專利名稱：動脈硬化的治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動脈硬化的治療劑，更具體地說涉及利用calponin基因的動脈硬化治療劑。
動脈硬化在病理上以內(nèi)膜損傷為代表，其特征在于脂肪和結(jié)締組織的沉積以及平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的生長，特別是動脈粥樣硬化引起局部缺血性心臟病和大腦出血，因此它是一種非常致命的疾病。一般認(rèn)為高脂血、高血壓、衰老和吸煙是動脈硬化的主要危險因素。
至于動脈硬化的治療，使用抗高脂血試劑和抗高血壓藥品作為治療劑以抑制危險因素的增強。使用抗氧化劑、抗血小板試劑、血管舒張劑、抗凝血劑和類似物作為治療劑以抑制疾病發(fā)作的起因。目前，這些治療尚未在臨床上產(chǎn)生足夠的效力。
另外，在對局部缺血性心臟疾病(如由動脈硬化引起的心絞痛和心肌梗死形成)的早期治療中進(jìn)行經(jīng)皮的經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)(PTCA)PTCA產(chǎn)生了明顯的效果。然而，在PTCA治療后發(fā)現(xiàn)30-40％的病人在3到6個月后再狹窄，這是一個大問題。為了抑制再狹窄，給病人施用一種藥物，但這種治療并不足夠有效。各種研究的結(jié)果表明，在內(nèi)膜中平滑肌細(xì)胞的增生引起再狹窄(Hanke，H.et al.，Timecourse of smooth muscle cell proliferation in theintima and media of arteries of following experimentalangioplasty，Circulation Res.1990；67651-659)。已嘗試了將試劑或基因直接導(dǎo)入內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞(特別是在病灶位點)來治療再狹窄的方法。作為一個例子，嘗試了在內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞(特別是在病灶位點)使用肝素的方法(Gimple，L.W.et al.，Effectof chronic subcutaneous or intramural administration ofheparin on femoral artery restenosis ofter balloonangioplasty in hypercholesterolemic rabbits Circulation1992；861536-1546)，但對抑制再狹窄沒有產(chǎn)生足夠的影響。另外，進(jìn)行了經(jīng)氣囊導(dǎo)入法將熒光素酶編碼基因?qū)肫交〖?xì)胞特別是動脈硬化形成的病灶的位置的試驗(Leclerc，G.et al.，Percutaneous arterial gene transfer in a rabbit model.J.Clin.Invest，1992；90936-944)，但該試驗作為動脈硬化的治療方法并不完全令人滿意，因為他們使用的該基因不是作為一種治療劑而是作為一種標(biāo)記。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供動脈硬化的治療劑，它能克服上面提及的背景技術(shù)之缺陷。換句話說，本發(fā)明的目的是提供用于動脈硬化的高效治療劑。
本發(fā)明的另一目的是提供在PTCA后能有效防止再狹窄的動脈硬化治療劑。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供對制備用于動脈硬化的高效治療劑中有用的重組載體。
本發(fā)明還有一個目的是提供在治療動脈硬化和它所引起的局部缺血性心臟疾病中有用的藥物組合物。
本發(fā)明另外的目的是提供一種治療動脈硬化的方法。
本發(fā)明甚至還有一個目的是提供一種治療局部缺血性心臟病的方法。
作為各種研究的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)血管壁中平滑肌細(xì)胞的增生可經(jīng)過將calponin基因?qū)胙鼙趤硪种撇⑼瓿闪吮景l(fā)明。本發(fā)明提供了用于動脈硬化的治療劑，它包含以calponin基因作為活性成份。而且，本發(fā)明提供了含有calponin基因的重組載體，它能在平滑肌細(xì)胞中表達(dá)calponin基因。本發(fā)明還提供了包含calponin基因和一種藥用的載體的藥物組合物。另外，本發(fā)明提供了一種治療動脈硬化的方法，包括給病人施用治療上有效量的calponin基因的步驟。此外，本發(fā)明提供了一種治療局部缺血性心臟病的方法，包括給病人施用治療上有效量的calponin基因之步驟。
盡管不受特定的理論限制，據(jù)信經(jīng)過應(yīng)用本發(fā)明用于動脈硬化的治療劑，calponin基因在血管壁平滑肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，從而將去分化的平滑肌細(xì)胞重新分化以抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。


圖1是參入了人calponin cDNA的重組載體pCAGGS/hCN的限制性圖譜。
圖2是證實人calponin基因?qū)胙鼙诘碾娪緢D譜，泳道1是不含DNA的陰性對照，泳道2是用質(zhì)粒pCAGGS處理的對照組2的頸總動脈DNA，泳道3是用含人calponin cDNA的重組載體pCAGGS/hCN處理的calponin組頸總動脈的DNA。
圖3是一組照片，顯示了在下面3組頸總動脈橫切片中觀察到的血管增生內(nèi)膜的生物學(xué)形態(tài)(a)用含人calponin cDNA的重組載體pCAGGS/hCN處理的calponin組；(b)用質(zhì)粒pCAGGS處理的對照組2；(c)未處理的對照組1。
圖4是顯示用氣囊摩擦兔頸總動脈后基因的導(dǎo)入在抑制血管壁內(nèi)膜增生中的有效程度。在圖4的橫座標(biāo)上，對照組1代表用氣囊摩擦頸總動脈后不作處理的未處理對照組(n＝18)，對照組2代表用氣囊摩擦頸總動脈后用質(zhì)粒pCAGGS處理的對照組(n＝7)，calponin組代表用含人calponin cDNA的重組載體pCAGGS/hCN處理的組(n＝8)?？v坐標(biāo)數(shù)表示內(nèi)膜與血管中層的面積比。
