專(zhuān)利名稱(chēng)：體外檢測(cè)分析物對(duì)生物體的效應(yīng)的方法和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物測(cè)定領(lǐng)域，更具體的說(shuō)，涉及一種生物體體外模擬實(shí)驗(yàn)方 法和裝置。
背景技術(shù)：
隨著藥物、食品、衛(wèi)生、環(huán)境科學(xué)以及農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越重視藥 物、前體藥物、食品添加劑、飲料、化妝品、消毒劑、飼料添加劑、農(nóng)藥、除 草劑、化肥等化學(xué)物質(zhì)、成分對(duì)人體的直接或間接的影響。為了研究、評(píng)價(jià)和 控制這些影響，人們建立了一系列實(shí)驗(yàn)、研究方法。其中最可靠的實(shí)驗(yàn)方法是 在健康志愿者身上進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)的方法。但考慮的人體安全性要求，大多數(shù)實(shí) 驗(yàn)無(wú)法在人體上進(jìn)行。為此，人們又建立了各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法。就是將要研究、 實(shí)驗(yàn)的藥物、前體藥物、食品添加劑、飲料、化妝品、消毒劑、飼料添加劑、 農(nóng)藥、除草劑、化肥等化學(xué)物質(zhì)、成分(以下簡(jiǎn)稱(chēng)分析物)通過(guò)飼喂、注射等
方法引入動(dòng)物體內(nèi)，或讓動(dòng)物與分析物密切接觸，在一定時(shí)間內(nèi)，觀察動(dòng)物各 項(xiàng)指標(biāo)的變化，從而推測(cè)該分析物對(duì)人體的效應(yīng)或安全性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法的有 效性得到了全球科學(xué)界的公認(rèn)。但是該方法存在的缺陷也是顯而易見(jiàn)的。首先， 由于動(dòng)物與人的種屬差異，許多時(shí)候動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不一致； 其次，為了保證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性，對(duì)動(dòng)物的生活、繁殖條件有嚴(yán)格的 要求，這常常帶來(lái)巨大的開(kāi)支；再次，為了研究需要，有時(shí)需要建立模擬人體 病理狀況的模型動(dòng)物，許多時(shí)候無(wú)法建立模型動(dòng)物；另外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所要觀察 的指標(biāo)，常常需要將動(dòng)物處死才能獲得，這違背了動(dòng)物保護(hù)宗旨。因此，人們 又發(fā)展了細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)方法(章靜波，徐存栓著，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)指南， 科學(xué)出版社，2006年1月第四版)。在體外用合適的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)人或動(dòng)物 的細(xì)胞，使之生長(zhǎng)。然后使細(xì)胞與分析物密切接觸，觀察細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)，如 細(xì)胞存活數(shù)量、形態(tài)，細(xì)胞中蛋白水平或基因表達(dá)水平等的變化。但這種方法 也存在巨大不足。因?yàn)槿嘶騽?dòng)物的生命過(guò)程極其復(fù)雜，有各種各樣的細(xì)胞參與 其中，他們相互作用相互影響。分析物進(jìn)入體內(nèi)，將經(jīng)歷吸收、代謝、分布等
生化過(guò)程，對(duì)生命體產(chǎn)生綜合影響。在體外，進(jìn)行彼此獨(dú)立的一些細(xì)胞實(shí)驗(yàn)， 根本無(wú)法代替動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種新的體外生物測(cè)定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種新的體外檢測(cè)分析物對(duì)生物體的效應(yīng)的方法。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于上述新的測(cè)定方法的系統(tǒng)。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種體外檢測(cè)分析物對(duì)生物體的效應(yīng)的方 法，它包括步驟
