專利名稱：生產(chǎn)d－泛解酸和d－泛酸或其鹽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)D-泛解酸和/或D-泛酸，或其鹽的新方法。泛酸是有用的維生素，泛解酸是生產(chǎn)泛酸或輔酶A的一種重要的中間產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
D-泛酸是有用的維生素?，F(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)D-泛酸的方法包括(1)一種包含旋光拆開DL-泛內(nèi)酯(pantolactone)并利用在甲醇中β-丙氨酸或其鹽與如此形成的D-泛內(nèi)酯化學(xué)縮合的方法，(2)一種包含利用微生物或酶水解D-泛酸酯以獲得D-泛酸，或者僅選擇性地水解DL-泛酸酯的D-異構(gòu)體以獲得D-泛酸的方法(JP-A1-228487，JP-A1-2284488)，(3)一種包含在Tris緩沖液中使D-泛解酸鉀，β-丙氨酸和ATP與一種微生物的靜止細胞或其酶進行接觸的方法(Journal of Biological Chemistry，Vol.198，p.23(1952)，Abstracts of Papers 176th American Chemical Society NationalMeeting，Division of Microbial and Biochemical Technology，Vol.48(1978)，etc.)，(4)一種包含在DL-泛解酸和β-丙氨酸存在的情況下培養(yǎng)一種特定的微生物及用β-丙氨酸特異性地凝聚D-泛解酸以獲得D-泛酸的方法(JP-A5-23191)，和(5)一種包含在β-丙氨酸存在的情況下培養(yǎng)一種特定的微生物以獲得D-泛酸的方法(JP-A6-216772)。
生產(chǎn)D-泛解酸和/或D-泛內(nèi)酯的方法包括(6)一種包含利用一種分解劑例如奎寧和番木鱉堿旋光拆開化學(xué)合成的DL-泛內(nèi)酯的方法，(7)一種包含利用一種特定的微生物僅分解DL-泛內(nèi)酯中的L-泛內(nèi)酯以獲得反D-泛內(nèi)酯的方法，(8)一種包含利用一種特定的微生物僅氧化DL-泛內(nèi)酯中的L-泛內(nèi)酯以獲得酮泛內(nèi)酯，然后非對稱地還原成D-泛內(nèi)酯的方法(JP-A47-19745)，(9)一種包含利用一種特定的微生物非對稱地還原化學(xué)合成的酮泛內(nèi)酯以獲得D-泛內(nèi)酯的方法(JP-B61-14797)，(10)一種包含利用一種特定的微生物選擇性地和非對稱地水解DL-泛內(nèi)酯中的L-泛內(nèi)酯以獲得D-泛內(nèi)酯的方法(JP-A57-152895和JP-A62-294092)，(11)一種包含利用一種特定的微生物選擇性地和非對稱地水解DL泛內(nèi)酯中的D-泛內(nèi)酯以獲得D-泛解酸的方法(JP-B3-65198)，和(12)一種包含培養(yǎng)一種特定的微生物從葡萄糖中生物合成D-泛解酸的方法(JP-A6-261772)。
在D-泛酸(從此以后皆包括其鹽的形式)的工業(yè)生產(chǎn)過程中，以上方法(1)不僅需要復(fù)雜的步驟來合成主要的原料DL-泛內(nèi)酯，而且包含復(fù)雜而困難的旋光拆開步驟。以上方法(2)不利地需要一個步驟以便從DL-泛內(nèi)酯生產(chǎn)D-泛酸酯或DL-泛酸酯。以上方法(3)不利地使用昂貴的ATP和Tris緩沖液，并且它是一個不實用的方法，因為它從昂貴的起始材料D-泛解酸中僅能產(chǎn)生少量的泛酸。以上方法(4)比其它方法都簡單，但是它需要步驟來生產(chǎn)DL-泛酸和消旋。以上方法(5)比以上方法(4)更加簡單，然后，位于泛酸生物合成途徑上游的纈氨酸生物合成途徑的活性在培養(yǎng)的后期階段消失，并且泛酸的生產(chǎn)隨著纈氨酸的耗盡而終止。因而產(chǎn)量是有限的。
大多數(shù)生產(chǎn)D-泛解酸和/或泛內(nèi)酯的方法不利地使用了需要經(jīng)過復(fù)雜的步驟才能合成的起始材料DL-泛內(nèi)酯。另外，以上方法(6)不利地使用了昂貴的分解劑并且很難回收D-泛內(nèi)酯。以上方法(7)由于半數(shù)的DL-泛內(nèi)酯被損失掉因而是不利的。以上方法(8)、(9)、(10)和(11)因為將使用的微生物的特性和泛內(nèi)酯或泛解酸的特性，很難在培養(yǎng)液中以100％的旋光產(chǎn)出率僅生產(chǎn)出D-異構(gòu)體。再者，以上方法(6)，(10)和(11)需要額外的復(fù)雜步驟來恢復(fù)和回收剩余的L-異構(gòu)體。在以上方法(12)中D-泛解酸的生產(chǎn)依賴于正如以上泛酸生產(chǎn)方法(5)中的纈氨酸生物合成的活性。
