專利名稱：古生物體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從如琥珀中重獲古微生物，以及分離和培養(yǎng)這些古微生物的方法。該發(fā)明首次揭示變成化石的微生物可以被重獲并培養(yǎng)顯示出生存能力。本發(fā)明的古微生物及其副產(chǎn)品的多種用途進行了展望，包括它們在農(nóng)業(yè)、工業(yè)加工、生物補救、診斷及疾病治療中的應用。
背景技術：
琥珀是一種天然、非晶的聚合玻璃，是植物變成化石的樹脂，具有與其它合成的聚合玻璃共同的機械、絕緣及熱特點，Poinar，G.O.，Lifein Amber，Stanford University Press，Stanford，CA(1992)。產(chǎn)生出琥珀的植物樹脂包含萜類化合物、酸、醇及香料油的復合混合物。隨樹脂的年代增加，樹脂變得更硬并形成一種叫硬樹脂的半化石產(chǎn)物。近代變成化石的樹脂認為是硬樹脂(少于400萬年)，而更長時間的通常稱為琥珀。琥珀和硬樹脂可通過研究其物理特征得以較好區(qū)分，如熔點、硬度、溶解度等。
已知最古老的琥珀是從古生代的石炭紀(360～286百萬年)重新獲得的。多數(shù)研究較多的琥珀來自中生代的白堊紀(65～144百萬年前)和新生代的第三紀(2～65百萬年前)。關于琥珀的廣泛討論及其特性，見Poinar(前述)。
琥珀好像具有非凡的保存生物材料，包括細胞器的能力。例如，本世紀初科學家們已觀察到琥珀包涵體中的保存組織，見Poinar，前述266～271。特別地，在波羅地海琥珀中變成化石的四千萬年的蒼蠅中還觀察到保存完好的細胞和細胞成分，包括線粒體和染色質(zhì)，Poinar andHess，Science 2151241-1242(1982)。
最近，科學家們開始評價琥珀能不能保存完整的古代遺傳物質(zhì)。如80年代中期，科學家們試圖重獲能生存的古生物材料，特別是廣泛的古資源中的古代DNA。早期提取古代DNA的實驗是用下述材料進行的古董的外皮，Higuchi et al.，Nature 312282-284(1984)，Thoms et al.，J.Mol.Evol.31101-112(1990)成為木乃伊的組織，Paabo，Nature 314644-645(1985)and Lawlor et al.，Nature 349785-788(1991)，骨骼，Hagelberg et al.，Nature342485(1989)；Hagelberg et al.，Nature Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.333399-407(1991)；Hanni et al.，Acad.Sci.Paris Ser.ii.310365-370(1990)；Hagelberg and Clegg，Proc.R.Soc.Lond.B.24445-50(1991)；Horai et al.，Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.333409-417(1991)；Hummel and Herrman，Naturwissenschaften 78266-267(1991)，植物化石，Golenberg，Nature 344656-658(1990)，冷凍的毛茸茸的猛犸，Higuchi and Wilson，F(xiàn)ederationProc.431557(1984)；Cherfas，Science 2531354-1356(1991)，以及古代種子，Rogers and Bendich，Plant Mol.Biol.569-76(1985)，Rollo et al.，Nature 335774(1988)。然而，這些重復的從埋葬在琥珀中的化石材料中分離能存活的古代DNA嘗試遭到失敗。
首例從琥珀化石中成功分離古代DNA的報道產(chǎn)生于1992年，該DNA片段是從滅絕的蜜蜂Proplebeia dominicana中分離的，它保存于25-40百萬年的多米尼加琥珀中，Cano et al.，Med.Sci.Res.20249-251 and 619-622(1992)。保存在古代黎巴嫩琥珀中的120-135百萬年象鼻蟲的DNA最近被PCR擴增和測序，Cano et al.，Nature363536-538(1993)。這些報道表明琥珀能夠在一定程度上保存古代遺傳信息。
然而，盡管從琥珀及其它古代材料中成功回收古代DNA的報道，在科學界中存在大量的懷疑態(tài)度，即這些研究中測序的遺傳物質(zhì)是真正古代的還是歸于現(xiàn)代的污染。(見Aneiewt DNA，Springer-Verlag at10，62-64，158-160，221-222)。其它科學家辨論指出由于DNA分子的遺傳不穩(wěn)定性，琥珀不可能完整地保持存活DNA上百萬年。Lindhal，Nature362709-715(1993)。
盡管從不同來源，包括琥珀，提取古代DNA進行了大量工作，但重獲保存在琥珀或相似的天然存在的樹脂材料中的古代細菌及其它古生物材料的工作則進行得極少。這項工作的意義又被無說服力的結果而妨礙。例如，雖然細菌桿狀體、真菌孢子體(Micrococcus electroni，Bacilluselectroni，Longibacillus electroni及Spirillum electroni)以及花粉在溶解早至1929年的琥珀于松節(jié)油中時觀察到，Blunck，G.，Bacterienn-eischlusse imm Berstein，Centraalblatt fur Mineralogie，Geologieand Palaontoligie(ABt，B，nomII 554-5)(1929)，引自Poiner，G.O.，Life in Amber at 350，Stanford University Press，Stanford，CA(1992)，這些生物體歸于現(xiàn)代的實驗室污染。同前。
相似地，從古生代鹽中分離存活的細菌的報道(Dombrosky.H.J.，Zentr.Bakteriol.Parasitenk.Abt.I.17883-90(1960)；Dombrosky.H.J.，Zentr.Bakteriol.Parasitenk.Abt.1，183173-179(1961))也是歸于現(xiàn)代的細菌污染，因為圈閉在這種土壤沉積的古微生物群很可能通過地面水的滲入被年代較近的微生物污染。1983年在墨西哥琥珀中發(fā)現(xiàn)保存的完整細菌細胞，Poinar，同上。然而，無論是細胞的年齡還是真實性均未證實，并懷疑被現(xiàn)代細菌污染。因而每次從琥珀中回收存活細菌的嘗試結果都無說服力。
在最近80年中，已經(jīng)出現(xiàn)了對微生物及其副產(chǎn)品的集中商業(yè)開發(fā)，用于醫(yī)學、工業(yè)、農(nóng)業(yè)及生物補救。在此引入Harvey，ed.，Drugs FromNatural Products；Pharmaceuticals and Agrochemicals，EllisHorwood Ltd.，England(1993)作為參考。例如在1928年的通過從點青霉生產(chǎn)青霉素的工作，觸發(fā)了對抗生素的大規(guī)?？茖W開發(fā)。同樣，在二十世紀四十年代隨著使用厭氧菌醋酪酸梭狀芽胞桿菌產(chǎn)生丙酮，微生物處理的工業(yè)應用的強烈增加了，Demain and Solomon，“Industrialmicrobiology and the advent of genetic engineering”，ScientificAmerican at pp.3-11，W.H.Freeman and Co.San.Francisco(1981)。目前相對少的微生物種類被開發(fā)用于抗菌化合物的生產(chǎn)及其它用于醫(yī)療或工業(yè)處理的微生物副產(chǎn)品。例如，只有三組微生物(絲狀真菌，非絲狀細菌和絲狀細菌，或放線菌)用于生產(chǎn)大部分抗菌化合物和工業(yè)微生物副產(chǎn)品。
微生物除能產(chǎn)生抗菌化合物外，還產(chǎn)生多種代謝已用于其它的藥學用途，包括(但不限于)心血管及抗炎藥，免疫調(diào)節(jié)劑，抗腫瘤化合物，中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑及酶抑制劑。見如Harwood，C.R.，BiotechnologyHandbooksBacillus at 294 et seq.，Plenum Press，New York(1989)。微生物代謝物還可用作合成化學和合理藥物設計的臺架分子，并廣泛用作疫苗生產(chǎn)的基礎。見Horrey，ed.，Drugs，F(xiàn)ron NaturalProducts；Pharmaceuticals and Agrochemicals，Ellis Horwood Ltd.，England(1993)。
微生物及微生物副產(chǎn)品中也用于多種工業(yè)加工，如酶和維生素的生產(chǎn)和發(fā)酵。例如枯草桿菌產(chǎn)生多種熱穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶，被廣泛用于洗滌劑，同前。不同種真菌，包括酵母菌屬、曲霉菌屬和念珠菌屬被用于生產(chǎn)啤酒、果酒、米酒及其它食物，還有多種維生素。微生物副產(chǎn)品還用于化妝品、生物聚合物、表面活性劑、嘌呤核苷和酚殺菌劑。同前。
最近，由于對環(huán)境污染的關注增加，微生物及其副產(chǎn)品用于生物殺蟲劑和生物補救。例如球果桿菌和蘇云金桿菌商業(yè)用作生物殺蟲劑以抵御多種植物及昆蟲害蟲。見Harwood at 309，同上。類似地，多種芽孢桿菌常規(guī)用于對有毒污染物的環(huán)境清除，同上，at 313；Debabov，“The Industrial Use of Bacilci”in the Molecular Biologyof The Bacilli，Vol.1(D.A.Dubnau，ed.)，Academic Press，NewYork(1982)at 331-370，在此引入作為參考。
此外，微生物及其副產(chǎn)品越來越多地用于診斷化驗。如枯草桿菌用于檢測鏈霉素、青霉素和新生霉素的化驗。見ATCC Catalog at 34(1994)引用J.Bact.45408-409(1943)，J.Bact.49411(1945)，Appl.Microbiol.4307-310(1956)。