a. 構(gòu)建檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括 n個(gè)用于盛放細(xì)胞或組織的容器Sn， n大于等于2，各容器S具有進(jìn)口
和出口，各容器Sn的出口處設(shè)有阻止細(xì)胞或組織通過(guò)的濾材，各容器Sn的進(jìn) 口和出口可拆卸且密封地與管路Tn和Tn'相連；和
至少一個(gè)泵W，各容器Sn通過(guò)管路Tn和Tn'與泵W液體連通；
b. 在容器Sn中加入不同的細(xì)胞或組織，其加量不小于獲得測(cè)定結(jié)果所需 的細(xì)胞或組織的最小需量，不同細(xì)胞或組織加量之比符合它們?cè)谏矬w內(nèi)的天 然含量之比；
c. 向系統(tǒng)中加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的加量與各細(xì)胞或組織加量之比符合它們 在生物體內(nèi)的天然含量之比；
d. 向系統(tǒng)中加入分析物；
e. 啟動(dòng)泵W，設(shè)定其流速使得系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)基的循環(huán)周期符合生物體內(nèi)的體 液循環(huán)周期；
f. 定時(shí)從容器Sn中取樣，檢測(cè)分析物對(duì)其中細(xì)胞或組織產(chǎn)生的效應(yīng)。 在另一優(yōu)選例中，所述系統(tǒng)還包括將管路Tn禾B/或Tn'匯總后與W連通的
管段C和/或C'，所述管段C和/或C'與各管路Tn和/或Tn'以及與泵W可拆卸
且密封連接。
在另一優(yōu)選例中，從管段C和/或C'加入分析物。 在另一優(yōu)選例中，所述生物體是哺乳動(dòng)物，更佳地為人。 在另一優(yōu)選例中，所述體液是血液。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種體外測(cè)定分析物對(duì)生物體的效應(yīng)的系 統(tǒng)，它包括
n個(gè)用于盛放細(xì)胞或組織的容器Sn， n大于等于2，各容器S具有進(jìn)口和
出口，各容器S的出口處設(shè)有阻止細(xì)胞或組織通過(guò)的濾材，各容器S的進(jìn)口和
出口可拆卸且密封地與管路Tn和Tn'相連；和
至少一個(gè)泵W，各容器Sn通過(guò)管路Tn和Tn'與泵W液體連通。 在另一優(yōu)選例中，它還包括將管路Tn禾n/或Tn'匯總后與W連通的管段C
和/或C'，所述管段C和/或C'與各管路Tn和/或Tn'以及與泵W可拆卸且密封連接。
在另一優(yōu)選例中，所述各容器Sn的容量不小于獲得測(cè)定結(jié)果所需的細(xì)胞 或組織的最小需量。
在另一優(yōu)選例中，所述各容器Sn的容量之比滿(mǎn)足其中不同細(xì)胞或組織的
含量之比符合它們?cè)谏矬w內(nèi)天然含量比的要求。
在另一優(yōu)選例中，所述系統(tǒng)的總?cè)萘颗c各容器Sn的容量與之比不小于生 物體內(nèi)循環(huán)體液與所述不同細(xì)胞或組織的天然含量比。
據(jù)此，本發(fā)明提供了一種新的體外檢測(cè)分析物對(duì)生物體的效應(yīng)的方法及相 應(yīng)的系統(tǒng)。


圖l是本發(fā)明的體外檢測(cè)分析物對(duì)生物體的效應(yīng)的系統(tǒng)示意圖，其中， Sl， S2，…SN為容器，每一容器中可加入一種細(xì)胞或組織；
C'和C為容器形式的管段，容器中可加入分析物； W為蠕動(dòng)泵；T為連接蠕動(dòng)泵和容器C'和C的軟管；
T1，T2，…TN和Tl， ，T2，，…TN，為輸液管路； 閉合回路中液體流動(dòng)方向?yàn)閺腃'流向C。 圖2是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法獲得的基因差異表達(dá)圖譜。 圖3是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法獲得的蛋白芯片檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，將各個(gè)裝有細(xì)胞或組織的不同
容器分別同裝有分析物溶液的容器相連，并通過(guò)泵產(chǎn)生液體回路。由于與分析物 接觸的各細(xì)胞或組織是處于一個(gè)完整的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)中，彼此之間相互影響相互作 用，與真實(shí)的生物體體內(nèi)過(guò)程更加接近，因此可以實(shí)現(xiàn)安全可靠的體外生物測(cè) 定。
體外檢淵分析物對(duì)生物體的效應(yīng)的方法和系統(tǒng)
