專利名稱：不含活污染顆粒的腺病毒、其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的病毒載體，它們的制備和基因治療用途。還涉及含有所述病毒載體的藥物組合物。更具體地，本發(fā)明涉及作為基因治療載體的重組腺病毒。
基因治療在于通過向病體細(xì)胞或器官中引入一種遺傳信息以糾正缺陷或異常(突變、異常表達(dá)等)。該遺傳信息或在體外引入從器官中取出的細(xì)胞中，然后修飾后的細(xì)胞再返回機(jī)體中，或在體內(nèi)直接引入適當(dāng)組織中。在后一情形下，存在不同技術(shù)，其中各種轉(zhuǎn)染技術(shù)涉及DNA與DEAE-葡聚糖的復(fù)合物(Pagano等，病毒學(xué)雜志1(1967)891)、DNA與核蛋白的復(fù)合物(Kaneda等，科學(xué)243(1989)375)、DNA與脂質(zhì)的復(fù)合物(Felgner等，PNAS84(1987)7413)、脂質(zhì)體的使用(Fraley等，生物學(xué)化學(xué)雜志255(1980)10431)等。最近，使用病毒作為轉(zhuǎn)移基因的載體已顯示是這些物理轉(zhuǎn)染技術(shù)的有利替代技術(shù)。關(guān)于這一點，已經(jīng)試驗了不同病毒感染某些細(xì)胞群的能力。特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒(RSV、HMS、MMS等)、HSV病毒、腺伴隨病毒和腺病毒。
在這些病毒中，腺病毒具有用于基因治療的某些令人感興趣的特征。特別是，它具有足夠大的宿主譜，能夠感染休止細(xì)胞，不整合在所感染細(xì)胞的基因組中，迄今未發(fā)現(xiàn)與人體重要疾病有關(guān)。因而腺病毒已用于向肌肉(Ragot等，自然361(1993)647)、肝(Jaffe等，自然遺傳學(xué)1(1992)372)、神經(jīng)系統(tǒng)(Akli等，自然遺傳學(xué)3(1993)224)等中轉(zhuǎn)移目標(biāo)基因。
腺病毒是其中線性雙鏈DNA長約36kb的病毒。其基因組中特別包括每個末端的反向重復(fù)序列(ITR)、包衣序列(Psi)、早熟基因和延遲基因(參見

圖1)。主要的是熟基因包含在E1、E2、E3和E4區(qū)中。其中，含于E1區(qū)(特別是E1a和E1b)中的基因是病毒復(fù)制所必需的。例如E4和L5區(qū)是病毒繁殖所涉及的區(qū)域。主要的延遲基因含于L1到L5區(qū)中。腺病毒Ad5的基因組已完全測序，并可在已知材料中獲得(尤其見Genebank M73260)。同樣，不同血清型腺病毒(Ad2，Ad7Ad12等)基因組的部分甚至全部也已測序。
考慮到以上提及的腺病毒特征，它們已用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。實際上已制備了帶有不同基因(β-gal、OTC、α-1AT、細(xì)胞因子等)的來自腺病毒的不同載體。在每種載體的構(gòu)建中，腺病毒經(jīng)修飾使其在受染細(xì)胞中不能復(fù)制。例如，現(xiàn)有技術(shù)中描述的構(gòu)建是腺病毒在E1(E1a和/或E1b)和任選的E3區(qū)缺失，并在相應(yīng)位置插入外源DNA序列(Levrero等，基因，101(1991)195；Gosh-Choudhury等，基因，50(1986)161)。另一些構(gòu)建則是在E1區(qū)和E4區(qū)的非必要部分含有缺失(WO94/12649)。然而現(xiàn)有技術(shù)中描述的載體仍有某些限制其在基因治療中應(yīng)用的缺點。尤其是，現(xiàn)有技術(shù)中所述類型的重組病毒產(chǎn)品可被復(fù)制性顆粒(特別是野生型)所污染。
目前，腺病毒衍生載體實際上是在一種互補(bǔ)細(xì)胞系(293細(xì)胞系)中產(chǎn)生的，該細(xì)胞系中已整合了腺病毒基因組的一部分。更具體講，293細(xì)胞系含有Ad5型(血清型5)腺病毒基因組的左端(約11-12％)，包括左側(cè)ITR、包衣區(qū)和E1區(qū)，E1區(qū)包括E1a、E1b和pIX蛋白編碼區(qū)的一部分。該細(xì)胞系能夠與E1區(qū)缺陷的重組腺病毒反式互補(bǔ)，上述E1區(qū)缺陷指缺少復(fù)制必需的E1區(qū)的全部或部分。實際上，由于該細(xì)胞系中所含E1區(qū)的良好的反式互補(bǔ)，從而可以在293細(xì)胞中制備E1-的重組腺病毒。然而在整合于細(xì)胞系基因組中的腺病毒區(qū)和所希望產(chǎn)生的重組病毒的DNA之間存在同源區(qū)。因此在生產(chǎn)過程中可能發(fā)生不同的重組事件，產(chǎn)生復(fù)制性病毒顆粒，尤其是E1+型腺病毒。如圖2中所示，這可能涉及簡單重組事件，隨后染色體斷裂(圖2A)，或涉及雙重重組(圖2B)。這兩種類型的修飾導(dǎo)致不含E1功能區(qū)的重組DNA左側(cè)部分被含一個拷貝E1功能區(qū)的細(xì)胞基因組中的相應(yīng)部分代替。另外，考慮到293細(xì)胞系產(chǎn)生的重組載體的高滴度(大于1012)，發(fā)生重組事件的可能性應(yīng)較高。事實上已證明許多批次的缺陷重組腺病毒載體被復(fù)制性病毒顆粒污染。
復(fù)制性顆粒的污染構(gòu)成一個很大的缺點。事實上，治療組合物中存在這種顆粒在體內(nèi)可引起病毒繁殖和無控制地擴(kuò)散，可能引起炎癥反應(yīng)、重組等。因而這些被污染的批次不能用于人體治療。
本發(fā)明克服了這些缺點。本發(fā)明實際描述一種新的構(gòu)建方法，使產(chǎn)生的缺陷重組腺病毒完全不被復(fù)制性顆粒污染。本發(fā)明還描述一種產(chǎn)生這些重組腺病毒的方法。本發(fā)明從而提供衍生自腺病毒的新的缺陷重組載體，特別是適于基因治療應(yīng)用的載體，尤其是適用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)。
更具體講，本發(fā)明在于含有腺病毒基因組的缺陷重組腺病毒的構(gòu)建，該基因組的基因結(jié)構(gòu)有改變，其與生產(chǎn)細(xì)胞系基因組的可能組合導(dǎo)致產(chǎn)生非復(fù)制性和/或非存活的病毒顆粒。本申請人現(xiàn)證明，可能改變腺病毒的基因組結(jié)構(gòu)以避免在大量生產(chǎn)過程中產(chǎn)生復(fù)制性顆粒。
本發(fā)明的第一個目的是含有腺病毒基因組的重組腺病毒，該基因組(i)E1區(qū)失活，(ii)基因組結(jié)構(gòu)改變，和(iii)與生產(chǎn)細(xì)胞系的基因組的可能重組導(dǎo)致產(chǎn)生非存活的病毒顆粒。
在本發(fā)明的意義上，基因結(jié)構(gòu)或基因組結(jié)構(gòu)應(yīng)理解為野生腺病毒基因組中不同基因或功能區(qū)的布置，如圖1中所示。經(jīng)改變的基因或基因組結(jié)構(gòu)相應(yīng)于其中某些基因或某些區(qū)域已不在其原始位置的基因組。例如，某些基因或區(qū)域可從基因組中除去并插入在另一位點上。也可以在一特別的位點插入給定的基因或區(qū)域，并消除或滅活該原始區(qū)域(通過突變、缺失、插入等)。
術(shù)語“非存活病毒顆粒”在本發(fā)明意義上指在被感染的細(xì)胞中不能復(fù)制其DNA和/或自主增殖的腺病毒。一種非存活病毒顆粒從而具有這樣的腺病毒基因組至少缺少在所感染細(xì)胞中復(fù)制和/或增殖所必需的序列。這些區(qū)域或被消除(全部或部分)，或使得非功能化、或被其他序列替代。復(fù)制和/或增殖的必需序列例如是E1區(qū)、E4區(qū)或L5區(qū)。更具體地講，關(guān)于E4區(qū)，重要的基因是ORF3和ORF6基因。
更具體地講，本申請人證明可以除去病毒復(fù)制或增殖所必需的功能，而不影響作為基因治療載體的腺病毒特征，即其對細(xì)胞(特別是人的)的高感染能力和其有效地轉(zhuǎn)移目標(biāo)基因至所述細(xì)胞中的能力。例如，在一優(yōu)選方案中，本發(fā)明的目的是這樣的重組腺病毒，其中病毒復(fù)制和/或增殖所必需的一個區(qū)域在基因組中的位置不是其原始位置。該區(qū)域最好位于或鄰近另一已非功能化的基因組區(qū)域中。
本發(fā)明的載體特別有利，因為它們允許摻入長目標(biāo)基因，可以以高滴度生產(chǎn)，而不產(chǎn)生被污染的可復(fù)制病毒顆粒。
在本發(fā)明的載體中，E1區(qū)或所有其他區(qū)域可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同技術(shù)進(jìn)行滅活或非功能化，特別是抑制、替代、缺失和/或增加一個或多個堿基。借助于基因工程技術(shù)或者還有誘變劑的處理，可在體外(在分離的DNA上)或就地獲得這種修飾。所述基因修飾可位于該區(qū)的編碼部分之中或編碼部分之外，例如在負(fù)責(zé)所述基因的表達(dá)和/或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的區(qū)域。這種失活可以表現(xiàn)為由于結(jié)構(gòu)或構(gòu)型修飾而產(chǎn)生無活性蛋白，不產(chǎn)生蛋白，產(chǎn)生活性改變的蛋白，或以低水平或預(yù)想的調(diào)節(jié)方式產(chǎn)生天然蛋白。
對于可用于滅活的誘變劑，例如可舉出物理誘變劑如能量輻射(X線、γ線、紫外線等)，或能夠與DNA堿基不同功能團(tuán)反應(yīng)的化學(xué)試劑，例如烷化劑[甲磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍、N-硝基喹啉-1-氧化物(NQO)]、二烷化劑、嵌入劑等。
基因修飾還可以通過基因斷裂來獲得，例如按照最先由Rothstein描述的方法[酶學(xué)方法，101(1983)202]。此時，優(yōu)選擾及編碼序列的全部或部分，以便通過同源重組使該基因組序列由非功能序列或突變序列替代。
優(yōu)選地，本發(fā)明腺病毒中相關(guān)區(qū)域通過一個或多個堿基的突變和/或缺失而滅活。更優(yōu)選通過全部或部分缺失而滅活。
更具體講，缺失應(yīng)理解為對所有有關(guān)基因的全部或部分的抑制。特別涉及所述基因編碼區(qū)的全部或部分，和/或所述基因的轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)的整體或部分。這種抑制可如實施例中所示，按分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用適宜的限制酶消化，然后連接來實現(xiàn)。
