專利名稱：編碼對n－乙?；璴－膦絲菌素具有特異性的氨基酸脫乙酰酶的新基因,其分離和應(yīng)用的制作方法
歐洲專利申請EP 531 716說明了，通過花藥特異性表達(dá)一種N-乙酰基-膦絲菌素(N-乙?；?PPT)特異性的脫乙酰酶，可化學(xué)誘導(dǎo)可逆性雄性植物不育的方案。其中所應(yīng)用來源于綠色產(chǎn)色鏈霉菌的脫乙酰酶基因[N-乙?；?L-膦絲菌素丙氨酰丙氨酸(N-乙?；?PPT)脫乙酰酶，dea]，和來源于大腸桿菌的argE(N-乙?；?L-鳥氨酸脫乙酰酶)編碼對N-乙?；?L-PPT具有特異性的蛋白質(zhì)。對于這二種基因來說，在植物內(nèi)的絨氈層特異性表達(dá)時(shí)，用N-乙?；?L-PPT處理單個(gè)花蕾后，可以出現(xiàn)雄性不育花朵。為了使該系統(tǒng)的應(yīng)用富有成果，尤其是在實(shí)踐相關(guān)條件下用N-乙?；?PPT處理整個(gè)植物時(shí)，應(yīng)用具有較高底物親合力的脫乙酰酶是有利的。因此要尋求對N-乙酰基-PPT具有高度親合力的其它一些脫乙酰酶。
本文說明的申請的目的是提供編碼脫乙酰酶的DNA分子。用這些脫乙酰酶可以制備出其局部可被特異地破壞了的植物。制備雄性或雌性不育植物具有特殊意義。通過在權(quán)利要求書中描述的實(shí)施方式，達(dá)到了該目的。
本發(fā)明涉及編碼脫乙酰酶或者具有脫乙酰酶生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的DNA分子。這些蛋白質(zhì)的酶促特性將在實(shí)施例中說明。本發(fā)明還涉及編碼生物學(xué)活性亞片段或衍生物的DNA分子。按照本發(fā)明的分子也包括片段、衍生物或等位基因變體。片段是指仍然還具有脫乙酰酶生物學(xué)活性的部分。
本發(fā)明此外還涉及被本發(fā)明DNA分子轉(zhuǎn)化了的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞可以按照已知的技術(shù)方法制備，然后再生成完整的植物。
本發(fā)明涉及編碼具有N-乙?；?PPT脫乙酰酶生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的DNA分子。
本發(fā)明尤其涉及選自下列分子組的、編碼具有N-乙酰基-PPT脫乙酰酶生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的DNA分子a)編碼具有SEQ ID No 2中所給定的氨基酸序列的蛋白質(zhì)及其片段和/或衍生物的DNA分子；b)編碼SEQ ID No 1中所給定的核苷酸序列的DNA分子或在遺傳密碼簡并性范圍內(nèi)偏離該序列的一些序列；c)編碼具有SEQ ID No 4中所給定的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其片段和/或衍生物的DNA分子；和d)編碼SEQ ID No 3中所給定的核苷酸序列的DNA分子或在遺傳密碼簡并性范圍內(nèi)偏離該序列的一些序列。
本發(fā)明此外還涉及按照本申請說明的方法鑒定和保藏的微生物寡養(yǎng)單胞菌屬種(DSM9734)和食酸叢毛單胞菌(DSM11070)。
本發(fā)明尤其涉及含有本發(fā)明DNA分子的植物細(xì)胞或植物。
具有特別意義的是，通過特異性表達(dá)脫乙酰酶基因而制備帶有可特異性破壞部分的植物的方法，以及通過脫乙酰酶基因的特異性表達(dá)制備雄性或雌性不育植物的方法。
因此，本申請書還涉及1)具有高N-乙?；?PPT脫乙酰酶活性的微生物的特異濃縮2)相應(yīng)脫乙酰酶基因的分離3)由這些基因編碼的、具有高N-乙酰基-PPT脫乙酰酶活性的蛋白質(zhì)的提純和鑒定4)在植物內(nèi)表達(dá)脫乙酰酶基因。
本申請此外還涉及-編碼具有高N-乙?；?PPT脫乙酰酶活性的酶的DNA分子-由這些基因編碼的蛋白質(zhì)-植物內(nèi)這些脫乙酰酶基因的表達(dá)。
在帶有殼多糖作為唯一的碳源的礦質(zhì)培養(yǎng)基內(nèi)可以從土壤樣品濃縮能高效切割N-乙?；?PPT的細(xì)菌。以這種方式分離出了二個(gè)菌株的純培養(yǎng)物寡養(yǎng)單胞菌屬種(DSM保藏號(hào)DSM 9734)和食酸叢毛單胞菌(DSM保藏號(hào)11070)。
然而，對于工業(yè)制備所需要的條件來說，更為合適的是應(yīng)用提純的酶。
本申請包括新的L-N-乙?；?PPT特異性的脫乙酰酶、一種由土壤微生物的濃縮培養(yǎng)物提純和鑒定這些酶的新的有效的方法、以及這種脫乙酰酶的應(yīng)用。
因此，本發(fā)明還涉及1.一種脫乙酰酶，它具有-20,000-100,000道爾頓的分子量-最佳pH值為6.5-10.0-對L-N-乙?；?膦絲菌素的底物特異性。
2.制備脫乙酰酶的方法，其特征為，在含有蟹殼多糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)不產(chǎn)生孢子的微生物，以及由這種微生物分離脫乙酰酶。
3.在第1項(xiàng)中表征的脫乙酰酶在制備雄性不育植物以及立體選擇性制備L-膦絲菌素中的用途。
本發(fā)明尤其涉及最佳溫度位于30-50℃之間的酶。
