專利名稱：七葉樹組織培養(yǎng)產(chǎn)生生育酚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過組織培養(yǎng)產(chǎn)生生育酚的方法。
自從Routin和Nickell(1956)提出第一個專利以來，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)有用的次生物質(zhì)已經(jīng)取得了極大的進(jìn)展。例如，日本的發(fā)酵法生產(chǎn)紫草素已達(dá)到了750升的水平，1984年以生物口紅進(jìn)入市場。到目前為止，從植物細(xì)胞中獲得的有用化學(xué)物質(zhì)已有幾百種，包括藥物、酶類、色素、香料、殺蟲劑、維生素、香精、興奮劑、食品添加劑等，每年都有許多從細(xì)胞培養(yǎng)得到新的有用物質(zhì)的報道。人們通過改良培養(yǎng)基、添加前體、選擇高產(chǎn)細(xì)胞株，適當(dāng)控制培養(yǎng)條件或利用生物轉(zhuǎn)化等不同手段獲得許多比原植物高幾倍甚至幾十倍的有用成分，目前這一技術(shù)正在成為人們獲得有用物質(zhì)的一個富有活力的新領(lǐng)域。
越來越多的研究表明，生育酚對于維持人體正常生理活動具有至關(guān)重要的作用。人工合成的生育酚為消旋的(dl-型)，而天然產(chǎn)生的生育酚為d-型，據(jù)報道d-α-生育酚的生理活性是dl-α-生育酚的1.36倍，而且，近年來，國際社會中的許多組織極力反對使用人工合成的食品添加劑，人們趨于歡迎在食品中使用安全性高的天然添加劑。因此，天然生育酚制品的需求量越來越大。這樣，尋求生育酚天然產(chǎn)生的新途徑就變得非常迫切。
本發(fā)明的目的在于提供一種通過組織培養(yǎng)從七葉樹中產(chǎn)生天然生育酚的方法。
本發(fā)明所提供的通過七葉樹組織培養(yǎng)制備生育酚的方法，包括如下步驟a.將未成熟果實的子葉或果皮接種于含有1ppm萘乙酸、0.5ppm激動素、3%蔗糖和0.6%瓊脂的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo);
b.將誘導(dǎo)所產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)到含有1ppm萘乙酸、2ppm吲哚丁酸、0.5ppm激動素、500mg/l酪蛋白水解物、3%蔗糖和0.6%瓊脂的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織繁殖，每3周繼代1次;
c.將上述固體培養(yǎng)的愈傷組織取出后，立即放入-20℃冰柜中，冰凍后置冰凍干燥機上干燥;
d.取干燥后的愈傷組織，加10倍量的石油醚，于組織搗碎機內(nèi)破碎，倒入三角瓶內(nèi)，置暗處浸泡24小時，過濾，在氮氣保護(hù)下，遮光，于70-80℃水浴鍋上回收石油醚，蒸干后加少許正己烷溶解，待用;
e.用正己烷濕法裝柱，將脫活中性氧化鋁裝入帶篩板的層析柱中，加上上述正己烷溶解物后，先用70-90ml正己烷洗脫，再用7%的乙醚正己烷洗脫，并收集前70-100ml洗脫液，在氮氣保護(hù)下，遮光蒸干。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點七葉樹種子很容易失活，繁殖非常困難，七葉樹已被國家列為珍稀瀕危樹種。而對其組織培養(yǎng)工作卻沒有人報道過，本發(fā)明所公開的方法為大規(guī)模繁殖該樹種提供了光明的前景。生育酚對維持人體正常生理活動所起的作用已為人們所認(rèn)識，但人工合成的生育酚是消旋的，天然產(chǎn)生的生育酚的生理活性是它的1.36倍，而且，由于人們擔(dān)心人工合成的生育酚具有一定程度的毒副作用，因此更趨于接受天然產(chǎn)生的生育酚。本發(fā)明通過七葉樹組織培養(yǎng)制備生育酚，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)生育酚提供了一條有效的途徑，同時，還證明了通過高大的木本科植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生有用代謝物的可能性。
下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明作更詳細(xì)地說明將未成熟的七葉樹果實用75%的酒精浸泡1-2分鐘，用無菌水沖洗數(shù)次，再用0.1%的升汞浸泡5分鐘，小心剝?nèi)」ぜ白尤~，切成0.5cm見方的小塊，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含有1ppm萘乙酸、0.5ppm激動素、3%蔗糖和0.6%瓊脂的MS培養(yǎng)基。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，果皮和子葉兩者皆可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)率都較高(80%以上)。組織塊在接種后的5-7天開始膨大，10天以后有新鮮的愈傷組織形成。
而成熟種子經(jīng)嚴(yán)格消毒后，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，結(jié)果幾乎100%遭到污染。
選擇較為疏松、綠色、半透明狀的愈傷組織進(jìn)行愈傷組織繁殖，每3周繼代一次。以MS為基本培養(yǎng)基，并加有3%的蔗糖，0.6%的瓊脂和500mg/l酪蛋白水解物(CA)，其它激素的配比如表1所示。表中NAA代表萘乙酸，IBA代表吲哚丁酸，K代表激動素。
