專(zhuān)利名稱(chēng)：雙鏈rna缺乏狀態(tài)的診斷和治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及dsRNA缺乏狀態(tài)的診斷，以及加入適當(dāng)分子構(gòu)型的外源dsRNA以恢復(fù)其正常水平的方法。
已發(fā)現(xiàn)天然dsRNA在宿主防疫中未發(fā)揮各種作用時(shí)。一些診斷和治療病毒疾病，一般的病原菌慢性感染和癌癥形成的新方法，例如，艾滋病(逆病毒感染/癌癥)的發(fā)展是與生物過(guò)程中逐步嚴(yán)重的機(jī)能障礙相關(guān)的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這些生物過(guò)程是由dsRNA催化的，它不僅包括干擾素的合成，而且還包括有生物活性的2-5A的產(chǎn)生，RNA酶L活性以及各種細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，特定細(xì)胞中特定生物活性dsRNA的減少，或依賴(lài)于dsRNA的酶的減少，影響到疾病的發(fā)展。
涉及生物活性dsRNA的代謝途徑中的缺乏狀態(tài)是處在導(dǎo)致死亡的宿主防御系統(tǒng)中各種細(xì)胞損傷的中心。早先，本發(fā)明人從被HIV感染的ARC和艾滋病病人的淋巴細(xì)胞中測(cè)得一種RNA酶L的抑制劑，它只是細(xì)胞內(nèi)dsRNA水平不正常的結(jié)果之一。用適當(dāng)構(gòu)型的合成dsRNA進(jìn)行治療可消除這種抑制劑，它解釋為本發(fā)明人所觀察到的部分臨床反應(yīng)，與象病毒濃度的減少以及目前醫(yī)學(xué)上仍是難以滯愈的各種病毒血癥病人體由免疫功能的恢復(fù)有關(guān)。相應(yīng)地，本發(fā)明人現(xiàn)已完成了一綜合發(fā)明，它可在對(duì)各種疾病劃分過(guò)程中對(duì)各種dsRNA缺乏狀態(tài)進(jìn)行解釋、定量測(cè)定和校正。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)，某些dsRNA，如失配dsRNA，實(shí)際上可以取代天然存在的dsRNA，其功能在于幫忙維持正常細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的功能。如果不用合適的外源dsRNA對(duì)這種dsRNA調(diào)節(jié)的缺乏進(jìn)行校正，就可能產(chǎn)生各種異常細(xì)胞病變，從而導(dǎo)致病毒和其它細(xì)胞內(nèi)病原體慢性感染，減少免疫細(xì)胞的功能，使疾病最終呈慢性狀態(tài)，也可能是自身的死亡。
臨床手段病毒感染可能常常與免疫系統(tǒng)的部分紊亂相伴隨，而這種紊亂是由各種試劑以及直接攻擊免疫功能的病毒引起的。例如，艾滋病(獲得性免疫缺陷綜合癥)是緊跟著人免疫缺陷病毒(HIV)感染T淋巴細(xì)胞，引起免疫系統(tǒng)逐步衰退而產(chǎn)生的(Coffin等，《Science》，232卷，697頁(yè)，1986)。
確切地講，應(yīng)該注意HIV病毒存在不同的名稱(chēng);LAV是從法國(guó)巴黎巴斯德研究所分離出的HIV病毒的名稱(chēng)，HTLV-Ⅲ是從美國(guó)馬里蘭州Bethesda國(guó)立衛(wèi)生研究所分離出來(lái)的HIV病毒的名稱(chēng)。通常，HIV是用作病毒的普通術(shù)語(yǔ)。在本文中，HIV通常泛指或命名為HIV或HTLV-Ⅲ或LAV，而不打算區(qū)分它們。而且，說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中的術(shù)語(yǔ)HIV包括與艾滋病的產(chǎn)生相關(guān)的所有其它病毒，不管是已被分離的，還是未被分離的。
HIV感染是一種漸進(jìn)性的疾病，盡管從一種狀態(tài)到另一種狀態(tài)的轉(zhuǎn)化率是可變的。被HIV感染的無(wú)癥狀個(gè)體可建立起一種具有淋巴結(jié)病特征的狀態(tài)(LAS或前ARC)。病人逐步發(fā)展成與艾滋病相關(guān)的綜合癥，顯示出T4細(xì)胞缺損，繼而表現(xiàn)出淋巴細(xì)胞經(jīng)受抗原刺激的繁殖和產(chǎn)生IFN-γ能力的減弱，這些病人喪失了各種細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能，如遲發(fā)型皮膚超敏反應(yīng)，實(shí)際上完全變?yōu)闊o(wú)反應(yīng)。證明了宿主防御機(jī)制的破壞，包括帶狀皰疹感染，口念珠菌病(真菌性口炎)以及象持續(xù)性發(fā)熱、盜汗性腹瀉和失重等癥狀。最終，這些病人受到機(jī)會(huì)致病菌的嚴(yán)重感染(如卡氏肺囊蟲(chóng))，而被稱(chēng)為成熟的艾滋病患者，在12個(gè)月內(nèi)有近似50%的死亡率。選擇HIV病毒感染作為例子僅僅是因?yàn)槠鋎sRNA缺乏的水平非常明顯。許多其它疾病，包括無(wú)痛的病毒感染，同樣與類(lèi)似的缺乏有關(guān)。因此，本發(fā)明具有極其廣泛的應(yīng)用范圍。
還有很重要的一點(diǎn)，即上面所指出的典型進(jìn)程并沒(méi)有說(shuō)明HIV感染的患者或許多其它具有慢性疾病[如非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒(EB)感染，肝炎病毒感染，巨細(xì)胞病毒、皰疹病毒感染等]的患者在臨床癥狀方面的明顯差異。各種患者中免疫系統(tǒng)組分的極大差異的速率衰退以及生物活性dsRNA的缺乏在這一過(guò)程中是一原因或影響因素。HIV感染可在各種不同類(lèi)型的細(xì)胞(如血細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞)中出現(xiàn)。某些患者出現(xiàn)神經(jīng)性機(jī)能障礙，作為他們的第一癥狀。因此，各種患者可能具有極其不同的治療要求，盡管所有患者都可能需要從T4細(xì)胞中排除HIV。
在各種不同病毒感染(包括ARC患者)中出現(xiàn)的兩個(gè)普通病理特征需要指出一下免疫缺陷和進(jìn)行中的病毒感染的聚集(Fauci，“Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA》83卷，9278頁(yè)，1986)。僅攻擊免疫缺陷而不能控制病毒復(fù)制的治療手法似乎起反作用，尤其當(dāng)這種治療活化了T4細(xì)胞時(shí)更是如此。例如，具有Tac受體的T輔助細(xì)胞與淋巴因子IL-2相應(yīng)答。在艾滋病患者中，IL-2引起HIV敏感細(xì)胞膨脹，疾病明顯惡化。
直接攻擊病毒感染(如HIV感染)所取得的明顯成功尤其被命名為疊氮胸苷(AZT)的病毒逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑所證實(shí)，它能夠減少，某些患者HIV的“負(fù)荷”，從而延長(zhǎng)壽命。這種治療法也不是不能產(chǎn)生所需的結(jié)果。在少數(shù)患者中，AZT也引起T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的暫時(shí)恢復(fù)，它是通過(guò)T4細(xì)胞的短暫升高以及遲發(fā)型超敏反應(yīng)的出現(xiàn)而測(cè)得(Fischl等，《New Eng.J.Med》，1987年7月)。但是，當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑達(dá)到產(chǎn)生明顯的抗病毒效果的劑量時(shí)是有毒的，因此帶來(lái)耐藥力極差?？共《緞┛赡苄枰∪私K生服用。
IFN作為一般抗病毒化合物或抗艾滋病藥品都是無(wú)效的，這可能是因?yàn)樗皇且环N對(duì)于本發(fā)明人所揭示的dsRNA相關(guān)缺陷的解毒藥。的確，ARC/艾滋病患者在IFN代謝途徑中有各種“缺陷”，如產(chǎn)生有缺陷的、酸不穩(wěn)性IFN，以及T細(xì)胞無(wú)力產(chǎn)生適量的IFNγ，這些都在醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中有完整敘述。本發(fā)明人早以得出結(jié)論，在ARC和艾滋病患者的各種與IFN相關(guān)的缺陷完全或部分與淋巴細(xì)胞中RNA酶L(一種末端途徑介體)活性有關(guān)，這些在本發(fā)明人1987年3月3日遞交的系列號(hào)為021，372的共同未決申請(qǐng)中已有敘述，在此引用以作參考。盡管ARC/艾辭病和其它慢性病毒血癥患者的血淋巴細(xì)胞中依賴(lài)dsRNA的2-5A合成酶升高，但本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在同一血細(xì)胞中真空2-5A水平下降，RNA酶L也下降(見(jiàn)下)。本發(fā)明人已將RNA酶L的低活性與能夠和光親和標(biāo)記的2-5A類(lèi)似物結(jié)合的Mr80，000蛋白質(zhì)的低數(shù)量相聯(lián)。本發(fā)明與已被關(guān)閉且相關(guān)物缺乏的dsRNA途徑和/或RNA酶L抑制劑相一致。
接種抗HIV和其它病毒的疫苗或使用被動(dòng)抗HIV抗體也可以考慮分別用于病毒的預(yù)防和治療，但都有明顯的限制。例如，HIV(尤其系統(tǒng)感病毒)可以很容易地隱蔽感染細(xì)胞。在上面提到的專(zhuān)利申請(qǐng)中，本發(fā)明人也指出了dsRNA的一種作用，即增強(qiáng)抗一般病毒尤其是逆轉(zhuǎn)病毒的抗體的形成。
本發(fā)明人在此敘述了一種新現(xiàn)象，它支持了這樣一種觀點(diǎn)，即雙鏈RNA(dsRNA)組成了能夠有效地抵抗由各種亞急性/慢性病毒感染(如HIV等)所帶來(lái)的病毒和免疫缺陷的第一組分子。對(duì)這種缺陷的校正可達(dá)到類(lèi)似激光那樣的精確性，且對(duì)機(jī)體的其它功能沒(méi)有不利影響，而對(duì)于現(xiàn)行用于治療慢性病毒感染的方法來(lái)說(shuō)這種不利影響是一個(gè)普通的缺點(diǎn)。本發(fā)明人認(rèn)為，具有未解決的且無(wú)痛的病毒感染的患者常常在其重要的細(xì)胞內(nèi)依賴(lài)dsRNA途徑上存在特定缺陷，通過(guò)加入外源dsRNA可以恢復(fù)或至少部分改善這種缺陷(這在