制備脫乙酰酶的本發(fā)明方法，優(yōu)選用選自本申請中說明的微生物組的微生物進(jìn)行。
可以按照Shimahara、Kenzo和Takiguchi、Yasuyuki說明的方法(酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)，161卷，417-423頁，1988年)獲得蟹殼多糖，或者在Sigma公司購得。
為了提純脫乙酰酶，將微生物在適于它們生長的最佳營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在有氧條件下進(jìn)行微生物的培養(yǎng)，例如在振搖或攪拌下，在搖瓶中或發(fā)酵罐中，適當(dāng)時(shí)注入空氣或氧氣的條件下，進(jìn)行深層培養(yǎng)?？梢栽诩s20-40℃的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選在約25-37℃，尤其是在30-37℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵作用。在5-8.5的pH值范圍內(nèi)，優(yōu)選在5.5-8.0的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。
在這些條件下，一般在1-3天以后微生物顯示明顯的酶累積。脫乙酰酶的合成從對數(shù)期開始?？梢越柚谕ㄟ^HPLC分析或光度測定法的活性試驗(yàn)監(jiān)測酶的產(chǎn)量。制備轉(zhuǎn)氨酶所應(yīng)用的營養(yǎng)液含有0.2-5％，優(yōu)選0.5-2％蟹殼多糖以及無機(jī)鹽。
營養(yǎng)液中可以含有的無機(jī)鹽例如是堿金屬或堿土金屬，鐵，鋅，錳的氯化物、碳酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽，還可以含有銨鹽和硝酸鹽。
按照本發(fā)明，可以應(yīng)用有效量的游離形式或固定形式的脫乙酰酶進(jìn)行脫乙?；饔茫瑑?yōu)選應(yīng)用于表達(dá)deac基因的植物內(nèi)。
可以考慮已知的方法進(jìn)行固定，例如在德國公開說明書32 37 341和32 43 591中說明的方法。
可以按照經(jīng)典方法通過超聲和法蘭西加壓法、硫酸銨沉淀法、離子交換法、親和色譜法和凝膠滲透法進(jìn)行分離，可以分離和提純酶。
酶制劑的分子量可以為20,000-100,000道爾頓，優(yōu)選為30,000-80,000，尤其是40,000-70,000道爾頓。酶產(chǎn)物的最佳pH值在6.0-10.0范圍內(nèi)，尤其是7.0-8.0范圍內(nèi)。酶的最佳溫度在30-50℃范圍內(nèi)，尤其是在35-45℃范圍內(nèi)。
在大腸桿菌內(nèi)克隆編碼脫乙酰酶的基因。在寡養(yǎng)單胞菌屬種deac1基因的情況下，對大腸桿菌中的基因組DNA噬菌粒表達(dá)庫進(jìn)行N-乙?；?PPT特異性脫乙酰酶活性的篩選。通過大腸桿菌-argE突變體的互補(bǔ)作用，利用基因組文庫克隆食酸叢毛單胞菌的deac2基因。
由二種基因的DNA序列衍生的氨基酸序列相互類似，并且還與馬尿酸水解酶具有同源性，正如由蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫已知的那樣。
deac1蛋白質(zhì)對N-乙?；?L-PPT具有高底物親和力(Km＝670μM)，這使得轉(zhuǎn)基因植物組織具有對這種物質(zhì)的高度敏感性的特征。這樣，組成型表達(dá)deac基因時(shí)，所獲植物的葉片對0.4mg/ml以下濃度的N-乙酰基-D，L-PPT(＝0.2mg/ml L-對映體)尚有敏感反應(yīng)。在絨氈層特異性表達(dá)時(shí)，通過用2mg/ml N-乙酰基-D，L-PPT(＝1mg/ml L-對映體)處理花蕾，可以誘導(dǎo)出雄性不育花朵。所說明的結(jié)果針對的是溫室植物。由于物質(zhì)濃度較低，在露天條件下需要時(shí)，完全可以將劑量增加5-10倍。
以下實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。如果沒有另作說明，則百分?jǐn)?shù)均指重量。本發(fā)明在權(quán)利要求書中進(jìn)行了進(jìn)一步定義。
實(shí)施例1具有N-乙酰基-PPT特異性的脫乙酰酶活性的土壤微生物的分離和鑒定用10mM氯化鈉、10mM磷酸鈉緩沖液(pH＝7.0)，將每1g土壤(砂質(zhì)粘土、Schwanheimer沙丘)在室溫下萃取1小時(shí)。為了篩選各組微生物，將土壤上清液接種至以下液體培養(yǎng)基中1)MS1培養(yǎng)基(用于真細(xì)菌) 5mM葡萄糖5mM琥珀酸鹽10mM甘油1g/l NH4Cl50ml/l 溶液A25ml/l 溶液B溶液A50g/l K2HPO4溶液B2.5g/l MgSO40.5g/l NaCl25ml/l微量元素2)殼多糖培養(yǎng)基(適于放線菌和鏈霉菌以及殼質(zhì)細(xì)菌)10g/l蟹殼多糖1g/l(NH4)2SO40.5g/l MgSO450ml/l 溶液A1ml/l微量元素3)抗生素培養(yǎng)基(適于較高級(jí)真菌)20g/l麥芽提取物10g/l葡萄糖2g/l酵母提取物0.5g/l(NH4)2SO450μg/ml四環(huán)素所有的培養(yǎng)基中均含有5mM N-乙?；?PPT，并且在細(xì)菌接種后在28℃下培養(yǎng)3-5天。
