專利名稱：人神經(jīng)細(xì)胞特異表達(dá)的質(zhì)粒型皰疹病毒載體的構(gòu)建及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在人神經(jīng)細(xì)胞中特異表達(dá)的質(zhì)粒型皰疹病毒載體及其用途，特別涉及外源基因表達(dá)為單純皰疹病毒立即早期啟動(dòng)子所控制的，利用單純皰疹病毒基因組復(fù)制元件和包裝信號(hào)序列所構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒載體及其用途。
單純皰疹病毒I型(HSV-1)的突出特征是其嗜神經(jīng)性，感染神經(jīng)細(xì)胞后可在其中順行或逆行傳播或經(jīng)突觸傳播，其基因組在神經(jīng)細(xì)胞中以環(huán)狀閉合的雙鏈形式存在于細(xì)胞核中，不影響神經(jīng)細(xì)胞功能。目前已明確HSV-1基因組中復(fù)制和包裝成病毒顆粒的編碼區(qū)段。在大腸桿菌質(zhì)粒中引入HSV-1基因組的這兩段序列元件以及HSV-1立即早期基因IE68的啟動(dòng)子區(qū)段(M.J.Murchie，et al.DNA sequence analysis of an immediate-earlygene region of the herpes simplex virus type 1 genome(map coordinates 0.950to 0.978).J.Gen.Virol.(1982)62，1-15)，便可構(gòu)成一個(gè)既能在大腸桿菌中擴(kuò)增，又能在人細(xì)胞中穩(wěn)定存在的穿梭載體，而且因此載體中含有HSV-1包裝信號(hào)序列，將其與輔助病毒HSV-1的溫度敏感株(tsK)共轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后，多拷貝的質(zhì)粒型載體可經(jīng)包裝信號(hào)序列切割、串聯(lián)在一起，達(dá)到HSV-1基因組長(zhǎng)度時(shí)包裝成假病毒顆粒，這種假病毒顆粒具有和完整HSV-1顆粒同樣的嗜神經(jīng)性和感染效率，可以有效得將外源基因?qū)肷窠?jīng)細(xì)胞而表達(dá)外源基因(Richard R.Spaete，et al.The herpes simplex virusamplicona new eucaryotic defective-virus cloning-amplifying vector.Cell(1982)30，295-304)。
實(shí)現(xiàn)基因治療的前提條件即是將外源基因有效得導(dǎo)入細(xì)胞。過(guò)去常用的方法如顯微注射、轉(zhuǎn)基因小鼠、DNA轉(zhuǎn)染和反轉(zhuǎn)錄病毒載體等均不能將外源基因有效地導(dǎo)入分裂后細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞。而將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物的神經(jīng)細(xì)胞，如將酪氨酸羥化酶基因?qū)氪笫蟀徒鹕习Y模型的紋狀體以改善其癥狀等(Matthew J.During，et al.Long-term behavioral recovery inParkinsonian rats by an HSV vector expressing tyrosine hydroxylase.Science(1994)266，1399-1403)；可以精確地改變神經(jīng)細(xì)胞的生理和病理狀況，將對(duì)神經(jīng)生理學(xué)的研究和神經(jīng)系統(tǒng)的基因治療等具有重要的意義。
本發(fā)明提出的質(zhì)粒型載體pHSV-apl中除具有HSV-1基因組復(fù)制起點(diǎn)和包裝信號(hào)序列外，還在HSV IE啟動(dòng)子下游引入一段多酶切點(diǎn)序列，可以插入外源基因以應(yīng)用于神經(jīng)生理、病理及神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的研究，使操作更簡(jiǎn)便，更具實(shí)用價(jià)值。
本發(fā)明的目的是提供一種神經(jīng)細(xì)胞特異表達(dá)載體，它可在輔助病毒的輔助下將外源基因有效地導(dǎo)入神經(jīng)系統(tǒng)，穩(wěn)定存在并表達(dá)外源基因，具有比其他方法高得多的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。它作為一種大腸桿菌、人細(xì)胞穿梭質(zhì)?？稍诖竽c桿菌中大量擴(kuò)增，經(jīng)簡(jiǎn)單的純化就可在輔助病毒幫助下包裝成病毒顆粒而用于向神經(jīng)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞特異表達(dá)的質(zhì)粒型載體pHSV-apl(見(jiàn)附圖
)，由下列元件組成1 HSV-1 IE68基因的啟動(dòng)子。
2 啟動(dòng)子之后的多酶切點(diǎn)3 HSV-1基因組復(fù)制子(HSV-1 ori)。
4 HSV-1包裝信號(hào)序列(Packaging site)。
5 大腸桿菌質(zhì)粒骨架，包括大腸桿菌復(fù)制子(E.coli ori.)和氨芐青霉素抗性β內(nèi)酰胺酶基因(Ampr)。
本發(fā)明中用于載體構(gòu)建的原始質(zhì)粒有如下幾種pSV-β-Galactosidase VectorPromega公司商品質(zhì)粒#E1081pT2(Nigel D.Stow，et al.Characterization of the TRs/IRs Origin of DNAReplication of Herpes Simplex Virus Typel.Virology(1993)130，427-438)pEcoBHSV-1病毒Kos株基因組EcoRIB片段克隆于pBR322質(zhì)粒。