圖1的流程中作了圖表式的解釋)，且在治療前或治療期間監(jiān)測(cè)這些途徑，提供了一種調(diào)整個(gè)別患者或特定疾病所需的取代療法中的dsRNA程度的有效新方法。
與宿主防御相關(guān)的關(guān)鍵酶需要dsRNA來(lái)表達(dá)生物活性。如果細(xì)胞內(nèi)天然dsRNA水平太低可以通過(guò)加入外源dsRNA活化這些酶。dsRNA的多種行為部分來(lái)自于它誘導(dǎo)整個(gè)IFN-α、β、γ-合成的能力，它是通過(guò)一組細(xì)胞內(nèi)介體來(lái)進(jìn)行的，包括依賴(lài)dsRNA的蛋白質(zhì)激酶、依賴(lài)dsRNA的2-5A合成酶和依賴(lài)2-5A的RNA酶L。如Lengyel所述，這些依賴(lài)dsRNA的酶是由于IFN而發(fā)揮許多生物學(xué)活性(《Ann.Rev.Biochem》，51卷，251頁(yè)，1982)。例如，一種阻斷2-5A合成酶表達(dá)的反義RNA的產(chǎn)生，可引起動(dòng)物細(xì)胞對(duì)于不同病毒感染的深度敏感性(Bendetti等，《Prac.Natl.Acad.SciUSA》84卷，658頁(yè)，1987年)。dsRNA活化的蛋白質(zhì)激酶使elF2磷酸化從而抑制蛋白質(zhì)合成;它也具有降解病毒蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)水解活性?！?4卷，658頁(yè)，1987年)。ds活化的2-5A合成酶合成2-5A，后者活化RNA酶L，本發(fā)明人認(rèn)為在抑制各種動(dòng)物病毒如細(xì)胞生長(zhǎng)控制中都發(fā)揮關(guān)鍵作用的一種途徑(避免了腫瘤的形成)。2′-5′多聚腺苷酸是不正常的，在這種情況下，大部分dsRNA的正常3′，5′磷酸二酯鍵連接特性被獲得了新的生物學(xué)特性的新型磷酸二酯鍵所代替。
dsRNA的抗病毒活性dsRNA是一種已知的抗病毒狀態(tài)誘導(dǎo)物(Marcus等，《Nature》66卷，815頁(yè)，1977)。與此類(lèi)似，poly(A)poly(U)不誘導(dǎo)IFN而產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)。但是，在本發(fā)明之前，并不知道存在天然dsRNA調(diào)節(jié)劑，從而也不知道實(shí)際dsRNA缺乏狀態(tài)在人體中是普遍，尤其是與病原菌發(fā)作相關(guān)(病毒、真菌、原生動(dòng)物、細(xì)菌侵入等)。
dsRNA的抗增殖活性
本發(fā)明人早已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在軟瓊脂上對(duì)100多個(gè)新鮮人腫瘤進(jìn)行研究時(shí)，有42%的在僅一個(gè)細(xì)胞集落暴露于dsRNA后腫瘤細(xì)胞集落形成減少50%或更多(J.IFN.Res.6卷，373頁(yè)，1986)。這些細(xì)胞缺乏dsRNA。本發(fā)明人也敘述了各種人腫瘤細(xì)胞系中的獨(dú)立IFN和dsRNA敏感性，且發(fā)現(xiàn)在無(wú)胸腺小鼠中繁殖的人腫瘤對(duì)dsRNA敏感;dsRNA治療對(duì)某些腫瘤(如腎的)有療效，且動(dòng)物活到預(yù)期的正常壽命(見(jiàn)公布的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0，113，162)。在此，本發(fā)明人報(bào)道了一種臨床反應(yīng)和依賴(lài)dsRNA的酶活化之間的強(qiáng)烈相互作用，dsRNA增強(qiáng)免疫活性本發(fā)明人早已報(bào)道(J.Immunol.，124卷，1852頁(yè)，1980)，dsRNA增強(qiáng)抗人白血病細(xì)胞的天然殺傷細(xì)胞(NK)的溶胞活性。dsRNA對(duì)NK強(qiáng)化的結(jié)構(gòu)需要類(lèi)似于它對(duì)于2-5A合成酶活化和IFN誘導(dǎo)的需要。
dsRNA介導(dǎo)的基因控制Sullo等證實(shí)(《Cell》43卷，793頁(yè)，1985)，dsRNA在支撐成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)活性基因，包括被定名為fos和myc的致癌基因。這里所說(shuō)的“活性基因”是指在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵行為如繁殖、生長(zhǎng)等時(shí)需要其發(fā)揮作用的那些基因。被dsRNA誘導(dǎo)的IFN-β基因可利用一種調(diào)節(jié)蛋白，它在細(xì)胞暴露于dsRNA時(shí)被除去(Zinn等，《細(xì)胞》45卷，611頁(yè)，1986)。本發(fā)明人也測(cè)得，對(duì)于生物活性來(lái)說(shuō)，外源供給的dsRNA類(lèi)似天然的、無(wú)病毒細(xì)胞內(nèi)dsRNA，象與poly(U)復(fù)合的異源核RNA或mRNA。例如，本發(fā)明人最近發(fā)現(xiàn)，在海拉細(xì)胞核有一種可誘導(dǎo)IFN的dsRNA，它可在體外活化2-5A合成酶。遠(yuǎn)在動(dòng)物進(jìn)化周期后面向細(xì)胞免疫的出現(xiàn)明顯地為IFN/dsRNA分子朝著完成細(xì)胞分化(尤其是由IFN促進(jìn)的分化)方向進(jìn)行建立了一個(gè)階段。本發(fā)明人也獲得了一個(gè)更全面的理解，即dsRNA能夠完成由其它調(diào)節(jié)蛋白促進(jìn)的分化，它為所定義的dsRNA缺乏狀態(tài)建立了一個(gè)階段。
圖1是一流程圖，顯示了導(dǎo)致宿主發(fā)病和宿主恢復(fù)的雙重途徑;
圖2是一曲線(xiàn)圖，畫(huà)出了如所示的IFN療法開(kāi)始前和開(kāi)始后的天數(shù)對(duì)合成酶活性的關(guān)系;
圖2B是一曲線(xiàn)圖，比較了治療120天后的白細(xì)胞數(shù)和失配dsRNA量。
圖3是一聚丙烯酰胺凝膠電泳板的照片，顯示出沿每條泳道的各種區(qū)和帶。
圖4是曲線(xiàn)圖，比較了每立方毫升血液中T4淋巴細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)(以從基線(xiàn)變化的百分?jǐn)?shù)表示)與治療月數(shù)的關(guān)系。
本發(fā)明人在此敘述了一種新現(xiàn)象，它支持這樣一種觀點(diǎn)，即雙鏈RNA(dsRNA)組成了有效抵抗各種亞急性/慢性感染(象HIV等)的病毒和免疫損傷的第一組分子。對(duì)這種缺陷的校正可達(dá)到類(lèi)似激光一樣的精確性，且對(duì)機(jī)體的其它功能沒(méi)有不利影響，而這種不利影響恰恰是現(xiàn)行的治療慢性病毒感染的方法的共同缺點(diǎn)。本發(fā)明人認(rèn)為，具有未解決的無(wú)痛病毒感染的患者在依賴(lài)于dsRNA的細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵途徑上存在特定缺陷，它可通過(guò)外源加入使dsRNA恢復(fù)或至少部分達(dá)到改善(在圖1的流程中已清楚解釋)，且認(rèn)為，在治療前或治療期間監(jiān)測(cè)這些途徑，提供了一種調(diào)整個(gè)體患者或特定疾病所需的替換療法中的dsRNA程度的有效新方法。
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)患者樣品中dsRNA缺乏狀態(tài)、定量分析這種缺乏(如果有的話(huà))的診斷方法，也提供了一種恢復(fù)任何dsRNA缺乏的治療方法，它以服用外源dsRNA(偶而與淋巴因子結(jié)合)為標(biāo)志。通常，dsRNA缺乏狀態(tài)在免疫系統(tǒng)的組成細(xì)胞中被證實(shí)，而不管這種組成細(xì)胞是否處在繁殖或分化過(guò)程。例如，通過(guò)免疫系統(tǒng)的組成細(xì)胞無(wú)力維持足量水平的生物活性RNA酶L，就可證實(shí)dsRNA的缺乏。治療前、治療期間和治療后監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)依賴(lài)于dsRNA的途徑，使得臨床醫(yī)師能夠根據(jù)個(gè)體需要調(diào)整dsRNA替換療法的程度。估計(jì)dsRNA缺乏的其它方法在下面有詳細(xì)說(shuō)明。“介體”在此指能夠影響dsRNA的存在而引起的特定生物化學(xué)功能的細(xì)胞內(nèi)任何部分(如具體的多聚核苷酸，蛋白質(zhì)，dsRNA一單獨(dú)的或是結(jié)合的)。這些生化作用將從單個(gè)細(xì)胞或整個(gè)(機(jī)體)水平上增強(qiáng)宿主防御機(jī)制。
對(duì)本發(fā)明的治療方法敏感的疾病一般是，與健康個(gè)別相比其細(xì)胞內(nèi)dsRNA水平低于正常限度的缺乏，引起組織病變的dsRNA缺乏和/或與細(xì)胞內(nèi)病原菌的存在偶聯(lián)或共存的異常低水平dsRNA存在下的缺乏。更具體的疾病或組織病變和全身癥狀包括如逆病毒感染(包括HIV，皰疹科病毒，副粘病毒，鼻病毒)等病毒感染，肝炎和慢性疲勞綜合癥。還包括癌細(xì)胞的失控繁殖和免疫系統(tǒng)病變，而不管細(xì)胞是否處在繁殖或分化過(guò)程。
“失配dsRNA”是指互補(bǔ)鏈之間的氫鍵(堿基堆集)相對(duì)完整即在每29個(gè)連續(xù)堿基中平均只有一個(gè)以下的堿基被破壞的dsRNA?！笆洹笔侵赣捎阪湹膬?nèi)陷(或外陷)產(chǎn)生容易被核糖核酸酶水解的部位，而導(dǎo)致RNA雙螺旋的正常構(gòu)型被破壞。也應(yīng)相應(yīng)地理解術(shù)語(yǔ)“失配dsRNA”。
dsRNA可能是含有一定比例的尿嘧啶堿基或鳥(niǎo)嘌呤堿基的多聚胞苷酸和多聚肌苷酸的復(fù)合物，如其比例從五分之一到三十分之一(poly I.poly(C4-29X＞U或G)。
dsRNA可能具有通式r In·r(C12U)n。下面討論了其它合適的dsRNA的例子。
在一最佳失配dsRNA r In·r(C12，U)n中，由6至12個(gè)堿基(即半個(gè)至1個(gè)完整RNA雙螺旋)的未破壞鏈組成的區(qū)域既作為引起淋巴因子釋放的生物觸發(fā)器，也作為組成天然抗病毒途徑的酶的專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)輔助因子。由尿嘧啶殘基組成的失配區(qū)定期插進(jìn)多嘧啶鏈，以加速dsRNA水解，從而防止毒性產(chǎn)生。
