專利名稱：：糖類的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及獲得葡萄糖、麥芽糖、麥芽低聚糖等糖鏈長(zhǎng)固定的高純度單體糖類的制備方法。獲得特定糖鏈長(zhǎng)的高純度單體糖類的方法迄今已知有下面這些用一種或兩種以上適當(dāng)?shù)牡矸勖割惙纸獾矸鄣绕暇厶牵霉母鞣N柱層析法等將其從其它非目的低聚糖和單糖中分離出來(lái)(例如，淀粉科學(xué)手冊(cè)p.452，1987、特開(kāi)昭57-209000號(hào)公報(bào)、特開(kāi)昭62-19210號(hào)公報(bào)、特公平2-17158號(hào)公報(bào))，或?qū)⑵湓俳Y(jié)晶，從而從其它微量混入的非目的低聚糖和單糖中分離出來(lái)(例如，淀粉科學(xué)手冊(cè)，p456，1987)。然而，上述任何方法本質(zhì)上均伴有葡萄糖和未切斷的糊精、以及其它非目的低聚糖副產(chǎn)品，均未能實(shí)際上從反應(yīng)系中去除這些非目的糖類。此外，人們已知，微量非目的糖類的共存，還明顯地妨礙作為目的物的特定糖鏈長(zhǎng)的糖類的結(jié)晶化。而且，用上述公知的方法，若要獲得盡可能高純度的低聚糖，則制備工序變復(fù)雜，收率和成本方面也有問(wèn)題。因此，本發(fā)明者們認(rèn)為糖類公知的制備方法很有改善余地，特別嘗試了建立實(shí)質(zhì)上不含非醫(yī)藥用目的糖類而僅含葡萄糖、麥芽糖、麥芽低聚糖等特定糖鏈長(zhǎng)的糖類單體的制備方法。本發(fā)明的要點(diǎn)在于連續(xù)進(jìn)行以下一系列操作。即在糖鏈轉(zhuǎn)移酶的作用下，直接地或經(jīng)中間體介導(dǎo)，將糖鏈從其它的糖鏈供給源轉(zhuǎn)移到對(duì)于作為目的物的特定糖鏈長(zhǎng)的糖類實(shí)質(zhì)上可分離的物質(zhì)(以下稱作“可分離物質(zhì)”)上，使所得到的低聚糖受將低聚糖特定長(zhǎng)度的糖鏈切成exo型的酶(以下稱作“exo型切斷酶”)的作用，從而分離作為目的物的特定糖鏈長(zhǎng)的糖類的方法。下面對(duì)本發(fā)明加以詳述。在本發(fā)明中所用的可分離物質(zhì)為殼聚糖珠、離子交換樹(shù)脂、合成高分子樹(shù)脂、或作為其他固定化載體被使用的載體或以下面的通式(Ⅰ)(式中R為氫、低級(jí)烷基、羥烷基、苯基烷基、苯基鏈烯基、苯基炔基、苯氧基烷基、苯氧基鏈烯基或苯氧基炔基，此處苯基中也包含被取代的苯基)表示的化合物(以下稱作“脫二氧亞胺基葡糖醇類”)、野尻霉素、氨基環(huán)醇、氨基環(huán)醇衍生物、或葡糖醛酸或其葡糖基或低聚葡糖基體等能吸附在離子交換樹(shù)脂上的有極性的糖類(以下稱作“極性糖”)等。載體不管是珠狀、膜狀、纖維狀等均可。脫二氧亞胺基葡糖醇類可從桑白皮和放線菌等獲得(如，特願(yuàn)昭54-159417號(hào)、特願(yuàn)昭55-76838號(hào)、特公昭56-9919號(hào)公報(bào)、特願(yuàn)昭57-93997號(hào)、特公昭59-27337號(hào)公報(bào))。脫二氧亞胺基葡糖醇類的葡糖基和低聚葡糖基體可用已公開(kāi)的方法制備(如，AgricultralandBiologicalChemistry49，2159(1985))。從有效霉素類獲得氨基環(huán)醇的方法已被揭示(如，特願(yuàn)昭55-128157號(hào))，也可從市售的有效霉素制劑制得氨基環(huán)醇。為了將糖鏈轉(zhuǎn)移到載體上，此載體上不具有末端葡糖基或極性糖等可被糖鏈轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移糖鏈的殘基，必須預(yù)先在載體上直接地或通過(guò)間隔物結(jié)合上具有可被糖鏈轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移糖鏈的殘基的中間體。此處，中間體可為極性糖、葡萄糖等單糖、麥芽糖、麥芽三糖等低聚糖。為了將中間體結(jié)合到載體上，可有例如在氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)這樣的還原劑作用下將中間體麥芽糖結(jié)合到已結(jié)合了具有末端氨基的間隔物的殼聚糖珠載體上的方法等。其中，間隔物可為環(huán)氧乙烷、戊二醛(GLA)等用于固定化技術(shù)的單功能團(tuán)和雙功能團(tuán)物質(zhì)。