動物和人類健康、農(nóng)業(yè)、工業(yè)及環(huán)境變化過程的形式改變需要尋找醫(yī)藥、診斷和工業(yè)應用的微生物副產(chǎn)品的新來源。例如，許多病原微生物對來自現(xiàn)代微生物的抗生素產(chǎn)生抗性Cooksey，R.C.，“Mechanismsof resistance to antimicrobial agents”，Manual of ClinicalMicrobiology at 1099，5th.Ed.，Am.Soc.for Microbilolgy(1991)。相似地，許多廣泛使用的農(nóng)業(yè)化肥已顯示對植物群和動物群有毒并引起水資源污染。對傳統(tǒng)抗菌化合物的不斷增長的抗性、現(xiàn)代工業(yè)加工產(chǎn)生的新需求、開發(fā)化學殺蟲劑和除草劑替代品的需要以及消除環(huán)境污染的需要為使用新微生物及其副產(chǎn)品創(chuàng)造了機會。對目前已知微生物副產(chǎn)品鑒定及存在的用途，理解性地歸納于Biotechnology，vol 1-8，H.J.Rehm and G.Reed，editors，Verlag Chemie(1986)，在此引入作為參考。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及從能保存生物材料和生物體數(shù)百萬年的原始材料中，重新獲得古生物體和生物材料。本發(fā)明特別涉及從琥珀和類似的天然存在樹脂中分離古微生物。這些古微生物包括但不限于細菌、真菌、原生動物、病毒和小藻類。此外，本發(fā)明指從琥珀和類似天然存在樹脂中重新獲得古微生物及生物物質(zhì)，包括花粉、植物、不同種節(jié)肢動物和線蟲。
本發(fā)明是基于特別令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即古微生物株在琥珀中變成化石大約25,000,000年后，能被重新獲得并復活到生存狀態(tài)。在本發(fā)明的一個特殊實例中(下面將全面描述)，在大約25-40百萬年前的多米尼加琥珀中變成化石的四種古無刺蜜蜂Proplebeia dominicana的腹腔組織中，分離到十幾株存活的古芽胞桿細菌。本發(fā)明用于重新獲得古芽胞桿菌的琥珀樣品經(jīng)嚴格設計鑒定，提取及無菌培養(yǎng)條件消除現(xiàn)代微生物污染的可能性，進行多種對照及模擬提取以證實提取物中得到的存活微生物的古年代。
為了證明琥珀即得到的生物體的古年代，從無刺琥珀蜜蜂的現(xiàn)代后裔的腹腔中分離的現(xiàn)代芽孢桿菌，通過分類學、生物化學和遺傳學分析與古芽胞桿菌分離物進行比較。古代和現(xiàn)代細菌分離物的16S rDNA部分用PCR擴增并測序。古代和現(xiàn)代芽胞桿菌的序列比較發(fā)現(xiàn)具有約93-95％的同源性。使用下面詳述的“分子鐘”分析，計算了幾種古分離物的核苷酸替代率?；谶@些計算，古生物體被確定大約5千萬年，與從之分離的多米尼加琥珀(25-40百萬年)的大至年齡一致。
結果由申請者分離并在此描述的芽胞桿菌無疑確實是重新獲得的古生物體，它們已保持休眠25-40百萬年了。
在本發(fā)明的另一特殊實例中，從年齡在250年至120百萬年的多種硬樹膠和琥珀中的許多種生物包涵體中分離到十多種不同的非芽胞桿菌古微生物。這些生物體包括(但不限于)放線菌、鏈霉鏈、青霉菌、酵母菌和假單胞菌。
這些古微生物依據(jù)其形態(tài)、生化和酶學分布類型描述，并期望具有一些農(nóng)業(yè)、工業(yè)、環(huán)境和醫(yī)藥用途，包括但不限于各種商業(yè)上有用的藥品、酶(如蛋白酶、淀粉酶等)及防腐劑，像生物殺蟲劑的生產(chǎn)和在工業(yè)加工上的應用。此外，某些古微生物分泌抗菌物質(zhì)，能抑制某些現(xiàn)代動物病原體如鏈球菌和葡萄球菌，以及某些農(nóng)業(yè)病原體如carotovara歐文氏菌，因此用于抗生素的生產(chǎn)。古微生物，尤其是古芽胞桿菌還能用作重組DNA載體的宿主。古微生物及其分泌的物質(zhì)也可用于環(huán)境清潔領域、開礦、診斷及食品生產(chǎn)。
相似地，古微生物及其副產(chǎn)品還具有工業(yè)上有用的應用。例如，現(xiàn)代微生物目前是工業(yè)上的重要制造者酵母菌株如釀酒酵母菌用于酒精飲料的釀造。這種酵母菌也能在土壤和沉積樣品中發(fā)現(xiàn)。總見Demainand Solomon，Biology of Industrial Microorganisms，Benjamin/CummingsPublishing Company，(1985)。現(xiàn)在微生物還能用作生物殺蟲劑，如園形芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌經(jīng)常發(fā)現(xiàn)與昆蟲有關。Mitscherlichand Martin，Microbial Survival in the Environment，Springer-Verlag(1984)。這些信息對鑒定琥珀或樹脂中生物材料的來源是有用的，從琥珀或樹脂中可能得到的具有潛在商業(yè)應用的古微生物。然而，由于這些古微生物在遺傳學上不同于它們的現(xiàn)代相似物，因此人們期望古微生物能產(chǎn)生具有潛在新化學結構的不同副產(chǎn)品。
附圖簡述

圖1，從具有25-40百萬年的琥珀中變成化石的古代無刺蜜蜂腹部組織中提取的樣品照片。
發(fā)明詳述古代微生物保藏多樣性可以從琥珀及相關的天然存在樹脂重新獲得的生物體包括但不限于細菌、真菌、原生動物、病毒、小藻類、花粉、植物(苔蘚和地衣，蕨和較高等植物)、不同種節(jié)肢動物和線蟲。本發(fā)明一方面涉及分離古微生物如細菌，特別是內(nèi)生孢子形成細菌，包括但不限于芽胞桿菌屬。
本發(fā)明的其它方面涉及分離古微生物，如細菌和真菌，包括但不限于放線菌屬、鏈霉菌屬、酵母菌屬、曲霉菌屬、青霉菌屬、細球菌屬、分節(jié)孢子桿菌屬、棒狀桿菌屬和假單胞菌屬。本發(fā)明其它方面涉及分離古微生物，包括但不限于生物體如細菌和真菌，它們能在極端條件下生長，包括但不限于pH和溫度的極端范圍。古微生物來源古生物體和生物材料可從不同地理位置、年齡從大約50年到120百萬年的琥珀和相關的天然存在樹脂中重新獲得。生物體不僅可以從樹脂基質(zhì)本身重新獲得，還可從多種埋在樹脂中的包涵體，包括植物孢子、微生物孢子、土壤樣品、水和氣泡、微生物、真菌、原生動物、昆蟲巢、昆蟲排泄物、昆蟲、植物材料如葉、枝條、樹皮、根、花、草、蕨、豆、種子莢、花粉、線蟲、節(jié)肢動物和貝殼。
真正的琥珀或類似的天然存在樹脂可在世界的多個區(qū)域發(fā)現(xiàn)，包括緬甸、多米尼加共和國、波羅地海區(qū)域、加拿大、中國、哥倫比亞、蘇門答臘、Chiapas、呂宋島、羅馬尼亞、西西里島、阿拉斯加的北極海岸、美國東北部、Manitoba的雪松湖區(qū)、法國北部、黎巴嫩、以色列、約旦和東泰米兒(蘇聯(lián)的北極)。證實重獲的古生物或生物材料的來源確實可靠是重要的。除了認真追蹤和證實一種樹脂樣品的來源，樣品的年代假如可能的話可通過檢測發(fā)現(xiàn)化石所在地層來間接確定。變成化石的樹脂保存地周圍的化石年代，為變成化石的樹脂年代提供建議。如在一個特殊的地質(zhì)時期，某些形成殼的原生動物豐富，如果這種原生動物的化石與琥珀一同發(fā)現(xiàn)，則可以假定該琥珀在那個地質(zhì)時期形成。其它鑒定、描繪和直接確定樣品年代的方法包括X-射線衍射、核磁共振光譜、高溫裂解氣相色譜和紅外光譜(總見Poinar，同前)。
涉及現(xiàn)代生物體已知產(chǎn)地的信息可用來鑒定直接應用古生物體的可能來源。
例如，不同微生物和昆蟲之間當今關系的知識可以為鑒定重獲古微生物的來源作指導。例如，蜜蜂和不同生物體好像利用共生微生物來保護它們自己免受病原體侵襲以及加工和保存食物。因而，基于目前對這些蜜蜂的共生微生物的知識，人們可以推斷蜜蜂的祖先也用微生物共生來抵抗古蜜蜂病原體，并加工和保存食物。更特別地，熱帶無刺蜜蜂Melipnoa fasciata好像用孢子形成細菌在它們的巢中保存食物。從M.fasciate巢中貯存的食物里已分離出各種芽胞桿菌生物體，包括巨大芽胞桿菌、環(huán)狀芽胞桿菌和蜂房芽孢桿菌，Gilliam et al.，Apidologie 2189-97(1990)?；谶@些細菌的生化性質(zhì)，作者認為那些細菌被蜜蜂用來保存和加工食物。已經(jīng)報道了細菌和蜜蜂之間聯(lián)系的其它實例。如短桿菌、巨大芽胞桿菌、凝固芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌和枯草桿菌已經(jīng)從蜜蜂Apis mellifera的不同器官分離到，Gilliam et al.，J.Invert.Pathol.31389-391(1978)?？莶輻U菌和蠟樣芽胞桿菌也已從唯一的蜜蜂Crawfordapsis Luctuosa中分離到，Gilliam et al.，Apideologie2199-105(1990)。
除了細菌，酵母似乎在加工蜜蜂收集的花粉中起作用，Gilliam etal.，Apidiologie 1053-53(1979)。一些從蜜蜂或蜂巢分離的細菌(如枯草桿菌)產(chǎn)生抗生素如枯草霉菌素，Besson et al.，J.Sntibiotics 291043-1049(1976)。因此，推測這種共生菌幫助蜜蜂保護自己不受病原體的侵襲，Gilliam et al.，Apidiologie 2199-105(1990)。在古蜜蜂里的古共生微生物可能扮演物相似的角色，好像這種微生物祖先產(chǎn)生某些物質(zhì)，即使給予十分不同的古代存在的環(huán)境條件如溫度、氣體濃度和病原體群，也無準確的現(xiàn)代等同物存在。
相似地，產(chǎn)生抗生素的微生物如放線菌、鏈霉菌、青霉菌和頭孢霉菌通常在土壤聚集處發(fā)現(xiàn)或與植物材料有關。同樣，作為工業(yè)酶已知的生產(chǎn)者-微生物，如枯草桿菌，也在土壤聚集處發(fā)現(xiàn)。酵母菌株如用于酒精飲料釀造的釀酒酵母菌也在土壤和沉積樣品中發(fā)現(xiàn)。總見Demainand Solomon，Biology of Industrial Microorganisms，Benjamin/CummingsPublishing Company，(1985)。目前用作生物殺蟲劑的微生物如園形芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌常常發(fā)現(xiàn)與昆蟲有關。Mitscherlich andMartin，Microbial Survival in the Environment，Springer-Verlag(1984)。再者，因為古微生物與它們現(xiàn)代的相似物遺傳學上不同，人們期望古微生物能產(chǎn)生具有潛在新化學結構的不同副產(chǎn)品。分離和培養(yǎng)古微生物的方法直接從琥珀、一種相似的天然存在樹脂或在這種琥珀或樹脂中形成化石的有機體中分離微生物、生物體及其它生物材料的各種方法可用于實踐本發(fā)明的一個方面，只要有適當?shù)目刂坪臀廴颈Ｗo措施。這種保護措施必須包括含有變成化石的生物材料或生物體的樹脂樣品的外表面進行消毒。