本發(fā)明提供的體外檢測(cè)分析物對(duì)生物體的效應(yīng)方法，需要構(gòu)建檢測(cè)系統(tǒng)， 所述的系統(tǒng)包括(i) n個(gè)用于盛放細(xì)胞或組織的容器Sn， n大于等于2，各 容器S具有進(jìn)口和出口 ，各容器Sn的出口處設(shè)有阻止細(xì)胞或組織通過(guò)的濾材， 各容器Sn的進(jìn)口和出口可拆卸且密封地與管路Tn和Tn'相連；和(ii)至少 一個(gè)泵W，各容器Sn通過(guò)管路Tn和Tn'與泵W液體連通。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述系統(tǒng)還包括將管路Tn禾B/或Tn'匯總后與 W連通的管段C和/或C'，所述管段C和/或C'與各管路Tn和/或Tn'以及與泵 W可拆卸且密封連接。
本發(fā)明提供的方法中，分析物可以本領(lǐng)域常用的方法加入，如注射加入管 路中，或直接加入各容器中。 一種優(yōu)選的方式是加入管路匯總后與泵連通的管
段c和/或c'中。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，所述的方法包括以下步驟-
(1) 將適量分析物分別加入管段C'和C (如圖l)的培養(yǎng)液中；
(2) 用軟管和泵將管段C'和C連接起來(lái)，其中泵的位置在管段C'和C
之間；
(3) 將n (n》2)種適量細(xì)胞或組織及培養(yǎng)液分別加入一個(gè)實(shí)驗(yàn)容器Sn， 然后將這些實(shí)驗(yàn)容器用輸液管路分別并聯(lián)到管段C，和C，并使每一個(gè)實(shí)驗(yàn)容 器都與管段C'和C以及泵形成閉合回路；
(4) 將所有管段和實(shí)驗(yàn)容器置于合適的溫度環(huán)境，如34 — 4(TC，更佳地 為35 —38°C;
(5) 啟動(dòng)泵，讓管段C，中的溶液流向管段C，管段C中的溶液流向每一 個(gè)實(shí)驗(yàn)容器，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)容器中的溶液則流回管段C'，如此反復(fù)，直到實(shí)驗(yàn) 周期結(jié)束；
(6) 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)容器中細(xì)胞或組織的指標(biāo)變化。
在本發(fā)明提供的方法中，分析物指擬研究、實(shí)驗(yàn)的藥物、前體藥物、食品 添加劑、飲料、化妝品、消毒劑、飼料添加劑、農(nóng)藥、除草劑、化肥等化學(xué)物 質(zhì)和成分。
所述的培養(yǎng)液指能保證各種細(xì)胞或組織在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)生存的通用培養(yǎng)液，
如人或動(dòng)物的血清、包括RPMI 1640， DMEM, Eagle， s MEM， TC199， Ham， s F10, F12在內(nèi)的各種合成培養(yǎng)基等；如果實(shí)驗(yàn)周期很短，也可以用Hanks液。這些 培養(yǎng)液或培養(yǎng)用溶液已經(jīng)是本領(lǐng)域的成熟產(chǎn)品，可以從國(guó)內(nèi)外的許多公司(如 Life Technology, Hylone, Sigma等公司)訂購(gòu)。也可以參照文獻(xiàn)方法(吳冠 云等編著，生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用數(shù)據(jù)手冊(cè)，科學(xué)出版社，1999年。 裴國(guó)獻(xiàn)等主編，組織工程學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，人民軍醫(yī)出版社，2006年)自己配制。
所述的n種細(xì)胞或組織是人為選定的，擬通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究加以考察確定分析 物是否對(duì)其有影響的n種細(xì)胞或組織。例如，要考察分析物的代謝物對(duì)其他細(xì) 胞或組織的影響時(shí)，n種細(xì)胞或組織之一為肝細(xì)胞或肝組織。
可以使用本領(lǐng)域常用的泵，只要可以使液體產(chǎn)生定向的流動(dòng)，優(yōu)選蠕動(dòng)泵。 泵的轉(zhuǎn)速可調(diào)節(jié)，以獲得最佳的泵流量，如流動(dòng)速度3—10ml/分鐘，優(yōu)選5 — 8ml/分鐘。
對(duì)于管路的材料沒(méi)有限制，本領(lǐng)域熟知的各種生物相容性材料均可采用。 例如，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的軟管將蠕動(dòng)泵W、管段C'和C連接，優(yōu)選硅橡 膠軟管，也可以采用聚四氟乙烯或或石英毛細(xì)管。