為使糖鏈從其它糖鏈供給源轉(zhuǎn)移過(guò)來(lái)所用的糖鏈轉(zhuǎn)移酶可為，例如，環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)、α-淀酚酶等。CGTase，迄今已有由若干種菌株產(chǎn)生的報(bào)告，例如，芽胞桿菌屬Bacillusmcaaelins、Bacillusmagtelium、Bacillussaculins、嗜堿性芽胞桿菌、耐熱性芽胞桿菌等。這些菌株產(chǎn)生的環(huán)糊精各自具有特征，而本發(fā)明中所用的CGTase，無(wú)論是它們中任何一型的CGTase，都能完全達(dá)到其目的。已知除酶以外，也有某種菌株直接形成糖轉(zhuǎn)移生成物(如，日本農(nóng)業(yè)化學(xué)會(huì)大會(huì)講演摘要集4N-2，1981.3.10發(fā)行)，即便象那樣的情況也可達(dá)到作為本發(fā)明的糖鏈轉(zhuǎn)移酶的目的。在糖鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)中的pH、反應(yīng)溫度，因所用糖鏈轉(zhuǎn)移酶的不同而各有所不同，例如在用CGTase時(shí)，pH為4.0-11.5范圍，以pH5.5-10.5范圍為佳;反應(yīng)溫度在20-85℃的范圍，以45-65℃的范圍為佳。糖鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)需要的時(shí)間，在使用CGTase轉(zhuǎn)移酶時(shí)，因pH、反應(yīng)溫度、酶濃度、糖鏈供給源的濃度不同而有相當(dāng)大的差異，通常為數(shù)小時(shí)至四天。CGTase的用量以在可被糖鏈轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移糖鏈的殘基上使盡可能多的糖鏈轉(zhuǎn)移為好，因此對(duì)應(yīng)于糖鏈供給源的淀粉系多糖，酶的比例越多，越能得到良好的結(jié)果，具體地因所用糖鏈供給源淀粉系多糖、pH、反應(yīng)時(shí)間而異，一般來(lái)說(shuō)，每1g淀粉系多糖用500-5000單位(B.V法)酶，較好地為1000-2000單位。此外，糖源供給源可為淀粉，淀粉系糖質(zhì)或環(huán)糊精。淀粉可用任何一種市場(chǎng)上流通的商業(yè)用淀粉。而淀粉系糖質(zhì)可用各種糊精、直鏈淀粉、支鏈淀粉這樣的中間加水分解物或高聚合度、中等程度或低聚合度的任何一種物質(zhì)。淀粉系多糖的濃度按制備上要求的時(shí)間，轉(zhuǎn)移酶的量的不同而不同，以5-60%(較好為10-20%)為宜。若為糊精，以30-50%為實(shí)用。用高濃度淀粉作為糖源供給源時(shí)，其粘度顯著升高，所以一般在進(jìn)行糖鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)前，用CGTase和α-淀粉酶等先將淀粉液化。為了提高添加的淀粉系多糖的利用率，使淀粉系多糖相對(duì)于轉(zhuǎn)移酶量的添加量以較低的濃度為好，例如，每1g淀粉系多糖2000-3000單位糖鏈酶量為好。作為可分離物質(zhì)使用極性糖時(shí)，例如脫二氧亞胺基葡糖醇，其濃度可上升至15%。然而，糖鏈供給源對(duì)脫二氧亞胺基葡糖醇的重量比以2-20倍為有效。作為可分離物質(zhì)使用載體時(shí)，通過(guò)在糖鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)完成后，將糖鏈被延長(zhǎng)的載體充妥洗凈。洗凈后，例如在100℃下加熱5分鐘使殘存的糖鏈轉(zhuǎn)移酶失活，也可更充分地洗凈。所用的糖鏈轉(zhuǎn)移酶用超濾法(以下稱作“UF”)等可容易地加以回收。作為可分離物質(zhì)使用極性糖時(shí)，在糖鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)完成后，將極性糖及該糖上轉(zhuǎn)移了葡萄糖低聚糖的物質(zhì)吸附在離子交換樹(shù)脂上。此時(shí)所用的糖鏈轉(zhuǎn)移酶可用UF法等容易地加以回收，因此在不回收糖鏈轉(zhuǎn)移酶的情況下將反應(yīng)液直接用離子交換樹(shù)脂處理，在回收糖鏈轉(zhuǎn)移酶的情況下用UF膜處理后，將濾液用離子交換樹(shù)脂處理。