在本發(fā)明的優(yōu)選實例中，一種琥珀樣品的外表面如下消毒琥珀樣品被(1)在一個確定皮重的稱量船形皿中稱重；(2)真空下浸于2％戊二醛緩沖液中，35℃ 12小時；(3)用無菌雙蒸水(SDDW)洗3次，然后將潤洗水在胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)(BBL，Cockeysville，MD)上培養(yǎng)以判斷消毒過程的有效程度；(4)再浸入10％漂白劑中37℃6小時；(5)用SDDW洗3次，然后將潤洗水培養(yǎng)于TSA上以判斷消毒過程的有效程度；(6)浸入70％乙醇，35℃2小時，及(7)暴露于火焰以蒸發(fā)乙醇。這種表面消毒的琥珀，取樣培養(yǎng)在胰蛋白酶大豆培養(yǎng)基(TSB)中，以評價消毒過程。
其它消毒和/或去污染琥珀和/或其它天然存在樹脂樣品的方法，包括原生質(zhì)浸蝕，超聲、固定、溶劑、氣體熏蒸，應用殺孢子劑和從樣品中去掉樹脂的外層。
化石材料樣品然后用無菌裝置，無菌技術并在無菌條件下提取。例如，琥珀可在液氮冷凍后粉碎，以暴露埋葬化石的特有組織。此外，有或沒有可見生物材料、礦石或生物體化石的樣品表面去污染后可在無菌條件下碾和/或研磨成粉末或半粉末材料。樣品可用任一種方法研成粉末或半粉末，包括使用無菌砂、研缽或碾槌。較少破壞和較有針對性的分離方法可以提供樣品保存和部分化石或其它包涵物移去以獲得古微生物后的對照物的雙重優(yōu)點。這些方法可以包括，如使用能從化石或其它包涵物提取非常少的樣品且不損壞整個樣本的空洞微鉆器。這些方法還可包括使用冷凍樹脂樣品的技術，導向激光，用無菌砂子將樣品研成粉末，加熱，用無菌粉碎壓縮及化學處理。干燥化石的水合作用可能便于樣品提取。
提取的樣品然后可在不同條件下置于目前用于繁殖微生物的各種類型培養(yǎng)基中，以便在密封的無污染環(huán)境中獲得存活的古微生物培養(yǎng)物。
借助于改變使古微生物產(chǎn)生存活培養(yǎng)物的條件，來針對分離一種特殊類型的微生物。例如，人們可以通過調(diào)節(jié)生長溫度至極限值，來培養(yǎng)能在非常條件下生長的微生物，而淘汰其它不能在這種條件下存活的微生物。也出于選擇的目的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分。除了在此描述的方法，其它在此沒有詳細描述的消毒方法和生長條件對那些本領域的技術人員是顯易的，也可周來維持適當?shù)奈廴痉雷o，以及分離和繁殖古微生物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，通過粉碎這些樹脂樣品(“粉碎提取方法”)從消毒琥珀或相似的天然存在樹脂樣品中提取古微生物，然后培養(yǎng)提取的微生物。特別地，可遵循下列方法1.如上所述消毒樹脂樣品。
2.在安全柜中，將表面消毒的樣品放入無菌研缽并用液氮淹沒。
3.用無菌研槌壓碎和研磨過分冷凍的琥珀，或通過將過分冷凍的琥珀經(jīng)無菌粉碎壓榨機粉碎。
4.將琥珀粉末等分到四個250ml含25ml下列無菌培養(yǎng)基的erlenneger三角瓶中(a)放線菌培養(yǎng)基(Difco)；(b)1％蛋白胨(2瓶)和(c)西紅柿汁瓊脂(Difco)。
5.將含1％蛋白胨的一個三角瓶于55℃，剩余三瓶于30℃在200RPM定軌搖床中保溫。
6.第一周每天，后四周每星期，從每瓶中取500μl樣品涂布下述培養(yǎng)基上(a)TSA；(b)馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)；(c)Czapek瓊脂(Difco)和0.4％酵母提取物；(d)平板計數(shù)瓊脂(Difco)和2％無菌脫脂牛奶(SMA)；(e)SMA pH8.1；及(f)淀粉瓊脂(Difco)。每個平皿置合適的溫度保溫(在55℃保溫的平皿要放入內(nèi)有濕潤無菌紙中或海綿的無菌密封口袋中)。
7.每天檢查平皿中存在的菌落。
8.挑出分開的菌落再分別在合適培養(yǎng)基上培養(yǎng)。冷凍(-80℃)平皿上每個克隆。進行革蘭氏染色以評價每個分離菌落的形態(tài)和革蘭氏染色特點。真菌和酵母菌在乳酚棉蘭制片培養(yǎng)基濕中檢查。
9.每平皿冷凍和冷凍干燥至少10個分離物。在這點上，應對每個分離物進行FAME(脂肪酸甲酯)分析以建立每個群體中遺傳差異的等級。
在此方法中，樣品可不用液氮研磨。
在第二種方法中，琥珀或類似的天然存在樹脂消毒后“爆裂”提取古微生物(“爆裂提取方法”)然后培養(yǎng)這些微生物。特別地，可用下列方法1、如上所述消毒琥珀或相似的天然存在樹脂。
2、在安全柜中，將帶有目的包涵物的消毒樣品放在無菌培養(yǎng)皿底部，并用液氮浸沒。使液氮完全蒸發(fā)。將幾滴熱無菌生理鹽水涂到超冷樣品的外部。
3、用無菌27號針，弄裂樣品碎片以暴露目的組織。
4、用無菌針頭收集組織并轉入二支含無菌1％胰蛋白胨培養(yǎng)基的1.5ml無菌微離心管中。
5、在80℃水浴熱休克一支管15分鐘，然后在一合適保溫箱或干浴鍋中將二管于30℃保溫。
6、第一周每天，后四周每星期從每管取一環(huán)于下列培養(yǎng)基上(a)TSA；(b)PDA；(c)Czapek瓊脂(Difco)含0.4％酵母提取物；(d)SMA；(e)SMA pH 8.1；及(f)淀粉瓊脂(Difco)。每皿于30℃保溫，每天檢查各皿的克隆存在。
7、取分開的菌落，在合適培養(yǎng)基上培養(yǎng)。冷凍(-80℃)平皿上的每個菌落。進行革蘭氏染色以評價每個分離菌落的形態(tài)和革蘭氏染色特點。真菌和酵母菌在乳酚棉花蘭鋪底的培養(yǎng)基濕座中檢查。
8、每皿冷凍和冷凍干燥至少10個分離菌落。在這點上，應對每個分離物進行FAME(脂肪酸甲酯)分析以建立每個群體中遺傳差異的等級。
在第三種實施方案中，通過鉆孔(“鉆孔提取法”)從消毒的琥珀或其它天然存在樹脂樣品中提取古微生物或生物材料，然后按下述方法培養(yǎng)1、如上所述消毒琥珀。
2、在安全柜中，將帶有目的的氣體、水或液體包涵物的琥珀片置無菌培養(yǎng)皿中一滴快速凝結膠上。等到膠變硬再進行(約5分鐘)。
3、用連在無菌鉆壓機的無菌0.5mm-1.0mm鈦鉆頭，在小心刺穿氣體、水或液泡的琥珀中鉆一個孔。
4、用一個連在Drummond微型移液管的無菌微型移液管吸頭從琥珀包涵物中收集氣體、水或液體。再將氣體、水或液體轉入盛有無菌1％胰蛋白胨培養(yǎng)基的1.5ml無菌微離心管中。
5、在合適保溫器或干燥浴鍋中將管在25-30℃保溫。
6、第一周每天，后四周每星期，從每管中取一環(huán)于下面的培養(yǎng)基上(a)TSA；(b)PDA；(c)Czapek瓊脂(Difco)含0.4％酵母提取物；(d)SMA；(e)SMA pH 8.1；和(f)淀粉瓊脂(Difco)。每皿在25-30℃保溫，并每天檢查皿中菌落的存在。
7、取分開的克隆并在合適培養(yǎng)基上培養(yǎng)。冷凍(-80℃)皿上每個克隆。進行革蘭氏染色以評價每個分離菌落的形態(tài)和革蘭氏染色特點。真菌和酵母菌在乳酚棉蘭制片培養(yǎng)基濕中檢查。
8、冷凍和冷凍干燥每皿至少10個分離菌落。在這一點上，應對每個分離物進行FAME(脂肪酸甲酯)分析以建立每個群體中遺傳差異的等級。
在第四種實施方案中，通過鉆孔(對生物體組織或昆蟲化石，并在蛋白胨培養(yǎng)基中水合干燥的組織)(“鉆孔提取法”)從消毒的變成化石的樹脂中提取古微生物或生物材料，然后根據(jù)下列方法培養(yǎng)1、如上所述消毒琥珀。
2、在安全柜中，將帶有目的包涵物的琥珀碎片置于無菌培養(yǎng)皿中一滴快速凝結膠上。等到膠變硬再進行(約5分鐘)。
3、用連在無菌鉆壓機上0.5mm-1.0mm的無菌鈦鉆頭，在小心刺穿包涵物的琥珀上打一孔。
4、用連在Drummond微型移液管上的無菌吸頭，用50μl無菌1％胰蛋白胨培養(yǎng)基的1.5ml微離心管中。
5、將管在合適的保溫器或干燥浴鍋中于25-30℃保溫。
6、第一周每天，后四周每星期從管中取一環(huán)于下面的培養(yǎng)基上(a)TSA；(b)PDA；(c)Czapek瓊脂(Difco)含0.4％酵母提取物；(d)SMA；(e)SMA pH 8.1；和(f)淀粉瓊脂(Difco)。每皿在25-30℃保溫。
7、取分開的菌落在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。冷凍(-80℃)平皿上每個菌落。進行革蘭氏染色以評價每個分離克隆的形態(tài)和革蘭氏染色特點。真菌和酵母菌在乳酚棉蘭制片培養(yǎng)基濕中培養(yǎng)。
8、每平皿冷凍或冷凍干燥每皿至少10個分離菌落。在這點上，應對每個分離物進行FAME(脂肪酸甲酯)分析以建立每個群體中遺傳差異的等級。
在這些方法中的任何一個，TSA的三個平皿可加蓋以檢查環(huán)境污染物。這些平皿在整個提取過程中敞開。在操作步驟的最后再蓋上培養(yǎng)皿蓋，平皿在35℃保溫二周。鑒定和表征古微生物鑒定和表征當今微生物的各種一般的和特殊的方法可用來鑒定和表征本發(fā)明的古微生物。在這點上，古微生物可進行形態(tài)學、生化、遺傳學和生物學的評價。例如，一種古細菌可以經(jīng)或不經(jīng)放大進行肉眼檢查，來評估各種形態(tài)特點。通常還評估染色親合性、內(nèi)生孢子特點，以及生長條件。生化特征，如那些典型地用于當今微生物分類，也可用來表征古微生物的特點。此外，還可測定古微生物廣范圍的各種當今微生物的特征酶的生產(chǎn)，以獲得現(xiàn)代及古代微生物之間的關系或區(qū)別。再者，可使用本領域熟知的技術檢測抗生素和/或其它生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)，不僅做為鑒定和表征該生物體的手段，而且為了鑒定該生物體產(chǎn)生的有用生物活性分子。
古生物體可進一步通過評價其遺傳信息來表征其特征。一種遺傳分析方法包含使用任何合適的DNA或RNA擴增技術來擴增古代核酸，如聚合酶鏈反應或連接酶鏈反應方法，使用從當今生物體基因序列設計的引物?？赡芘c當今微生物的基因相關的古微生物基因進行克隆及測序以評價基因相關性及進化趨異，并測定其編碼蛋白質(zhì)的結構。或者，用本領域已知的隨機引物擴增技術或序列獨立引物擴增技術分離古微生物的遺傳信息。此外，可用古微生物的培養(yǎng)物從序列分析中分離大量的基因組DNA。