發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明人已進行了深入的研究以期獲得生產(chǎn)泛酸的在工業(yè)上有利和有效的方法。因此，在一種包括在含有β-丙氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物生產(chǎn)D-泛解酸的方法中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種被含有分支的氨基酸生物合成基因轉(zhuǎn)化的細菌菌株能夠在培養(yǎng)基中的較高濃度生產(chǎn)D-泛酸或D-泛解酸(和/或D-泛內(nèi)酯)。質(zhì)粒的導(dǎo)入增強了纈氨酸生物合成在培養(yǎng)早期的活性并且在中期和后期保持了已增加的活性。泛酸的生產(chǎn)因此持續(xù)時間更長，并且最終產(chǎn)物和積累得到增加。
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)D-泛解酸或其鹽的方法，它包括培養(yǎng)用含有一段具有泛酸生物合成基因區(qū)域或其一部分和分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的一種微生物，在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累D-泛解酸或其鹽，并且收集D-泛解酸或其鹽。
本發(fā)明也提供了一種生產(chǎn)D-泛酸或其鹽的方法，它包括培養(yǎng)用含有一段具有泛酸生物合成基因區(qū)域或其一部分和分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的一種微生物，在β-丙氨酸存在時在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累D-泛酸或其鹽，并且收集D-泛酸或其鹽。
本發(fā)明進一步提供了一種生產(chǎn)D-泛解酸或其鹽的方法，它包括培養(yǎng)用含有一段具有泛酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒和含有一段具有分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的一種微生物，在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累D-泛解酸或其鹽，并且收集D-泛解酸或其鹽。
本發(fā)明進一步提供了一種生產(chǎn)D-泛酸或其鹽的方法，它包括培養(yǎng)用含有一段具有泛酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒和含有一段具有分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的一種微生物，在β-丙氨酸存在時在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累D-泛酸或其鹽，并且收集D-泛酸或其鹽。
另外，本發(fā)明提供了一種被以下質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的微生物，(a)含有一段具有泛酸生物合成基因區(qū)域或其一部分和分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒，或(b)含有一段具有泛酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒和含有一段具有分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒，并且它可以在β-丙氨酸存在時生產(chǎn)泛解酸或生產(chǎn)泛酸。
優(yōu)選地，此微生物是大腸埃希氏菌FV5069/pFV202(FERM BP-5227)。
再者，本發(fā)明提供了一種質(zhì)粒，它含有一段具有泛酸生物合成基因區(qū)域或其一部分和分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA。
優(yōu)選地，此質(zhì)粒是pFV202。