實施本發(fā)明的最佳方式術(shù)語“calponin基因”指編碼calponin或calponin樣蛋白質(zhì)的基因。發(fā)現(xiàn)calponin作為一種肌鈣蛋白樣蛋白質(zhì)主要存在于哺乳動物平滑肌細(xì)胞中(Takahashi，K.et al.，Biochem，Biophys.Res.Commun.1986；14120-26)。已知calponin存在于肌動蛋白絲上并經(jīng)過與肌動蛋白絲結(jié)合來抑制肌球蛋白ATPase的活性(Winder，S.J.et al.，J.Biol.Chem.1990；26510148-10155)。因此，據(jù)信calponin在調(diào)節(jié)平滑肌的收縮中起著重要作用。Takahashi等已測定了雞calponin的氨基酸序列(Takahashi，K.and Nadal-Ginard，B.，J.Biol.Chem.1991；26613284-13288)。SM22和mp20被熟知為calponin樣蛋白質(zhì)，Thweatt和Ayme-Southgate分別測定了它們的氨基酸序列(Thweatt，R.et al.，Biochem.Biophys，Res.Commun，1992；1871-7和Ayme-Southgate，A.et al.，J.Cell.Biol.1989；108521-531)。上述calponin和calponin樣蛋白質(zhì)可用于本發(fā)明。
最先從雞砂囊中克隆了calponin的cDNA并測定了其堿基序列(Takahashi，K.and Nadal-Ginard，B.，J.Biol.Chem.1991；26613284-13288)。后來報道了人和大鼠calponin cDNA的克隆(Takahashi，K.et al.，Japanese circulation Journal1992；56 supplement 140和Shanahan，C.M.et al.，Circulation Res.1993；73193-204)。本發(fā)明可使用這種calponin。為了減少被導(dǎo)入基因和被表達(dá)蛋白質(zhì)的免疫排異作用和為了增加治療的有效性，導(dǎo)入的calponin基因優(yōu)選來自人類。優(yōu)選使用含有編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列之堿基序列的calponin基因，更優(yōu)選使用含有SEQ ID NO1的堿基序列的calponin基因。calponin基因可含有補加編碼序列?？尚揎梒alponin基因以便增加、置換或缺失一些編碼的氨基酸序列。該修飾的前提是能表達(dá)具有與calponin功能相似的蛋白質(zhì)。calponin基因可以是經(jīng)過使用常規(guī)技術(shù)從細(xì)胞中分離和純化的基因組DNA或cDNA?；蛘咚梢允歉鶕?jù)Narang等的方法(Narang，S.A.，DNA Synthesis，Tetrahedron 1983；393)化學(xué)合成的。
可將calponin基因本身導(dǎo)入處于病灶位點的平滑肌細(xì)胞。作為選擇，可將含有calponin基因并能在平滑肌細(xì)胞中表達(dá)calponin基因的重組載體導(dǎo)入病灶位點的平滑肌細(xì)胞。這種重組載體包含calponin基因和表達(dá)該基因的表達(dá)載體。一般來說，可用能在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體或病毒載體DNA或RNA來構(gòu)建表達(dá)載體?？山?jīng)過最佳選擇和組合一個能引起表達(dá)載體復(fù)制的復(fù)制起點，一個表達(dá)啟動子，一個剪接信號，polyA加入信號，藥物選擇標(biāo)記，一個增強子等來構(gòu)建表達(dá)載體。優(yōu)選的是表達(dá)載體含有至少一個啟動子。能引起表達(dá)載體復(fù)制的復(fù)制起點的例子包括SV40病毒，乳頭狀瘤病毒，EB病毒(Epstein-Barr病毒)等。表達(dá)啟動子的例子包括β-肌動蛋白啟動子，延伸因子1α，胸苷激酶啟動子，SV40啟動子，腺病毒主要晚期啟動子，巨細(xì)胞病毒啟動子等。而且，除了剪接信號，polyA加入信號，為確保有效克隆選擇的藥物選擇標(biāo)記如氨芐青霉素抗性基因，和細(xì)胞特異性功能增強子外，可加入控制導(dǎo)入的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制基因。可用于構(gòu)建本發(fā)明的重組載體的優(yōu)選的表達(dá)載體的例子包括pEF-BOS(Mizushima，S.et al.，Nucleic Acid Research1990；185322)，pcDL-SR α296(Takebe，Y.et al.，Molecular and Cellular Biology 1988 8466-472)，pCAGGS(Niwa，H.et al.，Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryoticvector，Gene 1991；108；193-200)，pAd265SVp(A)3(Kaufman，R.J.，et al.，Mol.Cell.Biol 1985；51750-1759)等。其中，pCAGGS是最優(yōu)選的。含巨細(xì)胞病毒增強子，雞β-肌動蛋白啟動子，兔β-球蛋白3′剪接信號，兔β-球蛋白3′側(cè)翼區(qū)和SV40復(fù)制起點的pCAGGS能有效地表達(dá)參入哺乳動物細(xì)胞的基因。
可使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)(Maniatis，T.et al.，Molecular cloningA laboratory manual 1989；ColdSpring harbor laboratory)經(jīng)過將calponin基因參入表達(dá)載體中構(gòu)建本發(fā)明的重組載體。
calponin基因，或者含有calponin基因并能在平滑肌細(xì)胞中表達(dá)calponin基因的重組載體(下文稱為“含calponin基因的重組載體”)可用藥用的載體配制以制備隨后施用的以溶液、懸液、膠體或等形式存在的藥物組合物。
