專利名稱：人趨化因子β-9的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒別的多核苷酸，由這些多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸及多肽的用途及多核苷酸及多肽的生產(chǎn)。更具體地，本發(fā)明的多肽是人趨化因子β-9，有時(shí)后文中稱為“Ckβ-9”。本發(fā)明還涉及抑制該多肽的作用。
趨化因子，也稱內(nèi)分泌(intercrine)細(xì)胞因子，是一類結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的細(xì)胞因子亞家族，這些分子大小為8-10kd。一般地，趨化因子在氨基酸水平呈20-70％的同源性且特征在于四個(gè)保守的半胱氨酸殘基形成兩個(gè)二硫鍵?；陬^兩個(gè)半胱氨酸殘基的排列，趨化因子被分成兩個(gè)亞家族α和β。在α亞家族，頭兩個(gè)半胱氨酸被一個(gè)氨基酸分開因此稱作“C-X-C”亞家族。在β亞家族，兩個(gè)半胱氨酸位置相鄰因此稱作“C-C”亞家族。迄今為止，已在人體內(nèi)鑒別出至少8個(gè)這一家族的不同成員。
內(nèi)分泌細(xì)胞因子顯示有許多功能。一個(gè)特點(diǎn)是其能誘導(dǎo)不同的細(xì)胞類型包括單核細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞做趨化性游走。許多趨化因子有促炎活性且涉及炎癥期間的多個(gè)步驟。這些活性包括刺激組胺的釋放，溶酶體酶類和白三烯釋放，提高免疫靶細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的粘連，增強(qiáng)補(bǔ)體蛋白質(zhì)的結(jié)合，誘導(dǎo)粒細(xì)胞粘附分子和補(bǔ)體受體的表達(dá)及呼吸爆發(fā)。除了其涉及在炎癥中，還發(fā)現(xiàn)某些趨化因子呈現(xiàn)其它活性。例如，巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)1(MCD-1)能抑制造血干細(xì)胞增殖，血小板因子4(PF-4)是內(nèi)皮細(xì)胞生長的有效抑制物，白細(xì)胞介素3(IL-3)促進(jìn)角化細(xì)胞增殖，GRO是黑素瘤細(xì)胞的自泌生長因子。
根據(jù)其多種生物活性，趨化因子與各種生理或病理狀態(tài)，包括淋巴細(xì)胞運(yùn)輸，傷口愈合，造血機(jī)能調(diào)節(jié)及免疫失調(diào)如變態(tài)反應(yīng)，哮喘和關(guān)節(jié)炎相關(guān)是毫不驚奇的。
“C-C”分支的成員在下述細(xì)胞上發(fā)揮其功效嗜酸性細(xì)胞可殺滅寄生蟲以減輕寄生蟲感染，嗜酸性細(xì)胞也能引起呼吸系統(tǒng)的氣道慢性炎癥；巨噬細(xì)胞可抑制脊椎動(dòng)物腫瘤的形成；嗜堿性粒細(xì)胞可釋放在變態(tài)反應(yīng)炎癥中起重要作用的組胺。但是，一個(gè)分支的成員也可能在對其他分支的趨化因子正常應(yīng)笞的細(xì)胞引起作用，因而，沒有精確的作用可歸附于分支的成員。
盡管C-C分支的成員主要作用于單核細(xì)胞而C-X-C分支成員主要作用于嗜中性白細(xì)胞，但是不能基于此準(zhǔn)則把獨(dú)特的化學(xué)引誘物的性質(zhì)歸于一個(gè)趨化因子。來自一個(gè)家族的一些趨化因子呈現(xiàn)與其它家族的特點(diǎn)。
基于氨基酸序列同源性，本發(fā)明的多肽已被推定鑒別為Ckβ-9。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了新的多肽及其生物活性的并且診斷或治療有用的片段，類似物和衍生物。本發(fā)明的多肽是人源的。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸分子，包括mRNA，DNA，cDNA，基因組DNA及其生物活性的并且診斷或治療有用的片段，類似物和衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了通過重組技術(shù)生產(chǎn)這些多肽的方法，包括在促進(jìn)所述蛋白表達(dá)和所述蛋白的后續(xù)回收的條件下培養(yǎng)包含編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列的重組原核和/或真核宿主細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了為治療目的而使用這些多肽或編碼這些多肽的多核苷酸的方法，如治療實(shí)體瘤、慢性感染、自身免疫疾病、銀屑病、哮喘癥、過敏癥，調(diào)節(jié)造血功能及促進(jìn)傷口愈合。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了抗這些多肽的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了這些多肽的拮抗劑，其可用于例如在治療自身免疫疾病，慢性炎癥，組胺介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)，哮喘，關(guān)節(jié)炎，不依賴于前列腺素的發(fā)熱，骨髓功能低下，矽肺，結(jié)節(jié)病、嗜酸性細(xì)胞增多綜合征及肺炎時(shí)抑制這些多肽的作用。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了包含與本發(fā)明的核酸序列特異性雜交的足夠長的核酸分子的核酸探針。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于檢測與多肽的表達(dá)及編碼此多肽的核酸序列中的突變相關(guān)的疾病的診斷方法。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了為科學(xué)研究、DNA合成和DNA載體的生產(chǎn)相關(guān)體外目的使用這些多肽或編碼這些多肽的多核苷酸的方法。
本發(fā)明的這些及其它方面根據(jù)本文的教導(dǎo)對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。
下述附圖旨在說明本發(fā)明的實(shí)施方案，并非限制本發(fā)明的范圍。


圖1示出Ckβ-9的cDHA序列及相應(yīng)的推導(dǎo)的氨基酸序列，開頭的23個(gè)氨基酸代表前導(dǎo)序列，由此推定的成熟多肽包含111個(gè)氨基酸，使用了標(biāo)準(zhǔn)的單字母氨基酸縮寫。
圖2示出Ckβ-9與原趨素(eotaxin)成熟多肽(底行)間氨基酸序列同源性。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了分離的核酸(多核苷酸)，其編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的成熟多肽或編碼由1994年6月7日保藏的ATCC保藏號(hào)75803的克隆的cDNA編碼的成熟多肽。
編碼Ckβ-9的多核苷酸在衍生自人的乳腺淋巴結(jié)的cDNA文庫中被發(fā)現(xiàn)。Ckβ-9在結(jié)構(gòu)上與趨化因子家族相關(guān)。其含有一編碼134個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的開放讀框，該蛋白質(zhì)大約開始23個(gè)氨基酸是推定的前導(dǎo)序列，如此成熟蛋白質(zhì)包括111個(gè)氨基酸。該蛋白質(zhì)在75個(gè)氨基酸殘基的一段序列上與原趨素呈32％同一性及69％相似性的最高程度同源。另外在趨化因子中的4個(gè)空間保守的半胱氨酸殘基在本發(fā)明的多肽中也被發(fā)現(xiàn)，這一點(diǎn)是重要的。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA，DNA可以是雙鏈或單鏈，并且如果是單鏈，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼成熟多肽的編碼序列可以與圖1所示的編碼序列(SEQ ID NO1)相同，或與保藏克隆的編碼序列相同，或者也可以是不同的編碼序列，該編碼序列由于遺傳密碼的豐余性或簡并性，與圖1(SEQ ID NO1)的DNA或保藏的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖1(SEQ ID NO2)的成熟多肽或編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和另外的編碼序列如前導(dǎo)序列或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的另外的編碼序列)和非編碼序列如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列的5’和/或3’非編碼序列。
因此，術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”包含如下的多核苷酸，即僅包括多肽編碼序列的多核苷酸，以及包括另外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼具有圖1(SEQ ID NO2)的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽或由保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這些多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的該多核苷酸的等位基因變異體，或是該多核苷酸的非天然發(fā)生的變異體。
因此，本發(fā)明包括編碼圖1(SEQ ID NO2)所示的相同成熟多肽或由保藏克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及這些多核苷酸的變異體，所述變異體編碼圖1(SEQ ID NO2)的多肽或由保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物，這些核苷酸變異體包括缺失變異體、取代變異體和添加或插入變異體。
