專利名稱：用嗜酸鏈霉菌生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明是一種用嗜酸鏈霉菌(Streptomyces acidophilus)生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的方法，屬生物工程技術(shù)領域。
1965年Tsumura(津村)Takasaki(高崎)等分別發(fā)現(xiàn)了適于工業(yè)生產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)生菌種-暗色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces phaeochromogenes)和白色鏈霉菌(Streptomyces albus)。
1970年以來，我國對玫瑰暗黃鏈霉菌Kc-13，玫瑰紅鏈霉菌336，嗜熱放線菌M1033以及米蘇里游動放線菌等生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的條件、人工誘變育種和固定化技術(shù)作了研究。
張樹政主編“酶制劑工業(yè)”(科學出版社，1984)一書中，特別是其中由胡學智編寫的第十一章“葡萄糖異構(gòu)酶”已對當前國內(nèi)外這一領域的工業(yè)生產(chǎn)包括菌種、發(fā)酵工藝、固定化技術(shù)、檢測方法等進展做了詳述。
1984年Song H.Bok等報道從嗜酸性鏈霉菌(Acidophilic strep tomyces)耐酸鏈霉菌(Streptomyces acidodurans)篩選葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)生菌的方法(Appl.Environ.Microbiol.471213-1215，1984;U.S.patent 4，399，222，1983)。
本發(fā)明是一種用嗜酸鏈霉菌生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的方法，其目的在于用我們分離獲得的嗜酸鏈霉菌菌種，通過發(fā)酵及固定化工藝制備葡萄糖異構(gòu)酶制劑。本發(fā)明包括(1)依據(jù)pH值分段模式從土壤中分離嗜酸鏈霉菌，對于能夠在pH5乃至pH4培養(yǎng)基上生長之菌株進行分析鑒別篩選出葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)生菌株。(2)經(jīng)純化的產(chǎn)酶菌株，在適宜培養(yǎng)條件下，依次經(jīng)斜面孢子，搖瓶種子逐級擴大培養(yǎng)于含有適當碳源、氮源的接種培養(yǎng)基上，使種子生長旺盛。(3)生長良好的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在控制條件下進行發(fā)酵，從中收獲葡萄糖異構(gòu)酶，該酶經(jīng)固定化后用于制備高果糖漿。
本發(fā)明中產(chǎn)生葡萄糖異構(gòu)酶的鏈霉菌與其它已知的產(chǎn)生異構(gòu)酶鏈霉菌迥然不同之處在于其原始菌株生長及產(chǎn)酶的培養(yǎng)基應保持在pH5.2以下，甚至低達pH4.0。其中一些產(chǎn)酶菌株，經(jīng)過系列人工誘變之后，其適應pH范圍為5.5-7.0。
凡在pH4.8培養(yǎng)基上生長，又在pH4.0培養(yǎng)基上生長的菌株，從中篩選酶活較高者。測定酶活的方法為間苯二酚法，初篩時做定性測定，復篩時做定量測定。最終由高壓液相色譜分析測定酶活。
最初分離出的原始菌株，酶活高的可達5，000國際單位/升，經(jīng)過一系列人工誘變和發(fā)酵工藝方面的改進，酶活提高到20，000國際單位/升。
下面為本發(fā)明產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的嗜酸鏈霉菌株(Streptomyces acidophilus 10-168)CGMCC No.0142的微生物學特征。
1、形態(tài)學特征察氏培養(yǎng)基菌絲體生長迅速，并產(chǎn)生分枝，氣生菌絲為白色，基絲由白色漸變?yōu)辄S灰色。兩周后氣絲由頂端開始斷裂，形成灰色孢子，形狀橢園形，孢子絲彎曲，呈波浪狀，菌落表面皺褶，邊緣整齊。
高氏培養(yǎng)基生長較弱，氣生菌絲為白色，基內(nèi)菌絲灰色，無可溶性色素產(chǎn)生，菌落表面絨狀，邊緣整齊，呈同心園狀，兩周后，菌落中心凹下，菌落表面皺褶，中央灰色，孢子呈灰色，橢園形至園形。
2、培養(yǎng)特征(1)淀粉瓊脂生長較弱，氣絲白色，基絲由白色至淺灰色，未觀察到可溶性色素。
(2)馬鈴薯浸汁生長良好，氣絲由白色漸變?yōu)榛疑z褐色，觀察到褐色可溶性色素。
(3)馬鈴薯塊生長良好，氣絲由白色至灰色，基絲褐色，產(chǎn)生褐色可溶性色素。