此處，離子交換樹(shù)脂可為Dowex50W-X2(注冊(cè)商標(biāo))、DiaionSA-11A(注冊(cè)商標(biāo))、苯酚甲醛離子交換樹(shù)脂IR-120(注冊(cè)商標(biāo))等，按極性糖的極性作適當(dāng)?shù)倪x擇。離子交換樹(shù)脂的量當(dāng)然必須按反應(yīng)所用極性糖的量作增減。極性糖及該糖上轉(zhuǎn)移了葡萄糖低聚糖的物質(zhì)吸附在離子交換樹(shù)脂上以后，通常進(jìn)行充分洗滌。而且，在洗凈后一般將其從離子交換樹(shù)脂上洗脫下來(lái)，例如，用1N氨水等洗脫。接著，在對(duì)exo型切斷酶適合的pH條件下，通常在30-55℃反應(yīng)溫度下，使exo型切斷酶作用數(shù)小時(shí)-2天，exo型切斷酶可為葡萄糖淀粉酶、β-淀粉酶、麥芽糖低聚糖生成酶等。例如，制備麥芽糖時(shí)，可采用β-淀粉酶，將反應(yīng)液調(diào)節(jié)到適合于β-淀粉酶的pH4.5-6.0，如pH4.8，在反應(yīng)液中加入β-淀粉酶，在30-60℃反應(yīng)溫度下反應(yīng)1-2天為宜。exo型切斷酶的添加量根據(jù)所用的exo切斷酶和可分離物質(zhì)的種類而定，在可分離物質(zhì)為載體時(shí)，每ml載體加20-100單位酶，可在工業(yè)上1天工作時(shí)間內(nèi)切斷完畢。使用極性糖作為可分離物質(zhì)，在用前面的操作從離子交換樹(shù)脂上使其洗脫的情況下，在exo型切斷酶作用后直接，或用適當(dāng)?shù)腢F膜法等分離方法分離exo型切斷酶后，再次加到吸附所用的極性糖的離子交換樹(shù)脂上，這樣實(shí)際上可分離單純的目的物-特定糖鏈長(zhǎng)的糖類。使用極性糖作為可分離物質(zhì)，在不用前面的操作從離子交換樹(shù)脂上洗脫下來(lái)而直接受exo型切斷酶作用的情況下，或使用載體作為可分離物質(zhì)的情況下，在exo切斷酶作用后，用過(guò)濾和UF膜法等適當(dāng)?shù)姆蛛x方法分離exo型切斷酶，這樣實(shí)際上可分離單純的目的物-特定糖鏈長(zhǎng)的糖類。象上述那樣分離出來(lái)的exo切斷酶也可再利用。在最終得到的液體的濃縮上，可采用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器減壓濃縮法、反滲透壓(RO)膜法等通用的濃縮手段。在使用極性糖作為可分離物質(zhì)時(shí)，糖鏈轉(zhuǎn)移酶和exo型切斷酶也可以溶液狀態(tài)使用，也可以固定化酶的形式使用，此固定化酶是用制備通用的公知的固定化酶的方法制成的。特別是在使用粗酶時(shí)，用固定化酶可減少夾雜物，在精制工序上有利。按本發(fā)明涉及的制備法制備麥芽糖的反應(yīng)式圖解如下。(式中，A為可分離物質(zhì)，G為葡萄糖，B為β-淀粉酶。但全部A不限于同一種。為β-淀粉酶的切斷部位。)如上式，β-淀粉酶按其特性不切斷二糖或三糖而保留下來(lái)(上式中G-G、A-G及A-G-G)。從而可以通過(guò)過(guò)濾或離子交換樹(shù)脂等，從固體狀態(tài)或極性糖的其它物質(zhì)(A、A-G及A-G-G)中，容易地分離單一的溶液狀態(tài)中性糖-麥芽糖(G-G)。而且，在分離麥芽糖后，糖鏈轉(zhuǎn)移酶可再在其它殘?jiān)涎娱L(zhǎng)糖鏈，結(jié)果，通過(guò)反復(fù)的糖鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)、切斷反應(yīng)、分離，可連續(xù)生產(chǎn)麥芽糖。從以上所述，可以說(shuō)，本發(fā)明制備法兼?zhèn)溥B續(xù)性，是可以在實(shí)際上得到單體目的物特定糖鏈長(zhǎng)的糖類前所未有的新制備法。而且，按本發(fā)明，不僅可得單純的特定糖鏈長(zhǎng)的糖類這一優(yōu)點(diǎn)，與以往的方法相比較，它的制備工序非常簡(jiǎn)單，可大大節(jié)減經(jīng)費(fèi)，勞力等，收率也可充分提高。用本發(fā)明的制備法可制備的糖類，例如麥芽糖，在要求特別高純度的醫(yī)藥上是有用的，其使用形態(tài)可為點(diǎn)滴劑等。當(dāng)然，這些糖類也作為食品使用。麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖等可用作診斷藥物等。此外，將麥芽糖還原制得的甜味劑麥芽糖醇，因原料麥芽糖純度越高，其結(jié)晶化程度越好，因此，用本發(fā)明制備法制備的麥芽糖，對(duì)于這一點(diǎn)也是非常有效的。