cdks)的調(diào)控，所以cyclins和cdks的表達情況會影響細胞周期進程。如圖2所示，甜味劑阿斯巴甜添加顯著提高了羔羊十二指腸cyclind1、cdk1和cdk6的mrna表達量；空腸cyclina、cyclinb1、cdk1和cdk6的mrna表達量；回腸cyclina、cyclind1和cdk4的mrna表達量。以上結(jié)果表明：阿斯巴甜添加促進羔羊自身合成的glp-2促進了小腸上皮細胞周期蛋白和相關(guān)依賴性激酶的mrna表達，一定程度上推動了細胞周期進程，促進了小腸上皮的增殖。

甜味劑阿斯巴甜添加對羔羊小腸上皮緊密連接蛋白mrna相對表達量的影響：上皮屏障的完整主要是通過細胞和細胞間的連接蛋白及細胞和基質(zhì)間錨定骨架蛋白的粘著斑復合體來維持。結(jié)果如圖3所示，阿斯巴甜添加顯著提高了羔羊十二指claudin-4和zo-1的mrna表達量；空腸claudin-1、occludin和zo-1的mrna表達量；回腸claudin-4和occludin的mrna表達量。claudin家族蛋白是最主要的跨膜蛋白，其主要功能是封閉細胞與細胞的間隙。occludin是一種直接與claudins和actin作用的跨膜蛋白。zo-1是一種外周蛋白，對于緊密連接的分布和維持起到非常關(guān)鍵的作用。上述結(jié)果表明：阿斯巴甜添加促進羔羊自身分泌的glp-2促進了小腸緊密連接蛋白的mrna表達量，有利于羔羊小腸屏障功能的發(fā)育，維持腸道健康。

甜味劑阿斯巴甜添加對羔羊小腸上皮gcg、glp-2r、igf-1及igf-1rmrna相對表達量的影響：如圖4所示，與對照組相比，阿斯巴甜添加顯著升高了十二指腸gcg和igf-1；空腸gcg、igf-1、igf-1r和glp-2r；回腸gcg和igf-1的mrna表達量。上述研究結(jié)果表明：阿斯巴甜添加促進了羔羊小腸上皮glp-2受體的表達，同時促進了igf-1和igf-1受體的表達，暗示glp-2是通過igf-1信號通路調(diào)控細胞周期進程，促進了小腸上皮的增殖。同時采用實施例2犢牛為實驗對象，結(jié)果與上述實施例結(jié)果類似。

sequencelisting

<110>南京農(nóng)業(yè)大學

<120>阿斯巴甜在促進幼齡反芻動物小腸發(fā)育、增強小腸屏障功能的應用

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