作為選擇，calponin基因或含calponin基因的重組載體可在膜中包被以制備成顆粒，且該顆?？捎盟幱玫妮d體配制以制備隨后施用的以溶液、懸液、膠體或類似形式存在的藥物組合物。在膜中包被calponin基因或含calponin基因的重組載體可防止該基因或重組載體被核酸酶消化并能有助于高效地將該基因或重組載體無損傷地導(dǎo)入靶細(xì)胞。至于膜，可使用合成的膜，如脂質(zhì)體(Wong，T.K.et al.，Science 1980；215166)，脂質(zhì)乳濁液等，也可使用天然存在的膜，如原生質(zhì)體(Schaffner，W.，Proc.Natl.Acad.Sci，1980；77；2163)，病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒)衣殼(Cone，R.D.et al.，Proc.Natl，Acad.Sci，1984；816349)，紅細(xì)胞空殼(Furusawa，M.et al.，Nature 1974；2498449)等。其中，由于下面原因優(yōu)選脂質(zhì)體。對calponin基因或含calponin基因的重組載體不作任何特殊的處理就能將該基因或該重組載體包被進(jìn)脂質(zhì)體中。另外，如果從存在于人類的脂肪或在人體內(nèi)代謝的脂肪生產(chǎn)脂質(zhì)體，導(dǎo)入后脂質(zhì)體可代謝成無害的形式。用于形成脂質(zhì)體的物質(zhì)的例子包括脂肪，如N-[1-(2，3-二油酰氧)-丙基]-N，N，N-三甲基氨甲基硫酸鹽(DOTAP)，N-[1-(2，3-二油酰氧)-丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)，二月桂酰磷脂酰膽堿(DLPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)，二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)，二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)，N-(α-三甲基氨基乙酰)-雙十二烷基-D-氯化谷氨酸(TMAG)等，以及它們的混合物。優(yōu)選這些脂肪是因為它們能形成具有足夠內(nèi)部容積的大型單層泡囊(LUV)，使calponin基因或含calponin基因的重組載體有效地參入而不會損傷這些DNA。例如，已知N-[1-(2，3-二油酰氧)-丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)與二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)以1∶1(w/w)比例的混合物(Felgner，D.L.et al.，LipofectionA highly efficient，lipid-mediated DNA-transfection procedure，Proc.Natl.Acad.Sci，1987；847413)，N-(α-三甲基氨基乙酰-雙十二烷基-D-氯化谷氨酸(TMAG)與二月桂酰磷脂酰膽堿(DLPC)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)以1∶2∶2(mol/mol/mol)比例的混合物(Koshizaka，T.etal.，J.Clin.Biochem.Nutr.19897185)和類似物可形成能吸收DNA的脂質(zhì)體。在這些脂肪中，最優(yōu)選N-[1-(2，3-二油酰氧)-丙基]-N，N，N-三甲基氨甲基硫酸鹽(DOTAP)，因為它的細(xì)胞毒性低。而且，HVJ(日本血凝病毒)的糖蛋白可參入或共價結(jié)合到脂質(zhì)體的表面，或加入乙二醇以增加DNA導(dǎo)入細(xì)胞的效率。另外，抗存在于靶平滑肌細(xì)胞表面的抗原的特異性抗體或受體配體可參入或共價結(jié)合到脂質(zhì)體上以增強細(xì)胞的靶特異性。
使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)可將calponin基因或含calponin基因的重組載體包被進(jìn)上述各種膜中。例如，根據(jù)Danos O等人(Proc.Natl.Acad.Sci，1988；856460)中描述的方法可將calponin基因或含calponin基因的重組載體包裝進(jìn)病毒衣殼中。經(jīng)過將calponin基因或含calponin基因的重組載體與上述脂肪類型以及一種液體介質(zhì)(如水，Hepes緩沖的生理鹽水溶液(150mM NaCl/20mM Hepes，pH7.4)，Tris-HCl緩沖液等)混合并攪拌混合物可將calponin基因或含calponin基因的重組載體包裝進(jìn)合成膜內(nèi)。將calponin基因或含calponin基因的重組載體包裝進(jìn)合成膜時，可加入聚乙二醇，植物凝血素等。可選擇calponin基因與膜的比率或含calponin基因的重組載體與膜的比率的值以便按所需量表達(dá)calponin基因。膜中包含的calponin基因或含calponin基因的重組載體優(yōu)選的重量比為從10％到50％。
任選包裝的calponin基因或含calponin基因的重組載體可經(jīng)各種方法施用，如靜脈內(nèi)注射。優(yōu)選的是使用導(dǎo)管經(jīng)局部用藥。在導(dǎo)管的輔助下，可將calponin基因轉(zhuǎn)移到病灶位點或周圍并經(jīng)過使用導(dǎo)管高效地導(dǎo)入發(fā)病位點的血管壁。有代表性的導(dǎo)管的例子包括單氣囊導(dǎo)管，Wolinsky冠狀注入導(dǎo)管，雙氣囊導(dǎo)管和類似物。至于使用雙氣囊導(dǎo)管給藥的方法，可使用Chang等的方法(Chang，S.et al.，Direct in vivo gene transfer into the coronary andperipheral vasculatures of the intact dog，Circulation，1991；832007-2011)。