然后測試各濃縮培養(yǎng)物對N-乙?；?PPT的脫乙?；饔谩榇?，將細(xì)胞在10000rpm下離心，并在氨基酸分析儀(Biotronic LC 5001)中檢測上清液中PPT的形成。結(jié)果是僅有殼多糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物顯示脫乙酰酶陽性。在殼多糖瓊脂上鋪板后，從這些培養(yǎng)物總共分離出40個(gè)菌落，在殼多糖液體培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)這些菌落并重新測試脫乙酰酶活性。其間發(fā)現(xiàn)6個(gè)陽性分離物，由此可以通過在瓊脂平板上重復(fù)劃線并繼續(xù)培養(yǎng)單個(gè)菌落，即可以獲得活性純培養(yǎng)物。具有最高脫乙酰酶活性的菌株被鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬種(DSM保藏號(hào)DSM 9734)。
實(shí)施例2寡養(yǎng)單胞菌屬種的N-乙?；?PPT脫乙酰酶基因的克隆和測序該工作所應(yīng)用的分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法，已經(jīng)由Maniatis等，1982年，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港(MolecularCloninga laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor)，N.Y.進(jìn)行了描述。
按照Meade等，1982年，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)，149期，114-122頁中的方法，制備寡養(yǎng)單胞菌屬種的基因組DNA。用Sau3A部分消化后，分離出5-10kb大小的部分，連接到已用BamHI切割的來自Stratagene的λ-ZAP表達(dá)載體中，(ZAP表達(dá)載體試劑盒，索引號(hào)239201，指導(dǎo)手冊(Instruction Manual))連接。用包裝好的連接物制備原代λ噬菌體文庫，然后擴(kuò)增。借助于Stratagene的pBK-CMV噬菌粒系統(tǒng)(索引號(hào)212209，指導(dǎo)手冊)，由此制備大腸桿菌中的噬菌粒表達(dá)文庫。用[14C]-N-乙?；?L-PPT作為底物，通過活性篩選檢測該基因文庫中脫乙酰酶基因的存在。為此，將2000個(gè)單克隆接種至微滴定板中，并且在含有0.2mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作為誘導(dǎo)物和50μg/ml卡那霉素作為抗性標(biāo)記的LB-培養(yǎng)基中在37℃下培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞離心，28℃下在10μl 1mM[14C]-N-乙?；?L-PPT中培養(yǎng)過夜。接著分成8群，通過薄層層析和放射自顯影分析各批將N-乙?；?PPT轉(zhuǎn)變成PPT的情況(參見EP 531 716，實(shí)施例8)，在陽性結(jié)果時(shí)再次測定各個(gè)克隆。用這種方法，可以從1920個(gè)轉(zhuǎn)化子選擇出帶有6kb插入物的一個(gè)陽性克隆。通過限制性作圖更詳細(xì)鑒定這一DNA片段。通過將插入物的限制性片段亞克隆至pUC18/19中，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌內(nèi)，就可以借助于以上說明的活性試驗(yàn)，將deac結(jié)構(gòu)基因定位于2.5kb(2487個(gè)堿基對)Sall/Smal片段上(

圖1)。其活性取決于該片段相對于載體的lac啟動(dòng)子的方向。
用Sanger方法(Sanger等，1977年，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)，74期，5463-5468頁)對該2.5kb片段在兩條鏈上測序。整個(gè)片段長為2487個(gè)核苷酸(見SEQ ID NO.1)。長為1494個(gè)核苷酸的開放閱讀框開始于第367位核苷酸，終止于第1860位核苷酸。
此范圍內(nèi)的PCR亞片段在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)研究表明，活性脫乙酰酶蛋白質(zhì)由具有1365個(gè)核苷酸的一個(gè)區(qū)域所編碼，該區(qū)始于496位的ATG起始密碼子，終于1860位的TGA終止密碼子。由該DNA序列衍生的氨基酸序列為具有454個(gè)氨基酸(SEQ ID NO 2)的多肽，其計(jì)算分子量為48.1kDa。