如上所述，多核苷酸可以具有為圖1(SEQ ID NO2)所示的編碼序列的天然發(fā)生的等位基因變異體的編碼序列，或保藏克隆的編碼序列的天然發(fā)生的等位基因變異體的編碼序列。如本領(lǐng)域所公知的，等位基因變異體是多核苷酸序列的另一種形式，其可以取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸，但基本上不改變所編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還包括多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可以在同一讀框內(nèi)與有助于多肽從宿主細(xì)胞表達(dá)和分泌的多核苷酸融合，例如前導(dǎo)序列，其是用于控制多肽從細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的分泌序列。具有前導(dǎo)序列的多肽是一種前蛋白(preprotein)，前導(dǎo)序列可以由宿主細(xì)胞切下以形成多肽的成熟形式。多核苷酸還可編碼一種蛋白原(proprotein)，其是成熟蛋白加上另外的5’氨基酸殘基。具有序列原(prosequence)的成熟蛋白為蛋白原并是蛋白質(zhì)的非活性形式，一旦序列原被切掉，則保留活性成熟蛋白。
因此，例如，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼成熟蛋白，或編碼具有序列原的蛋白或具有序列原和前序列(前導(dǎo)序列)的蛋白。
本發(fā)明的多核苷酸還可以具有在讀框內(nèi)與標(biāo)記序列融合的編碼序列，其可用于純化本發(fā)明的多肽。標(biāo)記序列可以是，例如，由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記物用于在細(xì)菌宿主中純化與該標(biāo)記物融合的成熟多肽，或者，例如，當(dāng)使用哺乳動(dòng)物宿主如COS-7細(xì)胞時(shí)，標(biāo)記序列可以是血凝素標(biāo)記物(HA)。HA標(biāo)記物相應(yīng)于由流感病毒血凝素蛋白衍生的表位(Wilson，I.，et al.，Cell，37767(1984))。
術(shù)語“基因”指的是生產(chǎn)多肽鏈中涉及的DNA區(qū)段；它包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域(前導(dǎo)序列和尾隨序列)及各個(gè)編碼區(qū)段(外顯子)間的間插序列(內(nèi)含子)。
本發(fā)明的全長基因的片段可用作與cDNA文庫雜交的雜交探針以分離全長cDNA并分離與基因有高序列相似性或有相似生物活性的其它c(diǎn)DNA。此型探針優(yōu)選具有至少30個(gè)堿基且可含如50個(gè)或更多個(gè)堿基。此探針也可用于鑒別對應(yīng)于全長轉(zhuǎn)錄本的cDNA克隆和含有包括調(diào)節(jié)基因和啟動(dòng)子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子的完整基因的基因組克隆。篩選的一個(gè)例子包括用已知DNA序列合成一寡核苷酸探針以分離出基因的編碼區(qū)。具有與本發(fā)明的基因互補(bǔ)的序列的標(biāo)記的寡核苷酸用于篩選人cDNA，基因組DNA或mRNA文庫以確定探針與文庫的哪些成員雜交。
本發(fā)明還涉及可與上述序列雜交的多核苷酸，條件是序列間具有至少70％、優(yōu)選90％、更優(yōu)選95％的同一性。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所用的，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指雜交僅發(fā)生在序列間具有至少95％、優(yōu)選97％同一性的情況下。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸編碼基本上保持了由圖1(SEQ ID NO1)的cDNA或保藏的cDNA編碼的成熟多肽的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。
或者，多核苷酸可以具有至少20個(gè)堿基，優(yōu)選30個(gè)堿基、更優(yōu)選至少具有50個(gè)堿基，其與本發(fā)明的多核苷酸雜交且具有上述的同一性，并且可保持或不保持活性。例如，如此的多核苷酸可用作SEQ ID NO1的多核苷酸的探針，如用于多核苷酸的回收或作為診斷探針或作為PCR引物。
如此，本發(fā)明涉及與編碼SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸及其片段具有至少70％同一性，優(yōu)選至少90％同一性、更優(yōu)選至少95％同一性的多核苷酸，所述片段具有30個(gè)堿基、優(yōu)選50個(gè)堿基。本發(fā)明還涉及由中性多核苷酸編碼的多肽。
本文所指的保藏物將根據(jù)國際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的規(guī)定期限保藏。這些保藏僅為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供方便，而不是對根據(jù)35 U.S.C 112索取保藏物的許可。保藏物中所含的多核苷酸的序列以及該序列編碼的多肽的氨基酸序列引入本文作參考，并且在與本文的序列描述有抵觸時(shí)，其是參照。制造、使用或銷售保藏物需經(jīng)許可，而本文不授予這種許可。
本發(fā)明還涉及具有圖1(SEQ ID NO.2)的推導(dǎo)的氨基酸序列或具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的趨化因子多肽，以及該多肽的片段、類似物和衍生物。
當(dāng)指圖1(SEQ ID NO.2)的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽時(shí)，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持這些多肽的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。因此，類似物包括蛋白原，其可通過裂解蛋白原部分而激活以生產(chǎn)有活性的成熟多肽。
本發(fā)明的趨化因子多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
圖1(SEQ ID NO.2)的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)其中的一或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守的氨基酸殘基取代(優(yōu)選由保守的氨基酸殘基取代)，并且這種取代的氨基酸殘基可以由遺傳密碼編碼，也可不是由遺傳密碼編碼，或者(ii)其中的一或多個(gè)氨基酸殘基包括一取代基，或者(iii)其中的成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物例如為增加多肽的半壽期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)其中有附加的氨基酸與成熟多肽融合，例如前導(dǎo)序列或分泌序列或用于純化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。這種片段、衍生物和類似物被視為屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)而理解的范圍。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選地以分離的形式提供，并優(yōu)選純化至均一性。
術(shù)語“分離的”是指從其原始環(huán)境(例如，若其是天然存在的則是天然環(huán)境)中脫離的物質(zhì)。例如，存在于活體動(dòng)物中的天然發(fā)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但從一些或所有共存物質(zhì)中分離的相同的多核苷酸或DNA或多肽則是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分和/或這種多核苷酸或多肽可以是某種組合物的一部分，并且如果這種載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分，則其還是分離的。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO2所示的多肽(尤其是成熟多肽)，及與SEQ ID NO2的多肽有至少70％相似性(優(yōu)選至少70％同一性)、優(yōu)選與SEQ ID NO2的多肽有至少90％相似性(更優(yōu)選至少90％同一性)、更優(yōu)選與SEQ ID NO2的多肽有至少95％相似性(更優(yōu)選95％同一性)的多肽；也包括這些多肽的通常至少含30個(gè)氨基酸優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸的部分。
本領(lǐng)域已知兩多肽間的“相似性”的測定是通過將一種多肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸取代物與另一種多肽的序列相比較測定的。
本發(fā)明的多肽的片段或部分可通過肽合成法用于生產(chǎn)對應(yīng)的全長多肽；因而所述的片段可用作生產(chǎn)全長多肽的中間物。本發(fā)明的多核苷酸的片段或部分可用于合成本發(fā)明的全長多核苷酸。
本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的多核苷酸的載體，用本發(fā)明的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞，以及用重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