基因滅活的特別優(yōu)選的方式是只影響目標(biāo)基因而不影響其他病毒基因(尤其是相鄰基因)的方式。另外，某些變異如點突變能夠被自然校正或通過細(xì)胞機(jī)制被削弱，特別優(yōu)選這種失活的分離性和/或不可逆性絕對穩(wěn)定。
通過完全或部分缺失滅活時，病毒存活必需區(qū)優(yōu)選位于或鄰近缺失位點。但也可以利用其他插入位點，例如野生基因組中已有的限制位點。但此時優(yōu)選在至少鄰近缺失位點的位置進(jìn)行插入，即在缺失位點之外，但靠近程度足以使得在缺失位點和插入位點之間不能發(fā)生重組。優(yōu)選缺失位點和插入位點之間的距離不應(yīng)超過50pb。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方案中，將病毒復(fù)制和/或增殖的必需區(qū)移位，以使其包含于失活的E1區(qū)和/或E3區(qū)中。
根據(jù)一種特別有利的方案，本發(fā)明的重組腺病毒中，E1區(qū)通過缺失Ad5腺病毒序列的核苷酸454-3328的PvuII-BglII片段而失活。這一序列可在文獻(xiàn)中也可以在數(shù)據(jù)庫(特別見Grenebank n°M73260)中找到。在另一優(yōu)選實施方案中，通過缺失核苷酸382-3446的HinfII-Sau3A片段來滅活E1區(qū)。
本發(fā)明的病毒復(fù)制和/或增殖必需區(qū)最好選自E4區(qū)和/或PIX-IVa2區(qū)和/或L5區(qū)等的全部或部分。
在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的方案中，必需區(qū)由E4區(qū)的全部或一個功能部分組成，并插入在E1缺失位點或其鄰近位點。根據(jù)該實施方案，對病毒增殖必需的E4區(qū)被插入在其原始位點以外的位置，使該區(qū)在整個構(gòu)建過程中不存在，在構(gòu)建中原本會與生產(chǎn)細(xì)胞系的基因組發(fā)生重組(參見圖3)。本發(fā)明從而還涉及這樣的重組腺病毒，其基因組的特征在于存在失活的E1和E4區(qū)，還在于E4區(qū)全部或部分功能區(qū)被插入在E1區(qū)或其附近。
這樣的腺病毒載體優(yōu)選含有兩個ITR、一個包衣區(qū)、E1區(qū)中有缺失并在相應(yīng)位置插入了E4的全部或部分功能區(qū)、和一個失活的原始E4區(qū)。
E4區(qū)與延遲基因的表達(dá)調(diào)節(jié)、延遲核RNA的穩(wěn)定性，細(xì)胞宿主蛋白表達(dá)的消滅和病毒DNA的復(fù)制效力有關(guān)。不包括E4的突變體不能增殖。E4因而構(gòu)成一種病毒復(fù)制和/或增殖的必需區(qū)。該E4區(qū)由7個開放讀碼框架組成，稱為ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF3/4、ORF6和ORF6/7(圖4)。其中ORF3和ORF6是病毒增殖必需的兩個基因。每個這種基因都能誘導(dǎo)病毒增殖。因此，E4區(qū)的滅活涉及ORF3和ORF6的滅活。
在一種特別方案中，本發(fā)明載體中，E4區(qū)整個插入在E1缺失位點或其附近。這特別涉及相應(yīng)于核苷酸35835-32720的MaeII-MscI片段。
在另一特別方案中，只插入了E4的一個功能部分，即足以允許病毒增殖的部分。該部分包括至少一種功能基因ORF3或ORF6。優(yōu)選E4的該功能部分主要由ORF3或ORF6組成。例如，可以以相應(yīng)于核苷酸34801-34329和34115-33126的PvuII-AluI和BglII-PvuII片段的形式分別從E4區(qū)分離這些編碼框架。
E4區(qū)或該區(qū)的功能部分最好還包含一個轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)。這可以是E4區(qū)的啟動子或所有其他功能性啟動子，如病毒啟動子(Ela，SV40，LTR-RSV等)，真核啟動子或哺乳動物啟動子。以E4區(qū)的啟動子為佳。
如上所示，插入E1中的E4功能部分不一定要對應(yīng)于在原位置所缺失的E4部分。例如，可通過點突變滅活原E4區(qū)(不缺失)，而在E1中插入一個功能性E4區(qū)。同樣，可以完全缺失原E4區(qū)，但在E1區(qū)僅插入一個功能部分。
在本發(fā)明的意義上，E4區(qū)的失活至少涉及ORF3和ORF6區(qū)的功能失活。這些原始區(qū)域可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)滅活。特別是，以上給出的所有方法均可用于ORF3和ORF6或E4的任何補(bǔ)充區(qū)的滅活。例如，Ad2dl808病毒或Ad5d11004、Ad5dl1007、Ad5dl1011或Ad5dl1014的E4區(qū)缺失可用于本發(fā)明范圍(參見實施例3)。
這些腺病毒例如可通過共轉(zhuǎn)染來獲得帶有所要產(chǎn)生病毒基因組左側(cè)部分(在E1區(qū)有缺失，在其中或附近插入了至少一個E4功能部分)的第一質(zhì)粒和帶有病毒基因組右側(cè)部分(含失活的E4區(qū))的病毒基因組DNA片段共轉(zhuǎn)染至生產(chǎn)細(xì)胞系中。重組后擴(kuò)增并分離所產(chǎn)生的病毒。這些腺病毒還可以通過含ITR加鄰接區(qū)的基因組兩末端對調(diào)而獲得。此時，本發(fā)明還涉及一種重組腺病毒，其特征在于其基因組具有失活的E1區(qū)，還在于包含ITR和包衣區(qū)的左末端和包含ITR和E4區(qū)全部或一個功能部分的右末端對換。更具體地講，含左側(cè)ITR和包衣區(qū)的左末端包含在Ad5腺病毒基因組的頭382個核苷酸中(例如直到HinfI位點)。同樣，含右側(cè)ITR和E4區(qū)全部或一個功能部分(其中含有E4區(qū)的啟動子)的右末端包含在Ad5腺病毒基因組的最后3215個核苷酸中(例如從32720位的MSCI位點開始)。本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)允許構(gòu)建本發(fā)明的重組病毒，其中右側(cè)ITR和E4區(qū)全部或部分現(xiàn)位于病毒的左側(cè)，然后是Ad5腺病毒基因組的3446-32720區(qū)，然后是現(xiàn)變?yōu)橹亟M病毒右末端的包衣序列和左側(cè)ITR(參見圖5)。這樣獲得的重組腺病毒基因組特別有利，因為移位至左側(cè)的E4必需區(qū)保持在其自然環(huán)境中，從而處在高滴度感染周期的最佳活性條件下。另外，該區(qū)域現(xiàn)位于若存在于生產(chǎn)細(xì)胞系293的基因組中則引起活顆粒出現(xiàn)的區(qū)域之前。
在本發(fā)明的另一特別優(yōu)選的方案中，必需區(qū)由pIX和IVa2蛋白的編碼區(qū)組成，并插入在E3區(qū)中，可能替代缺失的序列(參見圖6)。更具體地講，pIX和IVa2蛋白的編碼區(qū)包含于相應(yīng)于Ad5野生腺病毒序列上核苷酸3328-6316的BglII-NruI片段中。在此實施方式中，重組腺病毒與整合在生產(chǎn)細(xì)胞系中的腺病毒區(qū)的可能重組只能產(chǎn)生非存活性病毒顆粒，因為存活所必需的大部分延遲基因被缺失。
根據(jù)本發(fā)明的一種特別實施方案，腺病毒基因組的兩個必需區(qū)移離其原始位置。更具體地講，這些必需區(qū)由pIX蛋白的編碼區(qū)和E4區(qū)全部或僅一個功能區(qū)的編碼區(qū)代表。在優(yōu)選方案中，這些區(qū)域?qū)⒈灰莆恢罞1區(qū)，替代缺失序列，保持或不保持其閱讀框架的方向。
為了說明此類構(gòu)建，尤其可提及圖8中所示的構(gòu)建。在此構(gòu)建中，pIX蛋白的編碼區(qū)被移位至E1區(qū)，E1區(qū)中從在左ITR的右側(cè)缺失變成重組病毒的右末端。pIX蛋白編碼區(qū)還以反向讀碼方向放置其中。E4的必需區(qū)在其中由基因ORF3-ORF6/7代表，它在E4啟動子控制之下，并且也插入在E1的缺失位點上，在pIX蛋白編碼區(qū)和IVa2蛋白編碼區(qū)(其位置未受形響)之間，圖8中的具體構(gòu)建中，分別編碼pIX蛋白和IVa2蛋白的兩個區(qū)域具有不同的多聚腺苷酸化位點。
這種結(jié)構(gòu)對安全無毒性計劃特別有利。實際上，在兩種此類病毒分子間的所有寄生重組(例如在E4區(qū))都導(dǎo)致重組病毒失去其包衣序列。同樣，這種病毒分子與整合在生產(chǎn)細(xì)胞系中的所述腺病毒互補(bǔ)互區(qū)間的重組只能產(chǎn)生缺失其主要延遲基因(對其生存力是必須的)的病毒顆粒。
如上所述，本發(fā)明的重組腺病毒最好含有ITR序列和包衣化區(qū)域。
反向重復(fù)序列(ITR)構(gòu)成腺病毒的復(fù)制起始區(qū)，它們位于病毒基因組的3′和5′末端(參見圖1)，按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分子生物學(xué)技術(shù)易于將它們從中分離。人腺病毒的ITR序列(特別是血清型Ad2和Ad5)及狗腺病毒的ITR序列(尤其是CAV1和CAV2)的核苷酸序列在文獻(xiàn)中有述。例如Ad5腺病毒的左側(cè)ITR序列相當(dāng)于包括基因組1-103核苷酸的區(qū)域。
包衣序列(也稱Psi序列)是病毒基因組衣殼化所必需的。因而為了能夠制備本發(fā)明的缺陷重組腺病毒，該區(qū)域應(yīng)該存在。該包衣序列在野生腺病毒基因組中位于左ITR和E1基因之間(參見圖1)。在本發(fā)明的腺病毒中，它可以位于左ITR附近，也可以位于右ITR附近(參見圖5)?？梢杂梅肿由飳W(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離或人工合成包衣序列。文獻(xiàn)中已描述了人腺病毒(特別是血清型Ad2和Ad5)包衣序列的核苷酸序列，以及狗腺病毒(尤其是CAV1和CAV2)的包衣序列。例如Ad5腺病毒的功能包衣序列位于基因組中核苷酸194和358之間。
另外，本發(fā)明的腺病毒還可以在其基因組中具有其他改變。具體講，還可以缺失其他區(qū)域以提高病毒的容量及降低由于病毒基因表達(dá)產(chǎn)生的付作用。例如，E3區(qū)的全部或部分可缺失。
本發(fā)明的重組腺病毒具有對基因治療應(yīng)用具特別吸引力的特征。這些載體實際上集中了高度感染性、安全性和基因轉(zhuǎn)移能力的特征。
有利的是，本發(fā)明的重組腺病毒還含有外源核酸序列，對該外源序列在細(xì)胞、器官或機(jī)體中的轉(zhuǎn)移和/或表達(dá)進(jìn)行了研究。
具體講，這種外源DWA序列可包括一種或多種治療基因?？梢匀绱宿D(zhuǎn)移的治療基因是其在靶細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和必要時的翻譯產(chǎn)生有治療效果之產(chǎn)物的任何基因。