根據(jù)常規(guī)配制技術(shù)可將作為活性成份的calponin基因或含calponin基因的重組載體與藥用的載體一起配制以制配藥物組合物。藥用的載體的例子包括稀釋劑、填充劑、無菌含水介質(zhì)和各種無毒的有機溶劑。適于結(jié)合或選擇以加入藥物組合物的藥用的物質(zhì)有穩(wěn)定劑、緩沖液、等滲劑等。穩(wěn)定劑的例子包括糖類(如葡萄糖、甘露醇和類似物)、氨基酸(如甘氨酸等)、HSA、BSA，明膠等。緩沖液的例子包括Tris緩沖液，PBS緩沖液，檸檬酸緩沖液，乙酸緩沖液，HEPES緩沖液等。等滲劑的例子包括鹽(如氯化鈉)等，糖類(如葡萄糖、甘露醇和類似物)等?？墒褂媒?jīng)過將活性成份溶于或懸浮于上面物質(zhì)的水溶液中生產(chǎn)的藥用制劑。為了增加基因?qū)氲男Я?，可加入聚乙二醇，DMSO和類似物。
當(dāng)使用包含非包裝狀態(tài)的calponin基因或含calponin基因的重組載體之藥用制劑時，可經(jīng)過在病灶位點內(nèi)血管壁上施用該藥用制劑將calponin基因?qū)氩≡钗稽c的平滑肌細(xì)胞中，導(dǎo)入可使用磷酸鈣共同沉淀法(Graham，F(xiàn).L.et al.，Virology 1973；52456)，使用DEAE葡聚糖方法進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染(Mocutchan，J.H.et al.，J.Natl.Cancer Inst.1968；41351)，使用以calponin基因或含calponin基因的重組載體與水凝膠的混合物覆層的單氣囊導(dǎo)管進(jìn)行氣囊導(dǎo)入，或類似方法。當(dāng)使用含有包裝狀態(tài)的calponin基因或含calponin基因之重組載體的藥用制劑時，可經(jīng)過注射和將藥用制劑與雙氣囊導(dǎo)管保溫一段時間或經(jīng)過使用Wolinsky冠狀注入導(dǎo)管注射進(jìn)血管壁以便在病灶位點應(yīng)用藥用制劑將calponin基因?qū)氚l(fā)病位點的平滑肌細(xì)胞。
本發(fā)明動脈硬化治療劑的用藥劑量范圍可根據(jù)年齡，性別，病人疾病的嚴(yán)重性，用藥途徑，用藥次數(shù)，劑量形式等進(jìn)行變動。一般來說，適于成年人的劑量相應(yīng)于每天約20μg至600mg calponin基因的范圍。
據(jù)信本發(fā)明的動脈硬化治療劑具有低毒性或高度安全性，因為其活性成份是存在于哺乳動物平滑肌細(xì)胞中編碼calponin的基因。另外，據(jù)信本發(fā)明的動脈硬化治療劑具有極低的致癌性，因為已知calponin基因?qū)肱囵B(yǎng)的平滑肌細(xì)胞中抑制了原癌基因如c-fos的表達(dá)。而且，經(jīng)過在膜如脂質(zhì)體和類似物中包裝calponin基因或含calponin基因的重組載體進(jìn)一步降低了本發(fā)明的動脈硬化治療劑的細(xì)胞毒性。
參考下面實施例對本發(fā)明作更詳細(xì)的解釋，這些實施例只作為舉證而不是對本發(fā)明范圍的限制。
實施例11.人calponin cDNA的克隆從日本肝癌病人(男，54歲)的主動脈中分離RNA并根據(jù)Chirgwin等的方法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry 1977；185294-5299)進(jìn)行純化。使用OligotexTM-dT30<Super>(catalogNo.9021B，TAKARA SHUZO CO.，LTD)從RNA中純化poly(A)+RNA。使用ZAP-cDNA合成試劑盒(catalog No.200400，StratageneCo.)和GigapackRII Gold(catalog No.200216，StratageneCo.)從poly(A)+RNA制備入主動脈入ZAPR-cDNA文庫。將該文庫的重組DNA涂布到尼龍濾膜HybondTMN+(catalog No.RPN.137B，Amersham Co.)上并使用雞calponin cDNA作探針進(jìn)行噬菌斑雜交(Takahashi，K.and Nadal-Ginard，B.，J.Biol.Chem.1991；26613284-13288)以產(chǎn)生陽性克隆。經(jīng)過用f1輔助噬菌體R408VCSM13感染在pBluescript SK-中亞克隆陽性克隆。從亞克隆中選擇最長的克隆并命名為pBluescript SK-hCN(Takahashi，K.etal.，Japanese Circulation Journal 1992；56 supplement 140)。使用SequenaseRVersion 2.0 DNA測序試劑盒(catalogNo.70781，USB Co.)對pBluescript SK-hCN進(jìn)行測序。由此產(chǎn)生的人calponin cDNA堿基序列在序列描述中以SEQ ID NO1表示。2.構(gòu)建含calponin基因的重組載體用限制性酶SmaI(Boehringer Mannheim Co.)將在1.中制備的pBluescript SK-hCN線性化并用T4DNA連接酶(TAKARASHV20 CO.LTD.)連接到退火的XhoI連接子(Boehringer MannheimCo.)上以便在pBluescript SK-hCN的人calponin cDNA 5′端插入XhoI限制性位點。用上面反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化E.coli DH5α細(xì)胞系(可從Lifetechnologies Inc.獲得)。從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒。用限制性酶XhoI(Boehringer Mannheim Co.)消化分離的質(zhì)粒以產(chǎn)生含1522bp人calponin cDNA的片段和pBluescript SK-質(zhì)粒的片段。該結(jié)果表明純化的質(zhì)粒是感興趣的質(zhì)粒。
然后，用限制性酶XhoI消化質(zhì)粒并在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳以分離SEQ ID NO1所示的含1522bp人calponin cDNA的片段。使用Prep-A-Gene DNA純化試劑盒(catalog No.732-6010，Biorad Co.)純化該片段。用T4DNA連接酶將純化的DNA片段連接到用限制性酶XhoI(Niwa，H.et al.，Gene 1991；108193-200)消化的質(zhì)粒pCAGGS上。用反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化E.coli DH5α細(xì)胞系。從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒并用限制性酶XhoI和PstI(Boehringer Mannheim Co.)消化以證實人calponin cDNA的插入和其相對于啟動子的方向。由于用XhoI消化產(chǎn)生含1522bp人calponin cDNA的片段，用PstI消化產(chǎn)生大約1270bp含人calponincDNA 3′端和兔β-球蛋白3′-側(cè)翼區(qū)的片段，因此證實純化的質(zhì)粒是表達(dá)人calponin之重組載體的質(zhì)粒pCAGGS/hCN。