在EMBL、DNA和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行的同源性檢索顯示與以下物質(zhì)有相似性本申請中首次說明的來源于食酸叢毛單胞菌的N-乙?；?PPT脫乙酰酶(37.4％的氨基酸相同)、來源于空腸彎曲桿菌的馬尿酸水解酶(33.9％)和來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的N-酰基-L-酰氨基水解酶(33.7％)。下面將由寡養(yǎng)單胞菌分離出來的基因稱為deac1。相應(yīng)的蛋白質(zhì)稱為Deac1。由于具有同源性，所以可以推測，可以將所列舉的馬尿酸水解酶和酰氨基水解酶與組織特異性的啟動(dòng)子聯(lián)合，接著進(jìn)行處理以制備具有可選擇性破壞的組織的植物，尤其是雄性和/或雌性不育植物。
實(shí)施例3Deac1蛋白質(zhì)的鑒定為了過表達(dá)和提純來源于寡養(yǎng)單胞菌屬種的脫乙酰酶(deac1)，應(yīng)用Pharmacia(目錄號(hào)27-4581-01、目錄號(hào)27-4570-01)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合載體系統(tǒng)。方法已經(jīng)在Smith和Johnson，1988年，基因(Gene)6731中說明。通過用谷胱甘肽-Sepharose 4B進(jìn)行親和層析，將融合蛋白提純。
將功能性deac基因作為1.4kb BamHI/Sall-PCR片段，重新克隆至GST融合載體pGEX-4T-2中，處于lac啟動(dòng)子的控制下。通過添加0.1mMIPTG誘導(dǎo)重組融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。通過對大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的粗提取物進(jìn)行SDS/聚丙烯酰胺電泳，可以檢測到融合蛋白質(zhì)，這是一條74kDa條帶。
為了提純蛋白質(zhì)，用超聲，將經(jīng)誘導(dǎo)的表達(dá)陽性的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的2升培養(yǎng)物的細(xì)胞分解，接著通過添加1％Triton X-100使提取液溶解。將上清液與谷胱甘肽-Sepharose 4B結(jié)合。用PBS緩沖液(140mMNaCl，3mM KCL，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH＝7.3)多次洗滌后，用凝血酶切割結(jié)合于Sepharose基質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。洗脫液含有48kDa切割產(chǎn)物這條唯一的蛋白質(zhì)帶(變性SDS/聚丙烯酰胺電泳后)，它在酶測定法(見下文)中被證實(shí)為N-乙?；?PPT脫乙酰酶。按照說明的方法，由2升細(xì)菌培養(yǎng)物可以提純出200μg均質(zhì)的脫乙酰酶蛋白質(zhì)。
用以下二種測定法測定脫乙酰酶蛋白質(zhì)的活性1)放射活性試驗(yàn)將2.5μg各提純酶在PBS緩沖液中的10μl溶液內(nèi)與0.1mM[14C]-N-乙酰基-L-PPT在37℃下溫育15分鐘。接著將樣品按1∶6在5mM KH2PO4、10％甲醇，pH＝1.92中稀釋，并在HPLC中用放射活性檢測儀分析(分離柱Spherisorb SAX，洗脫劑5mM KH2PO4，10％甲醇，pH＝1.92，流速0.5毫升/分鐘)。在此條件下，[14C]-L-PPT在4.5分鐘洗脫下來，[14C]-N-乙?；?L-PPT在6.5分鐘洗脫下來。以[納摩爾[14C]-L-PPT/分鐘/毫克蛋白質(zhì)]測定脫乙酰酶比活性。為了測得最佳pH值，將各份溶液在pH6-9范圍之間的40mMbis-tris，tris和Caps緩沖液系統(tǒng)中溫育。為了測定Km值，在imM CoCl2存在的條件下，用濃度在0.01mM-1mM之間的[14C]-N-乙?；?L-PPT，在pH8.0進(jìn)行3次測定。
2)非放射活性試驗(yàn)為了檢測底物特異性，將各5μg提純酶，在20μl含25mM某種N-乙?；?氨基酸或N-酰基-氨基酸的PBS緩沖液的體積中，在28℃下溫育60分鐘。接著將樣品在氨基酸分析儀(Biotronic LC5001)中測定游離氨基酸的產(chǎn)生。以[納摩爾氨基酸/分鐘/毫克蛋白質(zhì)]測定比活性。對于N-乙酰基-PPT脫乙酰酶，測得其最佳pH值為8(參見表1)，最佳溫度為37℃(參見表2)。動(dòng)力學(xué)測定得出Km值為670μM。通過添加1mM CoCl2，酶活性可以提高約20％。
表1N-乙酰基-PPT脫乙酰酶的最佳pH值pH值 比活性[摩爾/分鐘/毫克蛋白質(zhì)]6 2.47 7.28 12.09 8.5表2N-乙?；?PPT脫乙酰酶的最佳溫度溫度[℃] 比活性[納摩爾/分鐘/毫克蛋白質(zhì)]289.63716.85014.9604.3底物特異性的測定結(jié)果見于表3。