這特別涉及具有治療效果之蛋白產(chǎn)物的編碼基因。所編碼的蛋白產(chǎn)物可以是一種蛋白質(zhì)、肽、氨基酸等。這種產(chǎn)物可以與靶細(xì)胞同源(即，在沒有任何病理存在下在靶細(xì)胞中正常表達(dá)的產(chǎn)物)。此時，一種蛋白的表達(dá)例如可以緩解由于某種變異造成的細(xì)胞中的表達(dá)不足或所表達(dá)的蛋白無活性或活性低，或者還可以過量表達(dá)所述蛋白。治療基因還可以編碼一種細(xì)胞蛋白的突變體，它具有改善的穩(wěn)定性、得到提高的活性等。這種蛋白產(chǎn)物還可以是與靶細(xì)胞異源的。此時，所表達(dá)的蛋白例如可以補(bǔ)充或帶來一種細(xì)胞中缺陷的活性，使其能與疾病對抗。
本發(fā)明意義上的治療產(chǎn)物中，特別可列舉酶、血制品、激素、淋巴因子白細(xì)胞介素、干擾素、TNF等(FR9203120)，生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)或它們的前體或合成酶，營養(yǎng)因子BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等；載脂蛋白ApoAI、ApoAIV、ApoE等(FR9305125)、營養(yǎng)不良蛋白或小營養(yǎng)不良蛋白(FR9111947)，腫瘤的基因抑制劑P53、Rb、RaplA、DCC、k-rev等(FR9304745)，凝集相關(guān)因子VII、VIII、IX因子等的編碼基因；自殺基因胸苷激酶、胞嘧啶脫氨酶等；或者一種天然或人工免疫球蛋白的全部或部分(Fab、ScFv等)等。
治療基因還可以是反義基因或序列，其在靶細(xì)胞中的表達(dá)可以控制細(xì)胞基因表達(dá)或細(xì)胞mRNA的轉(zhuǎn)錄。例如按照專利EP140308中描述的技術(shù)，這樣的序列可在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成細(xì)胞mRNA的互補(bǔ)RNA，并因此阻斷它們翻譯成蛋白質(zhì)。
這種治療基因還可以是編碼能夠在人體中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原性肽的基因。在此具體實施方案中，本發(fā)明可制成使人體對特別是微生物或病毒有免疫性的疫苗。這特別涉及對EB病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(EP185573)、偽狂犬病毒、或?qū)δ[瘤特異(EP259212)的特異性抗原性肽。
一般地，外源核酸序列還包括一個在所染細(xì)胞中功能轉(zhuǎn)錄的啟動區(qū)，以及位于目的基因的3′的區(qū)域，它規(guī)定轉(zhuǎn)錄終止信號和多腺苷酸化位點。這些元件一起構(gòu)成表達(dá)盒。啟動區(qū)可涉及在所染細(xì)胞中易于發(fā)揮作用的天然負(fù)責(zé)目標(biāo)基因表達(dá)的啟動區(qū)。還可涉及不同來源的區(qū)域(負(fù)責(zé)其它蛋白質(zhì)的表達(dá)，或合成的等同物)。特別是涉及真核細(xì)胞或病毒基因的啟動序列，例如涉及來自欲感染細(xì)胞基因組的啟動序列。同樣涉及來自包括所用腺病毒在內(nèi)的病毒基因組的啟動序列。關(guān)于這一點，例如可舉出E1A、MLP、CMV、RSV等基因的啟動子。另外，這些啟動區(qū)可通過加入活化序列、調(diào)節(jié)序列等來修飾，或允許組織特異性或集中性表達(dá)。另外，當(dāng)外源核酸不含啟動序列時，可在缺陷性病毒基因組中在該序列的下游插入這樣的序列。
另外，外源核酸序列，具體在治療基因的上游還可含有引導(dǎo)合成的治療產(chǎn)物至靶細(xì)胞的分泌道中的信號序列。這種信號序列可為治療產(chǎn)物的天然信號序列，但還涉及所有其它有功能的信號序列，或人工信號序列。
可將治療基因的表達(dá)盒子插入在本發(fā)明重組腺病毒基因組的不同位點。它首先可插入在E1缺失處。此時它位于E4區(qū)或E4功能部分的附近(5′或3′)。它還可以插入在E3區(qū)中，增加或置換序列。它還可以位于失活的E4區(qū)中。
在一特別有利的方案中，本發(fā)明載體還含有異源啟動子控制下的功能性E3基因。更優(yōu)選的是，這些載體含有允許gp19K蛋白表達(dá)的一部分E3基因。這種蛋白實際上使得腺病毒載體免于成為免疫反應(yīng)的目標(biāo)，這種免疫反應(yīng)(i)限制載體的作用，(ii)有不利的副作用。
本發(fā)明的重組腺病毒可是各種來源的腺病毒。實際上存在不同血清型的腺病毒，其結(jié)構(gòu)和特征略有差別，但具有可比的基因結(jié)構(gòu)。因此，本申請中描述的教導(dǎo)易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員在任何類型腺病毒中重現(xiàn)。
更具體地，本發(fā)明的腺病毒可來自人、動物或混合來源(人和動物)。
對于人源腺病毒，優(yōu)選使用歸于C組的那些。更具體地講，在不同血清型人腺病毒中，本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選使用2型或5型腺病毒(Ad2或Ad5)。
如上所述，本發(fā)明的腺病毒還可以是動物來源的，或含有來自動物來源腺病毒的序列。實際上申請人已證明來自動物的腺病毒能夠高效地感染人細(xì)胞， 它們在已測試的人細(xì)胞中不能增殖(參見申請F(tuán)R9305954)。本申請還證明來自動物的腺病毒決不會被來自人的腺病毒反式互補(bǔ)，這完全消除了在人腺病毒存在下在體內(nèi)重組并增殖，從而導(dǎo)致感染性顆粒形成的可能性。這樣，利用動物來源腺病毒或其區(qū)段就特別有利，因為使用病毒作為基因治療載體的固有可能性更小了。
本發(fā)明范圍內(nèi)可用的動物來源腺病毒可來自狗、牛、鼠(如Mavl，Beard等，病毒學(xué)75(1990)81)、羊、豬、禽類或猴(例如SAV)。更具體講，禽類腺病毒中可列舉出可在ATCC得到的血清型1-10，例如毒株P(guān)helps(ATCC VR-432)、Fontes(ATCC VR-280)、P7-A(ATCC VR-827)、IBH-2A(ATCC VR-828)、J2-A(ATCC VR-829)、T8-A(ATCC VR-830)、K-11(ATCC VR-921)或編號為ATCC VR-831至835的毒株。在牛腺病毒中，可使用不同的已知血清型，特別是可在ATCC以編號ATCCVR-313、314、639-642、768和769得到的那些(1-8型)。還可舉出鼠腺病毒FL(ATCC VR-550)和E20308(ATCC VR-528)，5型(ATCC VR-1343)或6型(ATCC VR-1340)羊腺病毒；豬腺病毒(5359)，或猴腺病毒，特別是如ATCC編號為VR-591-594、941-943、195-203等的腺病毒。
在不同動物來源腺病毒中，在本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選使用來自狗的腺病毒或腺病毒區(qū)段，特別是所有CAV2腺病毒株〔例如Mannattan株或A26/61(ATCC VR-800)〕。狗腺病毒已作為許多結(jié)構(gòu)研究的對象。因此，現(xiàn)有技術(shù)中已描述了腺病毒CAV1和CAV2的完全限制圖譜(Spibey等，遺傳病毒學(xué)雜志70(1989)165)，已對E1a、E3基因以及ITR序列進(jìn)行了克隆和測序(特別見Spibey等，病毒研究14(1989)241；Linne，病毒研究23(1992)119，WO91/11525)。
可按不同方式制備本發(fā)明的缺陷重組腺病毒。
第一種方法是在體外制備的(缺陷)重組病毒的DNA轉(zhuǎn)移到感受態(tài)細(xì)胞系中，即該細(xì)胞以反式方式含有與缺陷病毒互補(bǔ)所必需的所用功能區(qū)。這些功能區(qū)優(yōu)選整合在該細(xì)胞的基因組中，這減小了重組的可能性并使該細(xì)胞系穩(wěn)定性提高。其中只有E1區(qū)缺陷的腺病毒中，優(yōu)選的細(xì)胞系是293細(xì)胞系。
第二種方法是在一個適當(dāng)?shù)募?xì)胞系中共轉(zhuǎn)染體外制備的缺陷重組病毒的DNA和一種或多種輔助病毒或質(zhì)粒的DNA。根據(jù)這一方法，沒有必要設(shè)置一種能補(bǔ)充重組腺病毒所有缺陷功能的感受態(tài)細(xì)胞系。實際上這些功能的一部分由一種或多種輔助病毒補(bǔ)充。這些輔助病毒本身是缺陷的。按該方法對發(fā)明缺陷重組腺病毒的制備還在實施例中進(jìn)行說明。
關(guān)于這一點，本申請還描述了含Ad5腺病毒基因組的經(jīng)修飾的左側(cè)部分的質(zhì)粒構(gòu)建(例如pCO1-E4系列質(zhì)粒)。這些質(zhì)粒對于作為基因治療載體的重組腺病毒的構(gòu)建特別有用。這樣，pCO1-E4質(zhì)粒含有腺病毒基因組的左側(cè)區(qū)域，從左ITR直到6316核苷酸，同時核苷酸382-3446間的區(qū)域(相當(dāng)于基因座E1)缺失，在此相應(yīng)位置插入了E4全部或一功能部分。pCO1-E4質(zhì)粒另外含有允許引入目的外源核酸序列的多克隆位點。pCO1-E4質(zhì)?？捎糜谕ㄟ^與一種優(yōu)選病毒來源的DNA一起在一種感受態(tài)細(xì)胞系中共轉(zhuǎn)染制備缺陷重組腺病毒，所述DNA相當(dāng)于包括失活E4區(qū)的腺病毒基因組右側(cè)部分。后者可來自諸如E4區(qū)缺失的Ad2dl808(Weinberg等，病毒學(xué)雜志，57(1986)833)、Ad5dl1004、Ad5dl1007、Ad5dl1011或Ad5dl1014等的缺陷病毒基因組(參見實施例)。關(guān)于這一點，本發(fā)明還涉及一種制備不含可復(fù)制顆粒重組腺病毒的方法，其中用-含所述腺病毒基因組左側(cè)部分的第一DNA，其中在E1區(qū)中缺失并在缺失處或其附近插入E4區(qū)的至少一個功能部分，和-至少含所述腺病毒基因組右側(cè)部分的第DNA，其中含失活的E4區(qū)和一個與第一DNA共有的腺病毒部分，共轉(zhuǎn)染一種感受態(tài)細(xì)胞系，并回收在所述兩種DNA間同源重組產(chǎn)生的腺病毒。
可使用的細(xì)胞系中，特別可提及人胚胎腎細(xì)胞系293(Graham等，遺傳病毒學(xué)雜志36(1977)59)。如前所述，這種細(xì)胞系特別含有整合在其基因組中的人腺病毒Ad5基因組的左側(cè)部分(12％)。有利的是，本發(fā)明方法中第一DNA選自pCO1-E4型質(zhì)粒。
另外，為制備含治療基因的重組腺病毒，用于實施本發(fā)明方法的第一或第DNA還含有一種目標(biāo)異源DNA序列。
然后，按病毒學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)回收、純化并擴(kuò)增增殖的重組病毒。