下面是質(zhì)粒型皰疹病毒載體pHSV-apl的構(gòu)建過(guò)程1從HSV-1基因組中分離出含有包裝信號(hào)序列的基因區(qū)段。首先人工合成兩個(gè)單鏈寡核苷酸片段，其鹼基序列分別與該基因片段的兩端互補(bǔ)，再將此兩段寡核苷酸鏈3’末端標(biāo)記Dig-ddUTP制成探針，分別與HSV-1EcoRIB片段的酶解片段進(jìn)行Southern印跡雜交，以分離該包裝信號(hào)序列。
詳細(xì)如下先用EcoRI從pEcoB中切出HSV-1 EcoRI B片段，再用BamHI酶解該片段，Southern印跡雜交后得到-6.5Kb大小的陽(yáng)性片段。將其克隆在pSK的BamHI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pBam6.5。同上再用BglI，HinfI，Sau3AI，StyI和XbaI分別酶解該6.5Kb片段。雜交后得到一約1.7Kb的HinfI陽(yáng)性片段，將其兩端補(bǔ)平后克隆入pGEM-3zf的SmaI位點(diǎn)，得到pGEM1.7。即此成功分離出含有包裝信號(hào)序列的基因片段。
2用HindIII、BamHI雙酶切pSV-β-Galactosidase Vector，得到含有l(wèi)acZ基因的3.7Kb片段；同時(shí)用EcoRI、BamHI雙酶切pSV-β-GalactosidaseVector，得到含有Ampr和E.coli ori的2.7Kb片段；用EcoRI、HindIII雙酶切pT2，得到含有HSV-1 IE68基因啟動(dòng)子和HSV-1基因組復(fù)制起點(diǎn)的1.0Kb片段。三片段連接，得到質(zhì)粒pHSV-β-gal。
3用HindIII、EcoRI雙切pGEM1.7，得到兩端為HindIII、EcoRI位點(diǎn)的1.7kb片段；同時(shí)用HindIII、BamHI切pHSV-β-gal，以去除lacZ基因片段；再將1.7kb片段與之連接，先使兩個(gè)片段的HindIII粘端相接，再補(bǔ)平EcoRI、BamHI兩個(gè)游離的不匹配末端，再平端自連。至此將包裝信號(hào)序列插入pHSV-β-gal，取代其中的lacZ基因，并在HSV-1 IE68基因啟動(dòng)子下游帶入一多酶切點(diǎn)，獲得既含有HSV-1IE啟動(dòng)子，又含有其復(fù)制起點(diǎn)及包裝信號(hào)序列的穿梭載體pHSV-apl(見(jiàn)附圖)。
本發(fā)明提出的質(zhì)粒型皰疹病毒載體pHSV-apl中的HSV-1 IE68基因啟動(dòng)子下游的多酶切點(diǎn)處可插入其它外源基因，當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可在輔助病毒的協(xié)助下被包裝成復(fù)制缺陷型的單純皰疹病毒毒粒，可直接接種體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞以在其中表達(dá)外源基因，也可以直接注射的方式注入神經(jīng)系統(tǒng)或接種外周神經(jīng)系統(tǒng)后，病毒通過(guò)在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的逆向運(yùn)動(dòng)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并表達(dá)外源基因。故pHSV-apl可用于神經(jīng)生理、病理及神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的實(shí)驗(yàn)研究。
本發(fā)明提出的質(zhì)粒型皰疹病毒載體pHSV-apl，可保存在大腸桿菌TG1株，含pHSV-apl質(zhì)粒的菌株命名為pHSV-apl/TG1。在含50-100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中(1％tryptone，0.5％yeast extract，1％NaCl)傳代培養(yǎng)(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)0263菌種名稱大腸桿菌pHSV-apl/TG1 Escherichia coli。
以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的質(zhì)粒型皰疹病毒載體pHSV-apl及以此為基礎(chǔ)制備的表達(dá)外源基因的復(fù)制缺陷型單純皰疹病毒毒粒的制備和用途作了詳細(xì)說(shuō)明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例1表達(dá)外源基因的pHSV-lac的構(gòu)建。
先用HindIII、BamHI雙酶切pSV-β-Galactosidase Vector中的3.7kblacZ基因片段；同時(shí)用HindIII、BamHI雙酶切pHSV-apl，因?yàn)閜HSV-apl多酶切點(diǎn)中恰好有此兩位點(diǎn)，故可將3.7kb lacZ基因片段直接連接入pHSV-apl，得到pHSV-lac。該質(zhì)粒以脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的神經(jīng)元后3-5天，用組織化學(xué)方法可檢測(cè)到受染細(xì)胞中LacZ基因的表達(dá)。
實(shí)施例2質(zhì)粒的制備。
將pHSV-lac/TG1接種于300ml LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，離心收菌體，加10ml溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/LEDTA，pH8.0)重懸菌體，冰浴下加20ml溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)5分鐘后加7.5ml溶液III(100ml中含5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)混勻，15000rpm離心15分鐘，上清加0.6倍體積異丙醇沉淀。沉淀以2ml TE溶解，等體積酚-氯仿-異戊醇(24∶24∶1，v/v)抽提去除蛋白質(zhì)，然后在Sepharose 4B柱(15.0×1.0cm)凝膠過(guò)濾，收集流出的質(zhì)粒峰。