在本發(fā)明的一個實施方案中，DNA從推斷的古微生物分離物提取到，并用合適的引物擴增一個16S rDNA基因片段。PCR擴增在50μl總體積中進行，使用1部位低DNA Taq聚合酶(AmpliTaq-LD DNAploymerase，Perkin Elmer，Nornalk，CT)，2μg/ml牛血清白蛋白組份V(Sigma，St.Louis，MO)，每種引物0.5μm，2.0mM MgCl2和0.2μm三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)。所有反應混合物及樣品稀釋液置冰浴中，當加熱器到80℃后，各管放入熱循環(huán)中。聚合酶鏈反應使用熱循環(huán)干浴，以適當?shù)牟襟E進行(最好用合適的模板DNA和引物)。PCR產(chǎn)物克隆到合適的克隆載體中，然后用標準方法測序。確定古微生物的年代用上述PCR擴增技術可確定古微生物的年代。測序后，序列可人工或借助排列軟件包進行排列，以評估序列?；谙惹皥蟮溃?6S rRNA基因的核苷酸替代速率r呈現(xiàn)出每年每個位置0.3-0.4×10-9替代，Ochman，H.& Wilson，A.C.J.Mol.Evol.2674-86(1987)；Moran，N.A.，Munson，M.A.，Baumann，P.，& Ishikawa，H.Proc.R.Soc.Lond.B.253167-171(1993)。兩個分類群之間的趨異時間(從中分離假定古微生物的琥珀的年代)通過將假定古生物體和其最近的尚存親屬之間替代的數(shù)目除以2r乘分析的核苷酸數(shù)目而確定。兩分類群間趨異時間應該大致與從中獲得分離物的琥珀的年代相同。用古微生物生產(chǎn)有用的蛋白質(zhì)古微生物可以產(chǎn)生酶生物和其它蛋白質(zhì)，它們雖然與現(xiàn)代微生物生產(chǎn)的蛋白質(zhì)相關，但在較高溫度、不同大氣條件和/或相對不同底物等情況下具有生物活性。例如，古蜜蜂用來加工和保存食物的古細菌在不同環(huán)境條件下旺盛生長，可能顯示使產(chǎn)生或許工業(yè)上有用的新代時物的生化途徑。因而，古微生物產(chǎn)生的祖先的酶可能具有獨特的及工業(yè)有用的生化特征，如在較高溫度或極端pH條件下最理想地發(fā)揮作用。
因而，本發(fā)明的一個實施方案涉及培養(yǎng)生產(chǎn)不同物質(zhì)的古微生物，包括但不限于具有工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和診斷用途的蛋白質(zhì)和酶。這些物質(zhì)可從培養(yǎng)物中直接分離，并優(yōu)選用目前用于分離純化當今微生物中相似物質(zhì)的各種技術進行純化?；蛘撸@些蛋白質(zhì)和酶可以進行化學合成或用重組DNA技術生產(chǎn)。
在本發(fā)明的一個特殊實施方案中，從琥珀中25-40百萬年的昆蟲化石分離的古芽胞桿菌細菌可用于生產(chǎn)各種有用的蛋白質(zhì)和酶，包括但不限于淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶和蛋白酶。此外，本發(fā)明的某種古芽胞桿菌可用來生產(chǎn)相對于其現(xiàn)代的后代具有可變、增強或宿主范圍明顯擴大特征的抗生素。一種古芽胞桿菌或其它微生物產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)的能力可用下面物描述的或其它已知并廣泛使用的生化和酶學試驗來測量，如Gordon et al.，The genus Bacillus USDA Handbook 427(1973)；API ZYM酶學特征試驗，下述。芽胞桿菌屬細菌產(chǎn)生的各種酶及其它產(chǎn)物的全面討論，其鑒定試驗、生產(chǎn)方法和各種工業(yè)和其它應用，見Harwood，C.R.，Biotechnology HandbooksBacillus，PlenumPress，New York(1989)，在此整個插入作為參考。
在本發(fā)明的一個實施方案中，一種命名為“BCA 5”的古芽胞桿菌，在其它化合物之間生產(chǎn)酸性磷酸酶，見表III。在本發(fā)明不同的實施方案中，古枯草桿菌樣生物體生產(chǎn)堿性磷酸酶，丁酸酯酶，辛酸酯酶和/或β-半乳糖苷酶(見實施例3)，一種古園形芽胞桿菌樣生物體生產(chǎn)辛酸酯酶和糜蛋白酶(見實施例3)，古蠟樣芽胞桿菌樣生物作生產(chǎn)堿性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶、亮氨酸氨肽酶、糜蛋白酶、酸性磷酸酶和β-glucoronidase，以及古短小芽胞桿菌樣生物體生產(chǎn)辛酸酯酶。
這些古代酶的當今相似物已廣泛商品化應用，包括用于確定蛋白酶和淀粉酶活性試驗，皮革軟化，防止啤酒中形成蛋白混濁，減少面粉的谷朊含量，以及作為家庭洗滌劑的內(nèi)容物。見如Harwood，C.R.，Biotechnology HandbooksBcaillus at 294 et seq.，Plnum Press，NewYork(1989)，在此插入作為參考。也見上面的討論。雖然古微生物生產(chǎn)的酶與它們當今相似物不等同，但現(xiàn)代微生物生產(chǎn)的酶的商業(yè)應用提示了在商業(yè)背景的大量用途中，古微生物生產(chǎn)的酶的應用。例如，下面物討論的一種枯草桿菌樣微生物形式生產(chǎn)一種有活性而且穩(wěn)定的堿生物性蛋白酶，見實施例3。來自古微生物的抗生素和抗菌劑古微生物可能已生產(chǎn)出有效抵抗各種古生物體的抗生素，這些古生物體再也不存在或在當今生物世界里較少流行或有效?，F(xiàn)代微生物的進化好像伴隨著某種特性的丟失，該特性使它們的祖先抵抗其古代微生物鄰居的抗菌作用。最終，一些微生物可能已進化到不能防御其祖先能夠容易抵抗的相同病原體，可能只因為很長一段時間內(nèi)這種古病原體流行減少。在這點上，抗菌物質(zhì)在古代一度對存活的是必需的，可能最后變得完全不必要或多余，因此時間和進化也許已致使現(xiàn)代微生物再也不產(chǎn)生這些活性物質(zhì)。因而，古微生物的抗生素可能對治療現(xiàn)代微生物感染非常有效，特別是那些由新出現(xiàn)和很快進化了抗生素抗性的病原株感染引起的。因此本發(fā)明給醫(yī)學提供了一個及時回顧并檢測那些千百萬年前生長在早已滅絕的各種生命形式之中微生物的抗菌性質(zhì)，這些微生物生活在一種與今天根本上和實質(zhì)不同的環(huán)境中。
因而，本發(fā)明的另一實施方案涉及用古微生物生產(chǎn)抗生素。更特別地，證明了某些申請者分離的并在下面物更全面描述的某些古芽胞桿菌和放線菌對人的微生物病原體有效的抗菌活性。雖然證明許多古芽胞桿菌和放線菌對不同菌株的抗菌活性，總體上枯草桿菌樣和地衣形芽胞桿菌樣古芽胞桿菌似乎產(chǎn)生最強的抗菌活性。命名為“BCA1”的一種古芽胞桿菌被鑒定為一種枯草桿菌樣細菌，能夠完全抑制金黃色釀膿葡萄球菌和釀膿鏈球菌的生長。另外，BCA1還能抑制雞瘟沙門氏菌、大腸桿菌、腫脹植物肥大病菌，Acinetobacter calcoaceticus，caratovora歐文氏菌、大麗紫輪枝孢菌和點青霉的生長。因而，BCA1產(chǎn)生一種非常有效的抗生素，它可望在治療由各種病原微生物引起的感染有用。古芽胞桿菌BCA12、BCA13和BCA15，所有鑒定為地衣形芽胞桿菌樣菌株的可能對產(chǎn)生來源于地衣形芽胞桿菌的當今的桿菌肽的分子祖先有用。
測定微生物的抗菌活性的方法已在本領域已知，并可很好地適用于本發(fā)明的古微生物。這些方法包括，如常規(guī)使用的交叉劃線方法，Colome et al.，Laboratory Exercises In Microbiology，WestEducational Publ.，St.Paul，MN(1986)，以及Chatterjee等，J.Antibiotics 45(6)832-838。Colome et al.，和Chatterjee et al.，的文獻在此一并插入作為參考。
其它有用的試劑，包括抗微生物、抗癌、抗炎、CNS、心血管和化療藥物也可由古微生物生產(chǎn)。Harvey，ed.，Drugs From NaturalProductsPharmaceuticals and Agrochemicals，Ellis Horwood Ltd.，England(1993)。古微生物的其它用途在本發(fā)明中的另一實施方案中，古微生物可用于昆蟲的生物防治。例如，某些芽胞桿菌目前用于防治昆蟲種群，如蘇云金芽胞桿菌和日本甲蟲芽胞桿菌，它們是今天使用的所有微生物控制劑中最成功的。此外，一些園形芽胞桿菌菌株好像對蚊幼蟲是致病的，最近田間試驗提示園形芽胞桿菌可能是一種有價值的化學殺蟲劑替代物。在此描述的兩種由申請者分離的古芽胞桿菌生物體，命名為“BCA Ex2”和“BCA16”，在各種形態(tài)學和生化特性的基礎上，確定為園形芽胞桿菌樣菌株。這些古代菌株對當今昆蟲可能是致病的，因此可能是有用的生物殺蟲劑。
古微生物特別是古芽胞桿菌，也可用做生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)的克隆和表達宿主。例如，枯草桿菌現(xiàn)在廣泛用于重組DNA技術，而且具有能很快分泌高水平重組產(chǎn)物的優(yōu)勢。相似地，古微生物特別是古芽胞桿菌，也可用做診斷試驗的試劑。例如，枯草桿菌廣泛用于檢測鏈霉素的診斷試驗。
本發(fā)明的古微生物也具有工業(yè)應用。如從多米尼加琥珀分離的一種酵母菌發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖和半乳糖，產(chǎn)生CO2(氣體)和乙醇(酒精)，并可用于發(fā)酵過程的任何一步。Demain and Solomor，Giology ofIndustrial Microorganisms，Benjamin/Cummings Publishing Company，1985)。古微生物還可用做生物殺蟲劑。園形芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌目前被用作生物殺蟲劑，推測它們的古代相似物具有相似的用途。Mitscherlich and Martin，Microbial Survival in the Environment，Springet-Verlag(1984)。