pCO1-E4質(zhì)粒允許構(gòu)建在E1區(qū)缺失382-3446核苷酸并在此處插入E4全部或一功能部分以及可能的治療基因的重組腺病毒。
本發(fā)明還涉及含有一種或多種如前所述的缺陷重組腺病毒的所有藥物組合物，本發(fā)明的藥物組合物，以通過局部、口服、非胃腸道、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、經(jīng)皮等途徑給藥。
優(yōu)選地，在本發(fā)明藥物組合物中含有注射配方的藥用載體。特別是消毒、等滲的鹽水溶液(磷酸一鈉、磷酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等，或這些鹽的混合物)，或干組合物，特別是凍干品，它通過加入無菌水或生理鹽水能形成注射溶液。
注射所用病毒的劑量可與不同參數(shù)相適應(yīng)，特別是所用給藥方法、有關(guān)的疾病、要表達(dá)的基因、還有要求的治療時間。一般地，本發(fā)明的重組腺病毒被配制成劑量為104-1014pfu，優(yōu)選106-1010pfu的形式，并以此形式給藥。pfu(蝕斑形成單位)相當(dāng)于病毒溶液的感染能力，通過感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)物確定，一般15天后測量被感染細(xì)胞的蝕斑數(shù)目。病毒溶液滴度pfu的測定技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的說明。
根據(jù)所插入的外源DNA序列，本發(fā)明的腺病毒可用于治療或預(yù)防許多疾病，包括遺傳病(營養(yǎng)障礙、囊性纖維變性等)、神經(jīng)退化性疾病(早老性癡呆、帕金森氏病、ALS等)、癌癥、凝集失調(diào)或脂蛋白障礙引起的疾病、由病毒感染引起的疾病(肝炎、艾滋等)等。
借助以下實施例將更完全地描述本發(fā)明，這些實施例是示范性的而不是限制性的。
圖1腺病毒Ad5的基因結(jié)構(gòu)。Ad5的完全序列可在現(xiàn)有技術(shù)文件中找到，并允許本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇或創(chuàng)立任何限制位點，以及分離基基組的任何區(qū)域。
圖2腺病毒和293細(xì)胞系間的重組事件。
圖3本發(fā)明載體類型及其與293細(xì)胞系重組的示意圖。
圖4E4區(qū)的結(jié)構(gòu)。
圖5末端對調(diào)的本發(fā)明腺病毒示意圖。E4+表示一個E4功能區(qū)；ΔE4表示一個E4非功能區(qū)，表示包衣序列。沒有顯示目標(biāo)基因的表達(dá)盒，但可以按文中所述來插入。
圖6本發(fā)明載體類型的示意圖(pIX-IVa2)。pIX+IVa2含有至少一個IVa2功能區(qū)。ΔE1ΔpIX表示區(qū)和E2區(qū)中140KD蛋白編碼區(qū)末端(5200位)間的腺病毒序列缺失。該缺失還包括IVa2區(qū)并涉及存在于293細(xì)胞系染色體中E&b區(qū)下游的序列。
圖7含于質(zhì)粒pCO1中的HindIII片段的限制性酶切圖。
圖8表達(dá)質(zhì)粒pPY40和pPY6的示意圖。
圖9質(zhì)粒pGY10的示意圖。
圖10質(zhì)粒pCO1-(ORF6+ORF7)的示意圖。
圖11質(zhì)粒pPY78和pPY77的示意圖。
圖12質(zhì)粒pPY15和pJY1的示意圖。
圖13本發(fā)明類型病毒的示意圖。
圖14質(zhì)粒pXL2675和pXL2757的示意圖。
圖15質(zhì)粒pPY66、pPY82和pPY75的限制性酶切圖譜示意圖。
圖16(A)復(fù)制子Hincp/Ad5和質(zhì)粒pPY66及(B)間同源重組的流程圖。
圖17通過兩個復(fù)制子pPY82和Hincp/Ad5〔del E4-(SacB+SpecR)〕間同源重組產(chǎn)生病毒基因組HincP/Ad5〔del E4(Y+ITR)〕的方法示意圖。
圖18HincP/Ad5〔ITRY del E1(SacB+SpecR)del E4(Y+ITR)〕和HincP/Ad5〔ITRY del E1(ORF6+ORF7)del E4(Y+ITR)〕的示意圖。
圖19質(zhì)粒pPY70、pPY71和pPY72的限制性酶切圖。
圖20質(zhì)粒pGY12、pGY14和pMC2的限制性酶切圖。
圖21質(zhì)粒pPY91、pPY94和pPY92的限制性酶切圖。
圖22制備本發(fā)明缺陷病毒的方法示意圖。
分子生物學(xué)的一般技術(shù)用于分子生物學(xué)中的常規(guī)方法如質(zhì)粒DNA的制備性提取、質(zhì)粒DNA的氯化銫梯度離心、瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳、電洗脫純化DNA片段、苯酚或苯酚-氯仿提取蛋白質(zhì)、在含鹽介質(zhì)中用乙醇或異丙醇沉淀DNA、在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化等都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并在文獻(xiàn)中有充分的描述〔Maniatis T.等，“分子克隆實驗室手冊”紐約冷泉港，冷泉港實驗室，1982；Ausubel F.M.等(編)，“分子生物學(xué)現(xiàn)代方法”，John Wiley & Sons，紐約，1987〕。
pBR322，pUC型質(zhì)粒和M13系噬菌體是從市場上購得的(Bethesda Research Laborataries)。關(guān)于連結(jié)，先將DNA片段用瓊脂糖或丙烯酰胺電泳按其大小分離，用苯酚或苯酚/氯仿混合物提取，用乙醇沉淀，然后按照供應(yīng)商的推薦方法在噬菌體T4的DNA連結(jié)酶(Biolabs)存在下孵育。按照供應(yīng)商的說明，用大腸桿菌的DNA聚合酶I的Klenow片段(Biolabs)對凸起的5’末端補(bǔ)平。按照制造商的推薦方法，在噬菌體T4的DNA聚合酶(Biolabs)存在下對凸起的3’末端進(jìn)行破壞。凸起的5’末端經(jīng)核酸酶S1處理進(jìn)行破壞。
利用合成的寡聚脫氧核苷酸的體外定向突變是用Amersham提供的試劑盒按Taylor等開發(fā)的方法〔核酸研究13(1985)8749-8764來進(jìn)行的。用所謂的PCR技術(shù)對DNA片段的酶法擴(kuò)增〔催化聚合酶鏈反應(yīng)Saiki R.K.等，科學(xué)230(1985)1350-1354；Mullis K.B和Faloona F.A，酶學(xué)方法155(1987)335-350 〕可用“DNA熱循環(huán)儀”(Perkin Elmer Cetus)按制造商的說明進(jìn)行。用Amersham銷售的檢測盒根據(jù)Sanger等〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，(1977)5463-5467〕研制的方法驗證核苷酸序列。
實施例1質(zhì)粒pCO1的構(gòu)建(圖7)A.質(zhì)粒pCE的構(gòu)建首先將相應(yīng)于腺病毒Ad5基因組左末端的片段EcoRI-XbaI克隆在載體pIC19H的EcoRI和XbaI位點間。生成質(zhì)粒pCA。然后，質(zhì)粒pCA用HinfI切割，其5′凸起末端用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段補(bǔ)平，再用EcoRI切割。這樣產(chǎn)生的PCA質(zhì)粒片段含有腺病毒Ad5基因組的左末端，隨后將其克隆在載體pIC20H(Marsh等，基因，32(1984)481)的EcoRI和SmaI位點間，產(chǎn)生質(zhì)粒pCB。質(zhì)粒pCB然后用EcoRI切割，其5′凸起末端用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段補(bǔ)平，再用BamHI切割。這樣產(chǎn)生的質(zhì)粒pCB片段含有腺病毒Ad5基因組的左末端，隨后將其克隆在載體pIC20H的NruI和BglII位點之間。這樣產(chǎn)生了質(zhì)粒pCE，其有趣的特征是具有取病毒Ad5的頭382個堿基對，隨后是一個多克隆位點。
B.質(zhì)粒pCD′的構(gòu)建首先連接腺病毒Ad5基因組的Sau3A(3346)-SstI(3645)和片段SstI(3645)-NarI(5519)，并克隆在載體pIC20H的ClaI和BamHI位點之間，生成質(zhì)粒pPY53。從一dam-框架(Contexte)制備質(zhì)粒pPY53的片段SalI-TaqI，其含有腺病毒Ad5基因組處在Sau3A(3346)和TaqI(5207)位點間的部分，將其克隆在載體pIC20H的SalI和ClaI位點之間生成質(zhì)粒pCA′。將從一dam-框架制備的腺病毒Ad5基因組的片段TaqI(5207)-NarI(5519)和質(zhì)粒pCA′的片段SalI-TaqI連接，并克隆在載體pIC20H的SalI和NarI位點間，生成質(zhì)粒pCC′。然后將從-dam框架制備的腺病毒Ad5基因組的片段NarI(5519)-NruI(6316)和質(zhì)粒pCC′的片段SalI-NarI連接，并克隆在pIC20R載體的SalI和NruI位點間，生成質(zhì)粒pCD′。
C.質(zhì)粒pCO1的構(gòu)建將質(zhì)粒pCD′用XhoI部分消化再用SalI完全消化，生成的限制片段含有腺病毒Ad5從Sau3A(3446)位點到NruI(6316)位點的序列。將該片段克隆在質(zhì)粒pCE的SalI位點中，生成質(zhì)粒pCO1(圖7)，其含有腺病毒Ad5左側(cè)直至HinfI位點(382)的部分，一個多克隆位點和腺病毒Ad5的Sau3A(3446)-NruI(6316)片段。實施例2pCO1-E4型質(zhì)粒的構(gòu)建(圖7)本實施例描述pCO1-E4型質(zhì)粒的構(gòu)建，即通過在質(zhì)粒pCO1(實施例1)中引入腺病毒E4區(qū)的全部或一個功能部分而獲得的質(zhì)粒。
2.1E4區(qū)全部的克隆2.1.1用來自E4區(qū)的原始啟動子表達(dá)-質(zhì)粒pPY2相應(yīng)于質(zhì)粒pMSG(Pharmacia)的片段Avr2-SalI(約1.3kb，含病毒MHTV的啟動子/LTR)克隆在從-contexte大腸桿菌dam+制備的質(zhì)粒pIC20H的Xbal和SalI位點間。
-在用BamHI和Bgl2切割然后再連接后通過缺失35pb片段從質(zhì)粒pPY2衍生得到質(zhì)粒pPY4。