宿主細(xì)胞用本發(fā)明的載體遺傳工程化(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，所述的載體可以是克隆載體或表達(dá)載體。載體可以是質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等。遺傳工程化的宿主細(xì)胞可以在改良的傳統(tǒng)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，改良培養(yǎng)基是為了激活啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增Ckβ-9基因。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是先前用于選擇用來表達(dá)的宿主細(xì)胞的條件，其對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明的多核苷酸可通過重組技術(shù)用于生產(chǎn)多肽，因此，例如，該多核苷酸可以包括在任一種表達(dá)載體中以表達(dá)多肽。這些載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；衍生于質(zhì)粒和噬菌體DNA的結(jié)合體的載體；病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和擬狂犬病毒。然而，也可使用任何其它載體，只要其在宿主中可復(fù)制和生存。
可通過多種程序?qū)⒑线m的DNA序列插入載體，通常，通過本領(lǐng)域公知的程序?qū)NA序列插入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。這些和其它程序?qū)儆诒绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員的范疇。
表達(dá)載體中的DNA序列與合適的表達(dá)調(diào)控序列(啟動(dòng)子)連接以指導(dǎo)mRNA合成，作為這些啟動(dòng)子的代表性例子，可提及的有LTR或SV40啟動(dòng)子，E.coli lac或trp啟動(dòng)子，λ噬菌體PL啟動(dòng)子和其它公知用于控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或者病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還含有一用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。載體還可包括用于擴(kuò)增表達(dá)的合適的序列。
另外，表達(dá)載體優(yōu)選含有一個(gè)用于為選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞提供表型標(biāo)記的基因，如對于真核細(xì)胞培養(yǎng)為二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，而在E.coli中例如為四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
可采用含有如上所述合適DNA序列以及合適啟動(dòng)子或調(diào)控序列的載體轉(zhuǎn)化合適的宿主以使宿主表達(dá)蛋白質(zhì)。
作為合適的宿主的例子，可以提及的有細(xì)菌細(xì)胞，如E.coli、鏈霉菌、鼠傷寒沙門氏桿菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞如果蠅和Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物細(xì)胞等。選擇合適的宿主細(xì)胞被視為屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)而理解的范圍。
更具體地，本發(fā)明還包括重組構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含一或多種上述序列。該構(gòu)建體包括載體，如質(zhì)?；虿《据d體，在該載體中以正向或反向插入本發(fā)明的序列。在這一實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選方面，該構(gòu)建體還包括調(diào)節(jié)序列，包括例如，與所述序列連接的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知大量的合適的載體和啟動(dòng)子，它們是可商購的。以下舉出載體的例子，細(xì)菌的載體pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phagescript，psiX174，pBluescript SK，pBSKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核載體pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，也可使用其它質(zhì)粒或載體，只要其可在宿主中復(fù)制和生存即可。
啟動(dòng)子區(qū)可以選自使用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)的載體或其它帶有選擇性標(biāo)記的載體的任何所需基因，兩個(gè)合適的載體是pKK232-8和pCM7。特別提到的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，lambda PR，PL和trp；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40 ，反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR，和鼠金屬硫蛋白-I。選擇合適的載體和啟動(dòng)子屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平范疇。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有上述構(gòu)建物的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞?？赏ㄟ^磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Bas ic Methods in Molecular Biology，(1986))將構(gòu)建物導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
可以用傳統(tǒng)的方式使用宿主細(xì)胞中的構(gòu)建物以生產(chǎn)由重組序列編碼的基因產(chǎn)物?；蛘?，也可通過常規(guī)的肽合成儀合成生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
在合適的啟動(dòng)子的控制下，可以在哺乳細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中表達(dá)成熟蛋白質(zhì)，也可采用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)使用由本發(fā)明的DNA構(gòu)建物衍生的RNA生產(chǎn)這種蛋白質(zhì)。原核和真核宿主使用的合適的克隆和表達(dá)載體見Sambrook，et al，Molecular ClonningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，該書引入本文作參考。
高等真核生物對編碼本發(fā)明的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄可通過在載體中插入一增強(qiáng)子序列而得以增加，增強(qiáng)子是約10-300bp的順式作用的DNA因子，其作用于啟動(dòng)子以增加其轉(zhuǎn)錄。其例子包括位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)(100-270bp處)的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子，以及腺病毒增強(qiáng)子。
通常，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和允許宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記，如E.coli的氨芐青霉素抗性基因和釀酒酵母的TRP1基因，以及衍生于高表達(dá)基因的啟動(dòng)子以指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。這種啟動(dòng)子可以衍生于編碼糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或熱休克蛋白的操縱子。在合適的階段，異源結(jié)構(gòu)序列裝配上翻譯起始和終止序列，以及優(yōu)選地，裝配一能指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)入周質(zhì)空間或胞外培養(yǎng)基的前導(dǎo)序列。任選地，異源序列可以編碼一包括N-末端鑒別肽的融合蛋白質(zhì)，以賦予所需的特征，如表達(dá)的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定性和純化簡便性。
用于細(xì)菌的表達(dá)載體的構(gòu)建是通過將編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列與合適的翻譯起始和終止信號(hào)一起插入帶有功能啟動(dòng)子的可操縱閱讀相而完成。載體包括一或多種表型選擇標(biāo)記及一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)以確證載體保持在宿主中，并且，如果需要，可以在宿主中擴(kuò)增。合適的用于轉(zhuǎn)化的原核宿主包括E.coli、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌以及假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各菌種，當(dāng)然，也可采用其它菌。