在本發(fā)明中，分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分優(yōu)選地是ilvGM基因。
本發(fā)明可以增加纈氨酸的生產(chǎn)，而這在以上方法(5)和(12)中正是一個難題，因此可積累更高濃度的泛酸。
附圖簡述

圖1是被插入到pFV2020中的4.7kb DNA片段的限制性圖譜。
發(fā)明詳述在本發(fā)明中，D-泛解酸，D-泛酸和β-丙氨酸可以以它們的鹽的形式存在。術(shù)語“D-泛解酸”，“D-泛酸”和“β-丙氨酸”有在此處包括它們的鹽以及它們的游離形式。D-泛解酸，D-泛酸和β-丙氨酸的鹽的例子包括與堿金屬和堿土金屬形成的鹽。在各種情況下，鈣鹽，鈉鹽或鉀鹽是優(yōu)選的。
本發(fā)明人進行了研究以發(fā)展一種有效且經(jīng)濟的方法來通過利用一種屬于埃希氏菌屬等的微生物進行直接發(fā)酵從例如糖類等碳源中生產(chǎn)D-泛解酸。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在被重組DNA技術(shù)處理過的微生物中包括一種能夠生產(chǎn)出比較高數(shù)量的泛解酸的微生物菌株，以不僅增加它們的泛酸生物合成途徑而且增加它們位于上游區(qū)的纈氨酸生物合成途徑。進一步發(fā)現(xiàn)通過在含有碳源的培養(yǎng)基中使這樣一種微生物與β-丙氨酸接觸可以產(chǎn)生大量的D-泛酸。即，本發(fā)明生產(chǎn)D-泛酸或D-泛酸的方法利用了微生物的能力來合成D-泛解酸或D-泛酸。由此，(a)D-泛解酸由各種不同的碳源例如葡萄糖等生物合成出來積累在培養(yǎng)基中，或(b)β-丙氨酸通過，例如，加β-丙氨酸到培養(yǎng)基中，與微生物進行接觸從而導(dǎo)致生物合成的D-泛解酸與β-丙氨酸縮合以便在培養(yǎng)基中積累D-泛酸。從而，本發(fā)明的方法可以通過利用重組DNA技術(shù)提高不僅泛酸生物合成途徑活性而且位于其上游區(qū)的纈氨酸生物合成途徑活性，從而生產(chǎn)出更高濃度的D-泛解酸和D-泛酸。
本發(fā)明中使用的微生物包括在β-丙氨酸存在時能夠產(chǎn)生D-泛酸的微生物和能夠產(chǎn)生D-泛解酸的微生物。為了實際應(yīng)用，這些微生物優(yōu)選地是屬于腸桿菌科的微生物，例如屬于檸檬酸桿菌屬，志賀氏菌屬，克雷伯氏菌屬，腸桿菌屬，沙門氏菌屬和埃希氏菌屬的微生物。更優(yōu)選的微生物的例子包括屬于埃希氏菌屬的細菌菌株，例如已知的列在Listof Cultures，8th ed.，1988(Institute for Fermentation，Osaka，Japan)上的大腸埃希氏菌菌株(例如，Escherichia coli IFO 3547)和由此衍生出的菌株。衍生菌株的例子包括大腸埃希氏菌菌株FV 5069，它是通過給大腸埃希氏菌IFO 3547提供水楊酸抗性，α-酮異戊酸抗性，α-丁酮酸抗性，β-羥基天冬氨酸抗性和o-甲基蘇氨酸抗性而獲得的，大腸埃希氏菌株FV 5069/pFV 202(FERM BP-5227)是通過用含有泛酸生物合成基因區(qū)域或其一部分和分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的質(zhì)粒pFV 202轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌菌株FV 5069而獲得的。
含有分支的氨基酸生物合成基因的基因片段可以通過描述在，例如，H.Saito和K.Miura，Biochim.Biophys.Acta上的已知方法或其修改的方法進行制備。例如，染色體DNA從供體細胞中提取出來，然后用限制性內(nèi)切酶HindIII切開。然后，獲得的染色體DNA片段被插入到載體DNA中。本發(fā)明中使用的載體DNA是從可以在宿主細胞中生長的載體DNA中適當(dāng)?shù)靥暨x出來的。在宿主細胞中可以生長的載體DNA包括，例如，pSC101(Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，70，3240(1973))，和pUC18(Gene，33，103(1985))。并不特異性地局限在這些載體DNA中，可以使用那些新分離或新合成的載體DNA，只要它們能夠完成本發(fā)明的目標(biāo)。基因片段可以通過描述在，例如，T.Maniatis et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Todai Shuppankai(1982))等上的已知方法或其修改的方法被插入到這些質(zhì)粒載體中。已被基因片段插入后的質(zhì)?？梢酝ㄟ^描述在，例如，J.Mol.Biol.，42，159(1972)等上的已知轉(zhuǎn)化方法或其修改的方法被導(dǎo)入到宿主細胞中。宿主細胞的例子包括已知的細菌菌株例如大腸埃希氏菌株JM 109(J.Mol.Biol.，166(1983))。
