專利名稱：混合基質植入物和外植物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明的領域是用于體內或體外的醫(yī)學裝置，用以生成和遞送醫(yī)學有用物質。
用于遞送醫(yī)學有用物質的方法能顯著影響它們的效力。許多此類物質給藥的一般途徑是口服，靜脈內，或皮下給藥。每一方法都有固有的局限，影響了所遞送物質的治療效用。例如，許多以蛋白質為主要成分的藥物具有必需在其配方和遞送中考慮的短半衰期和低生物利用度的因素。雖然已開發(fā)了用于遞送醫(yī)學有用物質的多種裝置，包括可攜式泵和導管，仍有對改進的遞送裝置的顯著需求。
許多醫(yī)學有用物質，包括蛋白質，糖蛋白，以及一些肽和非肽激素，用培養(yǎng)的細胞比通過人工合成途徑能更有效地產(chǎn)生。合適的細胞典型地在生物反應器中培養(yǎng)，并從中純化所需的產(chǎn)物，用以通過常規(guī)方法，例如口服或靜脈注射或皮下注射對病人給藥?；蛘?，可以把細胞直接植入入病人體內，產(chǎn)生和遞送所需產(chǎn)品。雖然這種方法比只注射該制品有一系列的理論優(yōu)點，包括利用正常的細胞反饋機制釋放生理合適水平的產(chǎn)物的可能性，但也引入了額外的復雜性。其中一點與植入時細胞所需的合適環(huán)境有關。需要把植入物中的細胞組織成與包括在植入物中的細胞類型的天然體內環(huán)境相容的形式(例如成纖維細胞，天然存在于主要由膠原組成的胞外基質的豐富網(wǎng)絡中)。有些情況下還需要保證植入的細胞保持在病人體內的特定部位，從而便于監(jiān)測并且在不需要時可以除去。
已經(jīng)研究出的一項用于此目的的技術使用了由一種固體的，單一的膠原凝膠片(一種“膠原基質”)組成的植入裝置，細胞包埋于其中(例如，Bell，美國專利No．4，485，096)。在膠原植入物中也可包括其它物質，諸如聚四氟乙烯(PTFE)纖維(Moullier等，自然遺傳學分冊(Nature Genetics)，4154，1993；WO 94／24298)以賦予膠原凝膠強度或其它期望特征。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過向膠原基質中添加微球體可顯著改進膠原基質的功能，從而形成此處稱為的“混合基質”。這可以通過在膠原膠凝形成基質前把微球體與細胞以及可溶性膠原混合來完成。如果需要，可在加入未膠凝的膠原溶液前將微球體和細胞共同培養(yǎng)一段時間，使細胞附著到微球體；或者，可基本上同時或以任何所需次序混合三種組分，隨后是混合物中的可溶性膠原膠凝，形成由不可溶膠原纖維，細胞和微球體組成的凝膠混合物。此凝膠混合物通過排除液體逐漸變小，形成包括包埋于不可溶膠原纖維網(wǎng)絡中的微球體和細胞的固體的，比較有彈性的可植入單位。當微球體也主要由膠原組成時，產(chǎn)生的基質此處稱為“混合膠原基質”。
本發(fā)明從而包括一種制品或裝置，其主體由包括不可溶膠原纖維的基質材料構成，并在主體內配置有(a)多元脊椎動物細胞(特別是哺乳動物細胞例如衍生于人，猩猩，小鼠，大鼠，田鼠，豚鼠，兔子，牛，馬，豬，山羊，綿羊，或貓的細胞)；以及(b)多元微球體(或小球)，其中每一種主要含有(即多于50％的干重是)選自下列的一種或多種物質膠原(優(yōu)選地是I型膠原)，聚苯乙烯，葡聚糖，聚丙烯酰胺，纖維素，海藻酸鈣，膠乳，聚砜，以及玻璃(例如包被有凝膠諸如膠原的玻璃，以增強細胞附著)。通常每種微球體干重的至少70％，優(yōu)選地至少80％(最優(yōu)選地在大約90％和大約100％之間，例如至少95％)是一種或幾種上列物質。被描述為基本上由純化的膠原組成的微球體的商品實例包括ICNCellagenTM球和Cellex Biosciences大孔微球體。微球體優(yōu)選地具有一致的孔，但也可是光滑的，并且一般具有近似的球形，直徑大約0．1到2毫米(例如，在大約0．3和1毫米之間)。當然，任何特定批次或劑型的微球體的形狀和大小都會在制造公差范圍內變化。制品可以預制成型用于植入動物，例如哺乳動物諸如病人，或者可以設計用于在體外生產(chǎn)細胞產(chǎn)物；例如在一種能從動物分流血液到制品，然后再流回動物血管的體外生物反應器裝置中，或者在一種從中可以回收含有所需細胞產(chǎn)物的介質，用于純化和制備藥劑的生物反應器或其它容器中。細胞可以來自從病人移出的一種或幾種細胞，并且優(yōu)選地是含有編碼一種或幾種醫(yī)學有用多肽例如一種酶，激素，細胞因子，集落刺激因子，血管生成因子，疫苗抗原，抗體，凝血因子，調節(jié)蛋白，轉錄因子，受體，或結構蛋白的外源DNA的轉染細胞。此類多肽例子包括人生長因子(hGH)，因子VIII，因子IX，促紅細胞生成素(EPO)，白蛋白，血紅蛋白，α-1抗胰蛋白酶，降鈣素，葡糖腦苷脂酶，低密度脂蛋白(LDL)受體，IL-2受體，珠蛋白，免疫球蛋白，催化性抗體，白介素，胰島素，胰島素樣生長因子I(IGF-1)，甲狀旁腺素(PTH)，勒帕茄堿(leptin)，干擾素，神經(jīng)生長因子，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)，表皮生長因子(EGF)，內皮細胞生長因子，血小板衍生生長因子(PDGF)，轉化生長因子，內皮細胞刺激血管生成因子(ESAF)，血管生成素，組織纖溶酶原激活物(t-PA)，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，以及粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)?；蛘?，外源DNA可以是激活一種內源基因表達的調節(jié)序列(例如，使用以參考文獻并入本發(fā)明的WO94／12650-PCT／US 93／11704中所述的同源重組)。
通常任何類型的能夠附著到膠原和／或微球體，并表現(xiàn)諸如表達醫(yī)學有用的細胞產(chǎn)物或執(zhí)行一種基本的結構或代謝功能等期望特性的細胞均可用于本發(fā)明的基質中。舉例包括脂肪細胞，星形細胞，心肌細胞，軟骨細胞，內皮細胞，上皮細胞，成纖維細胞，神經(jīng)節(jié)細胞，腺細胞，膠質細胞，造血細胞，肝細胞，角質形成細胞，成肌細胞，神經(jīng)細胞，成骨細胞，胰β細胞，腎細胞，平滑肌細胞和橫紋肌細胞，以及任何上述細胞的前體。如果需要，在提供的基質中可包括多種類型的細胞。細胞可以克隆或異源群體形式提供。