圖1顯示了含人calponin cDNA的重組載體pCAGGS/hCN的限制性圖譜。重組載體pCAGGS/hCN的大小是大約6.5kb。3.用脂質(zhì)體包裝用190μl Hepes緩沖的生理鹽溶液(Hepes，20mM，NaCl，150mM；pH7.4)稀釋N-[1-(2，3-二油酰氧)-丙基]-N，N，N-三甲基氨甲基硫酸(DOTAP)(Boehringer Mannheim Co.)(1mg/ml，60μl)。在一個單獨的步驟中，將2.中構(gòu)建的重組載體pCAGGS/hCN(30μg)溶于250μl Hepes緩沖的生理鹽溶液中。將上述2溶液混合并在室溫下保溫至少20分鐘以產(chǎn)生具有包裝于脂質(zhì)體中的pCAGGS/hCN的顆粒。
作為對照，除了用質(zhì)粒pCAGGS代替2.中構(gòu)建的重組載體pCAGGS/hCN外重復(fù)上面程序以產(chǎn)生具有包裝于脂質(zhì)體的pCAGGS的質(zhì)粒。4.動脈硬化治療劑的制備向含有包裝于脂質(zhì)體的pCAGGS/hCN的顆粒(3.中制備)之溶液(500μl)中加入臺盼藍(lán)(10μl(Sigma Co.)和生理鹽溶液(300μl)并混合以制備800μl的溶液。該溶液用作動脈硬化的治療劑。
除了用質(zhì)粒pCAGGS代替重組載體pCAGGS/hCN外重復(fù)上面程序以制備對照溶液。5.經(jīng)皮的經(jīng)腔基因轉(zhuǎn)移(PTGT)使用18只兔子，用充氣的氣囊導(dǎo)管在5個大氣壓下對每只兔子的頸總動脈內(nèi)面部分摩擦4-5cm以進(jìn)行PTCA(C.R.Bard Inc.)。該操作重復(fù)3次。2天后，在每只處理過的兔子耳靜脈中插入22G插管(Medikit Co.)并緩慢經(jīng)靜脈內(nèi)注射4-5ml RaNonal 1A(TANABE SEIYAKU CO.，LTD.)(硫噴妥鈉0.3g，碳酸鈉0.18g)溶于30ml生理鹽溶液形成的溶液以麻醉兔。隨后，將兔固定于實驗臺上。
使用Wolinsky冠狀注入導(dǎo)管(C.R.Bard Inc.)經(jīng)皮的經(jīng)腔基因轉(zhuǎn)移(PTGT)給每只兔施用含有包裝于脂質(zhì)體的重組載體pCAGGS/hCN顆粒之溶液。簡單地說，將每只頸總動脈內(nèi)面部分已摩擦過的兔腹股溝區(qū)切開并暴露股動脈。將兔子仰臥并用線固定。用插管將兔股動脈穿孔。將2cm長的Wolinsky冠狀注入導(dǎo)管(C.R.Bard Inc.)裝上導(dǎo)管線以備PTCA(C.R.Bard Inc.)。經(jīng)X-射線熒光鏡觀察選擇用氣囊預(yù)先摩擦的頸總動脈，導(dǎo)管線在摩擦位點最遠(yuǎn)點的前面，Wolinsky冠狀注入導(dǎo)管位于頸內(nèi)動脈與頸外動脈分叉近側(cè)1cm處。
然后將18F針頭(TERUMO CORP.)裝上30cm長的注射筒(catalog No.9070112，NAMIC Co.)，將800μl在4.中制備的包裝的pCAGGS/hCN溶液吸入注射筒。將注射筒連接到Wolinsky冠狀注入導(dǎo)管的輸入端，將包裝的pCAGGS/hCN溶液注射進(jìn)2天前摩擦的頸總動脈遠(yuǎn)端，并用BasixTMIn-deflator(MERIT Medical Co.)將壓力維持在3個大氣壓；通過10次循環(huán)大約8秒進(jìn)行注射，從頸總動脈去掉導(dǎo)線和Wolinsky冠狀注入導(dǎo)管。制備抗生素Cefotax(CHUGAI PHARMACEUTICAL CO.LTD)(0.5g)溶于生理鹽水(20ml)的溶液。將3ml Cefotax溶液局部注射到切開和穿孔的位置，剩余的Cefotax溶液經(jīng)靜脈內(nèi)注射。
重復(fù)上面程序，除了用4.中制備的含包裝的質(zhì)粒pCAGGS的對照溶液代替包裝的重組載體pCAGGS/hCN的溶液(對照組2)。
作為對照，2天前摩擦的頸總動脈近側(cè)部分2-3cm處不作處理(對照組1)。6.血管內(nèi)膜增生的證實經(jīng)皮的經(jīng)腔基因轉(zhuǎn)移(PTGT)14天后，從用氣囊摩擦的每只兔中取出頸總動脈。將大約4mm長的血管放入Tissue Tek冷凍模(可從Miles Laboratory Co.獲得)中，使用Tissue Tek DCTCompound 4583(可從Miles Laboratory Co.獲得)制備冷凍塊。使用冷凍切片機將冷凍塊切成5-6μm厚的切片?？諝飧稍锖?，將這些切片用蘇木精和曙紅染色。用頸總動脈壁橫切面的顯微照片評價三組中血管內(nèi)膜增生的程度，這三組是用含人calponin cDNA的重組載體處理過的calponin組(n＝8)，未作處理的對照組1(n＝18)和用質(zhì)粒pCAGGS處理的對照組2(n＝7)。這種橫切面的3張顯微照片如圖3所示。圖3(a)顯示了在calponin組頸總動脈橫切面觀察到的血管內(nèi)膜增生的形態(tài)學(xué)；圖3(b)是對照組2；圖3(c)是對照組1。圖3表明calponin組血管內(nèi)膜增生的程度比對照組1和對照組2的程度要小。
至于血管內(nèi)膜增生程度的數(shù)值表達(dá)，用面積計測量了內(nèi)膜和血管中層的面積，計算內(nèi)膜與中層的面積比作為內(nèi)膜增生的程度(Nabel，E.G.et al.，J.Clin.Invest.1993；911822-1829)。結(jié)果如圖4所示。在圖4的橫坐標(biāo)上，“對照組1”代表用氣囊摩擦頸總動脈后未作處理的未處理對照組(n＝18)，“對照組2”代表用氣囊摩擦頸總動脈后用質(zhì)粒pCAGGS處理的對照組(n＝7)，“calponin組”代表用含人calponin cDNA的重組載體pCAGGS/hCN處理的組(n＝8)?？v坐標(biāo)上的數(shù)值表示頸總動脈橫切面內(nèi)膜與中層的面積比。在圖4中，*和**分別表示顯著性水平(p)不超過0.05％和0.005％。它證實了calponin組內(nèi)膜增生的程度顯著小于對照組1和對照組2的程度。