(4)Emerson培養(yǎng)基生長良好，氣絲由白至灰色，基絲為褐色，產(chǎn)生大量深褐色可溶性色素。
3、生理特征(1)生長溫度范圍(采用酵母-麥芽浸汁瓊脂培養(yǎng)基)可生長溫度為18-38℃最適宜溫度為28-32℃(2)淀粉水解瓊脂產(chǎn)生淀粉酶，可以水解利用淀粉。
(3)明膠的液化作用陽性。
(4)脫脂奶的凝結(jié)和胨化作用有胨化現(xiàn)象。
(5)纖維素利用可分解利用纖維素，并有少量褐色素產(chǎn)生。
(6)Tresner培養(yǎng)基在生長過程中有H2S產(chǎn)生。
(7)碳源機用可利用淀粉、葡萄糖、木糖、蔗糖、檸檬酸、麥芽糖、麩皮浸漬液、馬鈴薯浸汁、落葉松木屑水解液。
此外，嗜酸鏈霉菌所需氮源營養(yǎng)成分種類范圍很寬。
有機氮源黃豆粉、黃豆餅粉、黃豆餅粉水解液、蛋白胨、玉米漿、酵母膏、牛肉膏、麥芽浸汁、蠶蛹粉。
無機氮源硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、氫氧化銨、磷酸銨、醋酸銨。
嗜酸鏈霉菌其生長及產(chǎn)酶的溫度范圍在24-36℃之間，較適宜的溫度為27-33℃，其中以30-32℃為最適溫度。
發(fā)酵時間依據(jù)菌種及培養(yǎng)基種類而變化，在本發(fā)明菌種試驗范圍為24-96小時，其中比較適宜時間為24-60小時，以36-56小時為最適發(fā)酵時間。過度延長發(fā)酵時間會導致酶活下降，菌絲斷裂和自溶，為后工序一固定化工藝造成困難。當發(fā)酵周期超過48小時，碳源以分次加入對產(chǎn)酶較為有利。
現(xiàn)在，本發(fā)明將在有關實施例中進一步予以詳細說明，但是，應該理解到本發(fā)明決不只限于這些特殊實施例。
例1從石家莊效區(qū)玉米地土壤中(pH6.4)采取土樣，在無菌操作條件下，將土樣稀釋至滅菌無離子水中，在搖瓶機上振蕩1小時，然后接種于如下分離培養(yǎng)基上(克/100毫升)淀粉 2.0KNO30.1K2HPO40.05NaCl 0.05MgSO4·7H2O 0.05FeSO4·7H2O 0.001
瓊脂 1.8pH 6.5用無離子水配制。
將于pH6.5分離培養(yǎng)基上生長的菌落，再接種于pH4.8分離培養(yǎng)基上，將長出的菌落再轉(zhuǎn)接于pH4.0分離培養(yǎng)基上。
pH4.0分離培養(yǎng)基成分(克/100毫升)淀粉 2.0NaNO30.1K2HPO40.05NaCl 0.05MgSO4·7H2O 0.05FeSO4·7H2O 0.001瓊脂 1.8用無離子水配制。
在一批分離獲得的228個菌株中統(tǒng)計其生長率為1.3%。從多批分離菌株中篩選出S10-168，S10-170，S13-219等酶活較高的菌株。在分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為1周。將生長于平皿的菌落分別挑選移植到斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)4-6天，挖塊接種到搖瓶種子培養(yǎng)基中，再轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。以上三株菌均達到5，000國際單位/升水平。
例2將S10-168菌種經(jīng)過多次純化后培養(yǎng)在下述斜面孢子培養(yǎng)基上(克/100毫升)
麥芽浸漬物 0.3酵母膏 0.4NaCl 0.5MgSO4·7H2o 0.05CoCl2·6H2o 0.001瓊脂 2.0pH 5.830℃培養(yǎng)4天后，將斜面孢子挖塊接種到搖瓶種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24-36小時，其成分為(克/100毫升)黃豆餅粉 1.5(NH4)2SO40.5葡萄糖 2.0KH2PO40.04NaCl 0.5pH 6.4將生長稠厚的搖瓶種子以5%接種量(體積/體積)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分(克/100毫升)玉米漿 2.0檸檬酸 0.2K2HPO40.5(NH4)2SO40.5NaCl 0.5MgSO4·7H2O 0.05
D-木糖 0.40pH 6.8接種后，于30℃，在搖瓶機(G-25型，N.B.S.公司產(chǎn)品)上，300轉(zhuǎn)/分，振蕩培養(yǎng)48-56小時，酶活達15，000國際單位/升。
例3嗜酸鏈霉菌的原始菌株S10-168在初篩階段表現(xiàn)出穩(wěn)定的酶活，所以以此為出發(fā)菌株進行系統(tǒng)誘變育種。
其方法是將原始菌株的斜面孢子，首先挖取一小塊(約為斜面孢子的1/5)接種到搖瓶種子及發(fā)酵培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)及發(fā)酵，當酶活超過對照組時，即以此斜面孢子為誘變育種的出發(fā)材料。