將本發(fā)明的糖類作醫(yī)藥用，適用的例子可為諸如輸液等。適用于輸液的情況下，例如，麥芽糖，已知其10%溶液是等滲的，因具有等量葡萄糖2倍的能量值，因此比葡萄糖等還有益。(“麻醉與復(fù)蘇”)20(3)163，1984)。同樣，等滲的15%麥芽三糖溶液具有葡萄糖3倍的能量?jī)r(jià)，其有效性更高。將本發(fā)明的糖類用于醫(yī)藥上時(shí)，可使用以下組成的組合物，通常包括單純的糖(麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖等)，或也可同時(shí)含有葡萄糖或麥芽糖，再含有適量氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉等無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)鹽。輸液組成例將麥芽三糖15g、氯化鉀0.03g、氯化鈣0.02g、氯化鈉0.6g、乳酸鈉0.31g混合，成為100ml輸液的組成。下面用參考例和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)且具體的說(shuō)明，而不是限定本發(fā)明。參考例1固定化CGTase珠的調(diào)制首先，將軟化芽胞桿菌(Bacillusmacerans)CGTase(Contizyme、天野制藥社制)200ml對(duì)0.01M醋酸緩沖液(pH6.0)作透析。另外，在室溫下，將殼聚糖珠BCW-3010(注冊(cè)商標(biāo)，富士紡織社制，以下同)50ml在含2.5%戊二醛的0.1M醋酸緩沖液(pH5.0)中緩緩振蕩24小時(shí)后，充分地用水洗。然后，在此活化的殼聚糖珠中加入上述透析內(nèi)液離心分離后的上清液，在4℃下緩緩振蕩16小時(shí)，使酶的結(jié)合完成后，充分水洗。這樣，獲得23.8mg蛋白質(zhì)/ml珠的本固定化酶。參考例2固定化β-淀粉酶的調(diào)制首先，將來(lái)源于甘薯的β-淀粉酶(シクマ社制，硫酸銨懸濁液)4.8ml對(duì)0.01M醋酸緩沖液(pH5.0)作透析。另外，在室溫下，將殼聚糖珠BCW-301010ml(在含2.5%戊二醛的醋酸緩沖液(pH5.0)中緩緩振蕩24小時(shí)后，充分水洗。然后，在此活化的殼聚糖珠中加入上述透析內(nèi)液離心分離后的上清液，在4℃下緩緩振蕩16小時(shí)，使酶的結(jié)合完成后，充分水洗。這樣，獲得6.44mg蛋白質(zhì)/ml珠的本固定化酶。參考例3在殼聚糖珠上結(jié)合了麥芽糖的載體的調(diào)制將殼聚糖珠(chitopearl)BCW-30105ml與麥芽糖1.8g溶于甲醇/水＝1/1的混合溶媒20ml中，在麥芽糖溶解后，加入氰基硼氫化鈉，用醋酸調(diào)節(jié)pH為3-4，令反應(yīng)進(jìn)行3天。然后，濾取糖珠，充分進(jìn)行水洗，得本載體。參考例4固定化葡糖淀酚酶的調(diào)制在35l葡糖淀粉酶“GluczymeNL-3”(天野制藥社制)中加入35l離子交換水進(jìn)行稀釋，在柱中充填的33l殼聚糖株BCW-3010中導(dǎo)入用UF法精制所得的酶濃縮液，使其吸附在糖珠上。即，將此酶濃縮液用終濃度為0.05M的醋酸緩沖液(pH5.0)56l配成溶液，在8℃下經(jīng)24小時(shí)循環(huán)，使其吸附，然后用0.05M醋酸緩沖液(pH5.0)150l洗滌，將含2.5%戊二醛的0.05M醋酸緩沖液(pH5.0)120l在柱中循環(huán)，完成固定化。剩余的戊二醛通過(guò)550l水而除去，從而得到24.4mg蛋白質(zhì)/ml珠的本固定化酶。實(shí)施例1分別取300mg脫二氧亞胺基葡糖醇、N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇、N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇、N-羥乙基脫二氧亞胺基葡糖醇、N-丁基脫二氧亞胺基葡糖醇及葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇到50ml三角燒瓶中，各加入可溶性淀粉1200mg，在10ml水中加熱溶解，加入按參考例1的方法調(diào)制的固定化CGTase珠5ml，在40℃下振蕩3天進(jìn)行轉(zhuǎn)移反應(yīng)。