因此，上面實驗的結(jié)果表明本發(fā)明的動脈硬化治療劑在PTCA后防止再狹窄上有效。7.人calponin基因?qū)胙鼙诘淖C實從用含人calponin cDNA的重組載體pCAGGS/hCN處理的calponin組的兔(n＝8)和用質(zhì)粒pCAGGS處理的對照組2的兔(n＝7)中取出的頸總動脈血管標(biāo)本用于進(jìn)行如下處理。
向在6.中取出的頸總動脈血管標(biāo)本中以所說標(biāo)本重量3倍的量加入磷酸鹽緩沖液(PBS)(8g/l NaCl，0.2g/l KCl，1.15g/1 Na2HPO4，0.2g/l KH2PO4)。剪切標(biāo)本并勻漿。以15,000rpm離心勻漿物3分鐘以產(chǎn)生上清。使用Sepa Gene(catalogNo.SG-0025，Sanko Junyaku Co.)從上清中提取DNA。用XhoI(Boehringer Mannheim Co.)處理DNA(10μg)并用酚和氯仿混合物提取。經(jīng)乙醇沉淀DNA后，所得的沉淀溶于20μl水中，根據(jù)260nm波長下的吸光率測定DNA濃度。
使用溶液中相當(dāng)于2μg DNA含量的DNA作為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。引物是下面2個合成的寡核苷酸，它含有人calponin cDNA5′和3′非翻譯區(qū)的堿基序列。對于PCR，使用含Ampli TaqTMDNA聚合酶的GeneAmpTMPCR試劑盒(catalog No.PJ5100，TAKARASHU20 CO.，LTD.)，在94℃變性條件下1分鐘，55℃的退火條件下2分鐘和72℃的合成條件下2分鐘。以1.2％瓊脂糖凝膠電泳證實對人calponin特異性的上面引物之間的DNA片段(1052bp)的擴(kuò)增。5′GAGTGTGCAGACGGAACTTCAGCC 3′(SEQ ID NO3；SEQ IDNO1中序列18-41的正義序列)。5′GGCTGGGCCTGGCTGGGTCCAGCC 3′(SEQ ID NO4；SEQ IDNO1中序列1046-1069的反義序列)。
結(jié)果如圖2所示。在圖2中，泳道1是不含DNA的陰性對照，泳道2是來自用質(zhì)粒pCAGGS處理的對照組2頸總動脈的DNA，泳道3是來自用含人calponin cDNA的重組載體pCAGGS/hCN處理的calponin組頸總動脈的DNA。在泳道3中檢測到了具有1052bp長度的DNA片段，但泳道2未檢測到。這些結(jié)果表明僅在calponin組中導(dǎo)入了人calponin cDNA基因。
工業(yè)適用性本發(fā)明的動脈硬化治療劑對抑制血管內(nèi)膜增生有用。因此，本發(fā)明的動脈硬化治療劑對抵抗動脈硬化和它引起的局部缺血性心臟病(如心絞痛和心肌梗死形成)有效，特別是它們在防止PTCA后的再狹窄中非常有效。
序列表(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度1522個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型mRNA的cDNA(iv)最初來源人(xi)序列描述SEQ ID NO1AACATGTGAG GAGGGAAGAG TGTGCAGACG GAACTTCAGC CGCTGCCTCT GTTCTCAGCG 60TCAGTGCCGC CACTGCCCCC GCCAGAGCCC ACCGGCCAGC ATG TCC TCT GCT CAC115Met Ser Ser Ala His5TTC AAC CGA GGC CCT GCC TAC GGG CTG TCA GCC GAG GTT AAG AAC AAG163Phe Asn Arg Gly Pro Ala Tyr Gly Leu Ser Ala Glu Val Lys Asn Lys10 15 20CTG GCC CAG AAG TAT GAC CAC CAG CGG GAG CAG GAG CTG AGA GAG TGG211Leu Ala Gln Lys Tyr Asp His Gln Arg Glu Gln Glu Leu Arg Glu Trp25 30 35ATC GAG GGG GTG ACA GGC CGT CGC ATC GGC AAC AAC TTC ATG GAC GGC259Ile Glu Gly Val Thr Gly Arg Arg Ile Gly Asn Asn Phe Met Asp Gly40 45 50CTC AAA GAT GGC ATC ATT CTT TGC GAA TTC ATC AAT AAG CTG CAG CCA307Leu Lys Asp Gly Ile Ile Leu Cys Glu Phe Ile Asn Lys Leu Gln Pro55 60 65GGC TCC GTG AAG AAG ATC AAT GAG TCA ACC CAA AAT TGG CAC CAG CTG355Gly Ser Val Lys Lys Ile Asn Glu Ser Thr Gln Asn Trp His Gln Leu70 75 80 85GAG AAC ATC GGC AAC TTC ATC AAG GCC ATC ACC AAG TAT GGG GTG AAG403Glu Asn Ile Gly Asn Phe Ile Lys Ala Ile Thr Lys Tyr Gly Val Lys90 95 100CCC CAC GAC ATT TTT GAG GCC AAC GAC CTG TTT GAG AAC ACC AAC CAT451Pro His Asp Ile Phe Glu Ala Asn Asp Leu Phe Glu Asn Thr Asn His105 110 115ACA CAG GTG CAG TCC ACC CTC CTG GCT TTG GCC AGC ATG GCG AAG ACG499Thr Gln Val Gln Ser Thr Leu Leu Ala Leu Ala Ser Met Ala Lys Thr120 125 130AAA GGA AAC AAG GTG AAC GTG GGA GTG AAG TAC GCA GAG AAG CAG GAG547Lys Gly Asn Lys Val Asn