將經(jīng)過檢測酶活的斜面孢子用接種針輕輕刮下，將孢子懸浮于無菌蒸餾水中，用30W紫外燈，照射距離為35厘米，照射時間1-3分鐘，然后涂布于分離平皿上，再挑選不同類型菌落接種于斜面孢子培養(yǎng)基上。
存活率在10%-15%，涂布密度以在每個培養(yǎng)皿上50-100個菌落為宜。將挑選的單個菌落分別接種于斜面培養(yǎng)基上，一一進行測試，從中篩選出酶活較高的嗜酸鏈霉菌菌株。
將嗜酸鏈霉菌的菌種，經(jīng)配方為3%葡萄糖，2%黃豆餅粉，0.6%(NH4)2SO4，0.05%KH2PO4，0.5%NaCl的種子培養(yǎng)基(30毫升裝入150毫升三角瓶中)，于300轉(zhuǎn)/分搖瓶機上，30℃培養(yǎng)36-48小時，再經(jīng)配方為0.2%檸檬酸鈉，0.5%(NH4)2SO4，0.5%NaCl，0.5%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.01%CoCl2·6H2O，0.001%FeSO4·7H2O，4%土豆浸汁(將土豆4克在100毫升水中煮沸30分鐘，濾去渣子備用)，2%麩皮浸漬液，1.0%玉米漿，于pH6.8，在300轉(zhuǎn)/分搖瓶機上，30℃培養(yǎng)48-56小時，收獲菌絲體，測定酶活可達20，000國際單位/升。
例4嗜酸鏈霉菌種(S.10-168 CGMCC No.0142)經(jīng)配方同例3的種子培養(yǎng)基，在300轉(zhuǎn)/分搖瓶機上，30℃培養(yǎng)36小時，再經(jīng)配方為0.2%檸檬酸鈉，0.5%(NH4)2SO4，0.5%NaCl，0.5%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.01%CoCl2·6H2O，0.001%FeSO4·7H2O，4%土豆浸汁，2%麩皮浸漬液，1.0%玉米漿，0.06%稀土化合物，pH6.8，(30毫升培養(yǎng)基裝入150毫升三角瓶中)，在300轉(zhuǎn)/分搖瓶機上，30℃發(fā)酵56小時，測定酶活達22，500國際單位/升。
＊葡萄糖異構(gòu)酶國際單位(G.I.U.)在pH6.6，65℃反應條件下，1分鐘能轉(zhuǎn)化生成1微克分子果糖的酶量，定義為1葡萄糖異構(gòu)酶國際單位。
＊實施例中培養(yǎng)基滅菌條件蒸汽壓為0.8-1.0公斤/平方厘米，30分鐘。
權(quán)利要求
1.一種用嗜酸鏈霉菌生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的方法，它包括(1)依據(jù)pH值分段模式從土壤中分離嗜酸鏈霉菌，對分離出的菌株進行分析鑒別，在含有適當碳、氮源分離培養(yǎng)基上篩選出產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的原始菌株。這些菌株在pH低于5.2條件下培養(yǎng)并產(chǎn)生葡萄糖異構(gòu)酶。(2)經(jīng)純化的產(chǎn)酶菌株，在適宜培養(yǎng)條件下，依次經(jīng)斜面孢子，搖瓶種子逐級擴大培養(yǎng)于含有適當碳源、氮源的培養(yǎng)基上，使種子生長旺盛。(3)生長良好的種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入含有適當碳、氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在控制條件下進行發(fā)酵并從中收獲葡萄糖異構(gòu)酶，該酶經(jīng)固定化后用于制備高果糖漿。
2.根據(jù)權(quán)利要求1嗜酸鏈霉菌包括從土壤中分離獲得的原始菌株及經(jīng)過理化因子處理的人工誘變菌株。其特征在于所說的嗜酸鏈霉菌是寄存在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，寄存號為CGMCC No.0142的嗜酸鏈霉菌(Streptomyces acidophilus 10-168)。所說明菌其微生物學特征為(1)、形態(tài)學特征察氏培養(yǎng)基菌絲體生長迅速，并產(chǎn)生分枝，氣生菌絲為白色，基絲由白色漸變?yōu)辄S灰色。兩周后氣絲由頂端開始斷裂，形成灰色孢子，形狀橢園形，孢子絲彎曲，呈波浪狀，菌落表面皺褶，邊緣整齊。高氏培養(yǎng)基生長較弱，氣生菌絲為白色，基內(nèi)菌絲灰色，無可溶性色素產(chǎn)生，菌落表面絨狀，邊緣整齊，呈同心園狀，兩周后，菌落中心凹下，菌表面皺褶，中央灰色，孢子呈灰色，橢園形至園形。(2)、培養(yǎng)特征①淀粉瓊脂生長較弱，氣絲白色，基絲由白色至淺灰色，未觀察到可溶性色素。②馬鈴薯浸汁生長良好，氣絲由白色漸變?yōu)榛疑?，基絲褐色，觀察到褐色可溶性色素。③馬鈴薯塊生長良好，氣絲由白色至灰色，基絲褐色，產(chǎn)生褐色可溶性色素。④Emerson培養(yǎng)基生長良好，氣絲由白色至灰色，基絲為褐色，產(chǎn)生大量深褐色可溶性色素。