容器S的出口處有濾材，以防止細(xì)胞流出容器。由于大部分細(xì)胞的直徑大 于IO微米，所用截流值為10-20微米的濾材。濾材的材質(zhì)沒(méi)有限制，本領(lǐng)域 熟知的各種生物相容性材料均可采用，例如尼龍濾膜。濾材的形式可以是在管 路端口塞入適量聚酯纖維或玻璃纖維，也可以購(gòu)買(mǎi)專(zhuān)門(mén)的細(xì)胞濾器接入管路。
實(shí)驗(yàn)溫度以接近人和動(dòng)物的體溫為宜，例如34-38°〇。
本發(fā)明方法可檢測(cè)效應(yīng)包括但不限于以下種類(lèi)指標(biāo)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)細(xì)胞 的數(shù)量、形態(tài)的變化；細(xì)胞或組織的基因表達(dá)水平的變化；細(xì)胞或組織的蛋白 水平的變化；細(xì)胞或組織的生化指標(biāo)的變化；細(xì)胞或組織的生理指標(biāo)的變化。
分析物的加量取決于預(yù)定的分析物待測(cè)濃度，通常，分析物的質(zhì)量除以實(shí) 驗(yàn)體系中液體總體積所得應(yīng)等于所述預(yù)定濃度。
細(xì)胞或組織的加量應(yīng)不少于獲取檢測(cè)結(jié)果所需的最小需量。同時(shí)，當(dāng)檢測(cè) 分析物對(duì)多種細(xì)胞或組織的效應(yīng)時(shí)，各細(xì)胞或組織的加量之比應(yīng)盡可能接近它
們?cè)谑д`體內(nèi)的天然比例。所述天然比例為本領(lǐng)域常識(shí)，在諸多現(xiàn)有文獻(xiàn)例如 解剖學(xué)、生理學(xué)經(jīng)典教科書(shū)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)等中多有記載。所述生物體可以是 例如但不限于哺乳動(dòng)物，例如家畜，畜牧動(dòng)物，寵物，或者人。
容器S的體積可以根據(jù)細(xì)胞或組織的量，在方便操作的情況下選擇盡可能 小的容器，這有利于節(jié)省試劑用量等實(shí)驗(yàn)自愿。然而，容器s應(yīng)能容納滿(mǎn)足取 自細(xì)胞或組織維持所需的足量培養(yǎng)液。這樣的"足量培養(yǎng)液"是細(xì)胞或組織培 養(yǎng)領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的常識(shí)。
出于簡(jiǎn)化系統(tǒng)總體積計(jì)算和簡(jiǎn)化細(xì)胞或組織加量與培養(yǎng)液加量匹配的考 慮，系統(tǒng)中管路的體積宜盡可能小。
系統(tǒng)中培養(yǎng)液的總體積應(yīng)當(dāng)根據(jù)所選細(xì)胞或組織所對(duì)應(yīng)的生物體的該細(xì) 胞或組織與體液天然比例來(lái)確定。所述天然比例為本領(lǐng)域常識(shí)，在諸多現(xiàn)有文 獻(xiàn)例如解剖學(xué)、生理學(xué)經(jīng)典教科書(shū)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)等中多有記載。
系統(tǒng)中加入的培養(yǎng)液體積之和應(yīng)當(dāng)?shù)扔趯?shí)驗(yàn)體系中液體的總體積。根據(jù)細(xì) 胞對(duì)應(yīng)的生物體種類(lèi)，最佳泵流量宜設(shè)定為完成密閉回路中所有液體一次循 環(huán)所需的時(shí)間與該生物體的體液循環(huán)一次的時(shí)間相近。所述體液例如但不限于 血液。
發(fā)明方法中需要設(shè)定或調(diào)定的因素包括分析物的濃度，細(xì)胞的種類(lèi)、用 量，培養(yǎng)液總量，泵流速等。
用本領(lǐng)域常規(guī)的方法檢測(cè)細(xì)胞或組織的細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)的變化；細(xì)胞或 組織的基因表達(dá)水平的變化；細(xì)胞或組織的蛋白水平的變化；細(xì)胞或組織的生 化指標(biāo)的變化；細(xì)胞或組織的生理指標(biāo)的變化等。
本發(fā)明實(shí)施過(guò)程中需要注意的事項(xiàng)及操作要領(lǐng)，與細(xì)胞培養(yǎng)和體外細(xì)胞實(shí) 驗(yàn)相同，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。