最適用于本發(fā)明的失配dsRNA是從選自poly(Cn，G)的共聚核苷酸得來(lái)的，其中n是從4到29的整數(shù)。它也是多聚肌苷酸和多聚胞苷酸復(fù)合物的失配類(lèi)似物，通過(guò)沿多聚胞苷酸(r(Cn)鏈加進(jìn)未配對(duì)堿基(尿嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤)對(duì)r In·r Cn進(jìn)行修飾而形成。或者，通過(guò)對(duì)多聚肌苷酸(r In)的核糖基骨架進(jìn)行修飾(如加入2′-O-甲基核糖基)從poly(I)·poly(C)dsRNA獲得dsRNA。這些r In·r Cn的失配類(lèi)似物，尤其是通式為r In·r(C11-14，U)n和r In·r(C29，G)n的類(lèi)似物，在Carter和Ts′O的美國(guó)專(zhuān)利4，130，641和4，024，222中已有所述，在此引用以作參考。其中所述的dsRNA一般適用于本發(fā)明。在某些情況下，互補(bǔ)核苷酸雙螺旋也可用于取代療法。
用于本發(fā)明的失配dsRNA的例子有poly(I)·poly(C4，U)poly(I)·poly(C7，U)poly(I)·poly(C13，U)poly(I)·poly(C22，U)poly(I)·poly(C20，G)poly(I)·poly(C29，G)poly(I)·poly(Cp)23G＞PdsRNA-淋巴因子協(xié)同作用由于dsRNA通過(guò)IFN部分介導(dǎo)的特定淋巴因子系統(tǒng)在其生物中發(fā)揮顯著作用，因此本發(fā)明人認(rèn)為，它必須(a)在缺乏IFN缺乏細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN，(b)活化相關(guān)的依賴(lài)dsRNA酶介體，細(xì)胞內(nèi)dsRNA在外源施用IFN不起反應(yīng)的細(xì)胞中是不可誘導(dǎo)的。
如果dsRNA僅通過(guò)IFN起作用，且如果dsRNA在細(xì)胞內(nèi)是過(guò)量的，那么單獨(dú)的IFN過(guò)量將發(fā)揮IFN和dsRNA結(jié)合時(shí)同樣高的生物活性。但是，這是一種比較少見(jiàn)的情況，因?yàn)楸景l(fā)明人發(fā)現(xiàn)了許多dsRNA-IFN協(xié)同作用的例子，而很少發(fā)現(xiàn)無(wú)協(xié)同作用的例子。例如，dsRNA在抑制來(lái)自人膀胱癌、肺癌和纖維肉瘤的細(xì)胞的生長(zhǎng)時(shí)與人IFNα、β或γ協(xié)同作用。本發(fā)明人將這些結(jié)果擴(kuò)大到15個(gè)其它人腫瘤細(xì)胞系，只有一個(gè)細(xì)胞系不能顯示抗繁殖協(xié)同作用。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)，在移入無(wú)胸腺小鼠的某些人腫瘤中同樣出現(xiàn)抗腫瘤協(xié)同作用。在臨床上本發(fā)明人也同樣觀察到，作為對(duì)腎腫瘤和CML的抗癌方案，IFN和dsRNA的結(jié)合使用要比任何一種單獨(dú)使用時(shí)優(yōu)越。
dsRNA缺乏狀態(tài)作為一種原型途徑，2-5A合成酶/RNA酶L途徑包括一種或多種dsRNA，2-5A，連接酶和抑制劑。這在dsRNA和RNaseL之間存在一直接生化聯(lián)系，其中依賴(lài)2-5A合成酶的產(chǎn)物2-5A是RNA酶L活性所必需的輔助因子。下面的例子列舉了在dsRNA介導(dǎo)的途徑中可能存在的幾種缺陷，它可通過(guò)外源加入dsRNA而得以恢復(fù)。
圖1的流程中顯示了dsRNA的充足導(dǎo)致宿主復(fù)原和dsRNA缺乏導(dǎo)致宿主發(fā)病的關(guān)系。生物活性dsRNA是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的，或是由某些事件引入的，它導(dǎo)致抗病毒狀態(tài)，以及免疫細(xì)胞分化和宿主復(fù)原。
體外測(cè)定2-5A合成酶價(jià)值不大，因?yàn)檫@種檢測(cè)沒(méi)有反應(yīng)出體內(nèi)2-5A合成酶活性。因此，本發(fā)明人建立了一種新方法，從健康個(gè)體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)中和失配dsRNA治療前及治療后從病原菌感染的患者中提取和測(cè)定2-5A的數(shù)量。2-5A的濃度可通過(guò)2-5A對(duì)于親和純的RNA酶L降解poly(U)[32P]p Cp的活化能力而測(cè)定。
表1細(xì)胞內(nèi)2-5A濃度和病毒感染患者的PBMC提取液中2-5A合成酶和RNA酶L體外活性PBMC來(lái)源失配RNaseL2-5A合成酶細(xì)胞內(nèi)RNA酶L周數(shù)活性a2-5Ab潛伏的c，d活化的d欄12345＃1AIDS049＜0.2260--+4105ND-KS94＜0.2-15101.8++19210.8-2426＞10.0++++2820＞10.0++++＃2AIDS-1205＜0.2240--+0180ND--KS41171.4++8192.4+++PCP21ND6.8++2695.4++++
PBMC來(lái)源失配RNaseL2-5A合成酶細(xì)胞內(nèi)RNA酶L周數(shù)活性a2-5Ab潛伏的c，d活化的d＃3ARC-611＜0.2270--213ND-419＜0.2-1731.8++++＃4ARC0130＜0.2270--2185ND-4180.4+8ND＜0.2-22ND＞10.0++++＃5LAS0300.6280--436＜0.2-9121.0++17213.0++++50.3-1.11350++++健康志愿者
a整合到2-5A的ATP納摩爾數(shù)/在poly(I)∶poly(C)-瓊脂糖檢測(cè)中測(cè)得的蛋白質(zhì)毫克數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)偏差9%;ND-未測(cè)。
b納摩爾數(shù)/在核心纖維素檢測(cè)(兩份)中測(cè)得的蛋白質(zhì)克數(shù);標(biāo)準(zhǔn)偏差20%。
cdpm/在放射結(jié)合檢測(cè)(兩份)(第3欄)中測(cè)得的50微克蛋白質(zhì);標(biāo)準(zhǔn)偏差20%。
d在兩次獨(dú)立的rRNA斷裂檢測(cè)(欄4和5)中測(cè)得。形成的特定酶解產(chǎn)物(SCP)可通過(guò)凝膠照片的光密度追蹤而定量測(cè)得，且以形成的SCP除以18S和28SrRNA，再乘以100表示;-，0;+，10-13;++，31-63;64-85;++++，86-100。
方法從10個(gè)健康個(gè)體和5個(gè)具有LAS、ARC和AIDS(由疾病控制中心定義)的男性患者體中獲得肝素化的外周血。這項(xiàng)研究所涉及的5個(gè)患者的臨床、病毒和免疫特性在本發(fā)明人的文章(《Lancet》，1987年6月6日)中已有鑒定，分別對(duì)應(yīng)其中的10，8，1，7和2號(hào)患者。PBMC在Ficoll-Hupaque上分離。L929和HL929(一種缺乏RNaseL的L929的亞克隆)細(xì)胞維持在單層培養(yǎng)物上。L929和HL929的胞漿提取物在甘油緩沖液中制備，PBMC提取液在NP40溶解緩沖液中制備。提取液的蛋白質(zhì)濃度范圍從10-15微克/微升。KS卡波濟(jì)肉瘤;PCP卡氏肺囊蟲(chóng)肺炎。
利用poly(I)∶poly(C)-瓊脂糖在PBMC提取液中測(cè)定2-5A合成酶(欄1)的活性(每次50微克蛋白)。2-5A從PBMC提取液(100微克蛋白質(zhì))的乙醇可溶部分(70%乙醇，體積比)中分離。然后在20微升的水中冷凍和再溶解于乙醇提取的2-5A。在使用L929提取液(作為RNA酶L來(lái)源)的核心纖維素檢測(cè)中，從利用真實(shí)2-5A獲得的校對(duì)曲線(xiàn)可測(cè)得存在于PBMC提取液(欄2)中的細(xì)胞內(nèi)2-5A的濃度。在這一檢測(cè)中2-5A對(duì)RNA酶L的活化是基于poly(U)[32P]p Cp向酸可溶性片段轉(zhuǎn)化。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中(缺少2-5A)，所加poly(U)[32P]p Cp(1.3uci/nmole)的總17700dpm中的6500dpm保留在玻璃纖維過(guò)濾板上。當(dāng)真實(shí)2-5A≤1×10-10M時(shí)，poly(U)[32P]p Cp降解0%;當(dāng)2-5A＞1×10-7M時(shí)，poly(U)[32P]p Cp降解100%。潛伏RNA酶L水平通過(guò)兩種途徑測(cè)得(ⅰ)同PBMC提取液中加入20，000dpm P3A4[32P]p Cp后進(jìn)行放射結(jié)合檢測(cè)(每次檢測(cè)50微克蛋白質(zhì)((欄3)。(ⅱ)在2-5A存在下進(jìn)行核糖體RNA斷裂檢測(cè)(欄4)。將從L929細(xì)胞制備的提取液(每次檢測(cè)150微克蛋白質(zhì))于30℃保溫60分鐘，其中存在5微升PBMC提取液的乙醇可溶部分和1×10M-8P3A3(最終體積為20微升)。提取總RNA，變性處理，在1.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。在紫外光下可見(jiàn)溴乙錠染色的RNA帶。在所加2-5A缺乏情況下通過(guò)核糖體斷裂檢測(cè)可測(cè)定出活化RNA酶L水平(欄5)。