該酶具有相對較寬的底物范圍。對馬尿酸(N-苯甲?；拾彼?和N-乙?；?L-谷氨酸獲得最高轉(zhuǎn)化。對N-乙?；?L-PPT的親和力約低于對上述兩種底物親和力的50％。該脫乙酰酶對N-乙酰基-L-氨基酸具有唯一的特異性。用相應(yīng)的D-對映體則觀察不到反應(yīng)。
表3N-乙酰基-PPT脫乙酰酶的底物特異性底物1相對活性2[％]馬尿酸(N-苯甲?；?甘氨酸) 100N-乙?；?膦絲菌素 43N-乙酰基-鳥氨酸37N-乙?；?甲硫氨酸 0N-乙酰基-色氨酸0.4N-乙?；?苯丙氨酸 24N-乙?；?酪氨酸11N-乙?；?谷氨酸100N-乙酰基-谷氨酰胺 30N-乙?；?甘氨酸59N-乙?；?組氨酸43N-乙?；?亮氨酸33N-乙酰基-纈氨酸2N-乙?；?絲氨酸4N-乙酰基-脯氨酸01所有的化合物均為L-對映體。
2用馬尿酸測定的比活性假設(shè)為100％，其它數(shù)值為其相對值。
實(shí)施例4煙草內(nèi)deac1基因的組成型表達(dá)將deac1結(jié)構(gòu)基因作為1.4kb BamHI/Sall PCT片段，重新克隆至二元載體pPCV801(Koncz和Schell，1986年，分子普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)，204期，383-396頁)內(nèi)，處于35S啟動(dòng)子的控制之下。將所形成的帶有表達(dá)載體35S啟動(dòng)子-deac1結(jié)構(gòu)基因-35S終止子的質(zhì)粒pPCVKDEAC1(附圖2)通過標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化至根瘤土壤桿菌(ATHV菌株)中。將煙草(Nicotiana tabacum)的葉片按照Horsch等，1985年，科學(xué)(Science)，227期，1229-1231頁中的方法用重組土壤桿菌轉(zhuǎn)化，然后在卡那霉素培養(yǎng)基上選擇，再生18個(gè)獨(dú)立的煙草轉(zhuǎn)化體，測定葉片內(nèi)的脫乙酰酶表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)蛋白質(zhì)有活性的情況下，預(yù)期葉片對N-乙酰基-PPT具有敏感性，這是因?yàn)?，由于脫乙酰酶的酶催活性，在植物?nèi)該物質(zhì)被轉(zhuǎn)化成除草劑活性物質(zhì)膦絲菌素。
在點(diǎn)滴試驗(yàn)中，分別用5μl以下濃度的N-乙?；?D，L-PPT處理轉(zhuǎn)基因植物以及多種非轉(zhuǎn)基因的對照植物的葉片4mg/ml(＝15mM)、1mg/ml(＝3.75mM)、0.4mg/ml(＝1.5mM)、0.1mg/ml(＝0.38mM)。1-2周后在處理部位檢查是否顏色變淺或有壞死。同時(shí)在粗提取液中測定轉(zhuǎn)化體以及對照植物的N-乙?；?PPT特異性脫乙酰酶活性。為此，分別將100mg葉片材料在200μlPBS緩沖液中勻漿，將細(xì)胞碎片離心除去，將含有蛋白質(zhì)的上清液在4℃下對相同的緩沖液透析過夜。將10μl每一樣品與0.1mM[14C]-N-乙?；?L-PPT在37℃溫育過夜。接著在如上說明的HPLC中分析[14C]-L-PPT的產(chǎn)生。
所選擇植物的點(diǎn)滴試驗(yàn)和活性試驗(yàn)的結(jié)果列于表4中。結(jié)果表明，約60％轉(zhuǎn)化體表達(dá)功能性脫乙酰酶蛋白質(zhì)，并顯示相應(yīng)的表型。
表4pPCVKDEAC1植物對N-乙?；?PPT的敏感性，以及粗提取液中的脫乙酰酶活性
1相對于所應(yīng)用的放射活性([14C]-N-乙?；?L-PPT)+++嚴(yán)重壞死
++明顯損傷+顏色稍變淺-沒有癥狀實(shí)施例5煙草中deac1基因的絨氈層特異性表達(dá)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法，將金魚草(Antirrhinum majus)tap1基因的絨氈層特異性啟動(dòng)子作為2.2kb EcoRI/BamHI片段，與deac1結(jié)構(gòu)基因(1.4kb BamHI/Sall PCR片段)和35S終止子融合于載體pUC18中。將這樣形成的表達(dá)盒tap1啟動(dòng)子-deac結(jié)構(gòu)基因-35S終止子作為3.8kb EcoRI片段代替35S啟動(dòng)子/終止子區(qū)域而克隆入二元載體pPCV801中(質(zhì)粒pPCVTDEAC1，附圖3)。按照實(shí)施例4說明的方法轉(zhuǎn)化煙草。
在脫乙酰酶的絨氈層特異性表達(dá)情況下，通過用N-乙?；?PPT處理花蕾應(yīng)可以誘發(fā)雄性不育花朵。PPT衍生物轉(zhuǎn)化成除草活性物質(zhì)膦絲菌素，導(dǎo)致選擇性破壞絨氈層組織，由此抑制功能性花粉的產(chǎn)生。
每種情形下，將每個(gè)花序(生長花蕾的整個(gè)區(qū))的僅僅一面用N-乙?；?PPT處理，花序的另一面不作處理，以確保所觀察到的現(xiàn)象不是因?yàn)橹参锏幕伟l(fā)育所引起的。處理是在各個(gè)花蕾不大于5mm(絨氈層啟動(dòng)子活性期)時(shí)進(jìn)行的。將煙草轉(zhuǎn)化株以及多個(gè)NT Sam NN對照植物在1周內(nèi)用0.2％N-乙?；?D，L-PPT(＝7.5mM)/0.1％Genapol(潤濕劑)處理3次。花蕾開花以后(處理結(jié)束后約9-11天)，檢查植物出現(xiàn)雄性不育花朵的情況。