作為代表性而非限制性的例子，有用的細(xì)菌表達(dá)載體可以包括衍生于包含熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳因子的商購質(zhì)粒的選擇標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，這些商購質(zhì)粒包括，例如，pKK223-3(Pharmacma Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega Biotec，Madi son，WI，USA)。這些pBR322“骨架”部分與合適的啟動(dòng)子及待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列結(jié)合。
轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株并將宿主菌株培養(yǎng)至合適的細(xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度改變或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選定的啟動(dòng)子，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間。
典型地，細(xì)胞由離心收集，用物理或化學(xué)方法破碎，保留得到的粗提物以進(jìn)一步純化。
用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞可用任何常規(guī)方法破碎，如凍-融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎，或使用細(xì)胞裂解試劑，這些方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的。
也可使用各種哺乳細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的例子包括由Gluzman，Cell，23175(1981)描述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞系，以及其它能表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，如C127，3T3，CHO，Hela和BHK細(xì)胞系。哺乳類表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)，合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，多腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，和5’旁側(cè)非轉(zhuǎn)錄序列?？墒褂迷醋許V40病毒基因組的DNA序列，例如SV40起點(diǎn)、早期啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、剪接體和多腺苷酸化位點(diǎn)以提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳因子。
可通過硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陽離子或陰離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析羥基磷灰石層析和凝集素層析等方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化Ckβ-9多肽。如果需要，可使用蛋白質(zhì)重折疊步驟以完成成熟蛋白的構(gòu)型，最后，可采用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行最后的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成過程的產(chǎn)物，或者通過重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，通過培養(yǎng)細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳類細(xì)胞)而生產(chǎn)。根據(jù)在重組生產(chǎn)過程中采用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化或是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可以包括一起始的甲硫氨酸殘基。
Ckβ-9多肽可用于抑制骨髓干細(xì)胞集落形成以作為在腫瘤化療及白血病治療期間的輔助保護(hù)性治療手段。
趨化因子多肽也可用于抑制表皮角化細(xì)胞增殖以治療以角化細(xì)胞過度增殖為特征的銀屑病。
趨化因子多肽也可通過刺激宿主防御細(xì)胞如胞毒性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的侵入及活化用以治療實(shí)體腫瘤。
趨化因子多肽也可通過抑制IL2生物合成來抑制T細(xì)胞增殖以治療自身免疫疾并和淋巴細(xì)胞型白血病。
Ckβ-9也可用于傷口愈合，都是通過清除碎屑及結(jié)締組織促炎細(xì)胞的募集，也通過其對過量的TGFβ-4介導(dǎo)的纖維化的控制來完成。以這種相同方式，Ckβ-9可被用于治療其它纖維性疾病，包括肝硬化，骨關(guān)節(jié)炎和肺纖維化。
趨化因子多肽也可提高嗜酸性細(xì)胞數(shù)量，這些細(xì)胞具有獨(dú)特的殺死侵入組織中寄生蟲的幼蟲的功能，如在血吸蟲病，毛線蟲病和蛆蟲病中。
趨化因子多肽也可通過調(diào)節(jié)各種原始造血細(xì)胞的活化和分化來調(diào)節(jié)造血機(jī)能。例如，在化療后從骨髓釋放成熟白細(xì)胞。
多核苷酸及由多核苷酸編碼的多肽還可用于與科研，DNA合成和DNA載體的制備及設(shè)計(jì)治療人體疾病的治療劑及診斷劑等相關(guān)的各種體外目的。
全長Ckβ-9基因的片段可用作一cDNA文庫的雜交探針以分離全長基因及分離出與該基因有高度相似序列或相似生物活性的其它基因。此型探針可以為例如20-2000個(gè)堿基。但優(yōu)選的探針有30-50個(gè)堿基對。此探針也可用于鑒別對應(yīng)于全長轉(zhuǎn)錄本的cDNA克隆和含有包括調(diào)節(jié)基因和啟動(dòng)子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子的完整基因的基因組克隆。篩選的一個(gè)例子包括用已知DNA序列合成一寡核苷酸探針以分離出基因的編碼區(qū)。具有與本發(fā)明的基因互補(bǔ)的序列的標(biāo)記的寡核苷酸用于篩選人cDNA，基因組DNA或mRNA文庫以確定探針與文庫的哪些成員雜交雜交。
本發(fā)明還涉及Ckβ-9基因用作檢測與Ckβ-9核酸序列中的突變相關(guān)的疾病或疾病的易感性的診斷分析的一部分。此類疾病與趨化因子多肽的低表達(dá)相關(guān)，如腫瘤和癌癥。
攜帶Ckβ-9基因突變的個(gè)體可通過各種技術(shù)在DNA水平上加以檢測。用于診斷的核酸可從病人的細(xì)胞中獲得，如從血液、尿、唾液、活組織檢查及尸體剖檢中獲得?；蚪MDNA可直接用于檢測或可在分析前使用PCR (Saiki et al.，Nature，324163-166(1987))進(jìn)行酶擴(kuò)增。RNA或cDNA也可用于同一目的。例如，互補(bǔ)于編碼Ckβ-9的核酸的PCR引物可用于鑒別及分析Ckβ-9突變。如通過與正?；蛐拖啾葦U(kuò)增產(chǎn)物的大小的變化能檢測缺失或插入。點(diǎn)突變可通過將擴(kuò)增的DNA與放射標(biāo)記的Ckβ-9RNA或放射標(biāo)記的Ckβ-9反義DNA序列雜交加以鑒別。完全匹配的序列可通過RNaseA消化或通過解鏈溫度的不同與錯(cuò)配的雙螺旋區(qū)分開。
基于DNA序列的不同的遺傳測試可通過檢測在帶有或不帶有變性劑的凝膠中的DNA片段的電泳遷移率的改變來完成。通過高分辨率凝膠電泳可觀察小的序列缺失及插入。不同序列的DNA片段可通過在變性甲酰胺梯度凝膠中區(qū)分，其中不同DNA片段根據(jù)其特異的解鏈溫度或部分解鏈溫度在凝膠中的不同位置停留(例見，Myers etal.，Science，230-1242(1985))。
特異位置的序列的改變通過核酸酶保護(hù)分析如RNase和S1保護(hù)或化學(xué)裂解法加以揭示(例如，Cotton et al.，PNAS，USA，8543934401(1985))。
因此，特異性DNA序列的檢測可經(jīng)如雜交、Rnase保護(hù)、化學(xué)裂解、DNA直接測序或使用限制性酶(例如，限制性片段長度多態(tài)性(RFLP))及基因組DNA的Southern印跡分析等方法來完成。
除了更常規(guī)的凝膠電泳和DNA測序，也可經(jīng)原位分析檢測突變。
本發(fā)明還涉及一種檢測各種組織中Ckβ-9蛋白質(zhì)變化水平的診斷分析法，因?yàn)榕c正常對照組織樣品相比該蛋白質(zhì)的過量表達(dá)可檢測疾病或疾病的易感性的存在，如腫瘤。用于檢測衍生自宿主的樣品中的Ckβ-9蛋白水平的分析法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括放射免疫分析、競爭-結(jié)合分析、Western印跡分析、ELISA分析及“夾心”分析。一種ELISA分析(Coligan，et al.，Current Protocols inImmunology，1(2)，Chapter6(1991))最初包括制備一種特異于Ckβ-9抗原的抗體，優(yōu)選一種單克隆抗體。另外制備一種抗單克隆抗體的報(bào)告抗體。該報(bào)告抗體與可檢測的試劑如放射活性、熒光或本實(shí)施例中的辣根過氧化物酶相連。從宿主取出樣品且在結(jié)合樣品中的蛋白質(zhì)的固相載體中如聚苯乙烯皿中保溫，然后用非特異性蛋白如牛血清白蛋白溫育而覆蓋皿中的任何游離蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。接著，在皿中溫育單克隆抗體，在此期間單克隆抗體與同聚苯乙烯皿結(jié)合的任何Ckβ-9蛋白結(jié)合，用緩沖液洗去所有未結(jié)合的單克隆抗體。將與辣根過氧化物酶連接的報(bào)告抗體置入皿中導(dǎo)致報(bào)告抗體與同Ckβ-9相結(jié)合的任何單克隆抗體結(jié)合，然后洗去未接合的報(bào)告抗體。將過氧化物酶底物加入皿中，當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比時(shí)在一定時(shí)間內(nèi)的顯色量是測量一定體積的病人樣品中Ckβ-9蛋白量的一種手段。