對(duì)于健康人來(lái)說(shuō)，PBMC提取液中功能性2-5A的濃度為0.3-1.1納摩爾/蛋白質(zhì)克數(shù);對(duì)于病毒感染的患者來(lái)說(shuō)，在失配dsRNA治療前，其濃度從低至不可測(cè)定到每克蛋白質(zhì)0.6納摩爾。但當(dāng)失配dsRNA治療后，積累的2-5A達(dá)到每克蛋白10.0納摩爾以上。已報(bào)到，2-5A活化的部分純化的RNA酶L主要打斷poly(U)，而不是poly(C)。分離的人2-5A，象真實(shí)的2-5A，能夠活化來(lái)自健康人的L929細(xì)胞或PBMC的親和純RNA酶L，以特異性地降解poly(U)，見(jiàn)表4。應(yīng)當(dāng)注意，當(dāng)使用TCA從PBMC中提取2-5A時(shí)，除提取出poly(U)降解(RNA酶L)活性外，還提取出poly(C)降解活性。通過(guò)蛋白酶水解或乙醇進(jìn)一步提取，可消除這種TCA可提取的poly(C)降解活性。在來(lái)自各種人PBMC的TCA可溶百分中發(fā)現(xiàn)了這種poly(U)可降解活性，但至今未在永久細(xì)胞系(如HelaL929，HL929)中發(fā)現(xiàn)。在PBMC的乙醇可溶部分未測(cè)得poly(C)降解活性。
表3dsRNA對(duì)由呼吸道合胞病毒感染的CCL25細(xì)胞形成的感染中心的作用失配dsRNA 感染中心b減少的百分?jǐn)?shù)的濃度a平板計(jì)數(shù)平均計(jì)數(shù)0μg/ml 49，44，15＊，33 42.00.5μg/ml 38，36，26，16＊33.3 21.71.0μg/ml54，44，42，5348.515.52.5μg/ml37，32，24，3030.826.75.0μg/ml27，14，17，1819.054.810.0μg/ml1，1，7，53.591.725.0μg/ml0，2，0，00.598.8＊未用于計(jì)算平均計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)。
失配dsRNA的最高濃度[r I·r(C12，U)n，25μg/ml]對(duì)CCL25細(xì)胞沒(méi)有毒性。
(a)在24孔平板的四排孔中含有融合的CCL25細(xì)胞，在RSV感染細(xì)胞的平板培養(yǎng)之前1小時(shí)，將1.5ml含有上述濃度dsRNA的維持培養(yǎng)基再加到四排孔中。將無(wú)dsRNA的維持培養(yǎng)基再加到模擬處理的細(xì)胞中。
(b)在總體積為1ml，其中含有5×105PFU的RSV(MOI＝12)情況下感染懸液中4×104CCL25細(xì)胞。在37℃下2小時(shí)的溫育過(guò)程中，隨著細(xì)胞的周期性重新懸浮出現(xiàn)病毒吸附。最后，用維持培養(yǎng)基以1/100稀釋?xiě)腋∫?。取?shù)份0.5ml的感染細(xì)胞懸液，直接加入到各試驗(yàn)孔中和各感染中心對(duì)照孔中。將0.5ml維持培養(yǎng)基加到細(xì)胞對(duì)照孔中。全部培養(yǎng)物于37℃，5%CO2-95%空氣下溫育72小時(shí)，與甲醇混合并用吉姆薩氏染劑染色。在顯微鏡下計(jì)數(shù)空斑(感染中心)。
moi是指感染復(fù)數(shù);即，可用于感染每個(gè)靶細(xì)胞的病毒粒子的大約數(shù)目。PFU是指空斑形成單位;即，通過(guò)計(jì)數(shù)病變細(xì)胞(死細(xì)胞)測(cè)得的病毒單位數(shù)目。
雖然已有關(guān)于2-5A存在于從未處理動(dòng)物中分離出的組織中以及2-5A在用dsRNA處理過(guò)的小鼠組織中積累的報(bào)道，但是本發(fā)明人的報(bào)道是2-5A在人的組織中積累的首次報(bào)道。充分證實(shí)了真實(shí)2-5A可與RNA酶L結(jié)合并激活之使rRNA降解為具有高度特性的特異酶切產(chǎn)物(SCP)。因此，本發(fā)明人鑒定了從PBMC提取液中分離出的2-5A在rRAN酶切測(cè)定中的活性。經(jīng)乙醇提取的2-5A通過(guò)RNA酶L產(chǎn)生的特異酶切圖譜與在真實(shí)2-5A存在下所得到的圖譜相同。這些結(jié)果表明給受病毒感染的病人靜脈內(nèi)注射失配dsRNA使得血細(xì)胞中的2-5A從低于檢測(cè)的濃度開(kāi)始顯著增加。
RNA酶L的活性在受HIV感染的個(gè)體中缺乏RNA酶L活性被進(jìn)一步證實(shí)并擴(kuò)展(表1，3，4，5欄)?；?-5A活化RNA酶L對(duì)rRNA的酶切特異性的靈敏技術(shù)(Wreschneretal，NucleicAcidsRes.，Vol.9，pp.1571-1581，1981)可測(cè)定從少到1ml外周血中分離出的PBMC提取液中的活化RNA酶L。L929細(xì)胞系(HL929)的RNA酶L缺乏亞克隆提取液被用作核糖體的來(lái)源。用放射結(jié)合測(cè)定法測(cè)得受HIV感染病人的PBMC提取液中隱性RNA酶L的水平比健康個(gè)體中的隱性RNA酶L的水平低5-7倍(表1，第3欄;240-280dpm對(duì)1350dpm)。WU等人已報(bào)道了類(lèi)似的觀察結(jié)果(AIDSResearch，vol.2，pp.127-131，1986)。對(duì)于用失配dsRNA治療的病人中隱性RAN酶L水平的測(cè)定，放射結(jié)合測(cè)定的應(yīng)用受到限制，因?yàn)榇嬖谟谶@些病人的PBMC樣品中的2-5A積累(表1，第2欄)能競(jìng)相與RNA酶L結(jié)合。因此，2-5A活化RNA酶L水平的測(cè)定是必不可少的。
首先，在沒(méi)有外源2-5A加入情況下通過(guò)測(cè)定rRNA由PBMC提取液的特異性酶切，來(lái)測(cè)定活化RNA酶L水平(表1，第5欄)。利用這一測(cè)定方法，證實(shí)了在治療之前受HIV感染病人的PBMC提取液中的RNA酶L未被激活(如圖3的聚丙烯酰胺凝膠電泳所示)。由于得知了在這些PBMC樣品中胞內(nèi)2-5A水平低(表3，第2欄)，所以這一結(jié)果不是出乎預(yù)料的。然而，所有受試健康個(gè)體的PBMC提取液都顯示出活化RNA酶L的存在，在rRNA酶切測(cè)定中產(chǎn)生特異酶切產(chǎn)物，盡管在某些健康個(gè)體中的2-5A低至0.3納摩爾/蛋白克(表3，第5欄)。值得注意的是在治療之前受HIV感染的病人樣品中RNA酶L活性的缺乏不能歸于所報(bào)道的2-5A競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的積累(CayletetalEuropeanJ.Bioch.，vol.143，pp.165-177，1984)。通過(guò)真實(shí)2-5A的加入能使RNA酶L活性得到恢復(fù)(表1，第4欄)。
其次，通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立的測(cè)定方法測(cè)定了隱性RNA酶L的水平。在rRNA特異性酶切測(cè)定中測(cè)定了隱性RNA酶L活性，但其中加進(jìn)了2-5A(表3，第4欄)。在失配dsRNA治療前所取的樣品中，在5位待檢測(cè)病人的任一位中都不能測(cè)出隱性RNA酶L活性。
采用P3A4[32P]pCp光親合標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步測(cè)定在受HIV感染病人的PBMC中RNA酶L是否缺失或改變。以前的光親合標(biāo)記研究已經(jīng)鑒定出具有象RNA酶L一樣對(duì)P3A4[32P]pCp結(jié)合親合力和特異的poly(U)內(nèi)切核糖核酸水解活性的Mr 80，000的蛋白質(zhì)。用P3A4[32P]pCp測(cè)定了存在于PBMC提取液中的RNA酶L的親合性標(biāo)記。得自正常個(gè)體之PBMC提取液的RNA酶L(50μg蛋白)與ARC病人(在失配dsRNA治療之前的病人)進(jìn)行比較或在有或沒(méi)有真實(shí)P3A4(1×10-8M)存在的情況下，加入P3A4[32P]pCp(30，000dpm，3000 Ci/mmole)之后光標(biāo)記L929細(xì)胞提取液(50μg蛋白)。在2-5A核心纖維素上純化得自正常個(gè)體之PBMC提取液的RNA酶L(100μg蛋白)并在加入P3A4[32P]pCp(30，000dpm;3000Ci/mM)之后進(jìn)行光標(biāo)記。在0℃下溫育90分鐘后，將樣品轉(zhuǎn)移到冰冷的瓷滴試板上并用254nm UVG-11 Mineralight燈(Ultraviolet Products)，以2cm的距離(1.0J/m2)光解3分鐘。確定蛋白標(biāo)志物和Mr 80，000RNA酶L的位置。
本發(fā)明的光標(biāo)記研究表明P3A4[32P]pCp與健康人PBMC提取液中蛋白質(zhì)共價(jià)相連(聚丙烯酰胺凝膠數(shù)據(jù)未示出)。然而，在受病毒慢性感染病人的PBMC提取液中蛋白質(zhì)未被標(biāo)記。在相同的試驗(yàn)條件下，在L929細(xì)胞提取液中，M80，000的蛋白質(zhì)被特異性地光標(biāo)記。將P3A4(1×10-8M)加入到含有P3A4[32P]pCp的溫育混合物中防止了光標(biāo)記，從而進(jìn)一步證實(shí)了光標(biāo)記是對(duì)RNA酶L高度特異的。對(duì)用核心纖維素法從健康人的PBMC提取液中提純的蛋白質(zhì)的光標(biāo)記研究揭示了與Mr 80，000蛋白質(zhì)的共價(jià)連接，在真實(shí)2-4A存在時(shí)能夠降解poly(U)，但不能降解poly(A)，poly(C)和poly(G)(見(jiàn)表4)。這些結(jié)果放在看可進(jìn)一步證實(shí)從健康個(gè)體的PBMC中提純并用P3A4[32P]pCp光標(biāo)記蛋白質(zhì)。
用失配dsRNA治療4-17周之后，先檢測(cè)5位慢性感染病人的PBMC提取液中的活化RNA酶L;到失配dsRNA治療17-28周時(shí)，這5位病人的活化RNA酶L活性與在健康個(gè)體中所觀察到的RNA酶L水平相同(表1，第5欄)?；罨疪NA酶L水平與從相同樣品中分離出的功能性2-5A的濃度密切相關(guān)(表1，見(jiàn)第2欄與第5欄的比較)。最令人感興趣的是，在28周內(nèi)1號(hào)病人維持一個(gè)升高的胞內(nèi)2-5A水平并使RNA酶L完全活化，在失配dsRNA治療后3周停止(表1，第2和5欄)。
這里所述的試驗(yàn)表明5位受HIV感染的病人在血液?jiǎn)魏思?xì)胞中具有共同的分子表型低水平的2-5A和缺乏可測(cè)的RNA酶L活性。健康個(gè)體的血液?jiǎn)魏思?xì)胞水平顯示出不同的表型，其中2-5A平均水平較高，并易于檢測(cè)RNA酶L活性。后一表型與功能2-5A合成酶/RNA酶L途徑的預(yù)期結(jié)果更為一致。在正常個(gè)體中，2-5A的穩(wěn)態(tài)庫(kù)是可測(cè)的;大部分該胞內(nèi)2-5A變得與RNA酶L緊密相關(guān)，從而可激活RNA酶L。在本文所述的試驗(yàn)步驟中，清楚地證實(shí)了在受病毒慢性感染的病人血液?jiǎn)魏思?xì)胞中，2-5A的胞內(nèi)水平低于測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，用現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定沒(méi)有活化RNA酶L。