被導(dǎo)入含有分支的氨基酸生物合成基因的質(zhì)粒的菌株可以通過，例如，菌落雜交技術(shù)等，利用大腸埃希氏菌株K-12的一部分乙酰羥酸合酶基因序列作為探針，從已轉(zhuǎn)化的菌株中挑選出來。含有如此獲得的分支的氨基酸生物合成基因的質(zhì)粒DNA可以從其宿主細胞中提取出來，并且導(dǎo)入其他宿主細胞中。作為一種替代方法，含有分支的氨基酸生物合成基因的DNA片段可以從提取的質(zhì)粒DNA中制備，然后連接到其他的載體上。
如此獲得的轉(zhuǎn)化菌株的例子包括大腸埃希氏菌株FV 5069/pFV202(FERM BP-5227，TFO 15857)。pFV202是一種質(zhì)粒，含有一個源自大腸埃希氏菌株FV525的泛酸生物合成基因和一個源自大腸埃希氏菌株FV5069的分支的氨基酸生物合成基因(乙酰羥酸合酶同功酶II基因)。大腸埃希氏菌株FV5069/pFV202(FERM BP-5227)是一個通過將pFV202導(dǎo)入大腸埃希氏菌株FV5069后獲得的菌株。根據(jù)布達佩斯條約，此處所用的IFO號碼是Institute for Fermentation Osaka(IFO)(17-5 Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-Ku，Osaka-shi，Japan)的貯藏號，此處所用的FERM BP號碼是National Institute ofBioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Scienceand Technology(NIBH)(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)的貯藏號。尤其，自從1995年9月7日，大腸埃希氏菌株FV5069/pFV202就根據(jù)布達佩斯條約以貯藏號FERM BP-5227貯存在NIBH中。
如此獲得的細菌菌株可以進行連續(xù)或間歇培養(yǎng)按照傳統(tǒng)的方法例如搖床培養(yǎng)(例如，在旋轉(zhuǎn)搖床上進行搖床培養(yǎng))，靜止培養(yǎng)和通氣搖床培養(yǎng)。使用的培養(yǎng)基可以是使用的微生物能夠生長的傳統(tǒng)配方。碳源可以適當(dāng)?shù)剡x自可同化的碳源例如碳水化合物，油脂，脂肪酸，有機酸和酒精，可以單獨使用或使用它們的混合物。氮源包括，例如，有機氮源如蛋白胨，大豆粉，棉子粉，玉米浸液，酵母汁，肉汁，麥芽汁和尿素，以及無機氮源如硫酸銨，氯化銨，硝酸銨和磷酸銨。這些氮源可以單獨使用或使用其混合物。使用磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀作為磷源較為有利。培養(yǎng)基除了碳源、氮源和磷源外，可以含有生長必需的金屬鹽(例如，硫酸鎂)，必需生長因子或生長促進物質(zhì)如氨基酸和維生素。為了在培養(yǎng)時控制pH值，可適當(dāng)加入些堿性物質(zhì)如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氨水，碳酸鈣等?？古菽瓌┑募尤肟梢杂行У乜刂飘a(chǎn)生泡沫。這些物質(zhì)可以在培養(yǎng)時適當(dāng)?shù)丶尤?。為了保持通氣條件，輸入含氧豐富的氣體是很有效的。培養(yǎng)溫度通常為15℃到45℃，優(yōu)選地為25℃到40℃。培養(yǎng)持續(xù)進行直到獲得最大積累的泛酸和/或泛解酸。通常，一個6小時到120小時的培養(yǎng)周期可以達到這一目標(biāo)。根據(jù)本發(fā)明，在D-泛酸的生長過程中，可以通過在細菌菌株培養(yǎng)之前或培養(yǎng)過程中的適當(dāng)階段加入原料，或?qū)⒃霞尤氲浇?jīng)處理的細菌細胞中，使原料β-丙氨酸與細菌細胞接觸。經(jīng)處理后的細菌細胞意謂著清洗通過培養(yǎng)細菌獲得的細菌細胞，丙酮干燥細菌細胞，用聚丙烯酰胺凝膠或k-角叉藻聚糖固定化細菌細胞等。原料可以一次性加入或經(jīng)過適當(dāng)?shù)囊欢螘r間連續(xù)地或間歇地以一種在適當(dāng)溶劑如水中的溶解液或懸浮液形式或以粉末形式加入。