基質材料中的膠原優(yōu)選地是I型，但也可是任何其它型膠原?；|材料可選地包括兩種或多種型的膠原(例如，選自I，II，III，IV，V，VI，VII，VIII，IX，X，以及XI型)，并且可加入任何能賦予產(chǎn)生的基質期望特征的組分例如，瓊脂糖，藻酸鹽，纖連蛋白，層粘連蛋白，透明質酸，硫酸乙酰肝素，硫酸皮膚素，硫酸軟骨素，硫酸蛋白聚糖，血纖蛋白，彈性蛋白，或肌腱蛋白。上述任何膠原和非膠原組分可來自人或其它動物。還可以在裝置中包括膠原或非膠原纖維。此纖維舉例可由一種包括尼龍，滌綸，聚四氟乙烯，聚乙醇酸，聚乳酸／聚乙醇酸聚合物混合物，聚苯乙烯，聚氯乙烯共聚物，貓腸，棉花，亞麻，聚酯，或絲的材料制成。
在混合基質中可含有大量細胞。例如，假定接種細胞數(shù)和初始制品體積相當，可制備含有的細胞是只單獨用可溶性膠原制備的基質的至少大約兩倍(優(yōu)選地大約3倍)混合基質。在給定時間內，由包埋于給定混合基質中的細胞表達的多肽總量一般顯著高于(例如，至少超過50％，優(yōu)選地至少超過100％，并最優(yōu)選地至少超過200％)使用相同體積常規(guī)膠原基質所獲的量。
本發(fā)明的混合基質通常由包括下列步驟的方法制備制成一種混合物，其中包括(a)多元脊椎動物細胞；(b)多元微球體，每種微球體主要包含一種或多種選自下列的物質膠原，聚苯乙烯，葡聚糖，聚丙烯酰胺，纖維素，海藻酸鈣，膠乳，聚砜，以及玻璃；和(c)含有可溶性膠原的溶液；使混合物中的可溶性膠原形成包埋有細胞和微球體的不可溶膠原纖維凝膠；以及將凝膠暴露于培養(yǎng)條件，使凝膠通過排除液體變小，從而形成制品的主體。一般通過將較酸性的膠原溶液pH升高到5以上，例如通過加入濃縮的緩沖培養(yǎng)基，引起膠凝，于是膠原變成不溶性纖維。當這一步驟在模子中進行時，凝膠會獲得模子內部的形狀。通常凝膠的收縮會受到混合物中細胞的影響，它們附著于纖維使它收縮成較小的模子形狀(例如，當模子是圓柱形狀的培養(yǎng)皿時，形成盤狀)。基質可在制造后立刻使用，可以培養(yǎng)以增進基質中的細胞數(shù)或增強其功能，或者在0℃下長期低溫保藏。
可以通過包括提供一種含有可分泌所研究的多肽的細胞的混合基質以及將制品植入到諸如皮下，腹膜內，腎下囊(sub-renal capsular)，腹股溝，肌肉內或鞘內等選擇部位的治療方法，將一種諸如上面列出的醫(yī)學有效多肽遞送到病人。若該多肽可促進傷口愈合(例如，PDGF或IGF-I)，可將基質植入到已存的傷口部位。如上面所討論，細胞可來自從病人取出的一種或多種細胞，并且優(yōu)選地用編碼多肽的外源DNA在體外轉染?；蛘咚鼈兪翘烊环置诙嚯牡幕驁?zhí)行期望代謝功能的細胞(例如，肝細胞或胰腺β細胞)。
在另一個實施例中，可以通過上述的裝置將部分病人血液分流把醫(yī)學有效多肽施入病人體，這樣混合基質中細胞分泌的多肽混入血液。通常，任何該領域技術人員熟知的此類裝置可改造以容納本發(fā)明的基質。例如，將血液分流到一個含有包裹本發(fā)明基質的選擇透性膜的裝置會使基質的治療產(chǎn)物遞送到血液中。為此目的可使用一種類似人工胰的裝置(Sullivan等，科學(Science)252718-721，1991)。
本發(fā)明混合基質的另一種用途是作為體外生產(chǎn)多肽的一種方法。此方法包括步驟將混合基質放在可使基質中的細胞表達和分泌多肽的條件下；用一種液體與基質接觸使細胞將多肽分泌到液體中；以及從液體中獲取多肽，例如通過對給定多肽合適的常規(guī)純化技術。在一個實施例中，將基質固定于某表面并用液體洗；或者基質自由浮動在液體中。包埋于混合基質中的細胞在小的空間范圍內有高水平的作用。此外，在純化表達的多肽的第一步(從培養(yǎng)基中除去細胞)使用該基質比使用多數(shù)細胞培養(yǎng)的常規(guī)方法有效的多。
本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點顯而易見于權利要求書中，以及下面提供的詳細描述。
附圖的簡要說明

圖1是hGH表達質粒pXGH 302的圖譜。
圖2是本發(fā)明一實施例的部分剖視的平面圖。
圖3表示植入了含有經(jīng)pXGH 302穩(wěn)定轉染并表達hGH的人皮膚成纖維細胞HF16 5-24細胞的膠原基質或混合膠原基質的裸鼠體內的hGH水平曲線圖。
下面給出說明本發(fā)明幾個實施方案的例子。這些例子僅是為了說明，而不是意味著限制。實施例I此實施例描述了制備用質粒pXGH 302穩(wěn)定轉染的分泌重組人生長激素(hGH)的人成纖維細胞的克隆細胞株，并將其與本發(fā)明混合基質中多孔膠原微球體結合的方法。此基質稱為混合膠原基質(HCM)。A．產(chǎn)生表達人生長激素的原代人成纖維細胞通過酶解離技術從新切割的人包皮分離到成纖維細胞。到鋪滿時，通過溫和胰蛋白酶消化從塑料表面移下原代培養(yǎng)物，稀釋并重涂平板以產(chǎn)生用于轉染的第二次細胞培養(yǎng)。
如實施例II所述構建質粒pXGH 302，并使用電穿孔法進行轉染，此方法中將細胞懸浮于質粒DNA溶液，置于一對相反電荷的電極之間，并用一瞬時電脈沖處理。
在含有G418的培養(yǎng)基中篩選處理的細胞10-14天。將質粒穩(wěn)定整合到其染色體的細胞表達neo基因并形成抗新霉素類似物G418殺死的克隆。含有一個細胞克隆群體的每個克隆分別經(jīng)胰蛋白酶消化從組織培養(yǎng)皿上的各自位置除下。那些表達hGH的陽性克隆進一步進行定量測定，并選擇出克隆HF 165-24用于進一步使用。
用于制備和轉染適于本發(fā)明基質使用的細胞的進一步的詳細方法由WO93／09222(PCT／US 92／09627)提供，并以參考文獻并入本發(fā)明。B．制備混合膠原基質1．制備微球體從每一個制造商提供的原始瓶中(-每瓶10毫升)將膠原微球體(CellexBiosciences制品目錄號#BOO-0015UW)轉移到50毫升錐形試管中(每瓶1管)。微球體沉降于管中，并抽出貯存緩沖溶液。將微球體洗滌培養(yǎng)基(含1％小牛血清和1％青霉素／鏈霉素的DMEM)加到刻度試管的50毫升標志處，微球體沉降后將培養(yǎng)基抽出。重復這一系列洗滌步驟，共4次。用25毫升塑料移液管將微球體轉移到250毫升三角瓶，將微球體體積限制在每250毫升三角瓶100毫升，并將三角瓶蓋住置于37℃組織培養(yǎng)箱中2-3小時。從培養(yǎng)箱中取出三角瓶，使微球體沉降并抽出洗滌培養(yǎng)基。重復此系列培養(yǎng)和洗滌步驟共3次。
2．制備混合膠原基質在加入膠原溶液前將細胞和微球體混合。將洗好的微球體加到15毫升刻度錐形試管中至所需體積(體積=基質號×1毫升；參看表1)。測量體積前允許微球體沉降至少10分鐘。通過抽出除去過量洗滌培養(yǎng)基。