-質(zhì)粒pPY5相應(yīng)于含Ad5中E4區(qū)的片段Taq1-Bgl2(35576-32490位)克隆在質(zhì)粒pIC20H的ClaI和BamH1位點。在該質(zhì)粒中，Ad5完整E4區(qū)的兩邊現(xiàn)為來自多克隆位點的EcoRV和SphI位點。用EcoRV對質(zhì)粒pPY5部分消化，再用SphI消化，使得純化了含Ad5整個E4區(qū)的約3.1kb的EcoRV-SphI片段。
-將片段EcoRV-SphI克隆在質(zhì)粒pPY4的SmaI和SphI位點之間，生成質(zhì)粒pPY6(圖8)。
-質(zhì)粒pPY6*與質(zhì)粒pPY6相同，只是在通過借助于大腸桿菌DNA聚合酶(Biolabs)的Klenow片段填平而切割然后再連接來破壞XbaI位點。因此，質(zhì)粒pPY6*含有在RSV病毒ITR啟動子控制下表達(dá)的整個E4區(qū)(從35576位的TaqI位點直到位于多腺苷酸化位點后約300pb的32490位點)。
質(zhì)粒pFG144〔F.L.Graham等，EMBO J.(1989)82077-2085〕特別含有1162pb的Sau3A片段，其包括Ad5基因組以34773位開始的右末端。然后將此片段克隆在質(zhì)粒pIC20H的BamHI位點中生成質(zhì)粒pGY9，其中Sau3A片段由于該片段相對載體的相對方向而包含于1184pb的片段BamHI-EcoRI片段中。然后經(jīng)電洗脫純化該片段，用AvrII切割，再用酶MaeII部分水解。一種限制產(chǎn)物相應(yīng)于片段MaeII(35835)-AvrII(35463)，其包括Ad5中E4區(qū)的啟動子直到右側(cè)ITR的邊界。該372pb的片段經(jīng)電洗脫純化，并在質(zhì)粒pPY6*的AvrII-SalI片段存在下連接在質(zhì)粒pCOI的ClaI和SalI位點間，生成pCOI-E4型(圖7)質(zhì)粒pGY10(圖9)。
2.1.2用異源啟動子表達(dá)i)用病毒MMTV的LTR表達(dá)相應(yīng)于表達(dá)盒LTR MMTV/E4的約4.5kb XhoI-SalI片段來源于質(zhì)粒pPY6。將該表達(dá)盒克隆在質(zhì)粒pCOI的SalI位點，生成pCOI-E4型質(zhì)粒pCOI-MMTV/E4(E4區(qū)相對ITR和序列有兩種可能方向)。
ii)用pGRE5啟動子表達(dá)含由糖皮質(zhì)激素高度可誘導(dǎo)的最小啟動子和多腺苷酸化信號〔Mader和White，Proc.Natl，Acad.Sci，(1993)905603-5607〕組成的表達(dá)盒的質(zhì)粒pGRE5.1 XbaI片段(約1kb)的克隆。將此片段克隆在由contexte dam-制得的質(zhì)粒pIC20H的XbaI位點之間，生成質(zhì)粒pPY21，其中連接糖皮質(zhì)激素受體的5個位點現(xiàn)位于緊鄰來自多克隆位點的Bgl2位點處。相應(yīng)于糖皮質(zhì)激素可高度誘導(dǎo)的最小啟動子的約0.8kb Bgl2-EcoRI片段來源于質(zhì)粒pPY21。將該片段克隆在pIC20H質(zhì)粒的Bgl2和EcoRI位點間生成質(zhì)粒pPY26。
包括Ad5基因組35576-34930位的Taq1-Hind3片段的約0.65kbEcoRN-Hind3片段來源于質(zhì)粒pPY5。該片段克隆在質(zhì)粒pIC20R的EcoRV和Hind3位點間生成質(zhì)粒pPY24，其中EcoRI位點現(xiàn)位于Taq1位點(35576位)附近。將質(zhì)粒pPY24的EcoRI-Hind3片段(0.65kb)和質(zhì)粒pPY5的Hind3-sph1片段(約2.4kb，包括Ad5的34930到32490位DNA)克隆在質(zhì)粒pIC20H的EcoRI和SphI位點間，生成質(zhì)粒pPY37。該質(zhì)粒是包含35576-32490位整個Ad5E4區(qū)的約3.1kbEcoRI-SphI片段的來源。將該片段克隆在質(zhì)粒pPY26的EcoRI和SphI位點間生成表達(dá)質(zhì)粒pPY40(圖8)，其中E4區(qū)以pGRE5啟動子表達(dá)。在該質(zhì)粒中保留了E4區(qū)的第一個絞接供體位點。質(zhì)粒pPY40的表達(dá)盒pGRE5/E4可以3.9kb Bgl2-Sal1片段的形式獲得，將此片段克隆在質(zhì)粒pCOI的BamHI和SalI位點間，生成pCOI-E4型質(zhì)粒pCOI-pGRE5/E4(圖7)。
2.2E4部分功能區(qū)的克隆2.2.1用來自E4區(qū)的原始啟動子表達(dá)i)最小序列ORF6+ORF7質(zhì)粒pGY47′相應(yīng)于質(zhì)粒pPY6的Bgl2-Sal1片段(其含有34115-32490位的Ad5 E4區(qū)，或E4區(qū)的ORF6和ORF7整個讀碼框架)克隆在質(zhì)粒pIC20R的相應(yīng)位點間。在質(zhì)粒pGY47′中，E4區(qū)的ORF6+ORF7現(xiàn)包含在約1.65kb Cla1-Sal1片段中。
在用Mae2部分水解和用Avr2完全水解后經(jīng)電洗脫純化相應(yīng)于35835-35464位Ad5序列的Mae2-Avr2片段、然后用Taq1水解該片段，將Mae2-Taq1片段(35835-35576位)在來自質(zhì)粒pGY47′的Cla1-Sal1片段(1.65kb)存在下克隆在質(zhì)粒pCO1的Cla1和Sal1位點間。該反應(yīng)的一種產(chǎn)物相應(yīng)于pCO1-E4型質(zhì)粒pCO1-(ORF6+ORF7)(圖10)。
在另一特別有趣的實例中，位于ORF7終止密碼子和Bgl2位點間的序列(直至32490位點，包括E4的多腺苷酸化位點)被缺失，并代之以一種異源多腺苷酸化位點。這樣，相應(yīng)于SV40病毒“延遲”多腺苷酸化信號的Xbal-Sal1片段(約0.25kb)從質(zhì)粒pGL3分離得到，并克隆在從contexte dam+制備的質(zhì)粒pIC20H的相應(yīng)位點間，生成質(zhì)粒pPY76。Kpn1-BssH2片段(Ad5基因組中33598-33249位)和BssH2-Sau3A片段(33249-32891位)克隆在質(zhì)粒pPY76的Kpn1和BamH1位點間，生成質(zhì)粒pPY77(圖11)。從該質(zhì)粒得到Kpn1-Sal1片段(包括33598-32891位間序列的約0.7kb)，將其克隆在質(zhì)粒pCO1-(ORF6+ORF7)的相應(yīng)位點間，生成PCO1-E4型質(zhì)粒pPY78(圖11)。ii)單一ORF6序列將Kpn1-BssH2片段(Ad5基因組中33598-33249位)和BssH2-Pvu2片段(33249-33126位)克隆在質(zhì)粒pPY76的Kpn1和Sma1位點間，生成質(zhì)粒pPY79。從該質(zhì)粒得到Kpn1-Sal1片段(約0.5kb，包括33598-33126位間的序列)，將其克隆在質(zhì)粒pCO1-(ORF6+ORF7)的相應(yīng)位點間，生成pCO1-E4型質(zhì)粒pCO1-(ORF6)。iii)單一ORF3序列用相似方法還可以構(gòu)建其中只存在E4區(qū)ORF3讀碼框架的pCO1-E4質(zhì)粒。實際上已知僅ORF3的表達(dá)已足以補(bǔ)充E4區(qū)缺失的病毒。
2.2.2用異源啟動子表達(dá)i)用MMTV病毒的LTR表達(dá)質(zhì)粒pPY6的Bgl2-Xba1片段(約1.65kb)包括34115和32490位間的Ad5序列(E4區(qū)的ORF6+ORF7)。該片段克隆在質(zhì)粒pIC20H的Bgl2和Xba1位點間生成質(zhì)粒pPY13。該質(zhì)粒在約1.65kb Xho1-Sph1片段中現(xiàn)含有Ad5的部分E4區(qū)(ORF6+ORF7)。該片段克隆在質(zhì)粒pPY4的Sal1和Sph1位點間生成質(zhì)粒pPY15(圖12)，其含有約3.1kb的Xho1-Sal1片段，相應(yīng)于在MMTV病毒LTR啟動子控制下的Ad5E4區(qū)(ORF6+ORF7)的表達(dá)盒。將該片段克隆在質(zhì)粒pCO1的Sal1位點生成pCO1-E4型質(zhì)粒pCO1-MMTV/(ORF6+ORF7)。ii)用pGRE5啟動子表達(dá)質(zhì)粒pPY13的Bgl2-Sal1片段(約1.65kb)包括Ad5的部分E4區(qū)(ORF6+ORF7)。該片段克隆在質(zhì)粒pIC20H的BamH1和Sal1位點間，生成質(zhì)粒pPY45，其中(ORF6+ORF7)子區(qū)現(xiàn)包含在約1.65kb的EcoR1-Sph1片段中。將該片段克隆在質(zhì)粒pPY26的EcoR1和Sph1位點間生成質(zhì)粒pJY1(圖12)，其包括在pGRE5啟動子下表達(dá)的(ORF6+ORF7)子區(qū)的表達(dá)盒，并呈約2.5kb Bgl2-Sal1片段的形式。該Bgl2-Sal1片段克隆在質(zhì)粒pCO1的BamH1和Sal1位點間生成pCO1-E4型質(zhì)粒pCO1-pGRE5/(ORF6+ORF7)(圖7)。實施例3衍生自pCO1-E4型質(zhì)粒的重組腺病毒的構(gòu)建本實施例描述一種重組腺病毒的構(gòu)建，該腺病毒在E1區(qū)中缺失382-3446核苷酸，含失活的E4區(qū)，并在E1缺失處插入了E4區(qū)全部或一個功能部分。
本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)允許構(gòu)建并在293細(xì)胞系中繁殖E1-E4+重組腺病毒。例如在E4區(qū)有修飾/缺失(以使該區(qū)非功能化，至少在ORF3和ORF6中突變)的病毒基因組存在下，可將pCO1-E4型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞系中。這種病毒在不能功能性地反式補(bǔ)充E4區(qū)的細(xì)胞系中不能存活。相反，這些病毒可以在W162細(xì)胞系(Weinberg和Kether，Proc.Natl.Acad.Sci.(1983)80，5383-5386〕，或?qū)＠鸉R9404590(1994年4月18日)中描述的一種293E4+細(xì)胞系中增殖。這種病毒包括病毒Ad2d1808〔Challberg和Ketner病毒學(xué)(1981)114，196-209 〕、Ad5dl1004、Ad5dl1007或Ad5dl1014〔Bridge和ketner，病毒學(xué)雜志(1989)63，631-638〕，或Ad5dl1011(Bridge等，病毒學(xué)(1993)193，794-801〕等。這樣，用XmnI酶線性化的pCO1-E4型質(zhì)粒和含非功能E4區(qū)并用ClaI酶縮減的病毒的病毒基因組DNA共轉(zhuǎn)染，生成相應(yīng)于在293細(xì)胞系中兩種DNA之間同源重組后的病毒。這些病毒的特征在于存在左側(cè)ITR和一種功能性包衣序列(序列，例如1-382核苷酸)，隨后是在功能性啟動子如E4區(qū)的原始啟動子〔含于Taq1(33576)-MaeII(35835)片段中〕或一種可誘導(dǎo)啟動子下表達(dá)的功能性E4區(qū)(整個E4區(qū)或至少ORF3或ORF6)，再隨后是位于Ad5基因組3446位Sau3A位點下游的區(qū)域，其延續(xù)到右側(cè)ITR，因而包括起始E4-病毒中的E4功能區(qū)的缺失(圖13)。例如，其特征為來自病毒Ad5dl1011的基因組右側(cè)E4缺失的病毒E1-E4+，能夠在293細(xì)胞系中以大于1011PFU/ml的滴度增殖。實施例4病毒基因組右側(cè)序列的引入4.1在E4區(qū)中引入(SacB+SpecR)盒4.1.1質(zhì)粒pPY66的構(gòu)建來自質(zhì)粒pFG144的Bcl1-Aur2片段(約0.5kb)相應(yīng)于從35464位Avr2位點開始的Ad5基因組右末端。將該片段克隆在從contexte大腸桿菌dam-制得的質(zhì)粒pIC19H的Xba1和BamH1位點間，生成質(zhì)粒pPY23。從該質(zhì)粒得到約320pb的Sal1-Hae3片段，包括直到35617位Hae3位點的Ad5基因組右末端。該片段克隆在質(zhì)粒pIC20H的XhoI和EcoRV位點間，生成質(zhì)粒pPY29。