總之，這里的重大發(fā)現(xiàn)在于用失配dsRNA治療克服了在2-5A合成酶/RNA酶L途徑中的缺點(diǎn)。由于通過(guò)將2-5A加入到PBMC提取液中不能恢復(fù)RNA酶L的體外活性，所以不能簡(jiǎn)單地通過(guò)沒(méi)有2-5A時(shí)RNA酶L蛋白質(zhì)的正常水平來(lái)解釋本結(jié)果。RNA酶L蛋白質(zhì)很可能缺乏或受到抑制，因缺乏被2-5A光親合性標(biāo)記類(lèi)似物的結(jié)合性進(jìn)一步證實(shí)了推斷。在這里所述的受治療病人中，在10～20天內(nèi)PBMC中的HIVRNA水平降低并且受HIV感染的PBMC的感染中心(共培養(yǎng))數(shù)目更加緩慢地下降。在此所測(cè)得的胞內(nèi)2-5A和RNA酶L活性的增加與在這些病人中感染中心的喪失更加一致。該結(jié)果清楚地表明在用失配dsRNA治療數(shù)周后，2-5A合成酶/RNA酶L途徑在受HIV感染的病人中比在健康人中更有效。因此該結(jié)果與某些慢性病毒感染表示dsRNA缺乏狀態(tài)(通過(guò)供給外源生物活性dsRNA可使這一狀態(tài)逆轉(zhuǎn))的假設(shè)完全一致。
通過(guò)下列說(shuō)明性實(shí)施例可進(jìn)一步描述本發(fā)明，其中所有的份數(shù)和百分比除非另外指明均為重量比。
實(shí)施例1協(xié)同IFN和dsRNA處理dsRNA缺乏狀態(tài)是其中經(jīng)IFN處理的腫瘤細(xì)胞顯示一點(diǎn)點(diǎn)或不顯示IFN誘導(dǎo)的生長(zhǎng)停滯的狀態(tài)。這是一種dsRNA缺乏的功能性或操作試驗(yàn)，如果需要的話(huà)，可用各種下述的生化測(cè)定法進(jìn)一步確證。在許多情況下，“dsRNA缺乏”的臨床診斷將隨著本發(fā)明更廣泛的實(shí)施變得完善。已知IFNγ腫瘤細(xì)胞在IFN受體中非常缺乏并可含有高水平或低水平的介體，但在每種情況下都發(fā)現(xiàn)它們對(duì)供給的外源dsRNA反應(yīng)。這些例子具有臨床相關(guān)性，因?yàn)樗鼈儽砻鱠sRNA將擴(kuò)大特別是IFN以及其它淋巴激活素，例如，IL-2，各種集落刺激因子和TNF的治療范圍。慢性骨髓性白血病(CML)是一個(gè)恰當(dāng)?shù)睦?。大約60%的CML病人只對(duì)IFN反應(yīng)，而40%的病人不反應(yīng)。后者不能誘導(dǎo)血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)中的2-5A合成酶，如Rosenblum等人在“癌癥研究”第46卷，第4848頁(yè)(1986)中所述。圖2-A表示IFN抗性病例，在該例中在單獨(dú)用IFN處理一段短時(shí)間(7天)后用失配dsRNA加上IFN處理，然后用失配RNA與IFN聯(lián)合處理。該病人在只接受IFN時(shí)不能誘導(dǎo)2-5A合成酶活性，但徑IFN和失配dsRNA聯(lián)合處理該介體的活性的確大幅度增加。在化療之前由阻斷所引起的血細(xì)胞數(shù)目瞬時(shí)增加以后，2-5A合成酶的誘導(dǎo)作用伴隨著持續(xù)數(shù)月之久的完全血液學(xué)緩解。RNA酶L活性也得到了測(cè)定并發(fā)現(xiàn)其比正常情況高10～100倍(圖3A，泳道1)，體外產(chǎn)生的RNA酶解產(chǎn)物表明除了正常RNA酶L的通常rRNA酶解產(chǎn)物以外的進(jìn)一步降解。在用IFN/dsRNA結(jié)合治療30天以后RNA酶L活性恢復(fù)到正常水平和酶切輪廓(圖3A，泳道2)，在這里注意到定期觀察到這種反應(yīng)。
實(shí)施例2T4細(xì)胞的病毒感染另一種dsRNA缺乏狀態(tài)是動(dòng)物病毒本身(或其復(fù)制中間產(chǎn)物)為介體活化提供抑制dsRNA或部分生物活性dsRNA的狀態(tài)，盡管IFN和它的介體可被病毒感染所誘導(dǎo)。在宿主中許多與慢性癥狀學(xué)相關(guān)的病毒都將屬于這一范疇。T4細(xì)胞受HIV感染也可構(gòu)成如圖1所示的情況。在組織培養(yǎng)中失配dsRNA可有效地阻斷T4細(xì)胞中HIV的復(fù)制(見(jiàn)本發(fā)明人已公開(kāi)歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0，213，921號(hào))，盡管在這些相同細(xì)胞中HIV的復(fù)制僅受到α，β或γIFN(單獨(dú)或生理混合物)適當(dāng)抑制。由于HIV RNA本身顯示相當(dāng)大的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不能阻斷其自身表達(dá)，因此不同的dsRNA可能引起不同的生物反應(yīng)。在HIV mRNA5′末端廣泛dsRNA結(jié)構(gòu)的一個(gè)區(qū)域使被懷疑為HIV處理(tat)蛋白的Mr15000多肽結(jié)合(Muesing et.al.，Cell，vol.48，p.691，1987)，我認(rèn)為失配dsRNA可與HIV RNA競(jìng)爭(zhēng)tat蛋白。支持有效HIV感染的性質(zhì)，以及其它慢性病毒血癥，在ARC和AIDS中可能是第二種dsRNA缺乏狀態(tài)。
實(shí)施例3HIV感染細(xì)胞第三種dsRNA缺乏狀態(tài)是在患有慢性病毒感染(如在ARC和AIDS中的HIV)的個(gè)體之血液淋巴細(xì)胞中觀察到的。Preble等人(J.Infect.Dis.，vol.152，1985)報(bào)道了這些細(xì)胞具有高水平的dsRNA依賴(lài)2-5A合成酶，本發(fā)明人進(jìn)一步證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)。這一結(jié)果在所研究的一系列連續(xù)的ARC和AIDS患者中具有典型性，就dsRNA在宿主痊愈中的中心作用和用合適來(lái)源的外源dsRNA替換dsRNA缺乏狀況的必要性而言，這一結(jié)果有助于形成本發(fā)明的基礎(chǔ)。
本發(fā)明人報(bào)道了RNA酶L在ARC和AIDS患者中經(jīng)常缺失(1987年6月6日，TheLancet);但本發(fā)明人報(bào)道了RNA酶L在某些病例中經(jīng)失配dsRNA治療數(shù)周后能夠恢復(fù)到更加正常的活性。如圖3B，泳道4所示，ARC淋巴細(xì)胞提取液在某些條件下能夠抑制正常RNA酶L的活性。由于三氯乙酸(TCA)和乙醇可溶性提取液缺乏抑制活性，所以在ARC患者的MNC中所觀察到的可轉(zhuǎn)移抑制劑可能是Williams等人所述的在皰疹感染細(xì)胞中的抑制劑(Virology，vol.151，p.233，1986)。同樣，在到目前為止所研究的健康個(gè)體之MNC提取液(泳道5)中也始終未看到抑制劑。
由于失配dsRNA直接作用于這些細(xì)胞，所以它們也必定是dsRNA缺乏的。因此，本發(fā)明人已證明不同的dsRNA具有不同的生物活性(HIVdsRNA是抑制性的，而失配dsRNA則不然)。看來(lái)得自ARC和AIDS患者的淋巴細(xì)胞在僅僅執(zhí)行某些必需dsRNA依賴(lài)性功能的意義上說(shuō)是dsRNA缺乏的。除非加入外源dsRNA，至少一種功能，即維持生物活性RNA酶L的足夠水平，不能被執(zhí)行。
實(shí)施例4慢性疲勞綜合癥需要適宜替換治療的dsRNA缺乏的一個(gè)實(shí)例是慢性疲勞癥(CFS)，是涉及到大約1千萬(wàn)到1千2百萬(wàn)美國(guó)人，難于診斷，普遍存在的病癥，其特征為極度疲勞，淋巴腺增大和體質(zhì)癥狀(如體重減輕，無(wú)食欲等)。這種狀況最初出現(xiàn)于年輕，有活力的人。盡管某些CFS患者顯示出神經(jīng)精神病學(xué)變化(如抑郁，記憶喪失和類(lèi)似的紊亂)，慢性疲勞癥有時(shí)還是難于與整個(gè)神經(jīng)病學(xué)病癥，特別是抑郁癥區(qū)分開(kāi)。各種實(shí)驗(yàn)室研究表明許多不同的病毒可在患有慢性疲勞癥的個(gè)體中復(fù)制，而且這些個(gè)體實(shí)際上成為“病毒下水道”。病毒(如EB病毒，細(xì)胞肥大病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，皰疹病毒等)常常存在于這些個(gè)體中。
在正常個(gè)體和患有慢性疲勞癥的病人中，2′-5′A分子的體內(nèi)濃度，即胞內(nèi)dsRNA水平的生化相關(guān)的精確測(cè)量，評(píng)價(jià)方法如下用2′-5′A核心纖維素測(cè)定法[親合層析(用poly U-｛32P｝-p Cp)]分析病人樣品乙醇可溶性部分(Ficoll-Hypaque純化的外周血淋巴細(xì)胞中2′-5′A的含量。在該測(cè)定中，利用2′-5′A活化RNA酶L水解poly(U)的能力測(cè)定功能性2′-5′A的濃度。
通過(guò)測(cè)試15位無(wú)近期病毒感染史(如不發(fā)燒，無(wú)體質(zhì)癥狀，未出疹等)的正常人確定參照值。用真空2′-5′A分子得到校正曲線(xiàn)，借此測(cè)定其淋巴細(xì)胞2′-5′A水平的濃度。正常個(gè)體參照值以2′-5′A的毫微摩爾數(shù)表示，每克PBMC細(xì)胞為0.3到1.1毫微摩爾。
利用這種測(cè)定方法，測(cè)試了10位顯示通常的慢性疲勞癥癥狀的病人，所得結(jié)果如下