采用本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法，管段C'和C以及泵的作用相當(dāng)于心臟，管路的 作用相當(dāng)于血管，容器S根據(jù)所盛的細(xì)胞或組織不同，就相當(dāng)于不同的器官。 分析物對(duì)容器S內(nèi)細(xì)胞或組織的效應(yīng)相當(dāng)于其進(jìn)入生物體內(nèi)對(duì)相應(yīng)細(xì)胞或組織 的效應(yīng)。假設(shè)，把人或動(dòng)物的心、腦、肝、腎的細(xì)胞或組織分別放入本發(fā)明系 統(tǒng)的各容器S內(nèi)，按照本發(fā)明的方法運(yùn)行該系統(tǒng)，就可以研究實(shí)驗(yàn)分析物及其 經(jīng)肝的代謝產(chǎn)物對(duì)上述各主要器官細(xì)胞的影響。采用本發(fā)明的方法，由于與分 析物接觸的各細(xì)胞或組織是處于一個(gè)完整的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)中，彼此之間相互影響相
互作用，與真實(shí)的生物體體內(nèi)過(guò)程更加接近，所得到的研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加有實(shí) 踐指導(dǎo)價(jià)值。
用途
由于制藥工業(yè)的飛速發(fā)展，藥物篩選、藥物安全性評(píng)價(jià)和藥物的質(zhì)量控制 受到普遍關(guān)注。特別是中藥，由于其成分特別復(fù)雜，藥源大多為天然動(dòng)植物， 受產(chǎn)地、季節(jié)、加工方法的影響很大，目前尚無(wú)好的方法用于其篩選、安全評(píng) 價(jià)和質(zhì)量控制。
本發(fā)明提供的系統(tǒng)可用于藥物的有效性與安全性的篩選和質(zhì)量控制中，所 述藥物優(yōu)選中藥或植物提取物。
本發(fā)明提供的方法和系統(tǒng)可以在幾小時(shí)內(nèi)獲得所實(shí)驗(yàn)的藥物或成份在動(dòng) 物或人體內(nèi)是否有效、無(wú)毒的信息，避免了昂貴費(fèi)時(shí)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
1、 在體外更好的模擬分析物和各細(xì)胞或組織的相互作用和影響；
2、 試驗(yàn)結(jié)果更接近在生物體內(nèi)的情況；
3、 試驗(yàn)安全性高，結(jié)果可靠；
4、 可實(shí)現(xiàn)高通量研究，且耗時(shí)少。
以下通過(guò)特定的具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 通過(guò)實(shí)施例所揭示的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明也可通 過(guò)其它不同的具體實(shí)施例加以施行或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可基于不 同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在不背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾與變更。
實(shí)施例l 檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)建
l.取1.5ml的微型離心管4支，分別標(biāo)為S1，S2， C， ，C(見(jiàn)圖l);另 取4根10厘米長(zhǎng)，內(nèi)徑800微米的聚四氟乙烯毛細(xì)管，分別標(biāo)為 T1,T2，T1， ，T2' ;1根20厘米長(zhǎng)，內(nèi)徑1毫米的硅橡膠軟管，標(biāo)為T(mén);管路 (T1，T2，T1， ，T2， ，T)總體積為178微升。
1臺(tái)微型蠕動(dòng)泵(BT00-50M/DG-1型，購(gòu)自保定蘭格恒流泵有限公司)，
標(biāo)為W;自制的橡皮塞4支，可以用OO號(hào)橡皮塞用刀切割成適宜大小形狀，
適合于塞緊1. 5ml微型離心管，塞子的大小應(yīng)使加塞后的1. 5ml離心管容積為 1.2ml。此時(shí)系統(tǒng)的總?cè)莘e約為5ml。
2. 在所有的微型離心管管塞上打孔。
3. 將硅膠軟管T穿過(guò)蠕動(dòng)泵泵頭，使管的中部夾緊在泵頭上。
4. 將軟管T的兩端分別插入微型離心管C和C'的管塞孔，將Tl管的兩端 分別插入微型離心管C和Sl的管塞孔，將T2管的兩端分別插入微型離心管C 和S2的管塞孔，將T1'管的兩端分別插入微型離心管S1和C'的管塞孔，將 T2'管的兩端分別插入微型離心管S2和C'的管塞孔。插管時(shí)應(yīng)注意，所有微 型離心管的進(jìn)液管的管口應(yīng)在離心管的底部，出液管的管口應(yīng)在離心管的上 部，并在管口內(nèi)塞入適量玻璃纖維，以避免細(xì)胞流出。
5. 將各離心管中充滿(mǎn)水，開(kāi)啟蠕動(dòng)泵，檢査體系的密封性。若管路溶液流 動(dòng)正常，無(wú)泄漏，則構(gòu)建了一體外生物測(cè)定裝置。