使用胰蛋白酶消化收獲要包埋入基質的細胞并測定細胞數(shù)。所需數(shù)量的細胞(每種基質細胞數(shù)乘以要生產(chǎn)的基質總數(shù))在室溫下1500rpm(500×g)離心7分鐘。在合適大小的錐形底聚丙烯管中，根據(jù)表1制備等體積改進的2×DMEM(含9克／升葡萄糖，4mM L-谷氨酰胺，和22．5mM HEPES的2×DMEM)和小牛血清混合物。(注意對于體積大于250毫升的，總混合體積應分裝到合適大小的管中。)將細胞沉淀重新懸浮于2×DMEM-牛血清混合物中。通過把1-2毫升細胞懸液加到壓緊的微球體中然后用10毫升移液管將濃縮的微球體轉移到剩余的細胞懸液中，將膠原微球體與細胞懸液混合，隨后用移液管輕輕混勻。將混合物置于冰上并如表1所指示加入合適體積的膠原溶液(大鼠尾I型膠原；UBI制品目錄號#08-115，稀釋至在0．02M乙酸中濃度4．0毫克／毫升)。用10毫升玻璃移液管將試管內容物小心混合(避免產(chǎn)生氣泡或泡沫)，直至基質溶液呈現(xiàn)均一。
為產(chǎn)生基質，根據(jù)表1列出的每培養(yǎng)皿的總體積，用一移液管(10或25毫升容積)將合適體積的膠原／細胞／微球體／培養(yǎng)基混合物加到無菌培養(yǎng)皿中。(將混合物填入培養(yǎng)皿時要不時地用移液管攪拌以防止細胞或微球體沉降。)將填好的培養(yǎng)皿放在37℃、5％二氧化碳，相對濕度98％的組織培養(yǎng)箱中并在大約24小時內勿動，在此期間內容物膠凝且凝膠在各方向的大小減小以形成發(fā)明的混合基質，其大小為未膠凝混合物直徑的50％和體積的10％。
圖2中圖示了本發(fā)明的混合基質的一個實施例。基質10含有收縮的膠原凝膠主體12，其中包埋有脊椎動物細胞14和微球體16。為了此圖中的清楚，將細胞以點的形式與微球體分開。實際上，大多數(shù)細胞預期會附著到微球體上，并且基本上比圖中所示要小。表1HCM制品所需的培養(yǎng)基，微球體，及膠原體積
實施例II通過將人體HPRT序列(Edwards等，基因組(Genomics)，6593-608，1990；Genbank入口HUMHPRTB)中位置11，960-18，869的并包括HPRT基因外顯子2和3的6．9kb Hind III片段亞克隆到pTZ18R(Pharmacia P-LBiochemicals，Inc．)的HindIII位點構建了pXGH302。將產(chǎn)生的克隆從HPRT基因片段的外顯子3中的單一XhoI位點切割，并插入來自pMC1Neo(Stratagene)的含有neo基因的1．1kb SalI-XhoI片段，破壞了外顯子3的編碼序列。選擇了neo轉錄方向與HPRT相反的一個取向并命名為pE3neo。
為了組合hGH基因，HPRT序列，和neo基因到同一質粒中，用EcoRI將pXGH5(Selden等，分子細胞生物學(Mol．Cell．Biol．)63173-3179，1986)消化，并分離到4．0kb的含有hGH基因和相連的小鼠金屬硫蛋白-I(mMT-I)啟動子的片段。用來自大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段將ExoRI突出端補平。用XhoI消化pE3Neo，它在neo片段和HPRT外顯子3接頭處(外顯子3插入物的3′接頭)切斷。用來自大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段補平線性質粒的XhoI突出端，并將產(chǎn)生的片段連接到4．0kb的鈍末端的mMT／hGH片段。通過對mMT-I／hGH片段單拷貝插入的限制性酶切分析篩選來源于連接混合物的細菌克隆。一個亞克隆，其中的hGH基因與neo基因轉錄方向相同，命名為pXGH 302。質粒pXGH 302的圖譜示于圖1。在此圖中，注釋了hGH編碼區(qū)和控制hGH表達的小鼠金屬硫蛋白-I啟動子(mMT-I)的位置和方向。標示了基本啟動子元件(TATA)，轉錄起始位點(CAP)，及翻譯起始位點(ATG)的位置。如圖所示，neo基因轉錄由多瘤病毒(polyoma)增強子／單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因啟動子控制。HPRT表示來自人次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因座的序列的位置。質粒pXGH 302使用了攜帶T7 RNA聚合酶啟動子和f1復制起點的質粒pUC18(Yanisch-Perron等，基因(Gene)33103-119，1985)衍生物pTZ18R(Pharmacia P-L Biochemicals，Inc．)的骨架。實施例III本實施例說明了制造一種混合膠原基質的一種方法，其中在形成混合膠原基質以前將如上所述制備的轉染細胞與微球體一起預培養(yǎng)。這種“預培養(yǎng)”混合膠原基質稱為PCHCM。A．細胞和微球體的預培養(yǎng)按照以下方法，將胰蛋白酶消化的轉染細胞接種到洗過的膠原微球體，比率為每毫升微球體2×106細胞(例如10×106細胞接種到5毫升微球體)1．將體積為微球體二倍的生長培養(yǎng)基細胞懸液加到125毫升三角瓶中。限制是每瓶10毫升微球體。
2．移出1-2毫升此懸液并加到預先測定有5毫升(堆積體積)微球體的15毫升管中。
3．將細胞懸液／微球體轉移回到125毫升三角瓶中。
4．將三角瓶放入組織培養(yǎng)箱并每小時輕微旋動近5秒鐘共4-5小時。將生長培養(yǎng)基加至三角瓶50毫升刻度，并將細胞和微球體無擾動培養(yǎng)過夜。
接種后20-24小時，通過下面的方法測定附著到膠原微球體的細胞數(shù)目1．稱量一支5毫升圓底聚苯乙烯試管的重量。
2．從三角瓶中取出少量微球體樣品(0．1-0．2毫升)并加到已稱重試管中。
3．從微球體樣品中吸出培養(yǎng)基并稱量試管加樣品的重量。通過從試管加樣品重量中減去試管重量計算樣品重量。
4．向微球體樣品中加入1毫升基質消化酶[在有Ca2+和Mg2+的PBS中的1-2毫克／毫升膠原酶IA(Sigma制品目錄#9891)]并通過輕敲試管側面輕輕混勻。
5．用石蠟膜封試管并置于37℃水浴1小時，通過以15分鐘間隔用巴氏吸管吸取促進微球體的分解。
6．溫育1小時后，使用5毫升玻璃吸管猛烈吸取進一步分離細胞。(注意如果仍然存在團塊，則向試管中加入所加膠原酶溶液體積1／10的10×胰蛋白酶-EDTA溶液，并繼續(xù)溫育10分鐘。
7．用血球計數(shù)器進行細胞計數(shù)。