表2每克淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)中含病人編號(hào)2′-5′A的毫微摩爾數(shù)1＜0.082＜0.053＜0.054＜0.055未測(cè)6未測(cè)7＜0.018＜0.019＜0.0110＜0.08患有慢性疲勞癥的病人每克淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)中的2′-5′A一般低于0.1毫微摩爾并總是低于大約0.2毫微摩爾。對(duì)于這種患有慢性疲勞癥的患者可通過(guò)按照需要供給外源dsRNA來(lái)治療，直到2′-5′A寡核苷酸的胞內(nèi)水平達(dá)到表明胞內(nèi)dsRNA水平恢復(fù)到正常狀態(tài)和/或病人的臨床復(fù)合癥狀減輕。通過(guò)不斷測(cè)定病人的胞內(nèi)2′-5′A寡核苷酸水平并按需要供給外源dsRNA以維持2′-5′A水平在正常范圍內(nèi)(通常每克淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)中0.2毫微摩爾以上的2′-5′A)來(lái)維持病人對(duì)慢性疲勞癥和機(jī)會(huì)病毒的抗性。
在低抗病毒性疾病(如慢性疲勞癥)時(shí)，天然dsRNA在宿主防御方面起一定作用。生物活性dsRNA，或依賴(lài)于dsRNA的酶，特別是RNA酶L的病毒相關(guān)抑制劑的特異性減少與外周血淋巴細(xì)胞中異常低水平的2′-5′A有關(guān)，其中特異性細(xì)胞有助于疾病的發(fā)展。dsRNA，特別是失配dsRNA，可抑制疾病的發(fā)展。
患有慢性疲勞癥患者的治療方法是靜脈內(nèi)滴注200～600mg(依疾病的嚴(yán)重程度和受病毒感染的程度等而定)的r I·r(C11-14，U)，每周兩次，隨著臨床的改進(jìn)1′-5′A的水平增高。dsRNA的給藥量和給藥頻率將根據(jù)所測(cè)得的與病人的臨床改進(jìn)相關(guān)的2′-5′A水平而定。dsRNA的給藥量在給藥后立即于遠(yuǎn)離滴注點(diǎn)處測(cè)定應(yīng)為每毫升病人系統(tǒng)血液循環(huán)中含0.01～1，000微克dsRNA。
實(shí)施例5對(duì)T4細(xì)胞群體的抗病毒作用外源給予dsRNA，特別是失配dsRNA可恢復(fù)受病毒感染的病人對(duì)病毒攻擊的反應(yīng)能力。作為病毒疾病的一個(gè)例子，選擇HIV作為一種最有破壞性的病毒。HIV感染的第一靶細(xì)胞是T4淋巴細(xì)胞，隨著病毒感染的加劇，T4淋巴細(xì)胞群體顯著減少。此外，T4細(xì)胞群體的減少是一個(gè)討厭的，可確定病情的參數(shù)，它的下降可反映疾病的惡化。反之，T4細(xì)胞群體的增加是表明治療方法有所改進(jìn)的一個(gè)有利的診斷指征。
健康個(gè)體的正常T4細(xì)胞群體是每立方毫米血液含400個(gè)細(xì)胞。測(cè)定了39位診斷患有前ARC或ARC患者(見(jiàn)圖4)并根據(jù)每mm3血液中T4細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)將其分成三類(lèi)(a)大于300(18位患者，數(shù)據(jù)未示出);(b)150-300(13位患者);和(c)小于150(8位患者，平均為92)。靜脈滴注100-200mg r In·(C12，U)(Ampligen )，每周兩次，對(duì)(b)和(c)組患者治療3到16個(gè)月(平均為8.4個(gè)月)。為了比較，給出了得自未經(jīng)治療的HIV感染患者(181位)的T4細(xì)胞群體數(shù)據(jù)(相連的三角形)，在這些個(gè)體中顯示出T4細(xì)胞群體在其它方面不可避免的下降。
基線(xiàn)是開(kāi)始治療前起始絕對(duì)T4淋巴細(xì)胞濃度。如圖4所示改進(jìn)情況是以該基線(xiàn)的正、負(fù)變化百分?jǐn)?shù)表示的。開(kāi)始觀察患者并測(cè)定T4細(xì)胞濃度。在圖4中以空心圓連線(xiàn)表示的(b)組患者T4細(xì)胞濃度在150到300個(gè)細(xì)胞/mm3范圍之內(nèi)。這些患者最初接受100mg(預(yù)防量)Ampligen(靜脈內(nèi)滴注，每周兩次)并觀察逆反應(yīng)，然后將劑量增加到200mg，以同樣頻率給藥。T4細(xì)胞濃度小于150個(gè)細(xì)胞/mm3的第二組病人(c)給300mg Ampligen(靜脈內(nèi)滴注，每周兩次)。以連接實(shí)心圓的線(xiàn)表示基線(xiàn)的變化百分率。如連接三角形的線(xiàn)所示，未經(jīng)治療的患者(181人)，絕對(duì)T4淋巴細(xì)胞繼續(xù)明顯減少。
30位患者在4個(gè)月后平均T4細(xì)胞增加4.3%，10位患者在8個(gè)月后增加8.0%，6位患者在12個(gè)月后增加17%。只有2位患者(平均基線(xiàn)T4＝82個(gè)細(xì)胞)盡管接受連續(xù)的r In·(C12，U)n治療還是患了愛(ài)滋病，另一位中止治療2個(gè)月的ARC患者患了卡波濟(jì)氏肉瘤。
這些數(shù)據(jù)表明絕對(duì)T4淋巴細(xì)胞水平小于150個(gè)細(xì)胞/mm3的受感染個(gè)體需要有效量的藥物以減慢T4細(xì)胞減少的速度;然而，在150-300范圍內(nèi)的患者有效地維持在較低劑量的水平。這些數(shù)據(jù)也強(qiáng)調(diào)在HIV患者的狀況大幅度下降之前開(kāi)始治療的重要性。
這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明dsRNA虧空數(shù)量(通過(guò)絕對(duì)T4細(xì)胞群體間接但精確地測(cè)定)與校正缺陷和使病人完全康復(fù)所需的外源dsRNA的量(使T4細(xì)胞群體恢復(fù)到接近輕度感染和未感染個(gè)體的T4細(xì)胞群體量)之間的直接關(guān)系-T4虧空越多，使之恢復(fù)所需dsRNA的量就越大。
實(shí)施例6雙鏈RNA(dsRNA)取代法治療付粘病毒感染需用適當(dāng)?shù)奶鎿Q法治療的暫時(shí)性dsRNA缺陷的另一個(gè)例子可發(fā)生在新生兒和嬰兒發(fā)育的不同時(shí)期，這時(shí)人體的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全。在這些情況下，潛在威脅生命的感染是從青春期和成人期自我限制感染出現(xiàn)的。一個(gè)特定的例子如下付粘病毒族的一些成員如呼吸道合胞病毒(RSV)可引起抗病毒免疫系統(tǒng)發(fā)育不全嬰兒(一般為6-18個(gè)月)的急性毛細(xì)支氣管炎。這種情況下，用dsRNA[r In·r(C12，U)n]替換治療是急救措施，否則將導(dǎo)致死亡。
為發(fā)展這一新方法，在本試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)了人羊膜衍生的命名為CC125的細(xì)胞株。CCL25株(從ATCC，MarylandUSA得到的)以與人新生兒細(xì)支氣管組織類(lèi)似的形式支持RSV的生長(zhǎng)和繁殖。附表說(shuō)明用人類(lèi)可耐受的99%的dsRNA劑量可減少RSV的繁殖。
表4從人PBMC分離的2-5A和RNA酶L對(duì)同質(zhì)聚核糖核苷酸的活性RNA酶LPBMCL929細(xì)胞來(lái)源降解%a降解%a聚(U)-聚(C)-聚(U)-聚(C)-(32P)pCp (32P)pCp (32P)pCp (32P)pCp真實(shí)2-5A840930從PBMC340450分離的2-5A
a三次獨(dú)立測(cè)定的平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差為20%。
方法將從健康人PBMC提取液(100μg蛋白質(zhì))或L929細(xì)胞純化的RNA酶L在核心纖維素試驗(yàn)條件下，有poly(U)(P)pCp(11000dpm，0.10μCi/mmole)或poly(C)(32P)pCp(12400spm，0.33μCi/nmole)參于下，加入真正2-5A(P3A3，5×10-7M)或從經(jīng)過(guò)9周失配dsRNA治療后的5號(hào)病人PBMC提取液(12.5μg蛋白)提取的2-5A后溫育。poly(U)(32P)pCp和poly(C)(32P)pCp是用T4連接酶(Bethesda Research Laboratories產(chǎn)品)從poly(U)或poly(c)(Sigma產(chǎn)品)和(32P)pCp(Amersham產(chǎn)品合成得來(lái)的。在對(duì)照試驗(yàn)中(無(wú)P3A3)3300dpm的poly(U)(32P)pCp和1000dpm的poly(C)(32P)pCp被保留在玻璃纖維濾器上，作為沒(méi)有降解(0%)。
由于RSV誘導(dǎo)的感染中心的形成涉及病毒直接從細(xì)胞到細(xì)胞的傳播，我們可簡(jiǎn)便地提高dsRNA細(xì)胞內(nèi)的濃度而有效地降低RSV在細(xì)胞間的傳播，但對(duì)人體組織又無(wú)明顯的不利影響。
因此，由其它潛在自我限制的病原體如RSV(付粘病毒族)及其它影響鼻/氣管/小支氣管樹(shù)的產(chǎn)生RNA病毒如鼻病毒或流感病毒引起的病理學(xué)是在dsRNA替換治療機(jī)制的范圍內(nèi)。病厚體侵入的局部門(mén)戶(hù)如導(dǎo)氣管(但不限于此)可在內(nèi)部暫時(shí)地降低dsRNA含量(這里的dsRNA可被定義為任何能觸發(fā)有關(guān)免疫/抗病毒防御連鎖反應(yīng)以阻止病原體的繁殖/組織誘導(dǎo)病理學(xué)的分子)。
實(shí)施例7最近兩三年有文獻(xiàn)報(bào)道艾滋病毒感染的病人引起的肝病。重新提到大量直接針吸活組織檢查和尸解時(shí)檢查樣品的組織學(xué)發(fā)現(xiàn)。下面提及的所有研究中，美國(guó)防病中心(USCentrerforDiseaseControl，Atlanta，Georgia，USA)制定的診斷艾滋病標(biāo)準(zhǔn)是令人滿(mǎn)意的。出現(xiàn)的典型癥狀及發(fā)現(xiàn)病人有肝病的信號(hào)完全是非特異性的，其它癥狀還包括體重減輕，高燒，淋巴結(jié)病，肝脾大和腹痛。大多數(shù)艾滋病人血清轉(zhuǎn)氨酶升高。堿性磷取酶不成比例地升高說(shuō)明這種升高與肉芽腫疾病的診斷有關(guān)。未選擇病人的尸解研究(沒(méi)有偏見(jiàn)的選擇病人是與選擇肝脾大肝功高的病人進(jìn)行活檢相對(duì)立的)說(shuō)明了肝內(nèi)的病理學(xué)。對(duì)艾滋病人80-90%例尸檢說(shuō)明均有肝解剖學(xué)異常。肝組織破壞包括血管充血，入口腫大，脂肪變性，病灶壞死，肉芽腫，膽汀滯，肝硬變和枯否氏細(xì)胞增生(以幾何級(jí)數(shù))，在一項(xiàng)研究中令人感興趣的結(jié)果是尸檢時(shí)卡波濟(jì)氏肉瘤肝內(nèi)診斷是最常見(jiàn)的特異性肝內(nèi)病原體(18%)(見(jiàn)Schneiderman等人，AnnalslnternalMed.，Vol.105，p207，1987)。