同時(shí)測定轉(zhuǎn)化株以及對照植物未成熟花藥內(nèi)的N-乙?；?PPT特異性脫乙酰酶活性。為此，將約5mm大小的花蕾的未成熟花藥剝離下來，并且在室溫下分別在50μM[14C]-N-乙?；?L-PPT溶液內(nèi)溫育過夜。接著將花藥在500μl PBS緩沖液中洗滌一次，然后在50μl PBS緩沖液中勻漿。細(xì)胞碎屑離心除去后，將上清液在Speed-Vac中濃縮，將沉淀各溶解于30μl HPLC緩沖液(5mM KH2PO4，10％甲醇，pH1.92)中。正如上面說明過的，在HPLC中分析各樣品中[14C]-L-PPT的產(chǎn)生。
對所選擇出來的植物進(jìn)行花朵處理和活性試驗(yàn)的結(jié)果列于表5。幾乎在所有的轉(zhuǎn)化株中，可以證實(shí)有花藥特異性脫乙酰酶活性。在3個(gè)轉(zhuǎn)化株中，在花序的用N-乙?；?PPT處理過的一面上，觀察到雄性不育花朵(也即沒有形成花粉)，或者花粉明顯減少的花朵。對新的成熟花蕾的作用持續(xù)約3周的時(shí)間。轉(zhuǎn)化株的未處理花朵、以及對照植物的處理花朵全部可育。在雄性不育花朵中未測得種子生成。然而，可以對雄性不育花朵進(jìn)行異花授粉，由此已證實(shí)，其雌性花朵部分保存了完整的功能(Nacken等，1991年，分子普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)，229期，129-136頁)。
表5通過用N-乙酰基-PPT處理pPCVTDEAC1植物花朵后誘導(dǎo)的雄性不育，和花藥的脫乙酰酶活性<
1基于所應(yīng)用的放射活性([14C]-N-乙酰基-L-PPT)實(shí)施例6從食酸叢毛單胞菌中分離對N-乙?；?膦絲菌素具有特異性的脫乙酰酶并進(jìn)行鑒定將來源于曼谷的土壤樣品懸浮于含有殼多糖(2g/l)作為唯一碳源的礦質(zhì)鹽培養(yǎng)基(0.5g K2HPO4，0.2g MgSO4，2g (NH4)2SO4、0.01g FeSO4，于980ml H2O中)中，接著在30℃下培養(yǎng)48小時(shí)。然后將細(xì)菌接種至新鮮的礦質(zhì)鹽培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，將各稀釋度鋪板于LB培養(yǎng)基上(Miller，分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Experimentsin molecular genetics，Cold Spring Harbour LaboratoryPress))。
在長成的菌落中有一種細(xì)菌菌株，其特征為，在純培養(yǎng)基中能充分利用作為唯一碳源的N-乙?；?谷氨酸(在含有N-乙酰基-谷氨酸(2g/l，作為無菌過濾溶液加至含有14g/l瓊脂的經(jīng)高壓滅菌的礦質(zhì)鹽培養(yǎng)基中)的礦質(zhì)鹽培養(yǎng)基上劃線，在30℃下培養(yǎng)12小時(shí)，產(chǎn)生明顯可見的菌落)。如上述檢測N-乙酰基-PPT的去乙?；饔谩?shí)驗(yàn)室描述為B6的細(xì)菌菌株由DSM鑒定為食酸叢毛單胞菌(DSM11070)。
實(shí)施例7對來源于食酸叢毛單胞菌的脫乙酰酶基因進(jìn)行克隆由食酸叢毛單胞菌分離出總DNA，用EcoRI消化，然后與載體pACYC184(Cang和Cohen，1978年，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol)，134期，1141-1156頁)的同樣經(jīng)EcoRI消化過的DNA連接。連接液用于電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌argE突變體XSID2(Mountain等，1984年，分子普通遺傳學(xué)，197期，82-89頁)。通過對精氨酸營養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)作用進(jìn)行篩選，可以由食酸叢毛單胞菌基因組分離出8.9kb大小的EcoRI片段，它對互補(bǔ)作用已經(jīng)足夠。通過亞克隆，可以將互補(bǔ)區(qū)域限定于1.4kb大小的片段。它存在于測序載體pSVB30(Arnold和Puehler，1988年，基因(Gene)，70期，172-178頁)的被稱為pGK83的衍生物中。
實(shí)施例8對來源于食酸叢毛單胞菌的脫乙酰酶基因進(jìn)行測序按照已知的方法對起互補(bǔ)作用的該1.4kb(1387個(gè)堿基對)片段通過雙鏈完整測序。
實(shí)施例9對測序區(qū)域進(jìn)行編碼區(qū)分析和同源性比較編碼區(qū)域分析顯示有一個(gè)從位置1至1206(SEQ ID NO.3)的開放閱讀框，其編碼一種402個(gè)氨基酸大小的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO.4)。