6. 將管路中的水棄去，并將實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行常規(guī)無(wú)菌處理。
實(shí)施例2 分析物制備
萘是一種工業(yè)原料。作為一種環(huán)境毒物，可以作為本實(shí)施例的分析物。我 們將待測(cè)濃度設(shè)計(jì)為0.5nmol/ml。將試劑商店買(mǎi)來(lái)的萘球研碎成粉末，稱(chēng)取 128mg溶解在lml無(wú)水乙醇中，然后取3微升加入3ml DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自捷瑞 生物工程(上海)有限公司，Cat.共920086)中，混勻，終濃度為lnmol/ml (128ng/ml)。上述操作為無(wú)菌操作。
實(shí)施例3 獲取細(xì)胞
1. 獲取肝細(xì)胞從中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海200031岳陽(yáng)路320號(hào)中國(guó)科 學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)購(gòu)買(mǎi)培養(yǎng)的人肝細(xì)胞(L-02) 107個(gè)。
2. 獲取肺細(xì)胞從中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi)培養(yǎng)的人胚肺細(xì)胞(HLF) 107個(gè)。
實(shí)施例4 檢測(cè)I
注所有操作為無(wú)菌操作 已知
1. 人體肝臟重量約為1.2Kg，人肺臟的重量約為1Kg;成年人的總血量約 為5000ral，其中80%參與血液循環(huán)(約為4000ml) ， 20%儲(chǔ)存在肝臟、脾臟。
(左明雪主編，人體解剖生理學(xué)，高等教育出版社，2003年8月，第一版)
2. 人肝臟約有2. 5X 109個(gè)肝細(xì)胞；
C http: //www. 39. net/disease/LiverDiseases/hbv/ygzlk/.jkzx/s 1/196 352. html)
3. 人安靜時(shí)，每次心臟搏動(dòng)的心輸出量約為70ml/博，按人體平均心率75 次/分鐘計(jì)算，則一分鐘心臟的血流量為5250ml;(左明雪主編，人體解剖生 理學(xué)，高等教育出版社，2003年8月，第一版)
4. 檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平所需的細(xì)胞數(shù)約為106個(gè)；檢測(cè)細(xì)胞中蛋白水 平所需的細(xì)胞數(shù)約為105個(gè)；檢測(cè)細(xì)胞死亡指標(biāo)所需的細(xì)胞數(shù)約為103個(gè)；(基 因表達(dá)譜芯片和蛋白芯片產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))
因此，為保證能夠檢測(cè)細(xì)胞基因表達(dá)水平的變化，細(xì)胞的數(shù)量必須大于106
個(gè)。由于人體中肝臟和肺臟的重量比約為1: 1，所以，在本實(shí)施例中，確定肝
細(xì)胞和肺細(xì)胞的用量均為3X1()6個(gè)。人肝臟含有2. 5X109個(gè)肝細(xì)胞，此時(shí)，人 體參加循環(huán)的血液體積為4000ml，因此使用3X106個(gè)肝細(xì)胞作為細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng) 液的總體積應(yīng)當(dāng)為(3X 106X4000) /2. 5X 109 ml=4.8ml。由于一分鐘心臟的 血流量為5250ml，人體參加循環(huán)的血液體積為4000ml，因此在本實(shí)施例中， 培養(yǎng)液的總體積為4. 8ml時(shí)，要使得所有培養(yǎng)液一次循環(huán)所需的時(shí)間與人的血 液循環(huán)一次的時(shí)間相近，則蠕動(dòng)泵的流量應(yīng)為(5250/4000) X4. 8=6. 3ml。 測(cè)定方法-
1. 將實(shí)施例l構(gòu)建的裝置放入一恒溫箱中，37。C保溫。
2. 將實(shí)施例2制備的分析物溶液各取1. 2ml分別放入實(shí)施例1所述的微型 離心管C'和C中，塞緊管塞。
3. 將實(shí)施例3獲取的肝細(xì)胞和肺細(xì)胞各取三分之一，分別用1.2ml DMEM 培養(yǎng)基懸浮，轉(zhuǎn)入實(shí)施例1所述的微型離心管S1和S2中，塞緊管塞。
4. 待體系溫度恒定后，啟動(dòng)蠕動(dòng)泵，調(diào)整轉(zhuǎn)速，使其流量達(dá)到6. 3ml/分鐘。 5.2小時(shí)后，停止蠕動(dòng)泵。將S2中的肺細(xì)胞混懸液用DMEM培養(yǎng)基稀釋到
200-2000個(gè)細(xì)胞/ml，取出100ul懸液，加入0. lml的0. 4%的臺(tái)盼蘭溶液，輕
輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞?；罴?xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)
色的細(xì)胞是死細(xì)胞。結(jié)果表明，肺細(xì)胞死亡率達(dá)30%。
5.將Sl中的肝細(xì)胞混懸液1000轉(zhuǎn)/分鐘離心，棄去上清液，將肝細(xì)胞按 文獻(xiàn)(P.鮑爾迪，G.W.哈特菲爾德著，DNA芯片和基因表達(dá)-從實(shí)驗(yàn)到數(shù)據(jù)分析 與模建[影印版]，科學(xué)出版社，2003年10月第一版)方法，抽提mRNA，反轉(zhuǎn) 錄成cDNA并用熒光染料Cy3標(biāo)記；另取未與分析物作用的等量肝細(xì)胞作為對(duì) 照，也按上述方法抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA并用熒光染料Cy5標(biāo)記；然后將兩 種不同標(biāo)記的cDNA混合，與人表達(dá)譜芯片(Agilent Technologies, Human 1A oligo microarray kit(V2))按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行雜交、檢測(cè)，肝細(xì)胞的基因表 達(dá)圖(局部)如圖2A所示。
實(shí)施例5
檢淵n
按照實(shí)施例4的方法，只是S1中不加肝細(xì)胞，2小時(shí)后考察肺細(xì)胞的死亡
情況°
結(jié)果表明，不加肝細(xì)胞時(shí)，肺細(xì)胞與分析物作用2小時(shí)未見(jiàn)明顯死亡。將 剩余的肺細(xì)胞按文獻(xiàn)方法(M.謝納著，蛋白質(zhì)芯片[影印版]，科學(xué)出版社，2005 年4月第一版)，與蛋白芯片(康成生物工程有限公司，Cat#:HM5000)按說(shuō) 明書(shū)要求進(jìn)行反應(yīng)，肺細(xì)胞中蛋白芯片檢測(cè)圖(局部)如圖3A所示。
實(shí)施例6 檢測(cè)III
按照實(shí)施例4的方法，只是C和C'中用空白培養(yǎng)基代替含分析物的培養(yǎng) 基，2小時(shí)后考察肺細(xì)胞的死亡情況。
結(jié)果表明，不加分析物時(shí)，肝細(xì)胞、肺細(xì)胞2小時(shí)未見(jiàn)死亡。將肝細(xì)胞按 實(shí)施例4方法用同樣的表達(dá)譜芯片檢測(cè)肝細(xì)胞基因表達(dá)情況，圖譜(局部)如 圖2B所示。肺細(xì)胞按實(shí)施例5方法用同樣的蛋白芯片檢測(cè)肺細(xì)胞蛋白，肺細(xì) 胞中蛋白芯片檢測(cè)圖(局部)如圖3B所示。
圖2A和B兩張肝細(xì)胞基因表達(dá)水平的差異表明萘對(duì)肝細(xì)胞基因表達(dá)是有 影響的。圖3A和B兩張肺細(xì)胞蛋白芯片檢測(cè)圖基本一致，說(shuō)明萘對(duì)肺細(xì)胞蛋
白的影響不大。結(jié)合細(xì)胞死亡結(jié)果顯示，萘本身對(duì)人細(xì)胞的毒性極小，但其代 謝產(chǎn)物對(duì)肺細(xì)胞有較大毒性。這與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)萘的研究結(jié)果完全吻合從黎明，
胡家慶等在"萘毒性的研究進(jìn)展"(中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2002， 3 (3) : 252-254) 中揭示萘本身對(duì)人細(xì)胞的毒性極小，但其代謝產(chǎn)物對(duì)肺細(xì)胞有較大毒性，萘 代謝產(chǎn)物在體內(nèi)達(dá)到0. 25nmol/ml時(shí)，對(duì)肺細(xì)胞有明顯毒性。
由此可見(jiàn)，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)，不需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)就可提供可靠的檢測(cè)信息。 而且，本發(fā)明系統(tǒng)和方法能夠很好的模擬生物體的循環(huán)環(huán)境，通過(guò)一次試驗(yàn)給 出分析物對(duì)多細(xì)胞或多臟器總和效應(yīng)的結(jié)果，這是傳統(tǒng)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)無(wú)法實(shí)現(xiàn) 的。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn) 被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申 請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種體外檢測(cè)分析物對(duì)生物體的效應(yīng)的方法，其特征在于，它包括步驟a.