8．使用下面的公式計算每毫升微球體的細胞密度，假定這些微球體50％的濕堆積體積為間隙細胞總數(shù)／毫升微球體=1000毫克／(樣品毫克重量)×(樣品中細胞數(shù))×0．5將細胞／微球體混合物從125毫升三角瓶轉移到250毫升旋轉瓶中(BellcoMicrocarrier旋轉瓶，250毫升，具#1965-60001型渦輪軸)，將生長培養(yǎng)基加至150毫升刻度線，并將旋轉瓶放入組織培養(yǎng)箱中的磁攪拌板上(設為50rpm)。通過使微球體沉降到瓶底，吸出“用過的”培養(yǎng)基至瓶上50毫升刻度線，并將新鮮培養(yǎng)基加入至200毫升刻度線方法用新鮮培養(yǎng)基向培養(yǎng)物補料，第二天進行一次并在此后每星期補料3次。可如上所述測定期望時間點的每毫米微球體細胞密度。B．制備預培養(yǎng)混合膠原基質(PCHCM)使用下面的方法制備PCHCM1．當達到期望的每微升微球體細胞密度時(由細胞計數(shù)確定)，從旋轉瓶中移取含有細胞的微球體。
2．按照概述于上的制備HCM的方法制備基質，并做以下改動i．細胞不經(jīng)胰蛋白酶消化。
ii．將培養(yǎng)的含細胞的微球體加到15毫升刻度錐形試管中，至所需堆積體積(體積=基質號×0．5毫升)。
iii．將空白微球體加到15毫升刻度錐形試管中至所需堆積體積(體積=基質號×0．5毫升)。
3．如上面實施例I所述制備改進的2×DMEM和牛血清混合物。將空白微球體(50％總微球體體積)和含細胞的微球體(50％總微球體體積)加到改進的2×DMEM／牛血清混合物中(參看下面表2)。將微球體／DMEM／牛血清混合物置于冰上并按照表2中的說明加入合適體積的膠原溶液(大鼠尾I型膠原；UBI制品目錄#08-115，稀釋至0．02M乙酸中濃度4．0毫克／毫升)。使用10毫升玻璃吸管小心混合試管內容物(避免產(chǎn)生氣泡或泡沫)，至基質呈現(xiàn)均一。表2用于產(chǎn)生PCHCM的培養(yǎng)基，微球體，及膠原體積
實施例IVA．通過使用下面的方法在第一天，及其后每星期2到3次補加基質保持培養(yǎng)物中的混合基質(HCM或PCHCM)1．小心吸出培養(yǎng)基2．考慮用于每種基質的培養(yǎng)皿大小，添加所需適當體積生長培養(yǎng)基(每60毫米培養(yǎng)皿5-7毫升，每100毫米培養(yǎng)皿10-15毫升，每150毫米培養(yǎng)皿30-40毫升)。培養(yǎng)基中可補充2-磷酸抗壞血酸和／或TGF-β(例如，10-50微克／毫升2-磷酸抗壞血酸和／或1-10納克／毫升TGF-β)。B．可使用下面的方法測量混合膠原基質的直徑1．將含有要測量基質的培養(yǎng)皿放到暗背景上的米尺上。
2．記錄所需直徑(厘米)例如，頭2個星期每天測一次，兩星期后隔天一次，及在實驗持續(xù)期間定量細胞時測量。C．可如下所述從混合膠原基質回收和定量細胞1．混合膠原基質的酶消化
a．制備膠原酶IA的PBS溶液(對HCM和PCHCM是1．0毫克／毫升，對補充有2-磷酸抗壞血酸和／或TGF-β的HCM或PCHCM是2．0毫克／毫升)。
b．將膠原溶液分裝到15毫升錐形離心管中，對用1-5×106細胞接種的基質是1毫升體積以及對用每份基質多于5×106細胞接種的基質是5毫升體積。制備同需要計數(shù)基質數(shù)相同的膠原酶試管。
c．用平頭鑷子將每份基質從其培養(yǎng)皿中取出，并小心地用吸水紙巾(如果計數(shù)后將把細胞丟棄)或無菌吸水墊吸去基質上多余的液體。
d．將每份基質分別放入含膠原酶的試管，蓋緊，并固定到組織培養(yǎng)箱中設為40rpm的定軌搖床上。
e．將基質培養(yǎng)1小時或至消化完全。為了加速消化，以5分鐘間隔用吸管破碎基質。
2．細胞計數(shù)a．使用離心管側面的刻度測量每一消化的細胞懸液總體積。
b．為了測定細胞存活力，移出0．1毫升細胞懸液并在1．5毫升微離心管中加入0．1毫升0．08％臺盼藍。輕敲小管混勻。
c．用血球計數(shù)器計數(shù)活細胞和死細胞。如果需要，在加入臺盼藍前用PBS進一步稀釋細胞懸液。計算細胞總數(shù)，考慮到步驟2a中測量的總體積。實施例V本實施例描述的實驗是改變混合膠原基質中用質粒pXGH 302穩(wěn)定轉染的人成纖維細胞克隆的接種密度，以確定HCM可支持的細胞密度。還監(jiān)測了每一HCM的hGH產(chǎn)生。
使用3種接種密度(ID)的稱為HF 165-24的穩(wěn)定轉染的表達hGH的新生兒包皮成纖維細胞克隆產(chǎn)生了混合膠原基質。密度為每HCM 5，10和20×106細胞。對于每一ID，9HCM產(chǎn)生于60毫米培養(yǎng)皿中。在50毫升錐形試管中用于每一ID的混合基質產(chǎn)生培養(yǎng)基包括9毫升改進2×DMEM，9毫升小牛血清，9毫升膠原微球體，及9毫升4毫克／毫升的可溶性大鼠尾膠原。
匯集從單層培養(yǎng)收獲的HF 165-24以提供充足用于9HCM的每個ID5×106細胞乘以9HCM=共45×106細胞；10×106細胞乘以9HCM=共90×106細胞；20×106細胞乘以9HCM=共180×106細胞。用于每ID的匯集細胞在1500rpm離心7分鐘，吸去上清液，將沉淀重懸于9毫升改進2×DMEM和9毫升小牛血清中并轉移到50毫升管。將在15毫升刻度試管中預先測量的9毫升膠原微球體加到細胞／2×DMEM／小牛血清混合物中并用10毫升吸管輕吸混合。然后將此混合物置于冰上，加入9毫升冰冷大鼠尾I型膠原溶液(4毫克／毫升)并用10毫升吸管混合產(chǎn)生均一溶液。將4毫升混合液加到每個濃度各9個60毫米培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放置到組織培養(yǎng)箱無擾動培養(yǎng)24小時。24小時培養(yǎng)后，小心吸出每皿中的培養(yǎng)基，并以每皿5毫升用生長培養(yǎng)基(DMEM，10％小牛血清，及1％青霉素／鏈霉素)向HCM重新補料。為了向每片基質提供更大體積生長培養(yǎng)基，在第三天用平頭鑷子將HCM從60毫米培養(yǎng)皿轉移至100毫米培養(yǎng)皿，并在每皿中加入10毫升生長培養(yǎng)基。在第六天，從每片HCM中抽去培養(yǎng)基，用5毫升Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)清洗基質然后吸出，并在每皿中加入10毫升生長培養(yǎng)基。記錄將生長培養(yǎng)基加到HCM的時間，以便在下一天(第七天)取24小時培養(yǎng)基樣品。在第13天和第20天重復清洗和補料步驟以提供第14天和第21天的培養(yǎng)基樣品。如下說明測定培養(yǎng)基樣品中的hGH。還在第10天和第17天不進行清洗步驟條件下對HCM補料。