近來(lái)有報(bào)道在少數(shù)艾滋病人中有膽病癥狀。個(gè)別病例報(bào)道有關(guān)艾滋病人有硬化膽管炎，肝內(nèi)破壞性膽管損傷和良性肝外膽阻塞。這些病例沒(méi)有特異性病原，活檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞巨病毒可能是其病因。有良性肝外膽阻塞癥狀的艾滋病人主訴還有肝四分區(qū)右上方疼痛及中度膽紅素升高等癥狀。在尸檢和腹壁部分切除術(shù)中進(jìn)行纖維變性繼發(fā)的十二指腸乳頭診斷。在至少兩例肝外阻塞中，從膽管樹(shù)中分離出Cryptospoidia。其它病例在十二指腸乳頭中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞巨病毒侵染體內(nèi)。在上述肝內(nèi)膽管炎病人中特異病原是未知的，特異病原體可能只引起這些癥狀的病理變化。
我們還確定了用dsRNA注入[r I·r(C12，U)n，200mg，每周兩次，靜脈內(nèi)滴注]校正或有效改善了與乙型肝炎病毒(HVB)增殖有關(guān)的潛在的細(xì)胞異常。具體用下列方法進(jìn)行估價(jià)血清或血漿中的HBV-特異DNA用糟吸印雜交測(cè)定與HBV DNA有關(guān)的血清(或血漿)的存在，它作為乙肝病毒的指示劑。將血清樣品用NH4OAC稀釋到終濃度為1M。用72孔的微濾器(schleicher & schuell，Keene，N.H.)將樣品直接載于硝化纖維素濾紙上，該濾紙先用1M NHOAC浸泡10分鐘。用堿將DNA原位變性，再中和。用正常人血清稀釋純化的HBV DNA，以定量測(cè)定每個(gè)糟吸印雜交同樣方式測(cè)該血清稀釋液。烘干濾紙，預(yù)雜交，雜交，在高度約束條件下洗滌，在標(biāo)準(zhǔn)條件下放射自顯影(Mariatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Sambrook，J.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1982)。用于雜交的HBV探針DNA得自含一個(gè)單位長(zhǎng)克隆在EcoRI點(diǎn)的HBV DNA拷貝(HBs AG血清型adw2)的重組質(zhì)粒。用EcoRI酶解該質(zhì)粒，再用兩次制備性瓊脂糖凝膠電泳再電泳洗脫來(lái)純化該HBV DNA。根據(jù)隨機(jī)引物標(biāo)記技術(shù)(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.Analyt.Biochem.，1326-13，1983)用32P-dCTP標(biāo)記的HBV DNA使其比活性為1-2×109cpm/μg。該試驗(yàn)的敏感水平是1pg的HBV DNA。根據(jù)這個(gè)敏感水平，我們探測(cè)到2.9×105個(gè)分子的HBV DNA。
估計(jì)放射自顯影照片的相對(duì)密度并根據(jù)觀察到的密度以數(shù)字評(píng)級(jí)，結(jié)果列在下表中。括號(hào)是治療天數(shù)。
表4施用dsRNA對(duì)體液中HBV濃度降低的效果1號(hào)病人(施用天數(shù))2號(hào)病人(施用天3號(hào)病人(施用天樣品號(hào)治療后吸印的密度數(shù))吸印的密度數(shù))吸印的密度T＊3+(0)3+(0)3+(0)13+(20)3+(21)3+(31)23+(64)2.5+(42)3+(72)33+(106)2+(56)3+(86)42+(162)2+(84)3+(115)52+(219)1.5+(140)2+(170)62+(266)1(180)2+(227)71.5+(310)1，5+(270)81+(353)1.5+(296)91+(400)1.5+(324)101+(450)1.5＝(387)T＊＝0(予處理)+是指在含32P的病毒DNA中暴光5天的X-射線(xiàn)膠片的相對(duì)密度。較大的帶加號(hào)數(shù)字(如3+對(duì)1+)表示更密，在X射線(xiàn)膠片上取印糟更大，即說(shuō)明有更多的病毒DNA存在。
為加強(qiáng)病毒測(cè)量的敏感性，用不同稀釋度的病人血清，常用的有1∶40，1∶200，1∶40和1∶1，500。用糟吸印量密度儀驗(yàn)證其結(jié)果?；赟chleicher和Schnell提供的試劑(材料命名為No3702/284)。用病毒特異性抗原分析得到補(bǔ)充的結(jié)果(測(cè)定人血清或血漿乙肝表面抗原的免疫試驗(yàn))，藥盒可從阿伯特實(shí)驗(yàn)室得到(AbbottLaboratories，命名為83-0804/R12，1985，7)。
由于本發(fā)明結(jié)果已公知，并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用于附加條件/感染/疾病，所以不用靠試驗(yàn)室資料及本發(fā)明人在本申請(qǐng)文本中推出的科學(xué)洞察力和新穎性即可將其用于dsRNA缺陷的臨床診斷。很多不明顯的dsRNA缺陷癥也可包括其中，如由于天然IFN作為增殖途徑的反饋抑制因子(Aullo等人，Cell，Vol.43，p793，1985)，又由于依靠dsRNA介體可補(bǔ)充，從而正分化的細(xì)胞或潛在成癌/轉(zhuǎn)移的細(xì)胞均可是dsRNA缺陷的。
從上述例子可看出通過(guò)有關(guān)生物機(jī)能(如細(xì)胞對(duì)外源IFN的反應(yīng))或生化機(jī)能(如提高的2-5A合成酶)或出現(xiàn)2′-5′寡腺苷取代中間體等，我們可很容易地診斷出dsRNA缺陷癥和用下列各種方法測(cè)定紊亂的程度(1)測(cè)定內(nèi)源2′-5′寡腺苷酸濃度(2)從高壓液相色譜得到的病人樣品定量分析2-5A的濃度和分子量(3)用核糖體RNA切割試驗(yàn)證實(shí)病人體內(nèi)合成的2-5A的生物機(jī)能。
(4)用2，′，5′-P3A4｛32P｝-3′-pCp結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定病人樣品中游離核糖核酸酶L的水平(5)用polyU-｛32P｝-p Cp進(jìn)行纖維素芯試驗(yàn)(親合層析)，根據(jù)病人樣品中合成的2-5A測(cè)定核糖核酸酶的活化特異性。
(6)核糖體RNA酶切割試驗(yàn)，根據(jù)病人樣品中合成的2-5A測(cè)定激活的核糖核酸酶水平。
這些方法已詳述在我的專(zhuān)利申請(qǐng)題為“在體液中制作宿主防御介體”系列號(hào)No028，823，于1987年8月12日遞交，和“用雙鏈RNA矯正紊亂代謝途徑”，系列號(hào)No074，649，于1987年7月17日遞交，它們均列在參考資料中。
雙鏈RNA充足狀態(tài)也可以存在。如CML和茸毛細(xì)胞白血病(HCL)對(duì)作為唯一治療的IFN常有應(yīng)答，反應(yīng)了細(xì)胞內(nèi)天然dsRNA充足。為支持增長(zhǎng)觀點(diǎn)，我們發(fā)現(xiàn)從未治療的HCL病人得來(lái)的單核血細(xì)胞核中2-5A合成酶激活的dsRNA與用IFN治療過(guò)的海拉細(xì)胞的核中的水平相似。
失配dsRNA然而很多dsRNA可誘導(dǎo)不同的淋巴因子，包括IFN和激活的2-5A合成酶，但不是所有dsRNA都有這些性質(zhì)。在合成的dsRNA中，poly(I)∶poly(C)是IFN和2-5A合成酶最好的誘導(dǎo)因子，然而也是毒性很大的。被稱(chēng)作“失配dsRNA”或Ampligen CHEM Research，Inc.，Rockville，Maryland，USA)的poly(I)∶poly(C12，U)在聚嘧啶鏈中含有周期性的尿嘧啶殘基。失配導(dǎo)致迅速的生物降解但不喪失生物功能。例如poly(I)∶poly(C12，U)顯示抗病毒，抗腫瘤和加強(qiáng)免疫活性的功能，但無(wú)毒。
在廣譜病毒和癌治療中將dsRNA用作替換治療失配dsRNA特別適用于慢性病毒感染，包括治療ARC，因?yàn)樗f(shuō)是廣譜抗病毒劑，又是免疫加強(qiáng)劑;既使用高劑量也基本上無(wú)長(zhǎng)期毒性。我的45個(gè)病例，用200-250mg poly(I))∶poly(C12，U)靜脈注射，每周兩次，顯示了病毒濃度CHIV，CMV和泡疹急劇下降，持續(xù)加強(qiáng)T和B細(xì)胞免疫而又無(wú)付作用。很多病人臨床效果持續(xù)約18個(gè)月，或隨著繼續(xù)的dsRNA治療而延長(zhǎng)(100-400mg，每周兩次)。某些情況下，可能需用較大劑量或用的更頻。艾滋病人病毒感染和免疫損傷因人而異，沒(méi)有單一藥物可逆轉(zhuǎn)所有潛在的臨床問(wèn)題。然而，dsRNA在各種治療方案中可能起到樞鈕作用。例如由于失配dsRNA與AZT協(xié)同作用，封鎖T4細(xì)胞的HIV感染(見(jiàn)我的共同未決申請(qǐng)No028，823)，失配dsRNA和非常低用量的AZT在治療包括ARC在內(nèi)的感染可是一個(gè)重要組合。dsRNA和IL-2加強(qiáng)T細(xì)胞，NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞活性都體現(xiàn)兩種生物活性物質(zhì)協(xié)同作用而又沒(méi)有附加的毒性。進(jìn)而還預(yù)見(jiàn)到，在IFN加強(qiáng)B細(xì)胞和單核細(xì)胞分化范圍內(nèi)，某些淋巴因子可以增強(qiáng)dsRNA促進(jìn)特異性中和抗HIV抗體的能力及單核細(xì)胞殺生能力。與此相似，由于樹(shù)脂樣增加T4細(xì)胞數(shù)目和用IFN促進(jìn)T和B細(xì)胞分化，dsRNA和樹(shù)脂樣組合可對(duì)ARC和AIDS額外有益。dsRNA和胸腺多肽結(jié)合也可有T4細(xì)胞恢復(fù)效果，特別是對(duì)T4細(xì)胞數(shù)目很低的病人尤為有效。最后，dsRNA還顯示抗卡波濟(jì)肉瘤細(xì)胞增殖的直接抗增殖活性，加IFNα或IL-2可增強(qiáng)該活性說(shuō)明這是一種新的抗癌途徑?？刂瓢滩⊙?xì)胞參數(shù)顯示增加的CNS問(wèn)題。要想解決這個(gè)問(wèn)題，用以足夠量失配dsRNA跨過(guò)腦血障，激活腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞中寡2′-5′腺苷合成酶，從而結(jié)合dsRNA和包括淋巴因子的其它因子可跨過(guò)腦血障。用于與病毒有關(guān)的癡呆。淋巴因子可理解為包括干擾素，優(yōu)選的是α-干擾素，白細(xì)胞介素，具體地說(shuō)是白細(xì)胞介素-2(IL-2)，重組白細(xì)胞介素2(rIL-2)和腫瘤壞死因子(TNF)。還包括暴露于淋巴因子應(yīng)答中動(dòng)物形成的淋巴因子激活殺生細(xì)胞(LAK)。