實(shí)施例3復(fù)制缺陷型HSV-lac Stock，即含有復(fù)制缺陷的病毒顆粒和HSV-1 tsK的混合毒株的制備。
HSV-1 tsK病毒懸液以0.1M.O.I接種60-80％成片的Vero細(xì)胞，31℃吸附1.5小時(shí)。取5ug pHSV-lac與30ul脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectine混合，加無(wú)菌去離子水到100ul，室溫放置15分鐘，補(bǔ)無(wú)血清培養(yǎng)基至2ml，加入到上述HSV-1 tsK感染的細(xì)胞單層上，置31℃10小時(shí)，加入含10％小牛血清的Eagle’s培養(yǎng)液，細(xì)胞病變超過(guò)80％后收毒，即為復(fù)制缺陷型HSV-lac stock。
實(shí)施例4復(fù)制缺陷型HSV-lac stock在體外培養(yǎng)的SD大鼠胚胎脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)lacZ基因取HSV-lac Stock 20ul接種到培養(yǎng)約10萬(wàn)的SD大鼠胚胎脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中，置37℃培養(yǎng)72小時(shí)后原位檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性，結(jié)果見(jiàn)有近10％的細(xì)胞變蘭。
實(shí)施例5復(fù)制缺陷型HSV-lac stock在成年Wistar大鼠腦內(nèi)表達(dá)LacZ基因。
取1ul復(fù)制缺陷型HSV-lac stock(1×105pfu)注射到體重250g左右成年Wistar大鼠的紋狀體(bregma+0.5，lateral 2.5，and ventral 5.0)。5天后，手術(shù)取出大腦，冰凍切片，用組織化學(xué)方法檢測(cè)β-半乳糖苷酶基因表達(dá)情況，可見(jiàn)在注射部位周圍有多量神經(jīng)細(xì)胞變藍(lán)。
權(quán)利要求
1.一種在人神經(jīng)細(xì)胞中特異表達(dá)的質(zhì)粒型皰疹病毒載體pSHV-apl，其特征在于由下列DNA元件組成(1)HSV-1IE68基因的啟動(dòng)子(2)啟動(dòng)子之后的多酶切點(diǎn)(3)HSV-1基因組復(fù)制子(HSV-1ori)(4)HSV-1包裝信號(hào)序列(Packaging site)(5)大腸桿菌質(zhì)粒骨架，包括大腸桿菌復(fù)制子(E.coli ori.)和氨芐青霉素抗性β內(nèi)酰胺酶基因(Ampr)。
2.一種在人神經(jīng)細(xì)胞中特異表達(dá)的質(zhì)粒型皰疹病毒載體pSHV-apl(由權(quán)力要求1所述的五種DNA構(gòu)件所組成)的用途，其特征在于可在多酶切點(diǎn)處插入其它外源基因，當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可在輔助病毒的協(xié)助下被包裝成復(fù)制缺陷型的單純皰疹病毒毒粒，可直接接種體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞并在其中表達(dá)外源基因，所表達(dá)的外源基因可用于神經(jīng)系統(tǒng)生理或病理學(xué)研究。
3.根據(jù)權(quán)力要求1和2在人神經(jīng)細(xì)胞中特異表達(dá)的質(zhì)粒型皰疹病毒載體pSHV-apl及以其為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)外源基因的復(fù)制缺陷型單純皰疹病毒毒粒，其特征在于可直接將外源基因以病毒感染的方式導(dǎo)入動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)行神經(jīng)生理學(xué)和神經(jīng)系統(tǒng)基因治療的實(shí)驗(yàn)研究，復(fù)制缺陷型病毒可以直接注射的方式注入神經(jīng)系統(tǒng)或接種外周神經(jīng)系統(tǒng)后，病毒通過(guò)在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的逆向運(yùn)動(dòng)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并表達(dá)外源基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在人神經(jīng)細(xì)胞中特異表達(dá)的質(zhì)粒型皰疹病毒載體及其用途，其組成1、HSV-1IE68基因的啟動(dòng)子。2、啟動(dòng)子之后的多酶切點(diǎn)。3、HSV-1基因組復(fù)制子(HSV-1ori)。4、HSV-1包裝信號(hào)序列(Packaging site)。5、大腸桿菌質(zhì)粒骨架，包括大腸桿菌復(fù)制子(E.coli ori.)和氨芐青霉素抗性β內(nèi)酰胺酶基因(Amp
文檔編號(hào)C12N7/01GK1141953SQ96104958
公開(kāi)日1997年2月5日 申請(qǐng)日期1996年5月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月10日
發(fā)明者楊天忠, 侯云德, 王曉丹, 顏?zhàn)臃f 申請(qǐng)人:中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所