Val Gly Val Lys Tyr Ala Glu Lys Gln Glu135 140 145CGG AAA TTC GAG CCG GGG AAG CTA AGA GAA GGG CGG AAC ATC ATT GGG595Arg Lys Phe Glu Pro Gly Lys Leu Arg Glu Gly Arg Asn Ile Ile Gly150 155 160 165CTG CAG ATG GGC ACC AAC AAG TTT GCC AGC CAG CAG GGC ATG ACG GCC643Leu Gln Met Gly Thr Asn Lys Phe Ala Ser Gln Gln Gly Met Thr Ala170 175 180TAT GGC ACC CGG CGC CAC CTC TAC GAC CCC AAG CTG GGC ACA GAC CAG691Tyr Gly Thr Arg Arg His Leu Tyr Asp Pro Lys Leu Gly Thr Asp Gln185 190 195CCT CTG GAC CAG GCG ACC ATC AGC CTG CAG ATG GGC ACC AAC AAA GGA739Pro Leu Asp Gln Ala Thr Ile Ser Leu Gln Met Gly Thr Asn Lys Gly200 205 210GCC AGC CAG GCT GGC ATG ACT GCG CCA GGG ACC AAG CGG CAG ATC TTC787Ala Ser Gln Ala Gly Met Thr Ala Pro Gly Thr Lys Arg Gln Ile Phe215 220 225GAG CCG GGG CTG GGC ATG GAG CAC TGC GAC ACG CTC AAT GTC AGC CTG835Glu Pro Gly Leu Gly Met Glu His Cys Asp Thr Leu Asn Val Ser Leu230 235 240 245CAG ATG GGC AGC AAC AAG GGC GCC TCG CAG CGG GGC ATG ACG GTG TAT883Gln Met Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ser Gln Arg Gly Met Thr Val Tyr250 255 260GGG CTG CCA CGC CAG GTC TAC GAC CCC AAG TAC TGT CTG ACT CCC GAG931Gly Leu Pro Arg Gln Val Tyr Asp Pro Lys Tyr Cys Leu Thr Pro Glu265 270 275TAC CCA GAG CTG GGT GAG CCC GCC CAC AAC CAC CAC GCA CAC AAC TAC979Tyr Pro Glu Leu Gly Glu Pro Ala His Asn His His Ala His Asn Tyr280 285 290TAC AAT TCC GCC TAGGGCCACA AGGCCTTCCC TGTTTTCCCC CCAAGGGAGG 1031Tyr Asn Ser Ala295CTGCTGCTGC TCTTGGCTGG ACCCAGCCAG GCCCAGCCGA CCCCCTCTCC CTGCATGGCA 1091TCCTCCAGCC CCTGTAGAAC TCAACCTCTA CAGGGTTAGA GTTTGGAGAG AGCAGACTGG 1151CGGGGGGCCC ATTGGGGGGA AGGGGACCCT CCGCTCTGTA GTGCTACAGG GTCCAACATA 1211GAGCCGGGTG TCCCCAACAG CGCCCAAAGG ACGCACTGAG CAACGCTATT CCAGCTGTCC 1271CCCCACTCCC TCACAAGTGG GTACCCCCAG GACCAGAAGC TCCCCCAGCA AAGCCCCCAG 1331AGCCCAGGCT CGGCCTGCCC CCACCCCATT CCCGCAGTGG GAGCAAACTG CATGCCCAGA 1391GACCCAGCGG ACACACGCGG TTTGGTTTGC AGCGACTGGC ATACTATGTG GATGTGACAG 1451TGGCGTTTGT AATGAGAGCA CTTTCTTTTT TTTCTATTTC ACTGGAGCAC AATAAATGGC 1511TGTAAAATCT C 1522(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度297氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ser Ser Ala His Phe Asn Arg Gly Pro Ala Tyr Gly Leu Ser5 10 15Ala Glu Val Lys Asn Lys Leu Ala Gln Lys Tyr Asp His Gln Arg20 25 30Glu Gln Glu Leu Arg Glu Trp Ile Glu Gly Val Thr Gly Arg Arg35 40 45Ile Gly Asn Asn Phe Met Asp Gly Leu Lys Asp Gly Ile Ile Leu50 55 60Cys Glu Phe Ile Asn Lys Leu Gln Pro Gly Ser Val Lys Lys Ile65 70 75Asn Glu Ser Thr Gln Asn Trp His Gln Leu Glu Asn Ile Gly Asn80 85 90Phe Ile Lys Ala Ile Thr Lys Tyr Gly Val Lys Pro His Asp Ile95 100 105Phe Glu Ala Asn Asp Leu Phe Glu Asn Thr Asn His Thr Gln Val110 115 120Gln Ser Thr Leu Leu Ala Leu Ala Ser Met Ala Lys Thr Lys Gly125 130 135Asn Lys Val Asn Val Gly Val Lys Tyr Ala Glu Lys Gln Glu Arg140 145 150Lys Phe Glu Pro Gly Lys Leu Arg Glu Gly Arg Asn Ile Ile Gly155 160 165Leu Gln Met Gly