在第7，14和21天取培養(yǎng)基樣品后，如實施例IV所述消化每ID 3片HCM用于細胞計數(shù)。如下面的實施例XII所述用放射免疫分析(NicholsInstitute)24小時培養(yǎng)基樣品測定指示時間點HCM產(chǎn)生的hGH。表3總結了每ID三重HCM細胞數(shù)，以及在第7天(n=9)，14天(n=6)，和21天(n=3)每ID由HCM產(chǎn)生的hGH。數(shù)值以平均值+／-標準偏差提供。如表所示，如上所述制備的HCM在第14和21天的測量平衡密度大約是每片基質7-10×106細胞。在測定的3個ID水平中，完全成形基質中在第21天的每細胞hGH產(chǎn)量是近似的。表3包埋于混合基質中的HF 165-24的接種密度為了細胞密度和hGH產(chǎn)
實施例VI“常規(guī)”膠原基質(CM)不含膠原微球體。為了比較CM和HCM，用另加的可溶性膠原代替HCM中由微球體占去的體積制備了CM，給出每片CM中的比率為1份2×DMEM，1份小牛血清，及2份可溶性膠原。如下所述評價CM與HCM的直接比較。
使用了用質粒pXGH 302穩(wěn)定轉化的人成纖維細胞克隆，命名為HF165-24。制出了每片兩個ID(每片基質1×106和5×106細胞)的每種類型各9片基質。對CM和HCM，將9×106細胞(用于1×106ID)和45×106細胞(用于5×106ID)重懸于50毫升管中的9毫升2×DMEM+9毫升小牛血清中。對于CM，向每ID組加入9毫升膠原微球和9毫升大鼠尾I型膠原溶液(4毫克／毫升)，并根據(jù)實施例I制成HCM。將基質保持在最初的60毫米培養(yǎng)皿并補加5毫升體積的生長培養(yǎng)基。如實施例V所述在第7，14和30天測定每份基質細胞數(shù)及hGH產(chǎn)量。表4中總結了兩種類型基質在兩種密度達到的最高細胞密度(在第14天測定)和hGH產(chǎn)量。如表中所示，與不含微球體的常規(guī)膠原基質相比，每份混合型基質提供更高的細胞密度以及實際的hGH產(chǎn)量。表4“常規(guī)”膠原基質(CM)與混合膠原基質(HCM)的由包埋HF165-24細胞產(chǎn)生的最高細胞密度和hGH的比較
實施例VII本實施例描述了預培養(yǎng)的混合膠原基質(PCHCM)的制備和檢測。以下面的方式，將用質粒pXGH302穩(wěn)定轉染的人成纖維細胞克隆的細胞(HF165-24)以每毫升微球體2×106細胞的比率接種到膠原微球體從收獲的單層細胞培養(yǎng)獲得在40毫升生長培養(yǎng)基中的48×106細胞懸液。向每一個含6毫升堆積的膠原微球體的4支15毫升刻度試管中加入5毫升此懸液，并將每一細胞／微球體混合物轉移到125毫升三角瓶。再向125毫升三角瓶中的細胞／微球體混合物中加入5毫升細胞懸液，使每瓶中達到終懸液為12×106細胞和6毫升微球體及10毫升生長培養(yǎng)基(共4瓶)。將三角瓶放入組織培養(yǎng)箱4小時，每小時輕輕旋轉約5分鐘。4小時后，將生長培養(yǎng)基加到每一三角瓶至50毫升標記，并無擾動地將三角瓶放置24小時。在24小時，將微球體從每一三角瓶轉移到250毫升旋轉瓶，將生長培養(yǎng)基加至每旋轉瓶的150毫升標記，并將瓶放入組織培養(yǎng)箱中設為50rpm的磁攪拌板上。第二天，將生長培養(yǎng)基加至每旋轉瓶的200毫升標記，并每星期3次通過吸出培養(yǎng)基至50毫升標記并將新鮮培養(yǎng)基加至200毫升標記向瓶中補料。
在旋轉瓶培養(yǎng)的第15天，測定每毫升微球體的細胞密度。從每瓶中移出少量微球體樣品(～0．1-0．2毫升)放入預先稱重的5毫升聚苯乙烯管。從每管中吸出多余的培養(yǎng)基，并將含有微球體樣品的試管稱重。將1毫升2毫克／毫升的膠原酶IA的PBS溶液加至每一管，用石蠟膜封口并置于37℃水浴。以15分鐘間隔，輕敲含微球體的管以分散團塊。1小時后，用5毫升玻璃吸管猛烈吸取進一步分離細胞。為進一步分解團塊，加入10×胰蛋白酶EDTA至膠原酶溶液中終胰蛋白酶濃度1X，并將管再溫育10分鐘。用PBS 1∶2稀釋分離的細胞懸液并加至血球計數(shù)器槽中用于細胞計數(shù)。使用下面的公式計算每毫升微球體中細胞密度總細胞數(shù)／毫升微球體=1000毫克／(毫克樣品重量)×(樣品中細胞數(shù))×0．5此公式假定1)濕膠原具有確定比重1．0，從而微球體樣品中膠原克重量與毫升膠原體積相等，以及2)微球體的濕堆積體積一半是間隙體積。本實驗每毫升微球體(n=4)平均細胞數(shù)為19．2×106。從每一瓶中移出微球體并移入15毫升刻度試管。使用每毫升微球體含19．2×106細胞的總體積為6毫升的微球體來產(chǎn)生混合膠原基質。
在100毫升無菌瓶中，用10毫升玻璃吸管將12毫升改進的2×DMEM，12毫升小牛血清，6毫升空白膠原微球體，及6毫升預培養(yǎng)的微球體小心混合。將此混合物置于冰上，加入12毫升冰冷大鼠尾I型膠原并用10毫升玻璃吸管小心混合。向12個60毫米培養(yǎng)皿中每個加入4毫升此混合物，并將培養(yǎng)皿置于37℃無擾動放置24小時。
由于每份基質包括0．5毫升含有19．2×106細胞／毫升的微球體，每份基質最終細胞數(shù)為9．6×106。24小時后，通過吸出培養(yǎng)基并加入5毫升生長培養(yǎng)基向這些預培養(yǎng)的混合膠原基質(PCHCM)補料。在第4，7，11，14，18和20天用6毫升生長培養(yǎng)基向PCHCM補料。在第7，14和20天，加入培養(yǎng)基前還用4毫升HBSS清洗PCHCM，并記錄加入培養(yǎng)基的時間。在第8，15，和21天，取24小時培養(yǎng)基樣品用于檢測hGH產(chǎn)生，并按下述消化PCHCM獲得細胞計數(shù)向每一15毫升管中加入6毫升在PBS中的2毫克／毫升膠原酶IA溶液。用平頭鑷子從培養(yǎng)皿中取出PCHCM并在轉移到膠原酶溶液中之前用吸水紙吸干。將含有PCHCM和膠原酶溶液的管固定到組織培養(yǎng)箱中定軌搖床上，將速度設為40rpm，使PCHCM消化2小時。培養(yǎng)2小時后，用5毫升玻璃吸管猛烈吸取把PCHCM解離出單細胞。如果有團塊存在，則認為需要進一步的解離，加入10×胰蛋白酶EDTA溶液(0．5％胰蛋白酶，5．3mMEDTA)至膠原酶中終胰蛋白酶濃度為1X。然后再培養(yǎng)試管10分鐘。記錄每管體積，并將細胞懸液2-5倍稀釋于PBS中，放入血球計數(shù)器槽獲得細胞計數(shù)。如實施例VIII所述在指定時間點用放射免疫分析測定24小時培養(yǎng)基樣品測出PCHCM的hGH產(chǎn)生。表5總結了每一時間點三重PCHCM的細胞數(shù)，以及在第8天(n=12)，15天(n=9)，和21天(n=6)PCHCM的hGH產(chǎn)生。數(shù)值以平均值±標準偏差形式提供。如表5所示，這些PCHCM比實施例V和VI中描述的HCM(表3和4)支持更高密度的細胞。在研究期間每份基質和每個細胞的hGH產(chǎn)生速率相近。表5在培養(yǎng)過程中，在膠原微球體中預培養(yǎng)并包埋入膠原的HF165-24形成PCHCM細胞數(shù)和hGH產(chǎn)量