與數(shù)據(jù)庫內(nèi)的已知基因進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示與嗜熱脂肪芽孢桿菌的N-?；?L-酰氨基水解酶(ama，Sakanyan等，1993年，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)，59期，3878-3888頁)明顯同源，與來源于空腸彎曲桿菌的馬尿酸水解酶(迄今尚無公開)明顯同源。在蛋白質(zhì)比較中，馬尿酸水解酶具有43％的相同氨基酸(見表6)。此外，該基因在DNA水平和蛋白質(zhì)水平與由寡養(yǎng)單胞菌屬種分離的脫乙酰酶基因具有非常明顯的同源性。根據(jù)由寡養(yǎng)單胞菌屬種分離的該基因的命名，將來自食酸叢毛單胞菌的鑒定的所述基因稱為deac2。
表6與已知序列的同源性比較
實(shí)施例10食酸叢毛單胞菌deac2基因的植物構(gòu)建體的過量表達(dá)為了分析來源于食酸叢毛單胞菌的deac2基因產(chǎn)物的底物特異性，將它過量表達(dá)。為此，將此基因克隆至高拷貝數(shù)載體中處于lacZ啟動(dòng)子的控制下。但是表達(dá)效率卻因?yàn)樵诹硗庖环N閱讀框中同時(shí)進(jìn)行的lacZ-α翻譯而受到限制。因此，通過導(dǎo)入一個(gè)終止密碼子而中斷該過程，使載體pGK81能夠進(jìn)行不被lacZ基因破壞的deac2基因的過量表達(dá)。還可以根據(jù)表型進(jìn)行檢測，因?yàn)檫@種構(gòu)建體對大腸桿菌argE突變體的互補(bǔ)作用更為顯著。
為了轉(zhuǎn)化植物，利用二元載體pROK1(Baulcombe等，1986年，自然，321期，446-449頁)，將deac2結(jié)構(gòu)基因重新克隆，處于組成型35S啟動(dòng)子或絨氈層特異性啟動(dòng)子TA-29之后。所獲得的表達(dá)質(zhì)粒pGK83和pMF9顯示于附圖中。
實(shí)施例11來源于食酸叢毛單胞菌的deac2基因產(chǎn)物的底物特異性分析為了分析來源于食酸叢毛單胞菌的deac2基因產(chǎn)物的底物特異性，應(yīng)用經(jīng)過甲苯/乙醇透化處理后帶有或不帶有載體pGK81的大腸桿菌菌株XL1 Blue細(xì)胞。通過IPTG處理，可以對受到該菌株中存在的Laci阻遏物阻遏的deac2基因進(jìn)行誘導(dǎo)。將透化處理過的細(xì)胞與各種不同的N-乙酰化氨基酸(終濃度25mM)在30℃下溫育3小時(shí)，然后借助于氨基酸分析儀分析上清液。結(jié)果表明20％以上所應(yīng)用的N-乙?；?鳥氨酸被轉(zhuǎn)化。對于N-乙?；?膦絲菌素，同樣發(fā)現(xiàn)，相應(yīng)于所應(yīng)用的N-乙?；?膦絲菌素濃度，有增加的脫乙?；饔蒙伸⒔z菌素(表7)。
表7通過deac2基因產(chǎn)物進(jìn)行的N-乙?；被岬霓D(zhuǎn)化
其中給出了所應(yīng)用的N-乙酰化氨基酸的濃度和由脫乙?；饔眯纬傻陌被?。
附圖1介導(dǎo)N-乙酰基-PPT特異性脫乙酰酶活性的2.5kbSall/BamHI片段的限制性圖譜。deac1結(jié)構(gòu)基因的位置和方向以箭頭標(biāo)示(BP＝堿基對)。
附圖2用于deac基因在植物內(nèi)組成型表達(dá)的質(zhì)粒pPVCKDEAC1的圖譜。
附圖3用于deac基因在植物內(nèi)的絨氈層特異性表達(dá)的質(zhì)粒pPCVTDEAC1的圖譜。
附圖4質(zhì)粒pGK83的圖譜。
附圖5質(zhì)粒pMF9的圖譜。
用于專利程序的微生物保藏的國際承認(rèn)的布達(dá)佩斯條約國際表格赫徹斯特-舍林農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司 由本頁底部所注明的國際保藏機(jī)生化研究，H 872 N 構(gòu)根據(jù)7.1條款所簽發(fā)的原始保藏65926法蘭克福/Main 收據(jù)
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GCGCTGGTGG CCATGCGCGA CACGCTGCCC 480GGCGAAGTAA TGCTGATCTT CCAGCCGGCC GAGGAAGGCG CGCCGCCGCC GGAGCAGGGC 540GGTGCCGAGC TGATGCTCAA GGAGGGGCTG TTCAAGGAGT TCAAGCCGGA GGCGGTGTTC 600GGCCTGCACG TGTTCTCCAG CGTCCAGGCC GGGCAGATCG CCGTGCGCGG CGGCCCGCTG 660ATGGCCGCCT CCGACCGCTT CGCCATCACC GTCAACGGCC GCCAGACCCA TGGCTCGGCG 720CCCTGGAACG GCATCGATCC GATTGTCGCC GCCTCCGACC TGATCGGCAC CGCGCAGACC 780ATCGTCAGCC GCCGCGCCAA CCTGTCCAAG CAGCCGGCGG TGCTGACCTT CGGCGCGATC 840AAGGGCGGCA TCCGCTACAA CATCATCCCC GACTCGGTGG AGATGGTCGG CACCATCCGC 900ACCTTCGACC