現(xiàn)代微生物代謝物也用作抗真菌化合物。例如，灰黃霉素，用于治療各種真菌疾病，是由青霉菌產(chǎn)生。硝吡咯霉素，是一種由假單胞菌不同種產(chǎn)生的局部抗真菌試劑，也顯示一些抗原生動物活性。擬素霉素也是一種局部抗真菌療法，是真菌Paecilomyces variottii的產(chǎn)物。Siccanin，用于治療皮膚的真菌疾病，來自一種裸麥草的寄生霉菌Helminthosporium siccans。見Biotechnology同上，Vol 4，248-486。
同樣，微生物產(chǎn)生的現(xiàn)代抗菌化合物也用作動物飼料添加劑，治療動物某些疾病，保護培養(yǎng)的植物免受細菌、真菌和病毒感染、寄生蟲病以及競爭的草，治療某些代謝失調(diào)物如糖尿病，子宮張力缺乏、偏頭痛、直立循環(huán)障礙、衰老、高血壓、血促性腺激素過高、肢端肥大癥和，帕金森氏病、癌癥、心血管疾病、血膽固醇過高、動脈硬化和冠狀疾病。見Biotechnology，Vol 4 at 510-620，同前。已知微生物也產(chǎn)生多種維生素和輔酶(見Biotechnology，vol 4，at 115-159，同前)，還能從外界環(huán)境積累重金屬和放射性核素(見Biotechnology，volume 66，at 402-403，同前)。相似地，微生物濾取金屬的能力用于采礦和冶金工業(yè)。這些當今生物體副產(chǎn)品的已知用途提供了其相應古代祖先的副產(chǎn)品可相似使用的證據(jù)。
已經(jīng)描述了本發(fā)明，下列實施例用以說明而非限制來解釋有關本題的發(fā)明。
實施例實施例1古芽胞桿菌生物體的分離和表征樣品來源用于提取化石組織的是結構完整的多米尼亞琥珀標本，它含有變成化石的無刺蜜蜂Problebeia dominicana，年代為25-40百萬年。這些樣品被嚴格鑒定，打開琥珀標本和提取化石組織的所有條件均為無菌，以消除被現(xiàn)代微生物污染的可能性。提取過程的所有步驟在一種IIa型層流罩中進行。此外，進行各種對照和模擬提取以證實從提取物中得到的存活微生物的古代狀態(tài)。
琥珀消毒和研磨程序 琥珀標本經(jīng)浸泡于2％戊二醛溶液并用無菌去離子水(SDW)洗3遍進行表面消毒。洗過的碎片然后泡在2％漂白溶液中5分鐘，用SDW洗2次。琥珀泡在70％乙醇中30分鐘并用火焰燒以完成消毒過程。滅菌的標本然后如下用液氮研磨。將琥珀標本置于無菌玻璃培養(yǎng)皿中并用液氮覆蓋，然后讓液氮蒸發(fā)。熱的無菌生理鹽水滴在琥珀碎片上，使琥珀沿平面裂開，暴露所述的變成化石的蜜蜂組織，Cano et al.，Med.Sci.Res.20249-251(1992)。
化石提取 使用一個帶有無菌27號針頭的無菌結核菌素注射器，從琥珀中吸出變成化石的蜜蜂組織(胸部和腹部)的少量樣品。每個樣品懸于每個含TSB的容器中，35℃保溫2周使存在的所有細菌增殖。這個階段后，從顯示微生物生長的容器中再等分培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基Trypticase大豆瓊脂(TSA)上，使之可見并進一步分離特定的細菌菌落。
分離的古細菌的鑒定和描繪特征古細菌分離物的鑒定基本上通過形態(tài)學和生化特征的評價而進行，如Gordon et al.，The genusBacillus，Department of Agriculture Handbook 427 Washington，D.C.(1973)所述。所有的形態(tài)學和生化評價在一個層流罩中進行。古芽胞桿菌培養(yǎng)物的酶活性用能檢測19種(API ZYM Methodology，API Analytab Products)的半定量系統(tǒng)來確定。BCA分離物的酶活特點與從ATCC獲得的現(xiàn)存枯草桿菌的酶活相比。
所有古細菌貯存培養(yǎng)液貯存于安全物且封閉的地方，所有分離物樣品被冷凍并貯存在-70℃的關緊的冷藏箱中。
抗菌活性分析使用交叉劃線方法(Colome et al.，1986)測試古細菌抗各種對人和植物致病的細菌和真菌的抗菌活性。古細菌劃線在Mueller Hinton瓊脂上，35℃保溫24-48小時。病原體以90°角交叉劃線，細菌病原體的平皿在35℃保溫，真菌病原體的平皿在室溫保溫。交叉劃線后48小時最長2星期，檢測交叉劃線平皿的生長抑制。
對照和模擬提取 為了進一步確認分離的古細菌不是分離過程中偶然獲得的現(xiàn)代污染物，進行幾個對照實驗和模擬提取。在所有提取過程中，“放哨”培養(yǎng)皿置于罩中檢測罩里存在的細菌污染物，但沒有發(fā)現(xiàn)。
消毒、研磨和化石提取過程使用的溶液及琥珀標本的外部及內(nèi)部碎片樣品，通過接種TSB并檢查微生物生長來分析微生物污染。在任何溶液或琥珀碎片中沒有檢測到細菌和真菌。通過接種100μl溶液樣品和琥珀標本內(nèi)部的碎片于Chelex溶液中，并提取和用現(xiàn)存的芽胞桿菌特異的引物PCR擴增芽胞桿菌DNA以檢驗芽胞桿菌DNA存在。雖然溶液中和消毒的琥珀標品的表面檢測到一些芽胞桿菌DNA，但琥珀內(nèi)部采取的樣品中沒檢到芽胞桿菌DNA。
另一個實驗對先用活枯草桿菌預處理的琥珀標本進行去污染，來檢驗消毒方法是否有效。簡要地說，無化石包涵體的琥珀標本浸于含內(nèi)生孢子的枯草桿菌培養(yǎng)物中過夜。然后將琥珀標本如上所述及下面物舉例說明的消毒，在許可條件下培養(yǎng)于TSB中，使任何污染菌生長。這個對照實驗進行了十一次，每次都沒檢測到污染。因而，消毒方法對消除琥珀標本表面現(xiàn)代細菌污染物的可能是有效的。
進行模擬提取以評估提取過程中對樣品可能的環(huán)境污染。一個無化石包體的琥珀標本如上所述進行表面消毒，并模擬以后描述的提取步驟。此外，溶液樣品及琥珀的外部和內(nèi)部被測試芽胞桿菌內(nèi)生孢子的存在。進行兩次模擬提取，無導致任何細菌生長。
結果通過將變成化石的Problebeia dominicana胸部和腹部組織樣品接種到細菌生長培養(yǎng)基，產(chǎn)生幾種古細菌培養(yǎng)物，這些組織是從以后描述的25-40百萬年的消毒琥珀標本中提取的。已評估了這些分離物的形態(tài)和生化特性，表明所有古細菌是芽胞桿菌或芽胞桿菌樣生物體。另外，還測定了酶活性質(zhì)。而且平行估價了幾種現(xiàn)代芽胞桿菌形態(tài)、生化特性以及酶活分布類型。然后比較了現(xiàn)代和古代芽胞桿菌的特點，以更特別地定義這些回收古芽胞桿菌的分類。
形態(tài)學和生化評價的結果分別見表I和表II。古細菌的酶學特點見表III，古代和現(xiàn)代/后代細菌的比較見表IV。
雖然古代細菌的酶特征在幾個方面與現(xiàn)代芽胞桿菌的有關，但也觀察到幾點不同。例如，古代細菌似乎與現(xiàn)代芽胞桿菌相比，產(chǎn)生較多的堿性磷酸酶和亮氨酸氨基肽酶。現(xiàn)代枯草桿菌和蠟樣芽胞桿菌產(chǎn)生α-葡糖苷酶，而在古代細菌中沒有發(fā)現(xiàn)此活性。相比之下，古代地衣形芽胞桿菌樣細菌產(chǎn)生α-葡糖苷酶，而現(xiàn)代地衣形芽胞桿菌則不能。再者，古地衣形芽胞桿菌樣細菌似乎與現(xiàn)代該菌株相比產(chǎn)生更多的β-半乳糖苷酶。
基于這些觀察，申請者通過參考表觀最近物的現(xiàn)存芽胞桿菌后代，鑒定了不同種古細菌分離物。因此，下面的古細菌確定如表5所示。
表I

C＝中央的S＝接近末端的T＝末端的表II

表III

表III(續(xù))

表IV

表IV(續(xù)I)

表IV(續(xù)II)

表VBCA 1枯草桿菌樣BCA 2巨大芽胞桿菌樣BCA 3枯草桿菌樣BCA 5蠟樣芽胞桿菌樣BCA 7蠟樣芽胞桿菌樣BCA 8蠟樣芽胞桿菌樣BCA 12 地衣形芽胞桿菌樣BCA 13 地衣形芽胞桿菌樣BCA 15 地衣形芽胞桿菌樣BCA Ex2 園形芽胞桿菌樣BCA 16 園形芽胞桿菌樣有趣地是，已知枯草桿菌、巨大芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌，地衣形芽胞桿菌和園形芽胞桿菌都棲居于某些尚存的Hymenoptera蜜蜂的消化道。
用前述交叉劃線法，古芽胞桿菌絲株還被確定產(chǎn)生抗菌化合物。任何明顯的抑制量(即從古細菌劃線至少2mm內(nèi)沒有生長)被記為“部分抑制”。試驗進行2次，只有那些能重復抑制被試病原體生長的古細菌被評價為能完全或部分抑制。結果見表VI。表VI

實施例2琥珀種的去污染根據(jù)上述方法，十一片琥珀(無內(nèi)涵物)表面消毒后分別放在枯草桿菌的內(nèi)生孢子培養(yǎng)物Trypticase大豆瓊脂(BBL，Cockeysville，MD)中。特別地，琥珀被(1)在預稱重的船型稱量皿中稱重；(2)真空下浸于2％戊二醛緩沖液，35℃至少12小時；(3)用約250ml無菌雙蒸水(SDDW)洗三遍，然后在TSB上培養(yǎng)潤洗水，以評價消毒過程的有效性；(4)再浸泡在10％漂白劑中37℃6小時；(5)用SDDW洗3遍，并在TSB上培養(yǎng)潤洗水，以評價消毒過程的有效性；(6)浸于35℃、70％乙醇兩小時并(7)暴露于火焰以蒸發(fā)乙醇。
測定的內(nèi)生孢子數(shù)(直接計數(shù))為大約每ml TBS中1.6×107個內(nèi)生孢子。進行消毒步驟前，琥珀浸于培養(yǎng)基中過夜。用表面消毒的琥珀接種到含10ml TSB試管中，35℃溫育14天。二周的溫育過程后，11個TSB試管中均未檢測到細菌生長。實施例3從不同來源的琥珀中提取古微生物(研磨法)從德國琥珀中分離枯草桿菌樣微生物。一種含有混土和昆蟲碎片的德國琥珀(bitterfelder)標本(15-25百萬年)表面消毒后，用上述消毒和研磨提取方法獲得組織。在30℃培養(yǎng)四天后，TSA瓊脂在表面上可見奶油色、粘液狀菌落。該分離物編碼為AG-14-BF-2。顯微鏡檢呈革蘭氏陽性桿菌，直徑＜1.0μm，具有橢園形孢子。無膨脹的孢子囊。sp.芽胞桿菌是嚴格需氧的，過氧化氫酶陽性，伏-普二氏反應陽性，V-P肉湯的pH值＜6，水解酪蛋白、明膠和淀粉。該分離物被推定為類枯草桿菌。
API-ZYM分布類型如下堿性磷酸酶(+)、丁酸酯酶(+/-)、辛酸酯酶(+)、豆蔻酸脂肪酶(-)、亮氨酸氨肽酶(-)、纈氨酸氨肽酶(-)、半胱氨酸氨肽酶(-)、胰蛋白酶(-)、糜蛋白酶(-)、酸性磷酸酶(-)、磷酸酰胺酶(-)、α-半乳糖苷酶(-)、β-半乳糖苷酶(-)、β-glucoronidase(-)、α-葡糖苷酶(-)、β-葡糖苷酶(-)、N-乙酰-β-葡糖酰胺酶(-)、α-甘露糖苷酶(-)、β-巖藻糖苷酶(-)。