競爭分析的使用方法是將特異于Ckβ-9的抗體與固相支持物相連，將標(biāo)記的Ckβ-9及衍生自宿主的樣品流過固相支持物，通過例如液閃層析檢測的標(biāo)記量與樣品中Ckβ-9的量相關(guān)。
“夾心”分析與ELISA分析類似，在“夾心”分析中，將Ckβ-9流過固相支持物而結(jié)合于同固相支持物連接的抗體。然后將第二種抗體與Ckβ-9相結(jié)合。將標(biāo)記的并特異于第二種抗體的第三種抗體流過固相支持物并結(jié)合于第二種抗體，然后確定數(shù)量。
本發(fā)明提供了一種鑒別Ckβ-9多肽的受體的方法。編碼受體的基因可經(jīng)許多本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法如配體淘選和FACS分選(Coligan，et al.，Current Protocols inImmun.，1(2).Chapter5，(1991))進(jìn)行鑒別。優(yōu)選地，采用表達(dá)克隆法，其中從對多肽有應(yīng)答的細(xì)胞中制備多腺苷酸化RNA，將產(chǎn)自該RNA的cDNA文庫分成各集合體用于轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞或?qū)Χ嚯臒o應(yīng)答的其它細(xì)胞。將在玻片上生長的轉(zhuǎn)染細(xì)胞暴露于標(biāo)記的多肽?？捎枚喾N方法包括碘化或引入位點(diǎn)特異性蛋白激酶的識(shí)別位點(diǎn)將多肽標(biāo)記。在固定和溫育后，對玻片進(jìn)行放射自顯影分析。鑒別出陽性集合體并使用重復(fù)的亞集合和重篩選方法制備亞集合體，最后產(chǎn)生編碼推測的受體的單一克隆。
作為受體鑒別的另一種方法，可將標(biāo)記的多肽與細(xì)胞膜或表達(dá)受體分子的提取制備物光親和性連接。經(jīng)PAGE分析將交聯(lián)材料分解并在X線下曝光。切下含多肽受體的標(biāo)記復(fù)合物，分解成肽片段并進(jìn)行蛋白質(zhì)微量測序。由微量測序得到的氨基酸序列用于設(shè)計(jì)生成一套寡核苷酸探針以篩選cDNA文庫從而鑒別編碼推測的受體的基因。
本發(fā)明提供了一種篩選化合物用以鑒別本發(fā)明的Ckβ-9多肽的刺激劑或拮抗劑的方法。刺激劑是一種具有多肽的類似生物學(xué)的化合物，而拮抗劑則阻斷這種功能。趨化物的檢測可通過將被本發(fā)明的多肽化學(xué)引誘的細(xì)胞置于具有足夠的孔徑(約5μm)以容納細(xì)胞的濾膜上。將可能的刺激劑的溶液置入小室的底部，而在上部分隔間中帶有合適的對照培養(yǎng)基，因此通過計(jì)數(shù)在一段期間內(nèi)遷移進(jìn)入或通過多孔膜的細(xì)胞測定刺激劑的濃度梯度。
當(dāng)分析拮抗劑時(shí)，將本發(fā)明的多肽置入小室底部并加入潛在的拮抗劑以測定細(xì)胞的趨化性是否被抑制。
或者，將表達(dá)多肽受體的哺乳細(xì)胞或其膜制備物在化合物的存在下與如放射性標(biāo)記的Ckβ-9多肽進(jìn)行溫育，則可檢測該化合物阻斷此相互作用的能力。當(dāng)以這種方法檢測刺激劑時(shí)，不使用趨化因子并測量刺激劑本身與受體相互作用的能力。
潛在的Ckβ-9拮抗劑包括抗體，或在某些情況下，與多肽結(jié)合的寡核苷酸。潛在的拮抗劑的另一例子是多肽的顯性失活突變體。顯性失活突變體是與野生型多肽的受體結(jié)合但不能保持其生物活性的多肽。
用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建物也是可能的拮抗劑。反義技術(shù)通過三螺旋形成或反義DNA或RNA可用于控制基因表達(dá)，這兩種方法均基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，用編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’編碼區(qū)設(shè)計(jì)長度為10-40bp的反義RNA寡核苷酸。設(shè)計(jì)一DNA寡核苷酸以互補(bǔ)于轉(zhuǎn)錄涉及的基因的某區(qū)域(三螺旋-見Lee et al.，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney et al，Science，241456(1988)；andDervan et al，Seience，2511360(1991)，從而防止趨化因子多肽的轉(zhuǎn)錄和生產(chǎn)。反義RNA寡核苷酸與mRNA體內(nèi)雜交并阻斷mRNA分子翻譯成多肽。(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。上述的寡核苷酸也可輸送至細(xì)胞，從而反義RNA或DNA可以在體內(nèi)表達(dá)以抑制Ckβ-9多肽的生產(chǎn)。
另一種潛在的Ckβ-9拮抗劑是多肽的肽衍生物，所述的多肽是失去生物學(xué)功能但仍能識(shí)別并與多肽受體結(jié)合從而有效地阻斷受體的多肽的天然或合成的修飾的類似物，肽衍生物的例子包括但不限于小肽或類肽分子。
拮抗劑可用于在自身免疫疾病、慢性炎癥及感染性疾病當(dāng)中抑制巨噬細(xì)胞及其前體、嗜中性白細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及一些T細(xì)胞亞型如活化的CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞及天然殺傷細(xì)胞的趨化性和活化作用。自身免疫疾病的例子包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥及胰島素依賴型糖尿病。一些感染性疾病包括阻止單核噬細(xì)胞的增生及激活的矽肺、結(jié)節(jié)病、原發(fā)性肺纖維化，阻止嗜酸性細(xì)胞的生產(chǎn)和遷移的原發(fā)性嗜酸性細(xì)胞增多綜合癥，阻止巨噬細(xì)胞的遷移及其生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的內(nèi)毒性休克。
拮抗劑也可通過阻止在動(dòng)脈壁的單核細(xì)胞的侵潤用于治療動(dòng)脈硬化。
拮抗劑也可通過抑制趨化因子誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫粒并釋放組胺用以治療組胺介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)和免疫失調(diào)包括晚期變態(tài)反應(yīng)，慢性蕁麻疹和特應(yīng)性皮炎。也可治療IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)如過敏性哮喘、鼻炎及濕疹。
拮抗劑也可通過阻止單核細(xì)胞對傷口區(qū)域侵潤治療慢性和急性炎癥。由于急性和慢性肺部炎癥與肺內(nèi)單核吞噬細(xì)胞的隔絕有關(guān)，因而拮抗劑也可用于調(diào)節(jié)正常肺吞噬細(xì)胞數(shù)量。
拮抗劑也可通過阻止單核細(xì)胞對患者關(guān)節(jié)內(nèi)滑液的侵潤用以治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。單核細(xì)胞的侵入及激活是退化性和炎癥性關(guān)節(jié)病的一個(gè)重要致病因素。
拮抗劑也可用于干擾主要是IL-1和TNF引起的損害性級(jí)聯(lián)作用，其能阻止其它炎性細(xì)胞因子的生物合成。由此拮抗劑可用于預(yù)防炎癥。拮抗劑也可用于抑制趨化因子誘導(dǎo)的前列腺素不依賴型發(fā)熱。
拮抗劑也可用于治療骨髓機(jī)能低下疾病，如再生障礙性貧血和骨髓發(fā)育不良綜合癥。
拮抗劑還可通過防止嗜酸性細(xì)胞積聚在肺內(nèi)用于治療哮喘及變態(tài)反應(yīng)。
拮抗劑還可用于治療上皮下基底膜纖維化，其是肺氣腫的一個(gè)顯著特征。
拮抗劑還可與如下所述藥學(xué)可接受的載體一起形成組合物而應(yīng)用。
Ckβ-9多肽及刺激劑和拮抗劑可以與合適的藥物學(xué)載體聯(lián)合應(yīng)用。如此的組合物包括治療有效量的多肽和藥物學(xué)可接受的載體或賦形劑。這種載體包括但不限于鹽水，緩沖鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇及其結(jié)合物。配制品應(yīng)適合給藥的方式。
本發(fā)明還提供了一種藥物包裝盒或試劑盒，其包括一或多個(gè)填充有一或多種本發(fā)明的藥物組合物成分的容器。與這種容器在一起的還有由控制藥品或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)出具的通知，該通知反應(yīng)了該機(jī)構(gòu)許可其為人體用而生產(chǎn)、使用或銷售。另外，本發(fā)明的多肽和刺激劑和拮抗劑可以與其它藥物化合物結(jié)合應(yīng)用。
此藥物組合物可以諸如局部，靜脈，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，腫瘤內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)，或皮內(nèi)途徑的傳統(tǒng)方式給藥。藥物組合物的給藥量是足以治療和/或預(yù)防特定的病癥。一般來說，多肽的給藥量至少為大約每天每千克體重10微克，大多數(shù)情況下給藥量不超過每天每千克體重約8毫克。大多數(shù)情況下，考慮到給藥途徑、癥狀等，藥劑量為每天每千克體重約10微克至1毫克。
根據(jù)本發(fā)明，Ckβ-9多肽和也是多肽的刺激劑或拮抗劑也可以用于體內(nèi)表達(dá)多肽，即經(jīng)常被稱為“基因治療”的方法。
因此，例如，可用編碼來自體內(nèi)的多肽的多核苷酸(DNA或RNA)對患者的細(xì)胞進(jìn)行工程化，隨后將工程化的細(xì)胞再提供給需用多肽治療的患者，這些方法是本領(lǐng)域公知的。例如，可用含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒利用本領(lǐng)域熟知的程序?qū)?xì)胞進(jìn)行工程化。