Thr Asn Lys Phe Ala Ser Gln Gln Gly Met Thr170 175 180Ala Tyr Gly Thr Arg Arg His Leu Tyr Asp Pro Lys Leu Gly Thr185 190 195Asp Gln Pro Leu Asp Gln Ala Thr Ile Ser Leu Gln Met Gly Thr200 205 210Asn Lys Gly Ala Ser Gln Ala Gly Met Thr Ala Pro Gly Thr Lys215 220 225Arg Gln Ile Phe Glu Pro Gly Leu Gly Met Glu His Cys Asp Thr230 235 240Leu Asn Val Ser Leu Gln Met Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ser Gln245 250 255Arg Gly Met Thr Val Tyr Gly Leu Pro Arg Gln Val Tyr Asp Pro260 265 270Lys Tyr Cys Leu Thr Pro Glu Tyr Pro Glu Leu Gly Glu Pro Ala275 280 285His Asn His His Ala His Asn Tyr Tyr Asn Ser Ala290 295(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型其它核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO3GAGTGTGCAG ACGGAACTTC AGCC(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GGCTGGGCCT GGCTGGGTCC AGCC
權(quán)利要求
1.一種用于動脈硬化的治療劑，包含作為活性成份的calponin基因。
2.權(quán)利要求1的動脈硬化治療劑，其中所說的calponin基因含有編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的堿基序列。
3.權(quán)利要求1的動脈硬化治療劑，其中所說的calponin基因含有SEQ ID NO1的堿基序列。
4.權(quán)利要求1-3中任意一項的動脈硬化治療劑，其中所說的calponin基因包裝于合成的或天然存在的膜中。
5.權(quán)利要求4的動脈硬化治療劑，其中所說的calponin基因包裝于脂質(zhì)體中。
6.權(quán)利要求1-3中任意一項的動脈硬化治療劑，其中所說的calponin基因包含在能在平滑肌細(xì)胞中表達(dá)calponin基因的重組載體中。
7.權(quán)利要求6的動脈硬化治療劑，其中所說的重組載體含有一個啟動子。
8.權(quán)利要求7的動脈硬化治療劑，其中所說的啟動子是β-肌動蛋白啟動子。
9.權(quán)利要求8的動脈硬化治療劑，其中所說的重組載體是大小大約為6.5kb的重組載體pCAGGS/hCN它含有巨細(xì)胞病毒增強子，雞β-肌動蛋白啟動子，兔β-球蛋白3′剪接信號，兔β-球蛋白3′側(cè)翼區(qū)，SV40復(fù)制起點和人calponin cDNA，并用下面的限制性圖譜代表
10.權(quán)利要求6-9任意一項的動脈硬化治療劑，其中所說的含calponin基因的重組載體包裝于合成的或天然存在的膜中。
11.權(quán)利要求10的動脈硬化治療劑，其中所說的含calponin基因的重組載體包裝于脂質(zhì)體中。
12.一種含有calponin基因并能在平滑肌細(xì)胞中表達(dá)calponin基因的重組載體。
13.權(quán)利要求12的重組載體，其中所說的calponin基因含有編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的堿基序列。
14.權(quán)利要求13的重組載體，其中所說的calponin基因含SEQ ID NO1的堿基序列。
15.權(quán)利要求12-14中任意一項的重組載體，它含有一個啟動子。
16.權(quán)利要求15的重組載體，其中所說的啟動子是β-肌動蛋白啟動子。
17.權(quán)利要求16的重組載體，它是大小大約為6.5kb的重組載體pCAGGS/hCN，含有巨細(xì)胞病毒增強子，雞β-肌動蛋白啟動子，兔β-球蛋白3′剪接信號，兔β-球蛋白3′-側(cè)翼區(qū)，SV40復(fù)制起點和人calponin cDNA并由下面限制性圖譜代表。
18.一種藥物組合物，包含作為活性成份的calponin基因和一種藥用載體。
19.權(quán)利要求18的藥物組合物，它用于治療動脈硬化。
20.權(quán)利要求18的藥物組合物，它用于治療局部缺血性心臟病。
21.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中所說的局部缺血性心臟病是心絞痛。
21.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中所說的局部缺血性心臟病是心肌梗死形成。
22.一種治療動脈硬化的方法，包含給病人施用治療有效量的calponin基因的步驟。
23.一種治療局部缺血性心臟病的方法，包含給病人施用治療有效量的calponin基因的步驟。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所說的局部缺血性心臟病是心絞痛。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所說的局部缺血性心臟病是心肌梗死形成。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于動脈硬化的治療劑，它包含作為活性成分的calponin基因。本發(fā)明的動脈硬化治療劑對抑制血管內(nèi)膜增生有用。因此，本發(fā)明的動脈硬化治療劑對抵抗動脈硬化和它引起的局部缺血性心臟病，如心絞痛和心肌梗死形成有效，特別是它們在防止PTCA后再狹窄中非常有效。
文檔編號C12N15/09GK1136281SQ94194329
公開日1996年11月20日 申請日期1994年2月28日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月29日
發(fā)明者高橋克仁, 柴田宣彥 申請人:麒麟麥酒株式會社, 大阪府