從華盛頓州Calmount琥珀中分離放線菌樣微生物。一種含泥土顆粒的華盛頓州Calnount琥珀標本(38-54百萬年)表面消毒后，用上述消毒及研磨提取法獲得組織。30℃培養(yǎng)8天后，在含4％酵母提取液的Czapek瓊脂平板表面可見帶白色的粉末狀菌落。該分離物編碼為AG-16-WA-3。顯微鏡檢顯示為革蘭氏陽性、分枝細絲和短桿狀。該分離物為兼性厭氧微生物，并在淀粉-酪蛋白瓊脂中生長良好，生長7天后產(chǎn)生直徑1.0-2.5mm的干燥、粉狀菌落。通過在pH調(diào)至8.1的SMA瓊脂平板中對酪蛋白的消化確定該分離物產(chǎn)生堿性蛋白酶。該分離物推定為放線菌。
從中國琥珀中分離園形芽胞桿菌樣微生物。一種含泥土顆粒的中國琥珀標本(40-53百萬年)表面消毒，并用上述消毒和研磨提取法獲得組織。30℃培養(yǎng)5天后在TSA瓊脂表面可見帶白色的糊狀菌落。該分離物編碼為AG-17-CH-1。顯微鏡檢顯示為革蘭氏陽性桿菌，直徑＜1.0μm，具有圓形孢子和膨脹的孢子囊。sp.芽胞桿菌為兼性厭氧、過氧化氫酶陽性、伏-普二氏反應陰性，V-P肉湯的pH＞7，水解酪蛋白、明膠和淀粉。該分離物推測為類圓形芽胞桿菌。
API-ZYM分布類型如下堿性磷酸酶(+)、丁酸酯酶(-)、辛酸酯酶(+)、豆蔻酸脂肪酶(-)、亮氨酸氨肽酶(-)、纈氨酸氨肽酶(-)、半胱氨酸氨肽酶(-)、胰蛋白酶(-)、糜蛋白酶(+)、酸性磷酸酶(-)、磷酸酰胺酶(-)、α-半乳糖苷酶(-)、β-半乳糖苷酶(-)、β-glucoronidase(-)、α-葡糖苷酶(-)、β-葡糖苷酶(-)、N-乙酰-β-葡糖酰胺酶(-)、α-甘露糖苷酶(-)、β-巖藻糖苷酶(-)。
從多米尼加琥珀中分離aurescens分節(jié)孢子桿菌樣微生物。含有絕種的Hymenaea protera豆的葉子和花的多米尼加琥珀標本(25-40百萬年)表面消毒，并用上述消毒和研磨提取法獲得組織。30℃培養(yǎng)7天后在TSA瓊脂表面可見黃色糊狀菌落。該分離物編碼為AMG7。顯微鏡下顯示為革蘭氏陽性、能動的多形桿菌，具有向桿菌-球菌循環(huán)的一定趨向。無菌絲產(chǎn)生，是嚴格的需氧微生物。該分離物推定為類aurescens分節(jié)孢子桿菌，這基于存在黃色色素及水解淀粉的能力。該微生物在交叉劃線試驗中抑制金生物黃色釀膿葡萄球菌和大腸桿菌的生長。
從黎巴嫩琥珀中分離枯草桿菌樣微生物。含有泥土顆粒的黎巴嫩琥珀標本(120-135百萬年)表面消毒后，用上述消毒和研磨提取法獲得組織。30℃培養(yǎng)5天后，在TSA瓊脂表面可見奶油色、粘液狀菌落。該分離物編碼為AG-14-LA-1。顯微鏡檢顯示為革蘭氏陽性桿菌，直徑＜1.0μm，具有橢園形孢子；無膨脹的孢子囊。sp.芽胞桿菌嚴格需氧，過氧化氫酶陽性，伏-普二氏反應陽性，V-P肉湯的pH＜6，水解酪蛋白、明膠和淀粉。該分離物推測為類枯草桿菌。此外，該微生物顯示產(chǎn)生堿性蛋白酶，該酶在65℃穩(wěn)定并在pH8.1具有活性。
API-ZYM分布類型如下堿性磷酸酶(+)、丁酸酯酶(+)、辛酸酯酶(+)、豆蔻酸脂肪酶(-)、亮氨酸氨肽酶(-)、纈氨酸氨肽酶(-)、半胱氨酸氨肽酶(-)、胰蛋白酶(-)、糜蛋白酶(-)、酸性磷酸酶(-)、磷酸酰胺酶(-)、α-半乳糖苷酶(-)、β-半乳糖苷酶(+)、β-glucoronidase(-)、α-葡糖苷酶(-)、β-葡糖苷酶(-)、N-乙酰-β-葡糖酰胺酶(-)、α-甘露糖苷酶(-)、β-巖藻糖苷酶(-)。
從波羅的海琥珀中分離鏈霉菌樣微生物。含泥土顆粒和植物碎片的波羅的海琥珀標本(40百萬年)表面消毒，并用上述消毒和研磨提取法獲得組織。30℃七天后，在含4％酵母提取物的Czapek瓊脂平板表面可見帶有氣生菌絲的灰色、粉狀菌落。該分離物編碼為AG-11-BA-11。顯微鏡檢顯示存在革蘭氏陽性、分枝細絲、具有產(chǎn)生成串孢子的孢子囊以及短桿菌。該分離物通過消化SMA瓊脂平板中酪蛋白確定其產(chǎn)生一種蛋白酶。該分離物被推定為鏈霉菌。
從多米尼加琥珀中分離酵母菌樣微生物。含有泥土顆粒和昆蟲糞便的多米尼加琥珀標本(40百萬年)表面消毒，并用相述消毒和研磨法收獲組織。30℃培養(yǎng)7天后，在PDA瓊脂表面可見白色、奶油狀克隆。該分離物編碼為AG-11-DM-6。顯微鏡檢顯示園形至橢園形、正在出芽的酵母細胞，直徑在5.0～7.5μm。該生物體沒有包入膠囊內(nèi)，在Levine’s EMB瓊脂(Difco)上沒形成假菌絲，并發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖和半乳糖產(chǎn)生CO2(氣體)和乙醇(酒精)。該分離物推定為酵母菌。
哥倫比亞硬樹膠中的玫瑰色細球菌樣微生物。含泥土顆粒和昆蟲糞便的哥倫比亞硬樹膠標本(大約2百萬年)表面消毒，并用上述消毒和研磨提取法獲得組織。在30℃培養(yǎng)5天后，TSA瓊脂表面可見紅色、糊狀克隆。該分離物編碼為AG-11-CC-5。顯微鏡檢顯示革蘭氏陽性，以成對、四個一組和不規(guī)則束排列的球菌。該分離物產(chǎn)生葡萄糖酸，但不是從甘油和水解淀粉而來。該分離物推定為類玫瑰色細球菌。
從波羅的海琥珀分離青霉樣生物體。含泥土顆粒的波羅的海琥珀(Lithuanian)標本(40百萬年)表面消毒，用上述消毒和研磨提取法收獲組織。在30℃培養(yǎng)7天后，在PDA和Czapek瓊脂表面可見具有黃色、膜反轉、無彌散性色素的粉狀、灰綠色菌落。該分離物編碼為AG-11-BA-5。顯微鏡檢乳酚棉蘭(LPB)濕制片顯示為hyline、有隔的菌絲，具有瓶梗分生孢子細胞的青霉。Phialoconidia成串，并具有光滑的或有刺毛的外壁。該分離物被推定為青霉。交叉劃線試驗顯示存在金黃色釀膿葡萄球菌、釀膿鏈球菌和大腸桿菌的生長抑制物質(zhì)。當生長在SMA上時菌落消化酪蛋白。
從非洲硬樹脂中分離sp.放線菌樣微生物。含有泥土顆粒和昆蟲碎片的非洲硬樹脂標本(大約5000年)表面消毒，并用上述消毒和研磨提取法獲得組織。30℃培養(yǎng)7天后，在含4％酵母提取物的Czapek瓊脂平板上可見白色、粉狀克隆。該分離編碼為AG-11-AC-14。顯微鏡檢顯示存在革蘭氏陽性、分枝細絲和短桿狀。該分離物兼性厭氧，并在淀粉-酪蛋白瓊脂中生長良好，培養(yǎng)7天后產(chǎn)生直徑在1.5-2.5mm的白色、干燥粉狀克隆。該分離物通過在SMA瓊脂平板消化酪蛋白，確定產(chǎn)生蛋白酶。該分離物被推定為放線菌。
從緬甸琥珀分離嗜熱棒狀桿菌樣微生物。含有泥土顆粒的緬甸琥珀標本(38-54百萬年)如上表面消毒，并用上述研磨提取法獲得組織。55℃培養(yǎng)7天后，在TSA平板表面可見黃色、糊狀菌落。該分離物編碼為AG-12-BM-2。顯微鏡檢顯示存在革蘭氏陽性桿菌，成串、柵欄和圍籬樣形式排列。該分離物兼性厭氧，在淀粉-酪蛋白瓊脂中生長良好。該分離物通過消化SMA瓊脂平板的酪蛋白確定為產(chǎn)生蛋白酶。該分離物暫時確定為嗜熱棒狀桿菌。
從哥倫比亞硬樹脂分離芽胞桿菌樣微生物。含有泥土顆粒的哥倫比亞硬樹膠標本(大約2百萬年)表面消毒，并用上述消毒和研磨提取法獲得組織。55℃培養(yǎng)5天后，TSA瓊脂表面可見奶油色、片狀菌落。該分離物編碼為AG-13-CC-33。顯微鏡檢顯示為革蘭氏陽性桿菌，直徑＞1.0μm，膨脹的孢子囊內(nèi)具有橢園形孢子。sp.芽胞桿菌嚴格需氧，過氧化氫酶陽性，優(yōu)-普二氏反應陽性，V-P肉湯的pH＜6，水解酪蛋白、明膠和淀粉。該分離物推定為芽胞桿菌。此外，此生物體顯示產(chǎn)生一種堿性蛋白酶，它在65℃時穩(wěn)定，并在pH8.1時有活性。
API-ZYM分布類型如下堿性磷酸酶(+)、丁酸酯酶(+)、辛酸酯酶(+)、豆蔻酸脂肪酶(-)、亮氨酸氨肽酶(-)、纈氨酸氨肽酶(-)、半胱氨酸氨肽酶(-)、胰蛋白酶(-)、糜蛋白酶(+)、酸性磷酸酶(-)、磷酸酰胺酶(-)、α-半乳糖苷酶(-)、β-半乳糖苷酶(-)、β-glucoronidase(-)、α-葡糖苷酶(-)、β-葡糖苷酶(-)、N-乙酰-β-葡糖酰胺酶(-)、α-甘露糖苷酶(+)、β-巖藻糖苷酶(-)。
從日本琥珀中分離蛋白分解球菌樣微生物。含有泥土顆粒的日本琥珀標本(大約80百萬年)表面消毒，然后用上述消毒和研磨提取法獲得組織。30℃培養(yǎng)5天后，在TSA瓊脂表面可見白色粘液狀菌落。該分離物編碼為AG-19-JA-2。顯微鏡檢顯示為革蘭氏陽性球菌，直徑＞1.0μm，膨脹的孢子囊內(nèi)有橢園形孢子。該芽胞桿菌兼性需氧，過氧化氫酶陽性，氧化酶及水解酪蛋白、明膠，但不能水解淀粉。該分離物暫時確定為革蘭氏陽性蛋白水解球菌。
從華盛頓州琥珀分離鏈霉菌樣微生物。含有泥土顆粒和植物碎片的華盛頓州琥珀標本(38-54百萬年)如上述表面消毒，并用研磨提取法獲得組織。30℃培養(yǎng)7天后，在含5％酵母提取物的Czapek瓊脂平板表面可見具有氣生菌絲的灰色粉狀菌落。培養(yǎng)物具有鏈霉菌的特征霉味。該分離物編碼為AG-15-WA-18。顯微鏡檢可見存在革蘭氏陽性、帶有產(chǎn)生成串孢子的孢子囊的分枝細絲，及短桿。該分離物顯示產(chǎn)生抗菌劑，抑制革蘭氏陽性和陰性細菌，包括金黃色釀膿葡萄球菌、枯草桿菌和大腸桿菌。該分離物被推定為類鏈霉菌。
從黎巴嫩琥珀中分離分枝孢子菌樣微生物。一種含泥土顆粒的黎巴嫩琥珀標本(120-135百萬年)如上表面消毒后，也如上述研磨提取法獲得組織。25℃培養(yǎng)10天后，Czapek瓊脂表面可見粉狀、橄欖黃褐色菌落，具有黑色膜反轉，但無彌散色素。該分離物編碼為AG-13-LA-5。乳酚棉蘭(LPB)濕制片顯微鏡檢可見從霉的，具有橢園、從霉的、連接的貧乏的分生孢子胚的有隔菌絲。從罩細胞見分枝是明顯的。該分離物被推定為類分枝孢子菌。生長在SMA上時，菌落消化殼多糖，并吸收多種碳水化合物，包括葡萄糖和蔗糖。實施例4從不同來源的琥珀中提取古微生物(破裂法)從緬甸琥珀中分離芽胞桿菌樣微生物。含有昆蟲和花粉粒的緬甸琥珀標本(38-54百萬年)表面消毒，用上述消毒和破裂提取法獲得組織。30℃培養(yǎng)6天后在TSA瓊脂表面可見奶油色、粘液狀菌落。該分離物編碼為AG-15-BM-1。顯微鏡檢顯示為革蘭氏陽性桿菌，直徑＞1.0μm，具有橢園形孢子，無膨脹的孢子囊。該sp.芽胞桿菌為兼性厭氧，耐酸，過氧化氫酶陽性，伏-普反應陽性，V-P肉湯的pH＜6，水解酪蛋白、明膠和淀粉，用檸檬酸作為唯一碳源。該分離物推定為灰蠟樣芽胞桿菌。
API-ZYM分布類型如下堿性磷酸酶(+)、丁酸酯酶(+)、辛酸酯酶(+)、豆蔻酸脂肪酶(-)、亮氨酸氨肽酶(+)、纈氨酸氨肽酶(-)、半胱氨酸氨肽酶(-)、胰蛋白酶(-)、糜蛋白酶(+)、酸性磷酸酶(+)、磷酸酰胺酶(-)、α-半乳糖苷酶(-)、β-半乳糖苷酶(-)、β-glucoronidase(+)、α-葡糖苷酶(-)、β-葡糖苷酶(-)、N-乙酰-β-葡糖酰胺酶(-)、α-甘露糖苷酶(-)、β-巖藻糖苷酶(-)。