實施例VIII使用制造商建議的條件，利用夾層(sandwich)放射免疫測定法(AllegrohGH測定，Nichols研究所，目錄號40-2205)定量測定hGH監(jiān)測hGH的表達。
為了測定hGH產(chǎn)生速率，在收獲用于傳代的細胞24小時前更換培養(yǎng)基。在傳代中，取出一份培養(yǎng)基用于hGH檢測，然后收獲細胞，計數(shù)，并重新接種。在計數(shù)收獲的細胞后計算hGH水平，并表示為微克hGH／24小時／106細胞。實施例IX本實施例說明如實施例I所述制備的混合膠原基質(HCM)，以及如實施例VI所述制備的常規(guī)膠原基質(CM)的體內植入。
為了進行基質的皮下植入，向小鼠[M．musculus strains NNIH(S)-nu／nu(nude；Taconic Farms，Germantown，NY)腹膜內注射0．0175毫升／克體重劑量的三溴乙醇(2％w／v 2，2，2-三溴乙醇和2％v／v2-甲基，2-丁醇)。將麻醉的鼠側躺放置，并用酒精和Betadine預處理好皮膚。在動物體左肋橫切出0．5厘米到1厘米的切口。通過快速解剖擴大皮下空間至得到比要植入的基質大小稍大的一區(qū)域。將基質水平放入皮下空間并用Millipore鑷子展平。使用不銹鋼醫(yī)用書釘將切口釘合。
將小鼠放入含有methoxyflurane(Pittman-Moore)的大燒杯中直到輕微麻醉，通過反循環(huán)放血(retroorbital bleed)收集血液。用上述商品化夾心放射免疫測定確定血清hGH水平。測定如建議所述進行，只是使用來自未處理小鼠的血清為對照以獲得用于產(chǎn)生標準曲線的校正的每分鐘計數(shù)(cpm)。
使用表達hGH的HF165-24細胞按照實施例I和VI所述制備用于植入裸鼠的CM和HCM。在第一個實驗中(實驗1，表6和7)，制備了每一類型13份基質。以每份基質5×106HF165-24細胞的接種密度(ID)制成HCM，并以每份基質2×106HF165-24細胞的ID制成常規(guī)膠原基質(CM)。使用較少的細胞接種CM是因為這些基質不象HCM(參看實施例V和VI)那樣支持高細胞密度。在隨后的實驗中(實驗2和3，表6和7)，只測定了HCM基質(實驗2和3中各13種)?；|保存于初始的60毫米培養(yǎng)皿中并用5毫升生長培養(yǎng)基補料。培養(yǎng)13天后，所有的培養(yǎng)皿均用新鮮生長培養(yǎng)基補料；24小時后消化每組三重基質用于細胞計數(shù)，并將來自每組所有13份基質的培養(yǎng)基樣品用于hGH檢測。
對于實驗1，在植入時CM中的平均細胞數(shù)是2．4×106細胞／基質，而HCM中的平均細胞數(shù)是7．4×106細胞／基質(表6)。每份基質的細胞數(shù)與后面用于實驗2和3制備的HCM(分別為每份基質8．9×106和9．2×106細胞)相近。表6總結了細胞數(shù)(n=3)，每份基質體外hGH產(chǎn)量(n=13)，以及每組體外實驗的特定產(chǎn)出速率(微克／106細胞／24小時；n=3)。數(shù)值以平均值±標準偏差形式提供。如表6中所示，在移植當天HCM比CM支持更高的細胞密度和產(chǎn)生更高水平的hGH。表6在植入當天每份膠原基質和混合膠原基質中HF165-24細胞密度及體外hGH產(chǎn)量
在實驗1中將每種類型八份基質植入到裸鼠，在實驗2和3中各有五份HCM植入入裸鼠。植入后以規(guī)律間隔測定血清hGH水平。結果顯示于表7和圖3。在實驗1中，植入后186天內植入HCM的動物比植入CM的動物保持明顯更高的血清hGH水平。在實驗2和3中用HCM植入的動物呈現(xiàn)相似的高血清hGH水平。表7通過植入含轉染的人皮膚成纖維細胞的膠原混合基質的hGH體內遞送血清hGH值(納克／毫升±標準誤)
實施例X本發(fā)明的混合基質可如下制成，用于植入到人體通過任何描述于實施例I-IV中的方法，從組織培養(yǎng)皿中收獲所需細胞，一般是來自病人的穩(wěn)定轉染的自體細胞，并處理用于產(chǎn)生HCM或PCHCM。通過使用大的或小的基質，向病人植入不同數(shù)目的基質，和／或在構建基質時使用每細胞表達不同水平產(chǎn)物的細胞，可以改變特定病人的用藥劑量(即，基質產(chǎn)生的生理有效量的治療產(chǎn)物)。病人體內所產(chǎn)生的治療產(chǎn)物的產(chǎn)量還可通過將基質中的細胞暴露于能改變治療基因表達的藥物學或生理學信號而得以變化。例如，如果治療基因在糖皮質激素效應啟動子控制下，則在體內將細胞暴露于諸如地塞米松的一種藥物(通過能保證藥物到達植入物的給藥方式)將會改變治療基因的表達。
一般地，植入在60毫米培養(yǎng)皿中形成的，每份基質含有10×106數(shù)量級細胞的多個小基質(直徑大約1-2厘米)。因此，使用10小份基質可植入大約100百萬個細胞。使用具有顯著的高細胞密度基質(通過并入例如2-磷酸抗壞血酸產(chǎn)生)可使特定病人需要更少量的基質?；蛘?，可以用較大的培養(yǎng)皿為模子(直徑＞150毫米)產(chǎn)生較大的基質，直接用于植入或者切成小片植入。
植入之前，可將基質貯存或浸入生長培養(yǎng)基或任何其它可使細胞保持存活的溶液中?；蛘?，將基質在合適的冷凍培養(yǎng)基中冷凍低溫保藏，在植入前可以洗掉。
可將基質植入到多個部位，包括但不限于，皮下，腹膜內，脾內，intraomental，腹股溝，鞘內，心室內，及肌肉內等部位，以及淋巴結內或脂肪組織內。在合適部位進行外科切口，插入基質，縫口傷口。實施例XI使用保持于本發(fā)明混合基質中的細胞，可將許多靜態(tài)的或灌流的大規(guī)模體外培養(yǎng)系統(tǒng)改造成用于制造蛋白。此選擇在純化目標蛋白前的補料和培養(yǎng)物收獲的必需步驟中提供不同程度的便利。有幾種描述于下。
1．在通常的培養(yǎng)皿板上形成和成熟混合膠原基質(HCM)后(例如，10-25天培養(yǎng)后)，將一些HCM無菌轉移到無菌Microcarrier旋轉瓶(250-100毫升容積)。這些HCM在能使每份基質中活細胞密度最大的條件下制成和保存。一般地，每一毫升基質體積需要5到20毫升培養(yǎng)基。制成的蛋白生產(chǎn)培養(yǎng)基含有少量不確定成分(例如血清)，并可能包括附加因子以達到每細胞的蛋白產(chǎn)出最大化。將旋轉瓶放到一個37°±1℃，5％±1％二氧化碳潮濕培養(yǎng)箱中設為30-70rpm的磁力攪拌平臺上。1到3天后，將瓶轉移到100級生物安全室中，并在不擾動沉降的基質情況下無菌取出含有表達的蛋白的生產(chǎn)培養(yǎng)基。將等體積的新鮮蛋白生產(chǎn)培養(yǎng)基加入瓶中，并將瓶放回培養(yǎng)箱的攪拌臺。