然后將相應(yīng)于Ad5基因組32490-33093位的Bgl2-Sma1片段克隆在質(zhì)粒pPY29的BamH1和Sam1位點間，生成質(zhì)粒pPY64。從該質(zhì)粒得到片段Xba1-Hind3，其克隆在質(zhì)粒pXL2675(圖14)多克隆位點的相應(yīng)位點間，生成質(zhì)粒pPY65。pXL2675質(zhì)粒(2513pb)是一種ColE1型復(fù)制子(包含在約1.15kb的BsA1-Rvu2片段中，來自市售質(zhì)粒pBKS+)，具有提供大腸桿菌中卡那霉素抗性的基因(來自Tn5，質(zhì)粒Pharmacia pUCKXXX)和合成的多克隆位點。
從質(zhì)粒pXL2757(圖14)得到約4kb的Sma1-EcoRV片段，其含有枯草芽胞桿菌的sacB基因和提供大腸桿菌中狀觀霉素抗性的基因。將該片段的(SacB+SpecR)盒克隆在質(zhì)粒pPY65的Sma1位點中，生成質(zhì)粒pPY66(15)。
4.1.2在大腸桿菌中構(gòu)建病毒基因組質(zhì)粒pPY66可用于通過與衍生自Ad5并含于大腸桿菌polA中功能復(fù)制子中的病毒基因組同源重組來引入(salB+SpecR)盒子。在專利申請F(tuán)R95016323中描述的這種方法依賴于利用大腸桿菌中的某些復(fù)制特性。實際上，不相容HincP類復(fù)制子(如RK2)在不存在polA基因編碼的酶的條件下復(fù)制。反之，ColE1型復(fù)制子(pUC、pIC、pBR…型質(zhì)粒)復(fù)制需要這種酶。在此觀察結(jié)果的基礎(chǔ)上，首先將衍生自質(zhì)粒pFG144的Ad5基因組克隆在質(zhì)粒RK2(HincP類)中，然后通過電穿孔引入polA基因中突變的大腸桿菌株中。再從基因組中缺失含有ColE1復(fù)制子(pBR)并含于質(zhì)粒pFG144E3區(qū)位置的Xba1片段(專利申請F(tuán)R95016323)。這產(chǎn)生了稱為E.coli polA/Ad5的大腸桿菌菌株。重要的一點是存在于這種菌株中的腺病毒基因組的邊界一邊是Pac1位點另一邊是ITR，且這種基因組轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中后有感染性。
按下述方法經(jīng)E.coli polA/Ad5中同源重組引入(SacB+SpecB)盒子a)首先將質(zhì)粒pPY66經(jīng)電穿孔引入E.coli polA/Ad5中。在狀觀霉素和卡那霉素存在下進(jìn)行選擇?？剐钥寺∠鄳?yīng)于HincP/Ad5復(fù)制子和質(zhì)粒pPY66間共整合的形式。在幾乎所有情況下，通過同源重組發(fā)生質(zhì)粒pPY66在兩類復(fù)制子間的插入。分離到一個相應(yīng)于E4區(qū)32490-33093(603pb)位重組結(jié)果的克隆(圖16A)。
b)該細(xì)菌克隆具有盒(SacB+SpecR)兩邊(A加B)序列的“正向重復(fù)”一邊603pb，另一邊320pb(基因組的右末端)。這種序列的存在是不穩(wěn)定性的根源，并引起(SacB+SpecB)盒雙方向的同源重組這種稀有事件。這種重組事件導(dǎo)致colE1復(fù)制子被排出并失去卡那霉素抗性標(biāo)志。這些重組事件最常發(fā)生在603pb序列中，因其導(dǎo)致重回原始狀態(tài)而不重要， 即導(dǎo)致有未修飾E4區(qū)并因不再有(SacB+SpecR)盒而失去其壯觀霉素抗性特征的腺病毒基因組。因而它們對這種抗生素敏感，又能在蔗糖作為碳源存在下生長。相反，在基因組右端320bp(序列B)中的同源重組導(dǎo)致失去原存在的E4區(qū)，而被(SacB+SpecB)盒代替(圖16A)。這產(chǎn)生一種稱為E.coli polA/Ad5〔del E4(SacB+SpecR)〕的大腸桿菌克隆。這種克隆對壯觀霉素有抗性，在蔗糖作為單一碳源存在下不能生長。根據(jù)其“卡那霉素敏感”、壯觀霉素抗性和蔗糖敏感性的表型分離了一株具有這種右端修飾的基因組的大腸桿菌克隆。
4.2在病毒基因組右側(cè)引入序列4.2.1質(zhì)粒pPY82的構(gòu)建首先將來自質(zhì)粒pPY6*并相應(yīng)于Ad5基因組32490-33093位的Sal1-Sma1片段克隆在質(zhì)粒pCO7的相應(yīng)位點間，生成質(zhì)粒pPY81。質(zhì)粒pCO1經(jīng)Pst1完全酶切并再連接后得到質(zhì)粒pCO7，其含有直至382位的Ad5左端、質(zhì)粒pCO1的多克隆位點，隨后是從3446位直到3788位Rst1位點的Ad5序列。從質(zhì)粒pPY81得到約1.4kb的H3-Xba1片段，將其克隆在質(zhì)粒pXL2675的相應(yīng)位點生成質(zhì)粒pPY82，其限制性酶切圖譜示于圖15中。
4.2.2在大腸桿菌中構(gòu)建病毒基因組將質(zhì)粒pPY82通過電穿孔引入大腸桿菌后，通過同源重組將序列引入在緊鄰右側(cè)ITR處，生成病毒基因組HincP/Ad5〔delE4(+ITR)〕。首先在卡那霉素存在下選擇復(fù)制子的融合。這樣分離了一株相應(yīng)于兩個復(fù)制子共有的32490和33093序列間同源重組的克隆(圖16B)。在足夠的傳代數(shù)時解除卡那霉素選擇，從而發(fā)揮colE1復(fù)制子(來自質(zhì)粒pXL2675)的排出作用。然后，用蔗糖代替葡萄糖作為碳源，從而分離到這樣的細(xì)菌克隆其中ColE1復(fù)制子的排出通過ITR的同源重組實現(xiàn)，生成病毒基因組HincP/Ad5〔del E4(+ITR)〕(圖16B)。分離了一種這樣產(chǎn)生的克隆E.coli pulA/Ad5〔del E4(+ITR)〕。實施例5用于獲得基因組中缺失左側(cè)序列的病毒的構(gòu)建5.1在病毒基因組左側(cè)引入(SacB+SpecR)盒質(zhì)粒pCO1的Hind3-EcoRV片段(約0.4kb)包括直至382位的病毒基因組左末端。將該片段克隆在質(zhì)粒pXL2675的相應(yīng)位點間生成質(zhì)粒pPY83。質(zhì)粒pCO1(在contexte dam+中制得)用Xba1酶消化，用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段處理，再連接后得到質(zhì)粒pCO1Dsal。從該質(zhì)粒得到一種約1kb的BamH1-Nsi1片段，其包含3446-4419(Nsi1位點)的Ad5序列。將該片段克隆在質(zhì)粒pIC20R的BamH1和Pst1位點間，生成質(zhì)粒pPY86，其中3446-4419位間的序列現(xiàn)包含在Bam H1-Bgl2片段中。該片段克隆在質(zhì)粒pPY83的Bam H1位點，生成質(zhì)粒pPY87。然后將相應(yīng)于質(zhì)粒pXL2757的(SacB+SpecB)盒的Sma1-EcoRV片段克隆在質(zhì)粒pPY87的EcoRV位點中，生成質(zhì)粒pPY88(圖17)。按圖16A中描述的相似方法，該質(zhì)粒用于將HincP/Ad5〔del E4(+ITR)〕的左側(cè)部分用來自質(zhì)粒pPY88的相應(yīng)部分代替，生成稱為HincP/Ad5〔ITR del E1(SacB+SpecR)del E4(+ITR)〕的病毒基因組，其結(jié)構(gòu)示于圖18中。
5.2缺失序列，引入E4功能區(qū)5.2.1質(zhì)粒pGY50′的構(gòu)建利用質(zhì)粒pY23作為模板(該質(zhì)粒含有直到35464位Avr2位點的腺病毒基因組右端)，用寡核苷酸5′-CGGCGGGAATTCTTAATTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGG-3′(SEQ ID No.2)(下劃線處為EcoR1和Pac1位點)和5′-CACCACCTGCAGGGCAGCCATAACAGTCAGCCTTACC-3′(SEQ ID N°3)(下劃線處為Pst1位點)經(jīng)PCR擴(kuò)增了腺病毒基因組的右端。PCR擴(kuò)增產(chǎn)生了相應(yīng)于Ad5右端的418pb片段，在其中ITR的緊上游引入Pac1位點、再引入EcoR1位點，而Pst1位點位于緊鄰35517位處。該片段克隆在質(zhì)粒pUC19的EcoR1和Pst1位點間，生成質(zhì)粒pXL2624(參見專利申請F(tuán)R95016323)。
將相應(yīng)于從35576位Taq1位點起的病毒基因組右端的質(zhì)粒pXL2624之片段EcoR1-Taq1克隆在質(zhì)粒pGY47′的EcoR1和Cla1位點間，生成質(zhì)粒pPY89。從該質(zhì)粒得一約2kb的EcoR1-Sal1片段，其包括直到35576位的病毒基因組右端，繼而是34115-32490位的部分E4區(qū)(ORF6+ORF7)。質(zhì)粒pPY89的EcoR1-Sal1片段和質(zhì)粒pCO1的Sal1-Nsi1片段(包括3446-4419位的Ad5基因組)克隆在質(zhì)粒pXL2675的EcoR1和Pst1位點間，得到質(zhì)粒pGY50′(圖17)。