從加拿大琥珀中分離芽胞桿菌樣微生物，含有昆蟲部分的加拿大琥珀標本(68-75百萬年)表面消毒，并用上述消毒和破裂提取法獲得組織。30℃培養(yǎng)5天后，TSA瓊脂表面可見奶油色、糊狀菌落。該分離物編碼為AG-18-CA-2。顯微鏡檢顯示為革蘭氏陽性桿菌，直徑大于1.0μm，膨脹的孢子囊中有橢園形孢子。該芽胞桿菌為兼性需氧，過氧化氫酶陽性，伏-普反應陰性，V-P肉湯的pH＜7，水解酪蛋白和明膠但不水解淀粉。該分離物被推定為芽胞桿菌。實施例5從不同來源的琥珀中提取古微生物(沖洗法)從多米尼加琥珀分離假單胞菌樣微生物。含有小水滴(有些其中有泥土顆粒)的多米尼加琥珀標本(25-40百萬年)表面消毒，并用上述消毒和沖洗提取法獲得組織。30℃培養(yǎng)5天后，TSA瓊脂表面可見黃色、潮濕、閃光的菌落。該分離物編碼為AG-10-DA-1。顯微鏡檢可見革蘭氏陰性、能動的桿菌。該分離物為需氧、還原硝酸鹽、過氧化氫酶陽性、氧化酶陽性、水解酪蛋白和明膠，但不水解淀粉。該分離物推定為假單胞菌。實施例6從不同來源琥珀中提取古微生物(鉆孔法)從墨西哥琥珀中分離短小芽胞桿菌樣生物體。含Plebeia silaceae包涵物的墨西哥琥珀標本(20-35百萬年)表面消毒，用上述消毒和鉆孔提取法獲得組織。25℃培養(yǎng)4天后，在TSA瓊脂表面可見淺黃色、奶油樣菌落。該分離物編碼為AG-12-MX-2。顯微鏡檢顯示革蘭氏陽性桿菌，直徑＜1.0μm，具有橢園形孢子，無膨脹孢子囊。該sp.芽胞桿菌嚴格需氧，過氧化氫酶陽性，伏-普反應陽性，V-P肉湯的pH＜6，水解酪蛋白和明膠但不水解淀粉。該分離物推定為類短小芽胞桿菌。
API-ZYM分布類型如下堿性磷酸酶(-)、丁酸酯酶(-)、辛酸酯酶(+)、豆蔻酸脂肪酶(-)、亮氨酸氨肽酶(-)、纈氨酸氨肽酶(-)、半胱氨酸氨肽酶(-)、胰蛋白酶(-)、糜蛋白酶(-)、酸性磷酸酶(-)、磷酸酰胺酶(-)、α-半乳糖苷酶(-)、β-半乳糖苷酶(-)、β-glucoronidase(-)、α-葡糖苷酶(-)、β-葡糖苷酶(-)、N-乙酰-β-葡糖酰胺酶(-)、α-甘露糖苷酶(-)、β-巖藻糖苷酶(-)。實施例7通過核酸測序分析證實從被稱作古分離物BCA16(確定為園形芽胞桿菌)提取的DNA用作模板，用一對引物BCF以(CGGGAGGCAGCAGTAGGGAAT)(SEQID NO1)和BCR2(CTCCCCAGGCGGAGTGCTTAAT)(SEQ IDNO2)。這些引物是從環(huán)狀芽胞桿菌(EenBank Accession NumberX60613)的16S rDNA序列中得到的，并擴增此基因的一個530堿基對區(qū)域。DNA通過硅膠懸浮抽提，見Gano and Poinar，Cano，R.J.&Poinar，H.N.，Biotechniques 158-11(1993)。PCR擴增中，5μl抽提的DNA用作PCR酶擴增的DNA來源。對稱PCR擴增用2單位低DNAAmpliTaq DNA聚合酶(Perkim-Elmer，Norwalk，CT)，2μg/ml牛血清白蛋白，BCA341F和BCA871R引物各0.5μm，2.0mM MgCl2及0.2mM三磷酸脫氧核苷酸在50μl總體積中完成。所有反應混合物和樣品稀釋液在冰水浴中進行，當加熱器達80℃后，將試管置于熱循環(huán)器中。聚合酶鏈反應使用Temp-Tronic熱循環(huán)干燥浴(Thermolyne，Dubuque，IA)完成。在第一輪循環(huán)中，DNA模板在95℃變性2分鐘，然后引物退火步驟在58℃1分鐘，然后延伸步驟為72℃1分鐘。下面的30個循環(huán)由94℃1分鐘變性步驟、58℃1分鐘，1分鐘引物退火步驟、72℃1分鐘引物延伸步驟組成。最后一個循環(huán)由1分鐘變性步驟、1分鐘引物退火步驟和10分鐘引物延伸步驟組成。每以擴增產(chǎn)物通過1.2％瓊脂糖在Tris-醋酸-EDTA緩沖液中鑒定。擴增產(chǎn)物依制造商指導用TA克隆試劑盒(Invitrogen，San Diego，CA)進行克隆?？寺〉馁|(zhì)粒DNA用Sequenase II DNA Sequencing試劑盒(USB，Cleveland，OH)及α-指導進行測序。每個樣品用SP6和T7測序引物，測序3個克隆。測序產(chǎn)物的電泳在6％測序膠(GEL-MIX 6Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中進行。用XAR X-光膠片(Kodak，Rochester，MN)將空氣干燥的測序膠進行放射自顯影。序列掃描入Sparc10工作站(Sun Microsystems，Mountain Uiew，CA)使用BioImageDNA分析軟件(Millipore，Bedford，MA)進行分析。人工鑒定放射自顯影以證實物計算機分析的序列。使用Genetic Date Environment(GDE 2.1)文本編輯將序列進行人工排序。
BCA16的16S DNA核苷酸序列，核苷酸替代速率r通過以下方式計算，即假定的古圓形芽胞桿菌和現(xiàn)存圓形芽胞桿菌間的替代數(shù)目除以分析的核苷酸位點數(shù)目。這個數(shù)，K，然后除以2T，其中T是兩個序列的趨異次數(shù)，Li，Wen-Hsiung，& Dan Grauer，F(xiàn)undanentals ofMolecular Evolution.Sinaner Asseciates，Inc.，Sunderland，Massachusetts(1991)。趨異次數(shù)(T)及琥珀碎片的年代可通過K/n2R算得，其中n是分析的核苷酸的數(shù)目(487)，r是每年每個位置0.3-0.4×10-9替代。BCA 16和現(xiàn)存園形芽胞桿菌間核苷酸替代數(shù)目為13。基于此K值，T為33.3×106-44.4×106年。由于多米尼加琥珀礦石的年代為25-40百萬年，假定的古園形芽胞桿菌和現(xiàn)存的之間的核苷酸替代速率與琥珀的年代一致，因此結果證實BCA 16是多米尼加琥珀中園形芽胞桿菌的古分離物的主張。實施例8通過核苷酸序列分析證實分離物的古年代從被稱作古分離物提取的DNA和16S rRNA基因或rbcL基因(光合生物)的一個片段用適當?shù)囊镞M行擴增。用1單位低DNA Taq聚合酶(AmpliTaq-LD)DNA polynerase，Perkin Elmer，Norwalk，CT)，2.5g/ml牛血清白蛋白組分V(Sigma，St.Louio，MO)，每種引物0.5μm，2.0mM MgCl2和0.2mM三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)。在總體積50μl下進行PCR擴增。所有反應混合物和樣品稀釋液在冰水浴中制得，加熱器達80℃后將試管置熱循環(huán)器上。以適當?shù)牟僮鞣椒?最好用合適的模板DNA和引物)用熱循環(huán)器干燥浴完成聚合酶鏈反應。PCR產(chǎn)物被克隆入合適的克隆載體然后用標準方法測序。人工或借助一套排序軟件進行排序，及評估序列。16S rRNA基因的核苷酸替代速率r基于不同報道假定的為每年每位置0.3-0.4×10-9替代，Ochmen andWilson，J.Mol.Evol.2674-86(1987)；Moran，et al.，Proc.R.Soc.Lond.B.253167-171(1993)，各種植物的rbcL基因的r為1.9×10-9，Zurarski and Clegg，Zurawski and Clegg，Anuual ReviewPlant Physiology 38391-418(1987)。兩分類群間的時間差異(假定的古微生物從中分離的琥珀的年代)用以下方法確定，即假定的古生物與其尚存的年代最近的親緣關系之間的替代數(shù)目除以2r與分析的核苷酸數(shù)目的乘積。兩分類群間差異的時間大致與從中獲得分離物的琥珀的年代相同。
微生物保藏下列古細菌的培養(yǎng)物在1994年1月28日(“BCA培養(yǎng)物”)和1994年11月1日(“AG”培養(yǎng)物)于NRRL，Peoria，Illinois保藏，并排列如下登記號培養(yǎng)物類型 登記號BCA1 類枯草桿菌 B-21177BCA3 類枯草桿菌 B-21178BCA5 類蠟樣芽胞桿菌 B-21179BCA7 類蠟樣芽胞桿菌 B-21180BCA13 類地衣形芽胞桿菌B-21181BCA15 類地衣形芽胞桿菌B-21182BCA Ex2 類園形芽胞桿菌 B-21184BCA 16類園形芽胞桿菌 B-21183AG-10-DA-1類假單胞菌 B-21357AG-11-DM-6類酵母菌Y-21355AG-13-LA-5類枝孢菌21356AG-15-WA-19 類鏈霉菌21354AG-11-AC-14 類放線菌21353AG-11-BA-5類青霉菌21352本發(fā)明不限于已保藏的細菌培養(yǎng)物或已公開的實施方案的范圍，它們只作為本發(fā)明一個方面的說明，并且任何作用上的等同物均在本發(fā)明范圍內(nèi)。實際上，本發(fā)明的各種改進，除了那些在此描述和所示的之外，對本領域的技術人員從前面所述是顯而易見的。這些改進表達在后附權利要求范圍之內(nèi)。文中提及的所有專利、專利申請和出版物在此引入作為參考。
序列表(1)一般數(shù)據(jù)(i)申請人Ambergene Corporation5214-F Diamond Heights BoulevardSan Francisco，Califorrnia 94131United States of America(ii)發(fā)明題目古生物體(iii)序列數(shù)目2(iv)聯(lián)系地址(A)收信人Pennie & Edmonds(B)街道 1155 Avenue of the Americas(C)城市 New York(D)州New York(E)國家 United States of America(F)郵政編碼10036(v)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC compatible(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Nersion #1.25(vi)當今申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朠CT/US95/01073(B)注冊號25,227(C)參考/摘要號8070-005(ix)電信資料(A)電話415-854-3660(B)電傳415-854-3694(C)電報66141 PENNIE(2)SEQ ID NO1的數(shù)據(jù)(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型未知(D)拓撲學未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQ ID NO1CGGGAGGCAG CAGTAGGGAA T21(2)SEQ ID NO2的數(shù)據(jù)(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓撲學未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQ ID NO2CTCCCCAGGC GGAGTGCTTA AT 2權利要求