然后，從各自這些反應(yīng)液中取出3ml，加到10ml強(qiáng)酸型離子交換樹(shù)脂Dowex50W-X2上，進(jìn)行充分水洗，用1N氨水60ml洗脫，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器濃縮至干。此糖鏈轉(zhuǎn)移物的重量列于表1，各自的薄層色譜(TLC)見(jiàn)圖1。(硅膠G60F254、メルク社制;展開(kāi)溶劑正丙醇/氨水＝6/2/1;顯色劑噴霧10%硫酸的乙醇溶液后，在火焰上加熱，以下同。)然后，將糖鏈轉(zhuǎn)移物按50mg/ml溶于水中，用2N鹽酸調(diào)節(jié)pH至5-6，加入按參考例2的方法調(diào)制的固定化β-淀粉酶200粒，在37℃下反應(yīng)5小時(shí)。此β-淀粉酶反應(yīng)液的TLC見(jiàn)圖2。從圖2很明顯可看出，分別生成麥芽糖。接著，將各β-淀粉酶反應(yīng)液加到10ml強(qiáng)酸型離子交換樹(shù)脂Dowex50W-X2上，通過(guò)液用2N苛性納中和后，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器濃縮至干。各自所得的麥芽糖重量列于表1。表1</tables>這些麥芽糖部分的TLC見(jiàn)圖3。從圖3可知生成的僅僅為麥芽糖。實(shí)施例2在50ml三角燒瓶中加入Validamine60mg和可溶性淀粉1200mg，加10ml水，加熱溶解，在其中加入按參考例1的方法調(diào)制的固定化CGTase珠5ml，在40℃下振蕩3天進(jìn)行轉(zhuǎn)移反應(yīng)。然后，從此反應(yīng)液中取出3ml，加到10ml強(qiáng)酸型離子交換樹(shù)脂Dowex50W-X2上，充分水洗，用1N氨水60ml洗脫，在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮至干。此糖鏈轉(zhuǎn)移物的重量為274mg，糖鏈轉(zhuǎn)移物的TLC見(jiàn)圖4。在此糖鏈轉(zhuǎn)移物中加水5.5ml，用2N鹽酸調(diào)節(jié)pH至5-6，加入按參考例2的的方法調(diào)制的固定化β-淀粉酶200粒，在37℃下反應(yīng)5小時(shí)。此β-淀粉酶反應(yīng)液的TLC見(jiàn)圖5。從圖5很明顯可看出生成的僅僅為麥芽糖。接著，將此β-淀粉酶反應(yīng)液加到10ml強(qiáng)酸型離子交換樹(shù)脂Dowex50W-X2上，通過(guò)液用2N苛性鈉中和后，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器濃縮至干。所得的麥芽糖重量為113mg。此麥芽糖部分的TLC見(jiàn)圖6。從圖6表明生成的僅僅為麥芽糖。實(shí)施例3在螺口試管內(nèi)加入N-(1，3-二羥基-2-丙基)valiolamine60mg和酶糊精“Amycol”(注冊(cè)商標(biāo)，日本淀粉社制)240mg，再加入CGTase“Contizyme”(天野制藥社制)1ml，加水至約2ml，在50℃下振蕩48小時(shí)，使發(fā)生轉(zhuǎn)移反應(yīng)。將全部反應(yīng)液通過(guò)約10ml強(qiáng)酸型離子交換樹(shù)脂Dowex50W-X2，充分水洗，用1N氨水60ml洗脫，將洗脫部分用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器濃縮至干。所得糖鏈轉(zhuǎn)移物的重量為118.6mg。在此糖鏈轉(zhuǎn)移物中加入0.1M醋酸緩沖液(pH4.8)10ml，使其溶解，接著加入100μlβ-淀粉酶(來(lái)源于甘薯、硫酸銨懸濁液，生化學(xué)工業(yè)社制)，于37℃下反應(yīng)16小時(shí)。然后，將此β-淀粉酶反應(yīng)液加到10ml強(qiáng)酸型離子交換樹(shù)脂Dowex50W-X2上，通過(guò)的流分和洗液一起，用2N氫氧化鈉中和，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器濃縮至干，得129.8mg麥芽糖。實(shí)施例4將低聚葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇4.7g溶于170ml水中，用1N鹽酸調(diào)節(jié)至pH4.9后，加入1mlβ-淀粉酶(SERVA社制，來(lái)源于甘薯，848U/mg蛋白，三次重結(jié)晶品，5mg/ml)，于37℃下反應(yīng)20小時(shí)。