類似地，例如也可通過本領(lǐng)域公知的程序在體內(nèi)對細(xì)胞進(jìn)行工程化以在體內(nèi)表達(dá)多肽。如本領(lǐng)域所公知的，可將生產(chǎn)含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)者細(xì)胞給予患者以在體內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞的工程化并在體內(nèi)表達(dá)多肽。通過這種方法給予本發(fā)明的多肽的這些和其它方法對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)是顯而易見的。例如，用于工程化細(xì)胞的表達(dá)載體可以不是反轉(zhuǎn)錄病毒，而是例如腺病毒，其在與合適的輸送載體結(jié)合后可用于在體內(nèi)工程化細(xì)胞。
本發(fā)明的序列還可用于染色體鑒定，該序列特異地定向于個(gè)別的人染色體的特定位置并可與之雜交。另外，目前需要鑒定染色體上的特定位點(diǎn)，而現(xiàn)在只有很少幾種基于實(shí)際序列資料(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記試劑可以商購用于標(biāo)記染色體位置。本發(fā)明的將DNA定位于染色體是將這些序列與相關(guān)疾病的基因聯(lián)系起來的非常重要的第一步。
簡而言之，可通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)而將序列定位在染色體上。使用cDNA的計(jì)算機(jī)分析快速選擇長度不超過基因組DNA的一個(gè)外顯子并因而不會(huì)使擴(kuò)增復(fù)雜化的引物，隨后使用這些引物對含有個(gè)別的人染色體的體細(xì)胞雜合子進(jìn)行PCR篩選。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合子能得到擴(kuò)增片段。
體細(xì)胞雜合子的PCR作圖是將特定DNA定位于特定染色體的一個(gè)快速程序。采用本發(fā)明相同的寡核苷酸引物，可以類似的方式將來自特定染色體的一組片段或大基因組克隆的集合體進(jìn)行亞定位。其它的可類似用于染色體作圖的作圖策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流選的染色體進(jìn)行的預(yù)篩選，以及通過雜交預(yù)選以構(gòu)建染色體特異cDNA文庫。
cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以用來提供精確的一步法染色體定位。這一技術(shù)可使用短至50或60個(gè)堿基的cDNA。此技術(shù)的綜述見Verma et al.，Human Chromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某一序列已被精確定位于染色體某一位置，則可比較該序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜資料的關(guān)系，這種資料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritance inMan中發(fā)現(xiàn)(可在線從Johns Hopkins University Welch Medical Library獲得)。隨后可通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳性)鑒別基因與已定位于相同染色體區(qū)的疾病之間的關(guān)系。
接著，必須確定感染個(gè)體和未感染個(gè)體之間的cDNA或基因組序列的差異，如果在一些或所有感染個(gè)體中觀察到某一突變而未在任何正常個(gè)體中觀察到這種突變，則該突變可能是該疾病的致病原。
應(yīng)用目前的物理作圖和遺傳作圖技術(shù)的分辨率，一種精確定位于與疾病有關(guān)的染色體區(qū)的cDNA可以是50-500個(gè)潛在的致病基因中的一個(gè)(這假定作圖分辨率為1兆堿基，并且每20kb為一個(gè)基因)。
多肽、其片段或其它衍生物、或其類似物、或表達(dá)其的細(xì)胞可用作免疫原生產(chǎn)抗體，這些抗體可以是例如多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還包括嵌合抗體、單鏈抗體和人源化抗體，以及Fab片段，或者Fab表達(dá)文庫的產(chǎn)物?？墒褂矛F(xiàn)有技術(shù)中公知的各種程序生產(chǎn)這些抗體和片段。
抗對應(yīng)于本發(fā)明的序列的多肽的抗體可以通過將多肽直接注射給動(dòng)物或?qū)⒍嚯慕o予動(dòng)物、優(yōu)選非人而獲得，如此獲得的抗體隨后與多肽本身結(jié)合。以這種方式，僅編碼多肽的一個(gè)片段的序列也可用于生產(chǎn)與完整天然多肽結(jié)合的抗體，這種抗體隨后可用于從表達(dá)該多肽的組織中分離該多肽。
為制備單克隆抗體，可使用任何提供由連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物生產(chǎn)的抗體的技術(shù)，例如雜交瘤技術(shù)(Kohler and Milstein，1975，Nature，256495-497)，三瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(kozbor et al.，1983，Immunology Today 472)，以及生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(USP4.946，778)可以用來生產(chǎn)本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。另外，轉(zhuǎn)基因小鼠也可用于表達(dá)本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的人源化抗體。
以下將參照實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是應(yīng)理解的是，本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。除非另有說明，所有的份或量均為重量份或重量。
為促進(jìn)對下述實(shí)施例的理解，以下將描述常用的方法和/或術(shù)語。
“質(zhì)?！钡拿菍⑿懽帜竝置于前面和/或后跟大寫字母和/或數(shù)字。本文的起始質(zhì)?；蛘呤巧藤彽玫降?，或者是公眾可以不受限制地得到的，或者可以根據(jù)公布的程序由可得到的質(zhì)粒構(gòu)建的。另外，與所述的這些等效的質(zhì)粒是本領(lǐng)域公知的，并對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
DNA的“消化”是指用僅作用于DNA的特定序列的限制性酶對DNA的催化裂解。本文所用的各種限制性酶是可商購的，其反應(yīng)條件、輔因子和其它要求對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的。為分析目的，典型地，1μg質(zhì)?；駾NA片段使用約2單位的酶，反應(yīng)體積為20μl緩沖液；為分離DNA片段用于構(gòu)建質(zhì)粒的目的，典型地，在較大體積中用20-250單位酶消化5-50μg DNA。對特定限制性酶的合適的緩沖液和底物由廠商提供。通常使用37℃1小時(shí)的溫育時(shí)間，但可根據(jù)供應(yīng)商的指示而變化。消化后，將反應(yīng)物直接在聚丙烯酰胺凝膠上電泳以分離所需片段。
裂解片段的大小分離是根據(jù)Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，84057(1980)所述在8％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行。
“寡核苷酸”是指可化學(xué)合成的單鏈聚脫氧核苷酸或兩個(gè)互補(bǔ)的聚脫氧核苷酸鏈。這種合成的寡核苷酸沒有5’磷酸，并因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸則不能與另一寡核苷酸連接。合成的寡核苷酸將與沒有經(jīng)過脫磷酸化的片段連接。
“連接”是指在兩個(gè)雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，etal.，Id.，p.146)。除非另有說明，連接可以采用公知的緩沖液，在每0.5μg約等摩爾的待連接DNA片段使用10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)的條件下進(jìn)行。
除非另有說明，使用Graham，F(xiàn).and Van der Eb.A.，Virology，52456-457(1973)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例1 Ckβ-9的細(xì)菌表達(dá)和純化用對應(yīng)于加工的Ckβ-9蛋白(減去推測的信號(hào)肽序列)的5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增編碼Ckβ-9的DNA序列，ATCC#75803。將對應(yīng)于Ckβ-9的附加的核苷酸分別加入到5’和3’序列。5’寡核苷酸引物序列為5’-CCCGCATGCGTGATGGAGGGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.3)，其含有一SphI限制性酶位點(diǎn)(黑體字處)，后接起自編碼成熟蛋白序列的第二個(gè)核苷酸的17個(gè)Ckβ-9編碼序列的核苷酸(下劃線處)。ATG密碼子包含在SphI位點(diǎn)內(nèi)，ATG后的下一個(gè)密碼子，其第一個(gè)堿基來自SphI位點(diǎn)，剩下兩個(gè)堿基對應(yīng)于推定的成熟蛋白的第一個(gè)密碼子(殘基S24)的第二個(gè)和第三個(gè)堿基。結(jié)果，此密碼子的第一個(gè)堿基與原序列相比由A變成C，結(jié)果導(dǎo)致在重組蛋白中S由R取代。3’序列為5’-AAAGGATCCTGGCCCTTTAGGGGTCTGTGA-3’(SEQ ID NO.4)，其含有互補(bǔ)于BamHI位點(diǎn)的序列(黑體字處)，后接21個(gè)在終止密碼子前的基因特異性序列的核苷酸。限制性酶位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-70(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，OA，91311)上的限制性酶位點(diǎn)。