5.2.2質(zhì)粒pPY90′的構(gòu)建質(zhì)粒pPY78的Kpn1-Sst1片段(約0.95kb)相應(yīng)于32891到33598位間的E4區(qū)C-末端部分，緊隨其后是S440病毒的“延遲”多腺苷酸化信號。該片段克隆在質(zhì)粒pPY89的相應(yīng)位點間，得質(zhì)粒pPY90。從該質(zhì)粒得約2kb的EcoR1-Sal1片段，其包括直至35576位的病毒基因組右端和34115-32891位的部分E4區(qū)(ORF6+ORF7)。質(zhì)粒pPY90的EcoR1-Sal1片段和質(zhì)粒pCO1的Sal1-Nsi1片段(包括3446-4419位的Ad5基因組)克隆在質(zhì)粒pXL2675的EcoR1和Pst1位點間，得質(zhì)粒pGY90′(圖17)。
5.2.3在左端引入一個E4功能區(qū)按類似于圖16B中描述的方法，質(zhì)粒pGY50′或pPY90′用于將基因組HincP/Ad5〔ITRdel E1(SacB+SpecR)〕〔del E4(+ITR)〕的左側(cè)部分用來自所述質(zhì)粒的相應(yīng)部分代替。例如，用質(zhì)粒pPY90′生成稱為HincP/Ad5〔ITR Ddel E1(ORF6+ORF7)〕〔del E4(+ITR)〕的病毒基因組，其結(jié)構(gòu)示于圖18中。實施例6用于獲得基因組中右側(cè)有新E4缺失之病毒的構(gòu)建6.1序列不存在時6.1.1缺失Mae2-Hae3(32811-35617)質(zhì)粒pPY32在專利申請F(tuán)R9404590(94年4月18日)中有述。從該質(zhì)粒得到約0.65kb的Bgl2-Hind3片段，其相應(yīng)于從Bgl2位點(32490位)的Ad5基因組右端，并在Mae2位點(32811位)直到Hae3位點(35617位)間缺失。該片段克隆在質(zhì)粒pXL2675的BamH1和Hind3位點間，得質(zhì)粒pPY70，其限制性酶切圖譜示于圖19中。該質(zhì)粒可用于例如在E coli polA/Ad5〔del E4(SacB+SpecR)〕中的同源重組引入相應(yīng)的E4缺失。
6.1.2缺失Taql-Avr2(33055-35464)質(zhì)粒pGY12相應(yīng)于BssH2-Msc1片段(33249-32720)克隆在市售質(zhì)粒pSL1180的BssH2和EcoRV位點間(圖20)。質(zhì)粒pXL2624的EcoR1-Taq1片段(該片段相應(yīng)于Ad5基因組的右端直到35576位的Taq1位點)和Taq1-BssH2片段(35576-33249)克隆在質(zhì)粒pGY12的EcoR1和BssH2位點間，生成質(zhì)粒pGY13。從該質(zhì)粒得EcoR1-Hpa1片段(約3.25kb)，其包括直至32720位的Ad5基因組右端。該片段克隆在質(zhì)粒pIC20H的EcoR1和Sma1位點間，得質(zhì)粒pGY14(圖20)。從該質(zhì)粒得EcoR1-BspH1片段，其相應(yīng)于直至34700位的Ad5基因組右端。將該片段與Ad5基因組的BspH1-Xba1片段(33750-30470位)一起克隆在從contexte dam+制得的質(zhì)粒pIC20H的Xba1和EcoR1位點間，制得質(zhì)粒pMC2(圖20)。
從質(zhì)粒pMC2純化位于Ad5基因組31224-33055位點間的Sph1-Taq1片段，然后克隆在質(zhì)粒pIC20H的Sph1和Cla1位點間，生成質(zhì)粒pYJ5。轉(zhuǎn)染至一contexte E.coli dam-中之后，從該質(zhì)粒得一Bgl2-Xba1片段，其包括位于32490-33055位間的病毒基因組序列。然后將該Bgl2-Xba1片段與來自質(zhì)粒pMC2并包括自35464位Avr2位點的病毒基因組右端的Avr2-Xho1片段一起，克隆在質(zhì)粒pXL2675的BamH1和Xho1位點間，得質(zhì)粒pPY71(圖19)。該質(zhì)?？捎糜谕ㄟ^例如在E.ColipolA/Ad5〔del E4(SacB+SpecR)〕中的同源重組引入相應(yīng)的E4缺失。
6.1.3缺失Sma1-Sma1(33093-35356)質(zhì)粒pMC2用Sma1完全消化然后再連接后得到質(zhì)粒pMC2DSmal。從該質(zhì)粒得到約1.2kb的Bgl2-Hind3片段，其包括自32490位的Ad5基因組右端全部，并在E4區(qū)33093-35356位間缺失。該片段克隆在質(zhì)粒pXL2675的BamH1和Hind3位點間，生成質(zhì)粒pPY72，其限制性酶切圖譜示于圖19。該質(zhì)?？捎糜诶缭贓 ColipolA/Ad5〔del E4(SacB+SpecR)〕中通過同源重組引入相應(yīng)的E4缺失。
6.2存在序列時6.2.1缺失Sma1-Sma1(33093-35356)質(zhì)粒pGY9的BamH1-EcoR1片段(約1.2kb)包括從34773位San3Aw位點開始的Ad5基因組右端。該限制性片段經(jīng)電洗脫純化，用Saml切割，然后用Mae2酶進(jìn)行部分水解。一種反應(yīng)產(chǎn)物相應(yīng)于MaeII(35835)-SmaI(35356)片段。該片段克隆在質(zhì)粒pPY82的Sma1和Cla1位點間，得質(zhì)粒pPY75(圖15)。該質(zhì)?？捎糜谕ㄟ^例如在E colipolA/Ad5〔del E4(SacB+SpecR)(+ITR)〕中的同源重組引入相應(yīng)的E4缺失。
6.2.2缺失Taq1-Sma1(33055-35356)包括32490(多克隆位點的Sal1位點)到33055位的質(zhì)粒pPY82的Taq1片段克隆在質(zhì)粒pIC20H的Cla1位點中，生成質(zhì)粒pICTaq，其中多克隆位點的Xho1被置于緊鄰32490位處。從質(zhì)粒pICTaq得到32490-33055位的Xho1-Sma1片段，將其克隆在質(zhì)粒pPY75的Sal1和Sma1位點間得到質(zhì)粒pPY91(圖21)。
6.2.3缺失Hpa2-Sma1(32980-35356)將包括32490-32980位的質(zhì)粒pPY82的Sal1-Hpa2片段克隆在質(zhì)粒pIC20H的Sal1和Cla1位點間，得到質(zhì)粒pPY93。從該質(zhì)粒得到包括32490-32980位的Sal1-EcoRV片段，將其克隆在質(zhì)粒pPY75的Sal1和Sma1位點間生成質(zhì)粒pPY94(圖21)。
6.2.4缺失Sau3A-Sma1(32891-35356)將包括32490-32891位的質(zhì)粒pPY82的Sau3A片段克隆在質(zhì)粒pIC20H的BamH1位點中，生成質(zhì)粒pICSau，其中多克隆位點的Sal1位點位于緊鄰32490位處。從質(zhì)粒pICSau得到包括32490-32891的Sal1-Sma1片段，將其克隆在質(zhì)粒pPY75的相應(yīng)位點，生成質(zhì)粒pPY92(圖21)。實施例7按實施例4和5在大腸桿菌中構(gòu)建的重組基因組轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的方法按實施例4和5描述的質(zhì)粒構(gòu)建，或例如以不同E4缺失或改變的E4功能區(qū)為特征的類似質(zhì)粒，或例如相應(yīng)于引入給定治療基因表達(dá)盒的類似質(zhì)粒等，用于通過在E coli polA中的同源重組來生成重組病毒基因組。經(jīng)限制酶驗證后，分離了一株細(xì)菌克隆，并提取和純化了其質(zhì)粒內(nèi)含。然后將DNA用Pac1酶進(jìn)行完全消化并轉(zhuǎn)染在293細(xì)胞中。該DNA有感染性(E1-E4+病毒)，細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE)出現(xiàn)在約2周后。然后CPE在293細(xì)胞中不斷擴(kuò)張，從而制備了大量病毒(參見專利申請F(tuán)R016323)。實施例8為制備基因組中pIX區(qū)移位的病毒的構(gòu)建方法8.1質(zhì)粒pCO1-pIX的構(gòu)建改變基因組內(nèi)部病毒pIX編碼序列的方向是有用的，以使細(xì)胞基因組和病毒DNA之間的重組不產(chǎn)生復(fù)制性顆粒，而產(chǎn)生只含其ITR、E1A和E1B區(qū)和pIX編碼序列的病毒。這種病毒是缺陷性的，比重組腺病毒小得多，這就允許在大量制備病毒時通過氯化銫離心易于分離(圖22)。
利用寡核苷酸5′-GATATCTGAAGATACAGATTGAG-3′(SEQ ID N°4)和5′CGGCCGTTAAACCGCATTGGGAG-3′(SEQ ID N°5)對質(zhì)粒pCO1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆在質(zhì)粒PCR2(Invitrogen)中，構(gòu)建了質(zhì)粒pCR2-pIX。
將pCR2-pIX的EcoRV-Eag1片段和質(zhì)粒pCI(Promega)的Eag1-BamH1片段(含SV40的polyA)克隆在EcoRV和BamH1消化的質(zhì)粒pIC20R中，構(gòu)建了質(zhì)粒pIC-pIX-pA。
將質(zhì)粒pCO1用寡核苷酸5′-AAGCTTATTGCCATCATTATGGAC-3′(SEQ ID N°6)和5′-ACTAGTTATTTAGGGGTTTTGCGC-3′(SEQ ID N°7)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆在質(zhì)粒pCR2(Invitrogen)中，構(gòu)建了質(zhì)粒pCR2-IVa2。
將pCR2-IVa2的Hind3-Spe1片段和質(zhì)粒pCDNA3(Invitrogen)的Xba1-Sph1片段(含有牛生長激素基因的多腺苷酸化信號)克隆在用Hind3和Sph1消化的質(zhì)粒pIC20R中，構(gòu)建了質(zhì)粒pIC-IVa2-pA。然后將質(zhì)粒pIC-IVa2-pA的BstX1-Sal1片段克隆在質(zhì)粒pCO1的BstX1-Sal1位點間，這樣就形成了質(zhì)粒pCO1-pIX。在pCO1-pIX的Cla1位點引入pIC-pIX-pA的Cla1盒子，使pIX的編碼基因與IVa2的編碼基因取向相同(與其在腺病毒基因組中的方向相反)，這樣就構(gòu)建了質(zhì)粒pCO1-pIX。
這樣，質(zhì)粒pCO1-pIX含有Ad5的ITR-序列、取向與其在Ad5中天然取向相反的病毒pIX表達(dá)盒(啟動子和pIX基因及隨后的SV40的polyA)、及隨后的IVa2序列(其polyA已被牛生長激素的polyA所取代)。
8.2病毒的構(gòu)建按“標(biāo)準(zhǔn)方法”構(gòu)建了重組病毒用Xho1線性化的質(zhì)粒pCO1-pIX和Cla1消化的病毒AdRSVβGal的病毒DNA共轉(zhuǎn)染在293細(xì)胞中。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱RHONE POULENC RURER.S.A.