1.一種包含從天然存在樹脂中得到的生物體的生物體培養(yǎng)物，該生物體培養(yǎng)物是通過消毒這種樹脂，從所述樹脂中提取生物體并培養(yǎng)所述提取的生物體而獲得。
2.權利要求1的培養(yǎng)物，其中天然存在樹脂選自琥珀和/或硬樹脂。
3.權利要求2的培養(yǎng)物，其中天然存在樹脂選自黎巴嫩琥珀、華盛頓州琥珀、墨西哥琥珀、加拿大琥珀、日本琥珀、波羅的海琥珀、德國琥珀、哥倫比亞硬樹脂、緬甸琥珀、多米尼加琥珀、中國琥珀和/或非洲硬樹脂。
4.權利要求1的培養(yǎng)物，其中天然存在的樹脂經(jīng)表面消毒。
5.權利要求1的培養(yǎng)物，其中用粉碎提取法從天然存在樹脂中提取該生物體。
6.權利要求1的培養(yǎng)物，其中樹脂在粉碎前用液氮處理。
7.權利要求1的培養(yǎng)物，其中樹脂在粉碎前冷凍至約-20℃～-140℃。
8.權利要求7的培養(yǎng)物，其中該樹脂冷凍至約-80℃。
9.權利要求1的培養(yǎng)物，其中通過破裂提取法從天然存在樹脂中提取生物體。
10.權利要求1的培養(yǎng)物，其中通過鉆孔提取法從天然存在樹脂中提取生物體。
11.權利要求1的培養(yǎng)物，其中通過沖洗提取法從天然存在樹脂中提取生物體。
12.權利要求1的培養(yǎng)物，其中該生物體包含在樹脂中變成化石的昆蟲材料中。
13.權利要求12的培養(yǎng)物，其中昆蟲材料選自昆蟲組織、昆蟲排泄物和昆蟲巢。
14.權利要求1的培養(yǎng)物，其中該生物體包含在樹脂中變成化石的植物材料中。
15.權利要求14的培養(yǎng)物，其中植物材料選自根、葉、種子、椏枝、樹皮、植物組織、孢子、花粉、花、草、蕨類植物和豆科植物。
16.權利要求1的培養(yǎng)物，其中該生物體包含在樹脂中變成化石的泥土中。
17.權利要求1的培養(yǎng)物，其中該生物體包含在樹脂中變成化石的水中。
18.權利要求1的培養(yǎng)物，其中產(chǎn)生培養(yǎng)物的生物體的年代通過核酸分析確定。
19.權利要求1的培養(yǎng)物，其中該生物體是一種微生物。
20.權利要求1的培養(yǎng)物，其中該生物體選自細菌、真菌、病毒、原生動物、小藻類(microalgae)、節(jié)肢動物和/或線蟲。
21.一種從天然存在樹脂中獲得一種生物體培養(yǎng)物的方法，它包括下列步驟(a)消毒天然存在樹脂；(b)從該天然存在樹脂中提取所述生物體；及(c)培養(yǎng)所述提取生物體。
22.權利要求21的方法，其中天然存在的樹脂選自琥珀和/或硬樹脂。
23.權利要求21的方法，其中天然存在的樹脂選自黎巴嫩琥珀、華盛頓州琥珀、墨西哥琥珀、加拿大琥珀、日本琥珀、波羅的海琥珀、德國琥珀、哥倫比亞硬樹脂、緬甸琥珀、多米尼加琥珀、中國琥珀和/或非洲硬樹脂。
24.權利要求21的方法，其中天然存在的樹脂經(jīng)表面消毒。
25.權利要求21的方法，其中通過粉碎提取法從天然存在樹脂提取生物體。
26.權利要求25的方法，其中粉碎前樹脂用液氮處理。
27.權利要求25的方法，其中粉碎前樹脂冷凍至約-20℃～-140℃。
28.權利要求27的培養(yǎng)物，其中樹脂冷凍至約-80℃。
29.權利要求21的方法，其中通過破裂提取法從天然存在樹脂中提取生物體。
30.權利要求21的方法，其中通過鉆孔提取法從天然存在樹脂中提取生物體。
31.權利要求21的方法，其中通過沖洗提取法從天然存在樹脂中提取生物體。
32.權利要求21的方法，其中該生物體包含在樹脂中變成化石的昆蟲材料中。
33.權利要求32的方法，其中昆蟲材料選自昆蟲組織、昆蟲排泄物和昆蟲巢。
34.權利要求21的方法，其中該生物體包含在樹脂中變成化石的植物材料中。
35.權利要求34的方法，其中植物材料選自根、葉、種子、椏枝、樹皮、植物組織、孢子、花粉、花、草、蕨類植物和豆科植物。
36.權利要求21的方法，其中該生物體包含在樹脂中變成化石的泥土中。
37.權利要求21的方法，其中該生物體包含在樹脂中變成化石的水中。
38.權利要求21的方法，其中通過核酸分析確定產(chǎn)生培養(yǎng)物的生物體的年代。
39.權利要求21的方法，其中該生物體選自細菌、真菌、病毒、原生動物、小藻類、節(jié)肢動物和/或線蟲。
40.權利要求21的方法，其中該生物體是微生物。
41.一種包含從天然存在樹脂中得到的植物細胞和孢子的植物細胞培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物是通過將這種樹脂消毒、從樹脂中提取植物細胞及培養(yǎng)所提取的植物細胞而得到。
42.權利要求41的培養(yǎng)物，其中該植物細胞從天然存在樹脂中變成化石的真菌菌絲體得到。
43.權利要求41的培養(yǎng)物，其中該植物細胞從天然存在樹脂中變成化石的細菌或真菌孢子得到。
44.權利要求41的培養(yǎng)物，其中該植物細胞從天然存在樹脂中變成化石的植物孢子得到。
45.權利要求41的培養(yǎng)物，其中該植物細胞從天然存在樹脂中變成化石的原生動物孢囊或孢子中得到。
46.一種通過將樹脂消毒、從樹脂中提取植物細胞和培養(yǎng)所述提取的植物細胞獲得包含來自天然存在樹脂的植物細胞或孢子的植物細胞培養(yǎng)物的方法。
47.確定古代生物體年代的一種方法，包括下列步驟(a)從古微生物中提取核酸；(b)擴增編碼核糖體核糖核酸的核酸序列；(c)克隆擴增的序列；(d)將克隆的核酸測序；(e)將克隆的核酸序列同最接近的現(xiàn)存微生物的核糖體核糖核酸序列進行排列；(f)確定古微生物核酸序列和現(xiàn)存生物體核糖體核糖核酸序列之間的核苷酸替代數(shù)目；(g)替代數(shù)目除以2(0.3-0.4×109)×比較的核苷酸數(shù)目。
48.權利要求47的方法，其中古生物體是一種微生物。
49.一種從天然存在樹脂中分離的生物體的培養(yǎng)物。
50.權利要求49的培養(yǎng)物，其中該生物體選自細菌、真菌、病毒、植物、原生動物、小藻類、節(jié)肢動物和/或線蟲。
51.權利要求49的培養(yǎng)物，其中該天然存在樹脂是琥珀或硬樹脂。
52.權利要求49的生物體的培養(yǎng)物，其中該生物體從樹脂中變成化石的昆蟲材料中分離到。
53.權利要求49的生物體的培養(yǎng)物，其中該生物體從樹脂中變成化石的泥土中分離到。
54.根據(jù)權利要求49的一種生物體的培養(yǎng)物，其中該生物體從樹脂中變成化石的植物材料中分離到。
55.根據(jù)權利要求49的一種生物體的培養(yǎng)物，其中該生物體從樹脂中變成化石的水中分離到
56.權利要求47、48、49、50、51、52、53、54或55的培養(yǎng)物，其中該生物體是一種微生物。
57.由權利要求1、41或49的微生物產(chǎn)生的化療劑。
58.權利要求57的化療劑，其中該化療劑具有抗菌活性。
59.權利要求57的化療劑，其中該化療劑具有抗微生物活性。
60.權利要求57的化療劑，其中該化療劑具有抗真菌活性。
61.權利要求57的化療劑，其中該化療劑具有抗癌活性。
62.權利要求57的化療劑，其中該化療劑具有抗原生動物活性。
63.權利要求57的化療劑，其中該化療劑具有抗炎活性。
64.權利要求57的化療劑，其中該化療劑是一種酶抑制劑。
65.權利要求57的化療劑，其中該化療劑是一種免疫調(diào)節(jié)劑。
66.一種由權利要求1、41或49的生物體產(chǎn)生的酶。
67.權利要求66的酶，其中該酶選自蛋白酶、淀粉酶、酯酶和磷酸酶。
68.由權利要求1、41或49的生物體產(chǎn)生的生物殺蟲劑。
69.由權利要求1、41或49的生物體產(chǎn)生的生物除草劑。
70.由權利要求1、41或49的生物體產(chǎn)生的維生素。
71.權利要求1、41或49的生物體，其中該生物體可用于發(fā)酵過程。
72.一種將權利要求1、41或49的生物體用作重組載體的方法。
73.保藏于NRRL，且指定的登記號為B-21177的古芽胞桿菌BCA1菌株。
74.保藏于NRRL，且指定的登記號為B-21178的古芽胞桿菌BCA3菌株。
75.保藏于NRRL，且指定的登記號為B-21179的古芽胞桿菌BCA5菌株。
76.保藏于NRRL，且指定的登記號為B-21180的古芽胞桿菌BCA7菌株。
77.保藏于NRRL，且指定的登記號為B-21181的古芽胞桿菌BCA13菌株。
78.保藏于NRRL，且指定的登記號為B-21182的古芽胞桿菌BCA15菌株。
79.保藏于NRRL，且指定的登記號為B-21184的古芽胞桿菌BCAEx2菌株。
80.保藏于NRRL，且指定的登記號為B-21183的古芽胞桿菌BCA16菌株。
81.保藏于NRRL，且指定的登記號為B-21357的古假單胞菌AG-10-DA-1菌株。
82.保藏于NRRL，且指定的登記號為Y-21355的古酵母菌AG-AC-14菌株。
83.保藏于NRRL，且指定的登記號為21356的古放線菌AG-11-AC-14菌株。
84.保藏于NRRL，且指定的登記號為21354的古青霉菌AG-11-BA-5菌株。
85.保藏于NRRL，且指定的登記號為21353的古分枝孢菌AG-13-LA-5菌株。
86.保藏于NRRL，且指定的登記號為21352的古鏈霉菌AG-15-WA-19菌株。
87.權利要求73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85或86的生物體的副產(chǎn)物。
全文摘要
在此描述存活的古代細菌，真菌和其它生物材料的重新獲得，它們來自琥珀或相關樹脂中變成化石的各種來源。幾種古代菌株基于其形態(tài)學與生物化學特征和酶活性分布類型，已被分類例如與現(xiàn)代芽胞桿菌屬的不同種相關。雖然古生物體的一些特征與其現(xiàn)代類似物密切相關，但是已觀察到幾點差別。此外，在此描述的幾種古代生物體顯示抵抗侵襲動物和植物的現(xiàn)代細菌及真菌病原體的有效抗微生物活性。展望了這些古代生物體多種用途，包括其在農(nóng)業(yè)、工業(yè)加工、生物補救、診斷和疾病治療方面的應用。
文檔編號C12N1/00GK1145020SQ95192328
公開日1997年3月12日 申請日期1995年1月27日 優(yōu)先權日1994年1月28日
發(fā)明者R·J·卡諾, M·K·波盧基 申請人:安伯基因公司