pQE-70編碼抗生素抗性(Ampr’)，一個(gè)細(xì)菌復(fù)制點(diǎn)(ori)，一個(gè)IPTG可調(diào)控啟動(dòng)子操縱子(P/O)，一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記(6-His)及限制性酶位點(diǎn)。用SphI和BamHI消化pQE-70。將擴(kuò)增序列連到pQE-9中并插入有編碼6-組氨酸標(biāo)記的序列及RBS的框架中。然后通過Sambrook，J.et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringLaboratory Press，(1989)所述步驟，用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli菌株M15/rep4(來自Qiagen，Inc.)。M15/rep4含有多拷貝的表達(dá)lacI阻遏物并賦予卡那霉素抗性(Kanr’)的質(zhì)粒pREP4。在LB平板上鑒別轉(zhuǎn)化子并篩選氨芐青霉素/卡那霉素抗性克隆。分離質(zhì)粒DNA并經(jīng)限制性分析確定。在補(bǔ)加Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的液體LB培養(yǎng)基中將含有所需構(gòu)建物的克隆培養(yǎng)過夜(O/N)，O/N培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的比例接種到大體積培養(yǎng)基中。培養(yǎng)細(xì)胞至光密度600(0.D.600)為0.4-0.6。隨后加入IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)激活P/O，使基因表達(dá)水平提高。再培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶解到離液劑6M鹽酸胍中，澄清后，在使得與含6-His標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下，通過鎳-鰲合柱層析(Hochuli，E.et.，J.Chromatography411177-184(1984)，從溶液中純化溶解的Ckβ-9。在6M鹽酸胍pH5.0中從柱中洗脫Ckβ-9(純度＞98％)。蛋白質(zhì)由GnHCl中復(fù)性出來可以各種方案進(jìn)行(Jaenicke，R.and Rudolph，R.，Protein Strueture-A Practical Approach，IRL Press，New York(1990)。首先使用透析步驟以除去GnHCl。或者從鎳-鰲合柱中分離出的純化的蛋白質(zhì)結(jié)合到第二個(gè)柱中，在第二個(gè)柱中具有下降的線性GnHCl梯度。在結(jié)合到柱中時(shí)使蛋白質(zhì)復(fù)性，隨后用含250mM咪唑，150mM氯化鈉，25mM Tris-HCl pH7.5及10％甘油的緩沖液洗脫。最后，將溶解的蛋白質(zhì)對含5mM碳酸氫銨的貯存緩沖液透析。
實(shí)施例2 重組Ckβ-9在COS細(xì)胞中的表達(dá)衍生自載體pcDNAI/Amp(Initrogen)的表達(dá)質(zhì)粒Ckβ-9 HA含有1)SV40復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)E.coli復(fù)制起點(diǎn)，4)CMV啟動(dòng)子，后接多接頭區(qū)、SV40內(nèi)含子和多腺苷酸化位點(diǎn)。編碼完整Ckβ-9前體和在框內(nèi)融合到其3’末端的HA標(biāo)記的DNA片段被克隆至載體的多接頭區(qū)，從而重組蛋白質(zhì)直接在CMV啟動(dòng)子下表達(dá)。HA標(biāo)記對應(yīng)于衍生自前述流感血凝集素蛋白的表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，Cell 37，767)。HA標(biāo)記與靶蛋白質(zhì)融合使得用識(shí)別HA表位的抗體很容易檢測重組蛋白質(zhì)。
下面闡述質(zhì)粒構(gòu)建策略使用兩種引物由PCR構(gòu)建編碼Ckβ-9的DNA序列，ATTC#75803，5’引物序列為5’-AAAGGGATCCAGACATGGCTCAGTCACT-3’(SEQ ID NO.5)，其含有一BamHI位點(diǎn)，后接18個(gè)起自起始密碼子的Ckβ-9編碼序列的核苷酸；3’序列為5’CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATGGCCCTTTAGGGGTCTG-3’(SEQ ID NO.6)，其含有互補(bǔ)于XbaI位點(diǎn)的序列，轉(zhuǎn)譯終止密碼子、HA標(biāo)記及Ckβ-9編碼序列的最后18個(gè)核苷酸(不包括終止密碼子)。因此PCR產(chǎn)物含有一BamHI位點(diǎn)，Ckβ-9編碼序列，后接框內(nèi)融合的HA標(biāo)記，HA標(biāo)記后的轉(zhuǎn)譯終止密碼子及XbaI位點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體，pcDNAI/Amp，用BamHI和XabI限制性酶消化并連接。用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli菌體SURE(得自Strategene Cloning Systems，La Jolla，CA 92037)，在氨芐青霉素培養(yǎng)平板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物并篩選抗性克隆。從轉(zhuǎn)化子中分離出質(zhì)粒DNA并用限制性分析檢測正確的片段的存在。為表達(dá)重組Ckβ-9，將COS細(xì)胞通過DEAE-DEXTRAN方法用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Manictis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1987)。用放射標(biāo)記和免疫沉淀法檢測Ckβ-9HA蛋白的表達(dá)(E.Harlw，D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，(1988)。轉(zhuǎn)染二天后，將細(xì)胞用35S-半胱氨酸標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)物培養(yǎng)基，用去污劑(RIPA緩沖液(150mM氯化鈉，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5)。(Wilson，I.et al.，Id.37767(1984))將細(xì)胞裂解，將細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基用HA特異性單克隆抗體沉淀。將沉淀的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE分析。
實(shí)施例3通過基因治療的表達(dá)成纖維細(xì)胞得自皮膚活組織檢查的材料，將所得組織置入組織培養(yǎng)物培養(yǎng)基并分成小片。將小體積組織放在組織培養(yǎng)瓶的濕表面上，在每瓶中放置大約10片組織。將瓶倒轉(zhuǎn)，密封并在室溫下過夜。在室溫下24小時(shí)后，將瓶顛倒，組織仍固定在瓶底，加入新鮮培養(yǎng)基(如含有10％FBS、青霉素及鏈霉素的Ham”S F12培養(yǎng)基)。然后在37℃溫育大約一周。此時(shí)加入新鮮培養(yǎng)基，每幾天換一次。又培養(yǎng)兩周后，成纖維細(xì)胞的單層形成。將該單層胰蛋白酶化并量入較大的燒瓶。
將兩側(cè)具有Moloney鼠肉瘤病毒的長末端重復(fù)序列的pMV-7(Kirschmeier，P.T.et al.，DNA，7219-25(1988))用EcoRI及HindIII消化，隨后用牛腸磷酸酶處理。用玻璃珠在瓊脂糖凝膠中將線性載體分離并純化。
編碼本發(fā)明多肽的cDNA用分別對應(yīng)于5’和3’末端序列的PCR引物擴(kuò)增。5’引物包括一EcoRI位點(diǎn)而3’引物還包括一個(gè)HindIII位點(diǎn)。將等量的Moloney鼠肉瘤病毒的線性骨架及擴(kuò)增的EcoRI和HindIII片段在T4 DNA連接酶的存在下加到一起。在使兩片段連接的合適條件下保持所得混合物。該連接混合物用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌HB101，然后將其在含卡那霉素的瓊脂上鋪板用以確定載體具有正確插入的感興趣的基因。
兼嗜性pA317或Gp+am12包裝細(xì)胞在含10％牛血清(CS)、青霉素和鏈霉素的Dvlbecco’s改良的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)中組織培養(yǎng)生長至鋪滿密度。然后將含基因的MSV載體加入培養(yǎng)基并用MSV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。包裝細(xì)胞現(xiàn)能生產(chǎn)含基因的感染性病毒顆粒(現(xiàn)將包裝細(xì)胞稱為生產(chǎn)者細(xì)胞)。
將新鮮培養(yǎng)基加入轉(zhuǎn)導(dǎo)的生產(chǎn)者細(xì)胞，隨后自鋪滿的生產(chǎn)者細(xì)胞的10cm平板中收集培養(yǎng)基。將含感染性病毒顆粒的失效培養(yǎng)基經(jīng)微孔濾膜過濾以除去脫落的生產(chǎn)者細(xì)胞，然后該培養(yǎng)基用于感染成纖維細(xì)胞。自成纖維細(xì)胞的一個(gè)亞鋪滿平板中除去培養(yǎng)基并迅速用取自生產(chǎn)者細(xì)胞的培養(yǎng)基代替。除去該培養(yǎng)基并替以新鮮培養(yǎng)基。如果病毒的滴度較高，則所有成纖維細(xì)胞都被感染且不需篩選。如果病毒的滴度很低，則需要使用具有選擇標(biāo)記如neo或his的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