(B)街道Raymond Aron大街20號
(C)城市安東尼(E)國家法國(F)郵編92165(G)電話40.91.69.22(H)傳真(1)40917296(ii)發(fā)明名稱不含活污染顆粒的腺病毒、其制備方法和用途(iii)序列數(shù)目7(iv)計算機(jī)可讀形式(A)載體類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Reloase#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQ ID No1的信息(I)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1AGATCCTCTA GCTAGAGTCG AC 22(2)SEQ ID No2的信息(i)序列特征(A)長度57個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO2CGGCGGGAAT TCTTAATTAA CATCATCAAT AATATACCTT ATTTTGG 57(2)SEQ ID No3的信息(i)序列特征(A)長度37堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3CACCACCTGC AGGGCAGCCA TAACAGTCAG CCTTACC 37(2)SEQ ID No4的信息(i)序列特征(A)長度23堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GATATCTGAA GATACAGATT GAG 23(2)SEQ ID No5的信息(i)序列特征(A)長度23堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5CGGCCGTTAA ACCGCATTGG GAG 23(2)SEQ ID No6的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO6AAGCTTATTG CCATCATTAT GGAC 24(2)SEQ ID No7的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7ACTAGTTATT TAGGGGTTTT GCGC 2權(quán)利要求
1.一種重組腺病毒，其特征在于它含有腺病毒基因組，其E1區(qū)失活，其基因組結(jié)構(gòu)被改變，其與生產(chǎn)細(xì)胞系基因組可能的重組產(chǎn)生非存活性的病毒顆粒。
2.權(quán)利要求1的重組腺病毒，其特征在于對其復(fù)制和/或增殖必需的至少一個區(qū)域存在于不同于其原位置的基因組位置處。
3.權(quán)利要求2的重組腺病毒，其特征在于該必需區(qū)位于另一非功能性基因組區(qū)中或其附近。
4.權(quán)利要求3的重組腺病毒，其特征在于該非功能性基因組區(qū)域是通過突變和/或缺失一個或多個堿基而失活的區(qū)域。
5.權(quán)利要求3或4的重組腺病毒，其特征在于該非功能性區(qū)域是通過部分或全部缺失而失活的。
6.權(quán)利要求2-5中任一項的重組腺病毒，其特征在于非功能性區(qū)由失活的E1區(qū)和/或E3區(qū)代表。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的重組腺病毒，其特征在于E1區(qū)通過缺失從核苷酸454到3328的PvuII-BagIII片段或從核苷酸382到3446的HinfII-Sau3A片段而失活。
8.權(quán)利要求2-7中任一項的重組腺病毒，其特征在于對病毒復(fù)制和/或存活必需的區(qū)域選自E4區(qū)和/或pIX-IVa2區(qū)，和/或pIX和/或L5區(qū)的全部或部分。
9.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項的腺病毒，其特征在于其基因組結(jié)構(gòu)是這樣的E4區(qū)全部或部分位于E1區(qū)缺失位點處或附近。
10.權(quán)利要求9的重組腺病毒，其特征在于E4區(qū)表現(xiàn)為相應(yīng)于核苷酸35835-32720的MaeII-MscI片段。
11.權(quán)利要求9的重組腺病毒，其特征在于E4區(qū)表現(xiàn)為至少ORF3編碼框架。
12.權(quán)利要求7或8的重組腺病毒，其特征在于E4區(qū)表現(xiàn)為至少ORF6編碼框架。
13.權(quán)利要求1-7之一的重組腺病毒，其特征在于其基因組結(jié)構(gòu)是這樣的pIX和IVa2蛋白的編碼區(qū)一起位于E3區(qū)中，取代或不取代缺失的序列。
14.權(quán)利要求13的重組腺病毒，其特征在于pIX-IVa2編碼區(qū)由包括Ad5腺病毒序列中核苷酸3328-6316的BglII-NruI片段組成。
15.權(quán)利要求1的重組腺病毒，其特征在于生產(chǎn)細(xì)胞系是293細(xì)胞系。
16.一種重組腺病毒，其特征在于其基因組具有失活的E1和E4區(qū)，還在于E4區(qū)全部或一功能區(qū)位于失活的E1區(qū)中或附近。
17.一種重組腺病毒，其特征在于其基因組結(jié)構(gòu)中，pIX蛋白編碼區(qū)和E4的全部或僅一個功能區(qū)一起從其原始位置轉(zhuǎn)移。
18.權(quán)利要求17的腺病毒，其特征在于這兩個區(qū)域被轉(zhuǎn)移至E1區(qū)代替缺失的序列。
19.權(quán)利要求17或18的腺病毒，其特征在于相應(yīng)于pIX蛋白編碼區(qū)的讀碼框以逆向讀碼方式置于其中。
20.權(quán)利要求17、18或19的腺病素，其特征在于包括ITR和包衣區(qū)的左端和包括ITR的右端對調(diào)。
21.一種重組腺病毒，其特征在于其基因組具有失活的E1區(qū)，還在于包括ITR和包衣區(qū)的左端和包括ITR和E4區(qū)全部或一個功能區(qū)的右端對調(diào)。
22.權(quán)利要求20或21的重組腺病毒，其特征在于左端含于Ad5基因組的頭382個核苷酸中，右端含于Ad5基因組的最后3215個核苷酸中。
23.一種重組腺病毒，其特征在于其基因組具有失活的E1和L5區(qū)，還在于L5區(qū)的全部或一功能區(qū)存在于失活的E1區(qū)中或附近。
24.根據(jù)以上權(quán)利要求之一的重組腺病毒，其特征在于其包含ITR和一個包衣區(qū)。
25.根據(jù)以上權(quán)利要求之一的重組腺病毒，其特征在于其包含異源核酸序列。
26.權(quán)利要求25的重組腺病毒，其特征在于該異源核酸序列包括一個或多個治療基因。
27.權(quán)利要求25或26的重組腺病毒，其特征在于異源核酸序列存在于E1、E2或E4區(qū)中，補(bǔ)充或取代缺失的序列。
28.根據(jù)以上權(quán)利要求之一的腺病毒，其特征在于腺病毒基因組源于人、動物或混合來源。
29.權(quán)利要求28的腺病毒，其特征在于人源腺病毒選自C類腺病毒，優(yōu)選選自2型或5型腺病毒(Ad2或Ad5)。
30.權(quán)利要求28的腺病毒，其特征在于動物來源的腺病毒選自狗、牛、鼠、羊、豬、禽和猴來源的腺病毒。
31.包含至少一種權(quán)利要求1-30之一的缺陷重組腺病毒的藥物組合物。
32.權(quán)利要求31的藥物組合物，其包可注射制劑的藥物可接受載體。
33.質(zhì)粒pCO1-E4，其包括Ad5腺病毒基因組的左側(cè)部分，由左側(cè)ITR直至核苷酸6316，并缺失相應(yīng)于E1基因包于核苷酸382-3446間的區(qū)域，在該缺失處插入E4區(qū)的全部或一個功能區(qū)。
34.制備不含復(fù)制性顆粒之重組腺病毒的方法，其特征在于-包含所述腺病毒基因組左側(cè)部分的第一DNA，其中在E1區(qū)中有缺失，在該缺失處或附近插入E4區(qū)的至少一個功能部分，和-包含所述腺病毒基因組的至少右側(cè)部分的第二DNA，其具有失活的E4區(qū)和與第一DNA共有一個部分，共轉(zhuǎn)染一種感受態(tài)細(xì)胞系，并回收重組產(chǎn)生的腺病毒。
35.權(quán)利要求34的方法，其特征在于該細(xì)胞系是293細(xì)胞系。
36.權(quán)利要求34的方法，其特征在于第一DNA選自pCO1-E4型質(zhì)粒。
37.權(quán)利要求34-36之一的方法，其特征在于第一或第二DNA還含有目標(biāo)異源DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及腺病毒衍生的新病毒載體，其制備和其基因治療用途。優(yōu)選的重組腺病毒含有腺病毒基因組，該基因組的(i)E1區(qū)失活，(ii)基因組結(jié)構(gòu)被改變，和(iii)與生產(chǎn)細(xì)胞系的可能重組生產(chǎn)非存活性病毒顆粒。
文檔編號C12N7/01GK1162338SQ95195913
公開日1997年10月15日 申請日期1995年10月25日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月28日
發(fā)明者P·伊, M·珀里考德特, C·奧斯尼 申請人:羅納-布朗克羅萊爾股份有限公司