(3)、生理特征①生長溫度范圍(采用酵母-麥芽浸汁瓊脂培養(yǎng)基)可生長溫度為18-38℃最適宜溫度為28-32℃②淀粉水解作用產(chǎn)生淀粉酶，可以水解利用淀粉。③明膠的液化作用陽性。④脫脂奶的凝結(jié)和胨化作用有胨化現(xiàn)象。⑤纖維素利用可分解利用纖維素，并有少量褐色素產(chǎn)生。⑥Tresner培養(yǎng)基在生長過程中有H2S產(chǎn)生。⑦碳源利用可利用淀粉 葡萄糖、木糖、蔗糖、檸檬酸、麥芽糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說pH分段模式，是將從土壤中分離獲得的鏈霉菌，依據(jù)pH6.5，pH4.8，pH4.0依次遞降的模式，將于pH6.5分離培養(yǎng)基上生長的菌落接種于pH4.8分離培養(yǎng)基上，依次再接種于pH4.0分離培養(yǎng)基上，從中選出嗜酸鏈霉菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所用的碳源為淀粉、葡萄糖、木糖、蔗糖、檸檬酸鹽、麥芽糖、麩皮浸漬液、馬鈴薯浸汁、落葉松木屑水解液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所用的氮源為有機氮源黃豆粉、黃豆餅粉、黃豆餅粉水解液、蛋白胨、玉米漿、酵母膏、牛肉膏、麥芽浸汁、蠶蛹粉。無機氮源硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、氫氧化銨、磷酸銨、醋酸銨。
6.根據(jù)權(quán)利要求1其中玉米漿需經(jīng)過氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH7.0-7.2，過濾除去沉淀。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所說分離培養(yǎng)基成分為1.5-2.0%淀粉，0.1%NaNO3，0.05%K2HPO4，0.05%NaCl，0.05%MgSO4·7H2O，0.001%FeSO4·7H2O，1.8-2.0%瓊脂，無離子水配制。pH3.5-4.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所說斜面孢子培養(yǎng)基成分為0.25-0.40%麥芽浸漬物，0.3-0.5%酵母膏，0.5%NaCl 0.05%MgSO4·7H2O，0.001%CoCl2·6H2O，1.8-2.0%瓊脂，無離子水配制。pH5.2-6.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所說搖瓶種子培養(yǎng)基成分為1.5-2.0%黃豆餅粉，0.4-0.6%(NH4)2SO4，1.5-3.0%葡萄糖0.04-0.06%KH2PO4，0.5%NaCl。pH5.5-6.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所說發(fā)酵培養(yǎng)基成分為1.0-3.0%玉米漿，0.2-0.3%檸檬酸鹽，0.5-0.6%K2HPO4，0.4-0.6%(NH4)2SO4，0.5%NaCl，0.05%MgSO4·7H2O，0.2-0.5%D木糖，3-6%馬鈴薯浸汁，1.5-2.5%麩皮浸漬液，pH5.8-6.8。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所說發(fā)酵培養(yǎng)基中加入稀土化合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11稀土化合物為以輕稀土為主的硝酸鹽及氯化物。
13.根據(jù)權(quán)利要求11發(fā)酵培養(yǎng)基中稀土化合物的濃度為0.01-0.1%。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領域。嗜酸鏈霉菌(Streptomyces acidophilus)具有生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的潛力。本發(fā)明是依據(jù)pH值分段模式從土壤中分離篩選能產(chǎn)生葡萄糖異構(gòu)酶的嗜酸鏈霉菌。通過對原始菌株一系列人工誘變并結(jié)合種子制備工藝及發(fā)酵過程的控制以提高酶活水平的方法。嗜酸鏈霉菌最適pH值為4-6，在發(fā)酵過程中不易為細菌污染。嗜酸鏈霉菌發(fā)酵終結(jié)，選擇合適載體和固定化技術(shù)制備固定化葡萄糖異構(gòu)酶，用于生產(chǎn)高果糖漿。
文檔編號C12N9/92GK1050407SQ8910766
公開日1991年4月3日 申請日期1989年10月10日 優(yōu)先權(quán)日1989年10月10日
發(fā)明者陸維新, 張紹鎮(zhèn), 靳慶生, 王忠秋, 王曉東, 田竹 申請人:河北省科學院生物研究所