令反應(yīng)液通過(guò)30ml強(qiáng)堿型離子交換樹(shù)脂DiaionSA-11A，用離子交換水充分洗凈。然后，將通過(guò)液和洗液合并，通過(guò)50ml強(qiáng)酸型離子交換樹(shù)脂Dowex50W-X2，用離子交換水充分洗凈。接著，將通過(guò)液和和洗液合并，濃縮至干，得粉末1.4g。用高速液相色譜法(柱Nucleosil5NH2、5μm、4mmi.d.×25;移動(dòng)相乙腈/水＝70/30;檢測(cè)示差折射計(jì))分析的結(jié)果，此麥芽糖的含量為98.3%。實(shí)施例5將可溶性淀粉15g在100ml水中加熱溶解后，溶解脫二氧亞胺基葡糖醇5g。然后，加水使全容積為170ml，加入按參考例1的方法調(diào)制的固定化CGTase珠20ml，于55℃下反應(yīng)42小時(shí)。接著，過(guò)濾去除固定化CGTase珠，水洗后，將濾液和洗液合并，令其通過(guò)50ml強(qiáng)酸型離子交換樹(shù)脂Dowex50W-X2。將此充分水洗后，用1N氨水洗脫，將洗脫液凍結(jié)干燥，得11.3g。將此粉末溶于250ml水中，用2N鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0后，加入按參考例2的方法調(diào)制的固定化β-淀粉酶10ml，于37℃下反應(yīng)3小時(shí)。然后，將此反應(yīng)液過(guò)濾除去固定化β-淀粉酶，水洗后，將濾液與洗液合并，令其通過(guò)30ml強(qiáng)堿型離子交換樹(shù)脂DiaionSA-11A，進(jìn)行充分水洗。接著，將通過(guò)液與洗液合并，減壓濃縮至約20ml，令其通過(guò)100ml強(qiáng)堿型離子交換樹(shù)脂Dowex50W-X2。輕輕地水洗后，將通過(guò)液與洗液合并，凍結(jié)干燥，得麥芽糖粉末800mg。將本品麥芽糖85mg/ml濃度的樣品10μl按與實(shí)施例4同樣的高速液相色譜條件進(jìn)行分析的結(jié)果，本品如圖7所示，為100%麥芽糖。實(shí)施例6在按參考例3調(diào)制的5ml麥芽糖結(jié)合殼聚糖珠中加入酶糊精“Amycol”(注冊(cè)商標(biāo)，日淀化學(xué)社制)3g、水10ml，用2N鹽酸調(diào)至pH6.0后，加入CGTase(Contizyme，天野制藥社制)5ml，于50℃下緩緩振蕩24小時(shí)。在濾去載體珠后，充分水洗，于100℃沸水中加熱5分鐘，進(jìn)一步作充分水洗。另外，將未處理的殼聚糖珠代替麥芽糖結(jié)合殼聚糖珠同樣地進(jìn)行反應(yīng)以作對(duì)照。在這樣得到的載體珠5ml中，加入0.2M醋酸緩沖液10ml，再加β-淀粉酶(SERVA社制)50μl，于37℃緩緩振蕩。將反應(yīng)液經(jīng)時(shí)地取樣500μl，加入1ml3，5-二硝基水楊酸試劑，于100℃沸水中加熱10分鐘后，用水冷卻，加5ml水，以535nm處的吸光度來(lái)測(cè)定游離的麥芽糖。結(jié)果見(jiàn)圖8-A。與未處理的殼聚糖珠比較，經(jīng)麥芽糖結(jié)合處理的殼聚糖珠明顯地顯示麥芽糖的游離。將此β-淀粉酶處理后的上清液濃縮，用TLC檢測(cè)，只檢出麥芽糖，未見(jiàn)其它小糖類的混入。實(shí)施例7將實(shí)施例6所用的β-淀粉酶切斷后的麥芽糖結(jié)合殼聚糖珠與對(duì)照的殼聚糖珠于100℃加熱處理5分鐘，充分水洗，在50ml三角燒瓶中，加入該水洗后的樣品5ml和酶糊精“Amycol”(注冊(cè)商標(biāo)，日本淀粉社制)3g、水10ml、CGTase“Contizyme”(天野制藥社制)5ml，于50℃下振蕩24小時(shí)，再次進(jìn)行反應(yīng)。然后，將糖珠過(guò)濾洗凈，再于100℃加熱處理5分鐘，進(jìn)一步地充分水洗。將此糖珠5ml加到0.2M醋酸緩沖液(pH4.8)10ml中，再加入50μlβ-淀粉酶(來(lái)源于甘薯，硫酸銨懸濁液，生化學(xué)工業(yè)社制)，于37℃下孵育，經(jīng)時(shí)地取樣0.5ml，加入3，5-二硝基水楊酸試劑1ml，于100℃沸水中加熱5分鐘后，用水冷卻，加5ml水，以535nm處的吸光度來(lái)測(cè)定游離的麥芽糖，吸光度的變化見(jiàn)圖8-B。如圖8-B所示，與實(shí)施例6第1節(jié)的反應(yīng)同樣，與對(duì)照比較，可充分確認(rèn)麥芽糖的生成。由此，用麥芽糖結(jié)合珠也能反復(fù)進(jìn)行麥芽糖的制備，即提示了連續(xù)生產(chǎn)的可能性。