從表中可以看出，在6號培養(yǎng)基，即NAA1ppm，IBA2ppm，K0.5ppm的培養(yǎng)基上，愈傷組織的生長速度最快，因此，本發(fā)明中選用表1中6號培養(yǎng)基做為愈傷組織繁殖用培養(yǎng)基。生長率是培養(yǎng)后組織重量與初始接種量之比。
不同的PH對愈傷組織生長速度的影響如

圖1所示。從圖中可以看出，同其它許多植物一樣，七葉樹愈傷組織在PH5.8時生長最為理想。
實驗中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)溫度高于32℃或低于22℃時，愈傷組織的生長都受到抑制，組織塊變得堅硬，呈非透明狀。同愈傷組織在26℃±1條件下培養(yǎng)時相比，相同時間內(nèi)生長的組織量，前者僅為后者的一半。因此，愈傷組織的培養(yǎng)最好在25-28℃條件下進(jìn)行。在相同培養(yǎng)條件下，光照(光照強度為1300Lux)和黑暗中愈傷組織的生長率，經(jīng)測定分別為7.8和5.1。這表明，光照對愈傷組織的生長有促進(jìn)作用。
愈傷組織的生長速度與時間的關(guān)系如圖2所示。圖中顯示了接種量分別為2克以及3克/50ml培養(yǎng)基時愈傷組織的生長情況。可以看出，兩者的愈傷組織都在第10天左右生長速度開始變快。同時還可以看出，接種量不同，生長所持續(xù)的時間也不同，初始接種量為2克的持續(xù)到第28天，而接種量為3克的持續(xù)到第20天左右，以后生長緩慢。
為了制備生育酚，將上述在固體培養(yǎng)基上繁殖的愈傷組織取出后，立即放入-20℃冰柜中，冰凍后，置冰干燥機上，冰凍干燥，然后，放置在-20℃冰柜中備用。
準(zhǔn)確稱量一定量的樣品，加10倍量的石油醚，于組織搗碎機內(nèi)破碎，用石油醚洗滌玻璃器皿，洗液倒入三角瓶中，密封，暗中浸泡24小時，過濾，每次用10ml左右的石油醚，洗濾渣三次，合并濾液，在氮氣的保護(hù)下，遮光，于70-80℃水浴鍋上回收石油醚。蒸干后，加少量正己烷溶解，待用。
根據(jù)材料的量不同，稱取8-15克脫活中性氧化鋁，于直徑為1cm，長30cm帶篩板的層析柱中，用正己烷濕法裝柱，加入上述正己烷溶解物后，先用70-90ml正己烷洗脫，再用7%的乙醚正己烷溶液洗脫，并收集前70-100ml洗脫液，在氮氣保護(hù)下，遮光，蒸干。這樣，就制備出了生育酚，經(jīng)鑒定確認(rèn)為γ-生育酚。
實驗中所用正己烷(A.R)由北京化工廠生產(chǎn)，乙醚(A.R)由天津化學(xué)試劑二廠生產(chǎn)，石油醚(30-60℃，A.R)由北京五二九五二化工廠生產(chǎn)。
用上述方法制備的生育酚可用于各種目的。
表1 不同的激素濃度對愈傷組織生長的影響激素濃度(ppm)編號 生長率(鮮重)NAA IBA K1 1 0.5 0.3 4.022 2 0.5 0.3 4.423 1 1 0.3 3.804 1 1.5 0.3 4.645 2 2 0.5 4.456 1 2 0.5 5.677 3 1 0.5 4.23注初始接種量為2.2g，培養(yǎng)16天后取樣測定。
權(quán)利要求
1.一種通過七葉樹組織培養(yǎng)制備生育酚的方法，包括a.將未成熟果實的子葉或果皮接種于含有1ppm萘乙酸、0.5ppm激動素、3%蔗糖和0.6%瓊脂的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)；b.將誘導(dǎo)所產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)到含有1ppm萘乙酸、2ppm吲哚丁酸、0.5ppm激動素、500mg/l酪蛋白水解物、3%蔗糖和0.6%瓊脂的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織繁殖，每3周繼代1次；c.將上述固體培養(yǎng)的愈傷組織取出后，立即放入-20℃冰柜中，冰凍后置冰凍干燥機上干燥；d.取干燥后的愈傷組織，加10倍量的石油醚，于組織搗碎機內(nèi)破碎，倒入三角瓶內(nèi)，置暗處浸泡24小時，過濾，在氮氣保護(hù)下，遮光，于70-80℃水浴鍋上回收石油醚，蒸干后加少許正己烷溶解，待用；e.用正己烷濕法裝柱，將脫活中性氧化鋁裝入帶篩板的層析柱中，加上上述正己烷溶解物后，先用70-90ml正己烷洗脫，再用7%的乙醚正己烷洗脫，并收集前70-100ml洗脫液，在氮氣保護(hù)下，遮光蒸干。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于上述愈傷組織誘導(dǎo)和繁殖是在光照強度為1300勒克斯，溫度為25-28℃的條件下完成的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于接種用的果皮及子葉是被切成0.5×0.5cm的小塊。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種七葉樹組織培養(yǎng)及制備生育酚的方法，在含有萘乙酸、激動素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，在含有萘乙酸、吲哚丁酸和激動素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織繁殖，通過層析柱從愈傷組織的石油醚浸出物中制備出生育酚。
文檔編號C12P17/06GK1049520SQ9010801
公開日1991年2月27日 申請日期1990年10月8日 優(yōu)先權(quán)日1990年10月8日
發(fā)明者胡昌序, 鞏志忠 申請人:中國科學(xué)院植物研究所