2．上面(1)中所述的基質可無菌轉移到有可控攪拌渦輪軸的1-5升生物反應器中(例如，Brunswick)。生產(chǎn)培養(yǎng)基水平由生物反應器的控制系統(tǒng)設定。培養(yǎng)基收獲和補充控制在無菌封閉環(huán)形系統(tǒng)內以減少污染。
3．對于大體積HCM生產(chǎn)，基質由其組成成分形成并在組織培養(yǎng)滾瓶中膠凝。將滾瓶靜態(tài)豎直培養(yǎng)至基質的收縮造成自由漂浮結構(3-5天)。然后補充生長培養(yǎng)基，向瓶中充5％二氧化碳氣體并放置于37℃培養(yǎng)箱的滾動裝置中。每2-3天補充生長培養(yǎng)基直到HCM成熟(共培養(yǎng)10-25天)，此時將HCM暴露于蛋白生產(chǎn)培養(yǎng)基。1-3天后，將滾瓶轉移到100級生物安全室中并在不擾動基質條件下無菌吸出含有表達的蛋白的生產(chǎn)培養(yǎng)基。將等體積新鮮蛋白生產(chǎn)培養(yǎng)基加到瓶中，將瓶放回滾動裝置。
4．可將HCM的組分通過可封的孔無菌引入無菌透氣聚四氟乙烯(TeflonTM)袋中。組分在袋中膠凝并采取其形狀和構象。將袋培養(yǎng)于37°±1℃，5％±1％二氧化碳潮濕培養(yǎng)箱中。當HCM收縮并減小體積時，將生長培養(yǎng)基調節(jié)來補償。培養(yǎng)基收獲和補充通過設在袋中的無菌-連接管道系統(tǒng)完成。使用有口培養(yǎng)箱和長管可設計循環(huán)的收獲／補料泵系統(tǒng)，從而消除在一個生產(chǎn)循環(huán)中從培養(yǎng)箱取出袋的需要。
5．可將大量體積的HCM組份無菌引入到定制的熱成型盤中。最簡單的形狀是設計具有氣體交換能力以用于二氧化碳培養(yǎng)箱的開蓋矩形盤。其它設計包括具有口與培養(yǎng)基貯池相連以控制補料和培養(yǎng)物收獲的封閉環(huán)系統(tǒng)，類似于一個生物反應器室。
其它實施例本發(fā)明的混合基質適于遞送廣譜的細胞產(chǎn)物，不僅包括hGH，而且包括因子VIII，因子IX，(促)細胞生成素(EPO)，白蛋白，血紅蛋白，α-1抗胰蛋白酶，降鈣素，葡糖腦苷脂酶，低密度脂蛋白(LDL)受體，IL-2受體，球蛋白，免疫球蛋白，催化性抗體，白介素，胰島素，胰島素樣生長因子1(IGF-1)，甲狀旁腺素(PTH)，leptin，干擾素，神經(jīng)生長因子，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，酸性FGF(aFGF)，表皮生長因子(EGF)，內皮細胞生長因子，血小板衍生生長因子(PDGF)，轉化生長因子，內皮細胞刺激血管生成因子(ESAF)，血管生成素，組織纖溶酶原激活物(t-PA)，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，以及粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。例如，包埋于基質中的可以是胰腺β細胞，它作為對血糖升高的反應能天然分泌胰島素，從而可以補充糖尿病或前糖尿病人的不充分胰島素反應。或者，可以是遺傳工程化的任何類型細胞以在病人體內表達和分泌高水平的所需多肽，例如凝血因子。此構建可在組成型激活啟動子，或在一種合適的生理或藥物調節(jié)啟動子控制下。
基質的膠原凝膠部分可全部由不可溶膠原纖維組成，或者可含有除膠原以外的其它成分例如，瓊脂糖；藻酸鹽；一種糖胺聚糖諸如透明質酸，硫酸乙酰肝素，硫酸皮膚素，或硫酸軟骨素；一種硫酸蛋白聚糖；纖連蛋白；層粘連蛋白；彈性蛋白；血纖蛋白；或肌腱蛋白。這些組分(特別是那些可在動物組織胞外基質中發(fā)現(xiàn)的)賦予本發(fā)明混合基質的結構穩(wěn)定性，和／或提供細胞在基質中和在植入部位宿主組織中的額外的附著能力。通過膠凝前將它們與膠原溶液混合而并入到基質中。
其它可能的添加劑包括細胞因子和／或生長因子，它們對優(yōu)化細胞的維持或促進與宿主組織的有益相互作用(例如，血管形成)是有用的，包括bFGF，aFGF，內皮細胞生長因子，PDGF，內皮細胞刺激血管形成因子(ESAF)，白(細胞)三烯C4，前列腺素(例如，PGE1，PGE2)，IGF-1，GCSF，血管生成素，TGF-α，TGF-β，抗壞血酸，EGF，以及制癌蛋白M。這些添加劑可在膠凝前與膠原溶液混合，也可通過將它們引入到微球體間隙，或通過將它們包括在浸浴基質的培養(yǎng)基中而并入基質?；蛘?，可基因工程化細胞以表達所需產(chǎn)物。例如，可以使用一段編碼血管生成因子的DNA和一段編碼第二個，治療蛋白的DNA，或者使用編碼連接于合適表達控制序列的兩種類型蛋白的單一載體轉染基質中的細胞。
凝膠中使用的膠原可以是任何合適的型(例如I-XI型)，或是任何兩種或多種的混合物?？稍谀z原膠凝前將纖維放入模子，從而使它們成為基質的必要部分并賦予基質堅固性和便于處理。一般地，纖維主要由膠原(例如貓腸)或非膠原材料諸如尼龍，絳綸，聚四氟乙烯(Gore-TexTM或TeflonTM)，聚乙醇酸，聚乳酸／聚乙醇酸混合物(VicrylTM)，聚苯乙烯，聚氯乙烯共聚物，纖維素(例如棉或亞麻)，聚酯，人造絲，或絲等制成。纖維可織成網(wǎng)或布，或以單獨的線使用。
除了上面的實施例中所述的I型膠原微球體，還可使用主要含有另一種類型的膠原，聚苯乙烯，葡聚糖(例如，CytodexTM，Pharmacia)，聚丙烯酰胺，纖維素，海藻酸鈣，膠乳，聚砜，玻璃(用一種物質，諸如膠原包被以增強細胞附著)，或膠原與任何上述物質的組合的微球體。這類微球體已商品化或可以用常規(guī)方法制備，然后滅菌用于本發(fā)明的混合基質。
其它實施方案在下面的權利要求書中。
權利要求
1．一種制品，包括含有不可溶膠原纖維的基質材料主體并在其中配置有(a)多元脊椎動物細胞；以及(b)多元微球體，其中每種微球體主要含有選自下面所列的一種或多種物質膠原，聚苯乙烯，葡聚糖，聚丙烯酰胺，纖維素，海藻酸鈣，膠乳，聚砜，以及玻璃。
2．根據(jù)權利要求1所述的制品，其中的細胞選自脂肪細胞，星形細胞，心肌細胞，軟骨細胞，內皮細胞，上皮細胞，成纖維細胞，神經(jīng)節(jié)細胞，腺細胞，膠質細胞，造血細胞，肝細胞，角質形成細胞，成肌細胞，神經(jīng)細胞，成骨細胞，胰腺β細胞，腎細胞，平滑肌細胞，橫紋肌細胞，及其前體。