隨后將工程化的成纖維細(xì)胞注射入宿主，或者將將工程化的成纖維細(xì)胞在cytodex3微載體珠上培養(yǎng)至鋪滿后再注射入宿主?，F(xiàn)在成纖維細(xì)胞可以生產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
依據(jù)上述教導(dǎo)對本發(fā)明可做各種修改及變動(dòng)，因此在權(quán)利要求范圍內(nèi)本發(fā)明可以與具體描述的不同方法實(shí)施。序列表(1)一般信息(i)申請人LI，ET AL.(ii)發(fā)明名稱人趨化因子β-9(iii)序列數(shù)6(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART &OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新澤西州(E)國家美國(F)郵編07068(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型3.5寸軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PS/2(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)注冊號(hào)36，134(C)案號(hào)/文檔號(hào)325800-434(ix)通訊信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的言息(i)序列特征(A)長度405堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGCTCAGT CACTGGCTCT GAGCCTCCTT ATCCTGGTTC TGGCCTTTGG CATCCCCAGG 60ACCCAAGGCA GTGATGGAGG GGCTCAGGAC TGTTGCCTCA AGTACAGCCA AAGGAAGATT120CCCGCCAAGG TTGTCCGCAG CTACCGGAAG CAGGAACCAA GCTTAGGCTG CTCCATCCCA180GCTATCCTGT TCTTGCCCCG CAAGCGCTCT CAGGCAGAGC TATGTGCAGA CCCAAAGGAG240CTCTGGGTGC AGCAGCTGAT GCAGCATCTG GACAAGACAC CATCCCCACA GAAACCAGCC300CAGGGCTGCA GGAAGGACAG GGGGGCCTCC AAGACTGGCA AGAAAGGAAA GGGCTCCAAA360GGCTGCAAGA GGACTGAGCG GTCACAGACC CCTAAAGGGC CATAG405(3)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度134氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala-20 -15 -10Phe Gly Ile Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp-5 15Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val10 15 20Arg Ser Tyr Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro25 30 35Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys40 45 50Ala Asp Pro Lys Glu Leu Tyr Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu55 60 65Asp Lys Thr Pro Ser Pro Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys70 75 80Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys85 90 95Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser Gln Thr Pro Lys Gly Pro100 105 110(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度26堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3CCCGCATGCG TGATGGAGGG GCTCAG26(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4AAAGGATCCT GGCCCTTTAG GGGTCTGTGA30(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5AAAGGATCCA GACATGGCTC AGTCACT27(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度56堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CGCTCTAGAT CAAGCGTAGT CTGGGACGTCG TATGGGTATG GCCCTTTAGG GGTCTG 5權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，其包括選自如下一組的成員(a)編碼包括SEQ ID NO2列出的-23位氨基酸至111位氨基酸的多肽的多核苷酸；(b)編碼包括SEQ ID NO2列出的1位氨基酸至111位氨基酸的多肽的多核苷酸；(c)能與(a)或(b)的多核苷酸雜交且與其有至少70％同一性的多核苷酸；(d)(a)、(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是DNA。
3.權(quán)利要求2的多核苷酸，其編碼包括SEQ ID NO2的第1-第111位氨基酸的多肽。
4.一種分離的多核苷酸，包括選自如下一組的成員(a)編碼具有由ATCC保藏號(hào)75803的DNA表達(dá)的氨基酸序列的成熟多肽的多核苷酸；(b)編碼具有由ATCC保藏號(hào)75803的DNA表達(dá)的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(c)能與(a)所述多核苷酸雜交且與其至少有70％同一性的多核苷酸；(d)(a)、(b)或(c)所述多核苷酸的多核苷酸片段。
5.權(quán)利要求1的多核苷酸，其包括SEQ ID NO1列出的從核苷酸1至核苷酸405的序列。
6.權(quán)利要求1的多核苷酸，其包括SEQ ID NO1列出的的從核苷酸70至核苷酸405的序列。
7.一種含有權(quán)利要求2的DNA的載體。
8.用權(quán)利要求7的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞。
9.一種生產(chǎn)多肽的方法，包括用權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞表達(dá)由所述DNA編碼的多肽。
10.一種生產(chǎn)能表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求7的載體對細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程化。
11.一種由權(quán)利要求1的多核苷酸編碼的多肽，包括選自如下一組的成員(i)具有SEQ ID NO2的推導(dǎo)的氨基酸序列的成熟多肽及其片段、類似物及衍生物；以及(ii)由ATCC保藏號(hào)75803的cDNA編碼的成熟多肽及其片段、類似物及衍生物。
12.權(quán)利要求11的多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO2的1-111位氨基酸。
13.一種抑制權(quán)利要求11的多肽的受體活化的化合物。
14.一種活化權(quán)利要求11的多肽的受體的化合物。
15.一種治療需要Ckβ-9的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求11的多肽。
16.權(quán)利要求15的方法，其中通過提供給患者編碼所述多肽的DNA并在體內(nèi)表達(dá)所述多肽而給予治療有效量的多肽。
17.一種治療需要抑制Ckβ-9多肽的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求13的化合物。
18.一種診斷與權(quán)利要求11的多肽低表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病的易感性的方法，包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中的突變。
19.一種診斷方法，包括分析衍生自宿主的樣品中權(quán)利要求11的多肽的存在。
20.一種鑒別權(quán)利要求11的多肽的刺激劑或拮抗劑化合物的方法，包括在允許與受體結(jié)合的條件下將在其表面表達(dá)多肽受體的細(xì)胞與可分析檢測的化合物接觸，所述受體與能提供一種應(yīng)答化合物與所述受體結(jié)合的檢測信號(hào)的第二種組分結(jié)合；檢測產(chǎn)生自化合物與受體相互作用的信號(hào)的存在與不存在。
全文摘要
本發(fā)明公開了人Ckβ-9多肽和編碼這種趨化因子多肽的DNA(RNA)，還提供了通過重組技術(shù)生產(chǎn)這種多肽的方法。還公開了利用該Ckβ-9多肽用于治療白血病、腫瘤、慢性感染、自身免疫疾病、纖維化疾病、傷口愈合及銀屑病的方法，以及抗此多肽的拮抗劑及其作為治療劑治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫和慢性炎癥及感染性疾病、變態(tài)反應(yīng)、前列腺素不依賴型發(fā)熱及骨髓功能低下的應(yīng)用。還公開了檢測Ckβ-9編碼序列中的突變及Ckβ-9蛋白的過表達(dá)的診斷分析法。
文檔編號(hào)C12N1/15GK1161714SQ95195764
公開日1997年10月8日 申請日期1995年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月6日
發(fā)明者李浩東, 馬克·D·亞當(dāng)斯 申請人:人體基因組科學(xué)有限公司