加入培養(yǎng)基中的β-丙氨酸的濃度隨著微生物生產(chǎn)率的不同而不同。多節(jié)約的觀點上，β-丙氨酸的濃度優(yōu)選地為0.1到6w/v％，更優(yōu)選地為0.5到4w/v％。
D-泛酸或其鹽可以通過傳統(tǒng)的方法從以上的培養(yǎng)物或反應(yīng)混合物中分離出來。例如，從培養(yǎng)物中除去細菌細胞后，剩余物經(jīng)過已知的分離技術(shù)如離子交換色譜，活性炭，合成吸附劑等的吸收，濃縮和結(jié)晶以分離D-泛酸或其鹽。這些技術(shù)可以單獨或聯(lián)合使用。根據(jù)JP-B40-2330結(jié)晶作用在工業(yè)上非常有利，因為它能夠高產(chǎn)量地產(chǎn)生可輕易過濾的晶體。根據(jù)這種結(jié)晶作用方法，可獲得每mol泛酸鈣中含有4mol甲醇和1mol水的溶解的水合物(Calcium pantothenate·4 MeOH·1H2O)作為沉淀的晶體。干燥形成的晶體可除去晶體中的甲醇和水得到泛酸鈣(M.Inagaki et al.，Chem.Pharm.Bull.，24，3097-3102(1976))。
例如，D-泛酸鈣可以按照下面所述從培養(yǎng)液中進行分離。將已除去細菌細胞的培養(yǎng)液通過一個裝有陽離子交換樹脂的柱子(例如，Diaion PK-216(H-form)，PK-228(H-form)由Mitsubishi ChemicalCorporation制造)以除去陽離子，然后通過一個裝有陽離子交換樹脂的柱子(例如，PA-412(H-form)，WA-30(H-form)由MitsubishiChemical Corporation制造)以除去無機陰離子和具有比泛酸更強的酸度的有機酸。將氫氧化鈣加入到含有游離泛酸的洗脫物(pH約2.6)中調(diào)整pH到約5.0，然后此混合物被濃縮到泛酸濃度約為25w/v％。然后，加入氫氧化鈣調(diào)整pH到約7.0，再加入活性炭(例如，例如，ShirasagiA由Takeda Chemical Industries，Ltd.制造)進行脫色。經(jīng)過濾將活性炭除去后，濾液被濃縮到泛酸濃度約45％到55％(w/w)。然后加入適量的甲醇調(diào)整溶液中的含水量到5％到15％，然后，溶液被冷卻到約2℃，并加入種子晶體沉淀溶解的水合物泛酸鈣的晶體。收集和干燥得到的晶體從而高產(chǎn)量地獲得高純度的D-泛酸。
實施例以下的實施例進一步詳細地說明了本發(fā)明，但不能被解釋為對其范圍進行限制。
D-泛酸通過高效液相色譜(柱子Shimadzu SCR101H(7.9mm，I.D.×30cm)；流動相0.008N硫酸；流速0.8ml/min；檢測差示折光儀)和/或生物分析(試驗菌植物乳酸桿菌IFO 3070；培養(yǎng)基可購買到的定量測定泛酸用培養(yǎng)基(DIFCO生產(chǎn)))。進行測定。培養(yǎng)物中的纈氨酸通過高效液相色譜(柱子Mitsubishi Chemical CorporationMCI GEL CRS 10W(4.6mm I.D.×5cm)；流動相1mM-CuSO4/CH3CN＝7/1；流速0.7ml/min；檢測UV光度計)。
實施例1(1)染色體DNA的制備大腸埃希氏菌FV5069被接種到L培養(yǎng)基中(1升)(細菌胰蛋白胨10％，酵母浸汁0.5％，氯化鈉0.5％)并在37℃培養(yǎng)過夜。從生成的細菌細胞中，利用酚通過Saito et al.的方法(Biochim.Biophys.Acta.，72，619(1963))得到染色體DNA(最終產(chǎn)量3.3mg)。
(2)染色體DNA插入到載體質(zhì)粒pUC 18中以上(1)中獲得的每份染色體DNA(10μg)和pUC 18(由NipponGene生產(chǎn))用限制性內(nèi)切酶HindIII(Nippon Gene生產(chǎn))進行切割，形成的DNA片段被混合起來并且用源自T4噬菌體的連接酶(NipponGene)進行連接。
(3)染色體DNA片段插入后的質(zhì)粒DNA的挑選大腸埃希氏菌株JM 109通過感受態(tài)細胞方法被在以上(2)中的各種質(zhì)粒的混合物所轉(zhuǎn)化。然后，一個含有此轉(zhuǎn)化株的懸浮液被涂布在一種含有氨芐青霉素鈉鹽(50μg/ml)，IPTG(0.5mM)和X-gal(100μg/ml)的L瓊脂平板培養(yǎng)基上并且在37℃培養(yǎng)過夜。在形成的菌落中，白色菌落作為被含有染色體DNA片段的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株被挑選出來。