當(dāng)α干擾素用作淋巴因子時(shí)，要要0.01～100，000IRU/ml病人體液。當(dāng)用IL-2，特別是rIL-2作為淋巴因子時(shí)，施用量為102-106IL-2單位/kg病人體重，最高值為接近毒性水平。然而，最有效又能控制毒性的值為103-104IL-2單位/kg體重。
dsRNA通常施用量使每ml病人體液達(dá)到0.1到1，000μgdsRNA水平。術(shù)語(yǔ)“體液”是指含血清，鹽，維生素等在機(jī)體中循環(huán)浸在組織中的溶液。兩種制劑(dsRNA和淋巴因子)同時(shí)施入時(shí)，它們可以混合物形式，或同時(shí)但分別施用，或先后施用。
dsRNA與淋巴因子“結(jié)合”施用包括以治療混合物形式一起施用這兩種藥劑，也包括同時(shí)但分別施用這兩種藥劑。
圖1流程圖表示典型dsRNA缺陷導(dǎo)致宿主病態(tài)和dsRNA充足導(dǎo)致宿主康復(fù)。細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的生物活性dsRNA或由某些病毒(如EMC)引入的活性dsRNA觸發(fā)了一系列酶反應(yīng)產(chǎn)生淋巴因子，激活介體，從而導(dǎo)致抗病毒狀態(tài)及免疫細(xì)胞分化，從而使宿主康復(fù)。由各種病毒(如HIV)或腫瘤細(xì)胞引入的dsRNA作為抑制劑可通過(guò)激活攪亂這一途經(jīng)。生理活動(dòng)可限制dsRNA產(chǎn)生或引起異常dsRNA的產(chǎn)生。這些異常導(dǎo)致慢性感染和宿主病態(tài)。在HIV和其它慢性病毒感染中，由于抑制了核糖核酸酶L(作為補(bǔ)充的途徑給出)也可導(dǎo)致免疫功能消失，但可通過(guò)供給合適構(gòu)型的外源dsRNA克服這一缺陷。
圖2A和2B表示在MNC或CML病人中用失配dsRNA誘導(dǎo)2′5′寡腺苷酸合成酶。單獨(dú)用IFN處理CML病人7天(圖2A)再用失配dsRNA和IFN結(jié)合處理(見(jiàn)圖2B)。在處理前或處理期間在Ficoll純化的MNC中測(cè)定合成酶活性。
圖3A是聚丙烯酰胺凝膠電泳平板照片，標(biāo)出了泳道號(hào)和每個(gè)泳道的帶或區(qū)。該平板上顯示出在CML病人的MNC中與新酶解產(chǎn)物有關(guān)的提高了的核糖核酸酶L活性。提供rRNA而非核糖核酸酶L的匈牙利L929細(xì)胞根據(jù)布達(dá)佩斯條約被保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物收集中心，貯藏號(hào)為ATCCNoCRL9659;L929細(xì)胞作為CCL1被貯存，而從CML病人得到的MNC是根據(jù)Kariko和Ludwig及Silverman等人方法制備的。根據(jù)本發(fā)明人共同未決申請(qǐng)No074，649，(于1981年7月17日遞交)描述的方法測(cè)定從MNC中提取的核糖核酸酶L，揭示的細(xì)節(jié)見(jiàn)參考資料。
圖3B也是一個(gè)聚丙烯酰胺凝膠電泳平板照片，表示在rRNA酶解試驗(yàn)測(cè)定時(shí)ARC病人PBMC萃取物中存在核糖核酸酶L抑制劑。L929細(xì)胞萃取物(它既提供核糖核酸酶也提供rRNA)和MNC可分別根據(jù)Kariko和Ludwig和Lujdwig及Silrerman等人的方法制備。
第一泳道18μlL929細(xì)胞萃取物(150μg總蛋白)在有用于MNC溶胞的4μlNP40緩沖液加5.5μl水時(shí)溫育。
第二泳道與泳道一相似，只是用5.5μl 5×10-8M真正P3A3代替水。
第三泳道與泳道一相似，只是將5.5μl溶于TCA的ARC病人的MNC萃取物(100μg總蛋白)在溫育前先加入。
第四泳道用4μlARC病人的MNC萃取物(100μg總蛋白)和5.5μl水溫育18μlL929細(xì)胞萃取物。
第五泳道用4μl得自健康人的MNC萃取物(100μg總蛋白)和5.5.μl水溫育18μlL929細(xì)胞。指出了28S和18SrRNA以及正常水平的2′5′A激活的核糖核酸酶L特異酶解產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種診斷患者中dsRNA缺乏狀態(tài)的方法，且如果缺乏的話(huà)，注入足量外源dsRNA以替換dsRNA，從而校正所說(shuō)缺乏狀態(tài)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中RNA缺乏狀態(tài)是由于免疫紊亂，病毒感染，或失控癌細(xì)胞繁殖。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中成因病毒是逆轉(zhuǎn)病毒，副粘病毒，鼻病毒，或皰疹病毒科的病毒。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中dsRNA缺乏狀態(tài)存在于免疫系列的組成細(xì)胞內(nèi)，而不管組成細(xì)胞是處在繁殖還是分化過(guò)程。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中dsRNA缺乏狀態(tài)的預(yù)期診斷是基于病毒、癌或免疫紊亂對(duì)于另外以合適或生理量注入淋巴因子最初無(wú)反應(yīng)或部分反應(yīng)而做出的。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中預(yù)期診斷被象2-5A途徑中間體的生化測(cè)定或宿主防御所涉及的其它生化途徑所證實(shí)，且顯示被天然dsRNA部分或完全調(diào)整。
7.如權(quán)利要求1所述的診斷dsRNA缺乏的方法，它包括首先注入充夠量的合成dsRNA，以模仿健康人中天然dsRNA的預(yù)期濃度，然后測(cè)定在任何dsRNA介導(dǎo)的途徑中是否有任何陽(yáng)性變化，或測(cè)定臨床狀態(tài)的參數(shù)，以作為所說(shuō)注入的結(jié)果。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中dsRNA替換療法是用配對(duì)dsRNA完成。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中dsRNA替換療法是用失配dsRNA完成。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中失配dsRNA是由多聚肌苷酸和含有一定比例的尿嘧啶或?yàn)踵堰蕢A基(從1/5到1/30)的多聚胞苷酸組成的復(fù)合物。
11.如權(quán)項(xiàng)9所述的方法，其中失配dsRNA為r In·r(C11-14)n。
12.如權(quán)項(xiàng)9所述的方法，其中dsRNA含有鍵斷裂區(qū)，且顯示了r In·r(C11-14)n的可觀治療率性質(zhì)。
13.如權(quán)項(xiàng)9所述的方法，其中失配dsRNA是以導(dǎo)致每毫升人初生物液中產(chǎn)生1-1，000微克dsRNA且在人的次級(jí)或分隔液中產(chǎn)生相應(yīng)量的dsRNA誘導(dǎo)的介體物質(zhì)的量服用。
14.一種改善由與細(xì)胞內(nèi)病原菌共存的dsRNA的缺乏引起的人組織病變的方法，它包括供給外源dsRNA給患者的受損組織，以恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)dsRNA水平。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中病原菌是病毒，或癌細(xì)胞的失控繁殖物。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中病毒病原菌為逆轉(zhuǎn)病毒，副粘病毒，鼻病毒，或皰疹科病毒。
17.如權(quán)項(xiàng)14所述的方法，其中組織病變發(fā)生在所有免疫系統(tǒng)的組分上，而不管組成細(xì)胞是否處在繁殖或分化過(guò)程。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中一種淋巴因子與外源dsRNA結(jié)合服用。
19.如權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其中dsRNA替換療法是用配對(duì)dsRNA完成。
20.如權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其中dsRNA替換療法是用失配dsRNA完成。
21.如權(quán)項(xiàng)9所述的方法，其中失配dsRNA是多聚肌苷酸和含有一定比例尿嘧啶或?yàn)踵堰蕢A基(從1/5至1/30)的多聚胞苷酸的復(fù)合物。
22.如權(quán)利要求9所述的方法，其中失配dsRNA為r In·r(C11-14)n。
23.如權(quán)利要求9所述的方法，其中dsRNA含有鍵斷裂區(qū)，且顯示了r In·r(C11-14)n的可觀治療率。
24.如權(quán)利要求9所述的方法，其中失配dsRNA是以導(dǎo)致每毫升人初級(jí)生物液中產(chǎn)生1-1，000微克dsRNA，且在人的次級(jí)或分隔液中產(chǎn)生相應(yīng)量的dsRNA誘導(dǎo)的介體物質(zhì)的量服用。
全文摘要
本發(fā)明介紹了一種診斷患者dsRNA缺乏狀態(tài)以及通過(guò)加入足量外源dsRNA取代dsRNA而校正所述缺乏狀態(tài)的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK1031651SQ8810641
公開(kāi)日1989年3月15日 申請(qǐng)日期1988年9月3日 優(yōu)先權(quán)日1987年9月4日
發(fā)明者威廉姆·阿·卡特 申請(qǐng)人:Hem研究公司