3．根據(jù)權利要求1所述的制品，其中的細胞是人細胞。
4．根據(jù)權利要求1所述的制品，其中的細胞是含有編碼一種醫(yī)學有用多肽的外源DNA的轉染細胞。
5．根據(jù)權利要求1所述的制品，其中的細胞是轉染細胞，并且含有的外源DNA包括一段調節(jié)序列，其能夠激活一個編碼醫(yī)學有用多肽的內源基因的表達。
6．根據(jù)權利要求4所述的制品，其中的多肽選自酶，激素，細胞因子，集落刺激因子，疫苗抗原，抗體，凝血因子，調節(jié)蛋白，轉錄因子，受體及結構蛋白。
7．根據(jù)權利要求4所述的制品，其中的多肽是一種血管生成因子。
8．根據(jù)權利要求4所述的制品，其中的多肽選自人生長激素，因子VIII，因子IX，促紅細胞生成素，及胰島素。
9．根據(jù)權利要求5所述的制品，其中的多肽選自人生長激素，因子VIII，因子IX，促紅細胞生成素，及胰島素。
10．根據(jù)權利要求4所述的制品，其中的多肽選自α-1抗胰蛋白酶，降鈣素，葡糖腦苷脂酶，低密度脂蛋白(LDL)受體，IL-2受體，珠蛋白，免疫球蛋白，催化性抗體，白介素，胰島素樣生長因子1(IGF-1)，甲狀旁腺素(PTH)，勒帕茄堿，干擾素，神經(jīng)生長因子，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，酸性FGF(aFGF)，表皮生長因子(EGF)，內皮細胞生長因子，血小板衍生生長因子(PDGF)，轉化生長因子，內皮細胞刺激血管生成因子(ESAF)，血管生成素，組織纖溶酶原激活物(t-PA)，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，以及粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
11．根據(jù)權利要求1所述的制品，其中的微球體是I型膠原珠。
12．根據(jù)權利要求1所述的制品，其中大多數(shù)微球體的直徑在大約0．1和大約2毫米之間。
13．根據(jù)權利要求1所述的制品，其中基質材料中的膠原是I型。
14．根據(jù)權利要求13所述的制品，其中的基質材料另外包括選自第二型的膠原，瓊脂糖，藻酸鹽，纖連蛋白，層粘連蛋白，透明質酸，硫酸乙酰肝素，硫酸皮膚素，硫酸蛋白聚糖，血纖蛋白，彈性蛋白，及肌腱蛋白的一種物質。
15．根據(jù)權利要求1所述的制品，其中的非膠原纖維配置在主體中。
16．根據(jù)權利要求15所述的制品，其中的纖維包含選自尼龍，滌綸，聚四氟乙烯，聚乙醇酸，聚乳酸／聚乙醇酸混合物，聚苯乙烯，聚氯乙烯共聚物，膠原，貓腸，棉花，亞麻，聚酯，和絲的一種材料。
17．根據(jù)權利要求1所述的制品，其中制品配置在哺乳動物體內。
18．根據(jù)權利要求1所述的制品，使成形以植入入病人。
19．根據(jù)權利要求18所述的制品，其中的細胞來源于從病人取出的一種或多種細胞。
20．根據(jù)權利要求18所述的制品，其中的細胞由一個克隆群體組成。
21．根據(jù)權利要求18所述的制品，其中的細胞是含有編碼一種醫(yī)學有用多肽的外源DNA的轉染細胞。
22．根據(jù)權利要求18所述的制品，其中的細胞是轉染細胞，并且含有的外源DNA包括一段調節(jié)序列，其能夠激活一個編碼醫(yī)學有用多肽的內源基因的表達。
23．根據(jù)權利要求11所述的制品，其中的細胞是轉染的人細胞且基質材料中的膠原是I型。
24．制備權利要求1所述的制品的方法，包括制成一種混合物包括(a)多元脊椎動物細胞；(b)多元微球體，其中每種微球體主要含有一種或多種選自包括膠原，聚苯乙烯，葡聚糖，聚丙烯酰胺，纖維素，海藻酸鈣，乳膠，聚砜，和玻璃的物質；以及(c)含有可溶性膠原的溶液；使混合物中的可溶性膠原形成含有細胞和微球體的凝膠；以及將凝膠暴露于使凝膠收縮的培養(yǎng)條件，從而形成制品的主體。
25．根據(jù)權利要求24所述的方法，其中的微球體是多孔膠原珠。
26．根據(jù)權利要求24所述的方法，其中的溶液另外含有選自包括第二種型的膠原，瓊脂糖，藻酸鹽，纖連蛋白，層粘連蛋白，透明質酸，硫酸乙酰肝素，硫酸皮膚素，硫酸蛋白聚糖，血纖蛋白，彈性蛋白，和肌腱蛋白的一種物質。
27．根據(jù)權利要求24所述的方法，其中的溶液是可溶性膠原的酸性水溶液，通過提高溶液的pH進行膠凝。
28．根據(jù)權利要求24所述的方法，其中的膠凝步驟在模子中發(fā)生，從而，在收縮步驟之前，凝膠是模子的形狀。
29．根據(jù)權利要求24所述的方法，其中的細胞和微球體在與溶液混合之前一起培養(yǎng)。
30．將一種醫(yī)學有用肽向需要的病人給藥的方法，它包括提供根據(jù)權利要求18所述的制品，其中的細胞分泌該多肽；以及將制品植入病人。
31．根據(jù)權利要求30所述的方法，其中的細胞來源于從病人取出的一種或多種細胞，并已在體外用編碼多肽的外源DNA轉染。
32．根據(jù)權利要求30所述的方法，其中的植入在病人的皮下部位進行。
33．根據(jù)權利要求30所述的方法，其中的植入在病人的腹膜內，腎下囊，腹股溝，肌肉內，心室內，或鞘內部位進行。
34．根據(jù)權利要求30所述的方法，其中的多肽能促進傷口愈合，并且植入在病人的已存?zhèn)诘牟课贿M行。
35．將一種醫(yī)學有用肽向需要的病人給藥的方法，它包括提供一種體外裝置包括(a)根據(jù)權利要求1所述的制品，其中的細胞分泌該多肽；和(b)從病人血管分流血液到裝置然后回流到病人血管的設備；以及將病人的部分血液分流過該裝置并回流到病人血流中，從而將多肽與血液混合。
36．一種生產(chǎn)多肽的方法，包括在細胞表達和分泌該多肽的條件下，提供權利要求1的制品；用一種液體與制品接觸從而使細胞將多肽分泌到液體中；以及從液體中獲取多肽。
37．一種保存細胞的方法，包括提供根據(jù)權利要求1所述的制品，以及將制品貯存在0℃溫度以下。
38．一種體外裝置，包括根據(jù)權利要求1所述的制品；以及一種從動物分流血液到該制品然后回流到動物血管的設備。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可植入裝置,其主體是由不溶膠原纖維組成的基質材料,其中并配置有:(a)多元脊椎動物細胞;以及(b)多元微球體,每種微球體主要由一種或幾種下列物質組成:膠原,聚苯乙烯,葡聚糖,聚丙烯酰胺,纖維素,海酸藻鈣,膠乳,聚砜,或玻璃。
文檔編號C12P21/04GK1205613SQ96199324
公開日1999年1月20日 申請日期1996年10月25日 優(yōu)先權日1995年10月25日
發(fā)明者羅切爾·邁尼奧－漢斯查克 申請人:轉移染色體治療公司