實(shí)施例8將與實(shí)施例1同樣獲得的脫二氧亞胺基葡糖醇糖鏈轉(zhuǎn)移物149mg溶于3ml水中，用2N鹽酸調(diào)至pH5.0，加入按參考例4調(diào)制的固定化葡糖淀粉酶珠200粒，于40℃下振蕩4小時(shí)使葡萄糖游離出來(lái)。將此反應(yīng)液加到Dowex50W-X210ml上，未被吸附流出的部分用2.5N苛性鈉中和后，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器濃縮至干，得純凈的葡萄糖58.3mg。圖9為其TLC。實(shí)施例9將與實(shí)施例1同樣得到的N-丙基脫二氧亞胺基葡糖醇和N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇的糖鏈轉(zhuǎn)移物各12.5mg溶于250μl水中，用2N鹽酸調(diào)至pH6.0，在其中加入由灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)NA-468(FERMP-2227)調(diào)制的生成麥芽三糖的淀粉酶溶液250μl(95單位/0.25mg蛋白;1單位在1小時(shí)內(nèi)生成相當(dāng)于1mg麥芽三糖的還原糖的酶量)，于40℃下緩緩振蕩2小時(shí)，生成麥芽三糖。圖10所示為此反應(yīng)液的TLC。再將此反應(yīng)液放到Dowex50W-X2上，未被吸附而流出的部分用2.5N苛性鈉中和。圖11所示為此麥芽三糖部分的TLC。圖11表明僅產(chǎn)生麥芽三糖。進(jìn)一步用3，5-二硝基水楊酸法以麥芽三糖標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)進(jìn)行定量，測(cè)得麥芽三糖分別為5.2mg和5.7mg。實(shí)施例10在與實(shí)施例1同樣得到的N-丙基脫二氧亞胺基葡糖醇和N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇的糖鏈轉(zhuǎn)移物各12.5mg中，加入由施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)IFO-3773株調(diào)制的生成麥芽四糖的淀粉酶溶液250μl(26.25單位/0.24mg蛋白;1單位1小時(shí)內(nèi)生成相當(dāng)于1mg麥芽四糖的還原糖的酶量)，于40℃下緩緩振蕩2小時(shí)，生成麥芽四糖。再將此反應(yīng)液加到Dowex50W-X2上，收集未被吸附而流出的部分。此麥芽四糖部分反應(yīng)第20分鐘的TLC見(jiàn)圖12。圖12表明僅產(chǎn)生麥芽四糖。進(jìn)一步用3，5-二硝基水楊酸法以麥芽四糖標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)進(jìn)行定量，測(cè)得麥芽四糖分別為2.0mg和1.6mg。實(shí)施例11在與實(shí)施例1同樣得到的N-丙基脫二氧亞胺基葡糖醇和N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇的糖鏈轉(zhuǎn)移物各12.5mg中，加入由假單胞菌屬Pseudomonssp.kO-8940(FERMP-7456)調(diào)制的生成麥芽五糖的淀粉酶溶液250μl(10.13單位/1.85mg蛋白;1單位在1小時(shí)內(nèi)生成相當(dāng)于1mg麥芽五糖的還原糖的酶量)，于40℃下緩緩振蕩2小時(shí)，生成麥芽五糖。再將此反應(yīng)液加到Dowex50W-X2上，收集未被吸附而流出的部分。圖13所示為從N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇制麥芽五糖部分的反應(yīng)第90分鐘的TLC圖。圖13表明僅產(chǎn)生麥芽五糖。進(jìn)一步用3，5-二硝基水楊酸法以麥芽五糖標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)進(jìn)行定量，測(cè)得麥芽五糖分別為0.6mg和0.8mg。圖1為實(shí)施例1中的糖鏈轉(zhuǎn)移物的TLC。