(4)探針的制備大約600bp序列的被Rother等測定的大腸埃希氏菌株K-12 ilvG基因(乙酰羥酸合酶同功酶II大亞基基因，Nucleic Acids Research，2137，15(1987))通過PCR方法被擴增。擴增后有基因通過隨機方法用32P進行標(biāo)記，并用作探針。
(5)乙酰羥酸合酶同功酶II基因的克隆放置一層尼龍膜于含有氨芐青霉素鈉(50μg/ml)的L瓊脂平板培養(yǎng)基上，用以上(3)中得到的白色菌落在其上進行劃線，并在37℃培養(yǎng)過夜。此膜用堿處理，中和后在80℃烘烤2小時以固體膜上的細胞內(nèi)DNA。通過利用以上(4)中的探針，將此膜進行雜交以獲得一株比其他菌落發(fā)射出明顯地更強信號的菌落。
(6)通過Southern雜交進行確定從以上的菌落中提取出質(zhì)粒(10μg)，用HindIII切割并進行電泳。插入的片段通過Sonthern雜交進行分析。結(jié)果表明這一片段為4.7kb長(含有K-12乙酰羥酸合酶同功酶II基因的HindIII片段也是4.7kb長)并且能與以上(4)中獲得的探針高度地雜交。
(7)表達質(zhì)粒的構(gòu)建以上4.7kb插入片段被插入到質(zhì)粒載體pMW 118的HindIII位點，大腸埃希氏菌FV525的2.5kb的泛酸生物合成基因被插入到EcoRI位點。形成的質(zhì)粒被命名為pFV202。用這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化泛酸生產(chǎn)菌株FV5069，形成的轉(zhuǎn)化株被命名為FV5069，形成的轉(zhuǎn)化株被命名為FV5069/pFV202。這一轉(zhuǎn)化株的乙酰羥酸合酶同功酶II活性與用pFV31轉(zhuǎn)化的僅插入泛酸生物合成基因的FV5069/pFV31的活性及未經(jīng)轉(zhuǎn)化的原始菌株FV5069的活性進行比較。
(8)轉(zhuǎn)化株乙酰羥酸合酶活性的測定測試細菌在生產(chǎn)培養(yǎng)基(A)中培養(yǎng)的48小時，通過超聲波處理制備細菌的裂解液。將裂解液US20,000rpm離心1小時得到上清液。按照J(rèn)aekson的方法(Methods Enzymol.1988)，利用上清液作為粗酶溶液，形成的乙酰乳酸被轉(zhuǎn)化成3-羥基丁酮。形成的3-羥基丁酮用2-萘酚染色并在530nm波長下進行定量測定。
結(jié)果見表1。
由表1可看出，插入到pFV202中的4.7kb的HindIII片段含有編碼乙酰羥酸合成酶同功酶II的ilvGM基因。
表1
(9)含有ilvGM的4.7kb片段的限制圖譜插入到pFV202中的4.7kb DNA片段含有一個PstI位點，一個SalI位點。圖1顯示出此片段的限制性圖譜。
實施例2具有表2中顯示的成分的液體培養(yǎng)基在高壓滅菌鍋中加熱至121℃15分鐘滅菌，以每份20ml分裝到200ml的三角瓶中。在培養(yǎng)基中接入從以上實施例1(7)中的斜面培養(yǎng)基上獲得的大腸埃希氏菌株FV5069/pFV202(FERM BP-5227)和菌株FV5069/pFV31(FERM BP-4395)每種一接種環(huán)，以220rpm在搖床上30℃培養(yǎng)20小時。將種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到具有表2中顯示的成分的培養(yǎng)基中(20ml)，在200ml的三角瓶中38℃搖床培養(yǎng)72小時。在培養(yǎng)期間，如表3中所示各種不同物質(zhì)加入其中。表4中顯示出在培養(yǎng)結(jié)束時產(chǎn)生的泛酸(PaA)數(shù)量和纈氨酸(Val)的當(dāng)量。
表2培養(yǎng)基成分種子培養(yǎng)基CSL 0.5％(NH4)2SO40.5％MgSO4·7H2O0.001％KH2PO40.01％K2HPO40.01％鹽酸硫胺素2μg/ml葡萄糖5％CaCO32％pH7.0主培養(yǎng)基CSL 2％(NH4)2SO41.25％MgSO4·7H2O0.002％KH2PO40.01％β-丙氨酸 1％鹽酸硫胺素0.5μg/ml葡萄糖9％CaCO34％pH7.0
表3各種不同物質(zhì)的加入
表4培養(yǎng)結(jié)果