構(gòu)建檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括n個(gè)用于盛放細(xì)胞或組織的容器Sn，n大于等于2，各容器S具有進(jìn)口和出口，各容器Sn的出口處設(shè)有阻止細(xì)胞或組織通過(guò)的濾材，各容器Sn的進(jìn)口和出口可拆卸且密封地與管路Tn和Tn’相連；和至少一個(gè)泵W，各容器Sn通過(guò)管路Tn和Tn’與泵W液體連通；b.在容器Sn中加入不同的細(xì)胞或組織，其加量不小于獲得測(cè)定結(jié)果所需的細(xì)胞或組織的最小需量，不同細(xì)胞或組織加量之比符合它們?cè)谏矬w內(nèi)的天然含量之比；c.向系統(tǒng)中加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的加量與各細(xì)胞或組織加量之比符合它們?cè)谏矬w內(nèi)的天然含量之比；d.向系統(tǒng)中加入分析物；e.啟動(dòng)泵W，設(shè)定其流速使得系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)基的循環(huán)周期符合生物體內(nèi)的體液循環(huán)周期；f.定時(shí)從容器Sn中取樣，檢測(cè)分析物對(duì)其中細(xì)胞或組織產(chǎn)生的效應(yīng)。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述系統(tǒng)還包括將管路Tn和 /或Tn'匯總后與W連通的管段C和/或C'，所述管段C和/或C'與各管路Tn和 /或Tn'以及與泵W可拆卸且密封連接。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，從管段C和/或C'加入分析物。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生物體是哺乳動(dòng)物。
5. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述體液是血液。
6. —種體外測(cè)定分析物對(duì)生物體的效應(yīng)的系統(tǒng)，其特征在于，它包括n個(gè)用于盛放細(xì)胞或組織的容器Sn， n大于等于2，各容器S具有進(jìn)口和 出口，各容器S的出口處設(shè)有阻止細(xì)胞或組織通過(guò)的濾材，各容器S的進(jìn)口和 出口可拆卸且密封地與管路Tn和Tn'相連；和至少一個(gè)泵W，各容器Sn通過(guò)管路Tn和Tn'與泵W液體連通。
7. 如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，它還包括將管路Tn和/或Tn' 匯總后與W連通的管段C和/或C'，所述管段C和/或C'與各管路Tn和/或Tn' 以及與泵W可拆卸且密封連接。
8. 如權(quán)利要求6或7所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述各容器Sn的容量不 小于獲得測(cè)定結(jié)果所需的細(xì)胞或組織的最小需量。
9. 如權(quán)利要求6或7所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述各容器Sn的容量之 比滿(mǎn)足其中不同細(xì)胞或組織的含量之比符合它們?cè)谏矬w內(nèi)天然含量比的要 求。
10. 如權(quán)利要求6或7所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)的總?cè)萘颗c各 容器Sn的容量與之比不小于生物體內(nèi)循環(huán)體液與所述不同細(xì)胞或組織的天然 含量比。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種體外檢測(cè)分析物對(duì)生物體的效應(yīng)的方法，它是將裝有分析物的容器通過(guò)泵分別與裝有不同細(xì)胞或組織的容器連接并形成回路；通過(guò)起動(dòng)泵使液體自裝有分析物的容器流向各裝有細(xì)胞或組織的容器，并分別流回裝有分析物的容器；然后檢測(cè)裝有細(xì)胞或組織的容器中指標(biāo)的變化。本發(fā)明還公開(kāi)了可運(yùn)用上述方法的裝置。
文檔編號(hào)G01N33/00GK101187655SQ20061011835
公開(kāi)日2008年5月28日 申請(qǐng)日期2006年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月15日
發(fā)明者刑軍芬, 濱 朱 申請(qǐng)人:上海百傲科技有限公司