圖1中，1-6分別表示脫二氧亞胺基葡糖醇、N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇、N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇、N-羥乙基脫二氧亞胺基葡糖醇、N-丁基脫二氧亞胺基葡糖醇及葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇的各糖鏈轉(zhuǎn)移物，a、b、c、d、e、f為作為標(biāo)準(zhǔn)品的上述各脫二氧亞胺基葡糖醇類。圖2為實(shí)施例1中β-淀粉酶反應(yīng)液的TLC。圖中1、2、3、4、5、6與圖1所說(shuō)明的相同。M為麥芽糖。圖3為實(shí)施例1中麥芽糖部分的TLC。圖中1、2、3、4、5、6與圖1所說(shuō)明的相同。M為麥芽糖。圖4為實(shí)施例2中糖鏈轉(zhuǎn)移物的TLC。7和Ba分別表示validamine糖鏈轉(zhuǎn)移物和validamine。圖5為實(shí)施例2中β-淀粉酶反應(yīng)液的TLC.7為validamine糖鏈轉(zhuǎn)移物，M為麥芽糖。圖6為實(shí)施例2中麥芽糖部分的TLC。7為validamine糖鏈轉(zhuǎn)移物，M為麥芽糖。圖7為實(shí)施例5中所得的麥芽糖粉末的高速液相色譜圖。圖中A為溶劑峰，B為麥芽糖峰。圖8-A是實(shí)施例6的結(jié)果?！駷椴捎名溠刻墙Y(jié)合殼聚糖珠的情形，○為采用未處理的殼聚糖珠的情形，縱軸為溶液的吸光度，橫軸為時(shí)間(小時(shí))。圖8-B是實(shí)施例7的結(jié)果。●為采用麥芽糖結(jié)合殼聚糖珠的情形，○為采用未處理的殼聚糖珠的情形?？v軸為溶液的吸光度，橫軸為時(shí)間(小時(shí))。圖9為實(shí)施例8中葡萄糖部分的TLC。圖中8為葡萄糖部分，G為葡萄糖。圖10為實(shí)施例9中生成麥芽三糖的淀粉酶反應(yīng)液的TLC。圖中9、10分別為N-丙基脫二氧亞胺基葡糖醇和N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇的糖鏈轉(zhuǎn)移物，T為麥芽三糖。圖11為實(shí)施例9中麥芽三糖部分的TLC。圖中9為從N-丙基脫二氧亞胺基葡糖醇而來(lái)的麥芽三糖部分，10為從N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇而來(lái)的麥芽三糖部分，T為麥芽三糖。圖12為實(shí)施例10中麥芽四糖部分的TLC。圖中11為從N-丙基脫二氧亞胺基葡糖醇而來(lái)的麥芽四糖部分，圖中12為從N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇而來(lái)的麥芽四糖部分，Te為麥芽四糖。圖13為實(shí)施例11中麥芽五糖部分的TLC。圖中13為從N-芐基脫二氧亞胺基葡糖醇而來(lái)的麥芽五糖部分，Pe為麥芽五糖。權(quán)利要求1.糖類的制備方法，其特征在于在糖鏈轉(zhuǎn)移酶的作用下，直接地或經(jīng)中間體介導(dǎo)地，將糖鏈從其它的糖鏈供給源轉(zhuǎn)移到對(duì)于作為目的物的特定鏈長(zhǎng)的糖類實(shí)質(zhì)上可分離的物質(zhì)上，使所得到的低聚糖受將低聚糖特定長(zhǎng)度的糖鏈切成exo型的酶的作用，從而分離作為目的物的特定糖鏈長(zhǎng)的糖類。2.按權(quán)利要求1所述的糖類的制備方法，其特征在于對(duì)于作為目的物的特定糖鏈長(zhǎng)的糖類實(shí)質(zhì)上可分離的物質(zhì)為載體或以下面的通式[Ⅰ]表示的化合物(式中R為氫、低級(jí)烷基、羥烷基、苯基烷基、苯基鏈烯基、苯基炔基、苯氧基烷基、苯氧基鏈烯基或苯氧基炔基，其中苯基上也含有取代基)、野尻霉素、氨基環(huán)醇、氨基環(huán)醇衍生物、或葡糖醛酸或其葡糖基或低聚葡糖基體。3.一種輸液，其特征在于以下面的通式[Ⅱ](式中，n為從2-5的整數(shù))表示的麥芽低聚糖為主成分。全文摘要提供可獲得高純葡萄糖、麥芽糖、麥芽低聚糖等固定糖鏈長(zhǎng)的糖類單體的簡(jiǎn)便制備方法。本制備法系采用糖鏈轉(zhuǎn)移酶將糖鏈從糖鏈供給源轉(zhuǎn)移到對(duì)于上述糖類實(shí)質(zhì)上可分離的物質(zhì)上，使所得的低聚糖受將特定的糖鏈切成exo型的酶的作用。文檔編號(hào)C12P17/12GK1063897SQ9110801公開(kāi)日1992年8月26日申請(qǐng)日期1991年12月12日優(yōu)先權(quán)日1991年2月5日發(fā)明者江連洋治,丸尾重昭,宮崎克憲,山田直義申請(qǐng)人:日本新藥株式會(huì)社