如上所述，本發(fā)明的方法可以提高位于泛解酸和泛酸生物合成途徑上游的纈氨酸生物合成途徑的活性的增加纈氨酸的產(chǎn)出率，并且能夠生產(chǎn)出更高濃度的泛解酸和泛酸。因此，本發(fā)明的方法是一種在工業(yè)上有利的和有效的方法。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)D-泛解酸及其鹽的方法，包括培養(yǎng)用含有一段具有泛酸生物合成基因區(qū)域或其一部分和分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的一種微生物，在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累D-泛解酸或其鹽，并且收集D-泛解酸或其鹽。
2.一種生產(chǎn)D-泛酸及其鹽的方法，包括培養(yǎng)用含有一段具有泛酸生物合成基因區(qū)域或其一部分和分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的一種微生物，在β-丙氨酸存在時，在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累D-泛酸或其鹽，并且收集D-泛酸或其鹽。
3.一種生產(chǎn)D-泛解酸及其鹽的方法，包括培養(yǎng)用含有一段具有泛酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒和含有一段具有分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的一種微生物，在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累D-泛解酸或其鹽，并且收集D-泛解酸或其鹽。
4.一種生產(chǎn)D-泛酸及其鹽的方法，包括培養(yǎng)用含有一段具有泛酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒及含有一段具有分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的一種微生物，在β-丙氨酸存在時在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累D-泛酸或其鹽，并且收集D-泛酸或其鹽。
5.一種被以下質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的微生物，(a)一種含有一段具有泛酸生物合成基因區(qū)域或其一部分和分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒，或(b)一種含有一段具有泛酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒和一種含有一段具有分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA的質(zhì)粒，并且它可以在β-丙氨酸存在時生產(chǎn)泛解酸或生產(chǎn)泛酸。
6.權(quán)利要求5中的微生物，其中分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分是ilvGM基因。
7.權(quán)利要求5中的微生物，它是大腸埃希氏菌FV 5069/pFV 202(FERM-BP5227)。
8.一種質(zhì)粒，它含有一段具有泛酸生物合成基因區(qū)域或其一部分和分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分的DNA。
9.權(quán)利要求8中的質(zhì)粒，其中分支的氨基酸生物合成基因區(qū)域或其一部分是ilvGM基因。
10.權(quán)利要求8中的質(zhì)粒，它是pFV 202。
全文摘要
有一個公開的生產(chǎn)D－泛解酸或D－泛酸的方法,利用微生物的能力合成D－泛解酸或D－泛酸。根據(jù)此方法,(a)D－泛解酸由多種碳源如葡萄糖生物合成以便在培養(yǎng)基中積累之,或(b)β－丙氨酸通過,例如,將β－丙氨酸加入到培養(yǎng)基中從而與微生物進行接觸,導(dǎo)致生物合成的D－泛解酸與β－丙氨酸凝聚下來從而在培養(yǎng)基中積累D－泛解酸。
文檔編號C12P7/40GK1201491SQ9619818
公開日1998年12月9日 申請日期1996年9月11日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月13日
發(fā)明者守谷·岳郎, 引地裕一, 守谷由美子, 山口高正 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社