CGGACATGCG CAAGCAGATC TTCGCCGACT TGCGCAACGT CGCCGAGCAC 960ACCGCTGCCG CATGGCGCCA CCGCCACCAC CGACATCTAC GAGAAGGACG GCAACCCGGC 1020CACGGTCAAC GACCCGGCGC TGACCGCGCG CATGCTGCCC AGCCTGCAGG CCGTGGTCGG 1080CAAGGACAAC GTCTACGAGC CGCCGCTGCA GATGGGCTCG GAGGACTTCT CGCTGTATGC 1140GCAGCAGGTG CCGGCGATGT TCTTCTTCGT CGGCTCCACC GGCGCGGGCA TCGACCCGGC 1200CACCGCGCCC AGCAACCACT CGCCGAAGTT CCTGCTCGAC GAGAAGGCGC TGGACGTGGG 1260CCTGCGCGCG CTGCTGCAGG TGTCGCTGGA CTATCTGCAC GGTGGCAAGG CGGGGTGACC 1320CCTGCCAGTA TCGTGCCCCC GATACGGAAG AAGGACCTCC CATGA 13652)關(guān)于SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度454個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..454(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ile Arg Lys Thr Val Leu Leu Thr Ala Leu Ser Cys Ala Leu Ala1 5 10 15Ser Ala Thr Ala Thr Ala Ala Glu Gly Gln Arg Pro Glu Val Glu Ala20 25 30Ala Ala Ala Arg Leu Gln Arg Gln Val Val Glu Trp Arg Arg Asp Phe35 40 45His Gln His Pro Glu Leu Ser Asn Arg Glu Val Arg Thr Ala Ala Lys50 55 60Val Ala Glu Arg Leu Arg Ala Met Gly Leu Gln Pro Gln Thr Gly Val65 70 75 80Ala Val His Gly Val Val Ala Ile Ile Lys Gly Ala Leu Pro Gly Pro85 90 95Lys Ile Ala Leu Arg Ala Asp Met Asp Ala Leu Pro Val Thr Glu Gln100 105 110Thr Gly Leu Pro Phe Ala Ser Thr Ala Thr Ala Glu Tyr Arg Gly Glu115 120 125Lys Val Gly Val Met His Ala Cys Gly His Asp Ala His Thr Ala Thr130 135 140Leu Leu Gly Val Ala Asp Ala Leu Val Ala Met Arg Asp Thr Leu Pro145 150 155 160Gly Glu Val Met Leu Ile Phe Gln Pro Ala Glu Glu Gly Ala Pro Pro165 170 175Pro Glu Gln Gly Gly Ala Glu Leu Met Leu Lys Glu Gly Leu Phe Lys180 185 190Glu Phe Lys Pro Glu Ala Val Phe Gly Leu His Val Phe Ser Ser Val195 200 205Gln Ala Gly Gln Ile Ala Val Arg Gly Gly Pro Leu Met Ala Ala Ser210 215 220Asp Arg Phe Ala Ile Thr Val Asn Gly Arg Gln Thr His Gly Ser Ala225 230 235 240Pro Trp Asn Gly Ile Asp Pro Ile Val Ala Ala Ser Asp Leu Ile Gly245 250 255Thr Ala Gln Thr Ile Val Ser Arg Arg Ala Asn Leu Ser Lys Gln Pro260 265 270Ala Val Leu Thr Phe Gly Ala Ile Lys Gly Gly Ile Arg Tyr Asn Ile275 280 285Ile Pro Asp Ser Val Glu Met Val Gly Thr Ile Arg Thr Phe Asp Pro290 295 300Asp Met Arg Lys Gln Ile Phe Ala Asp Leu Arg Asn Val Ala Glu His305 310 315 320Thr Ala Ala Ala Trp Arg His Arg His His Arg His Leu Arg Glu Gly325 330 335Arg Gln Pro Gly His Gly Gln Arg Pro Gly Ala Asp Arg Ala His Ala340 345 350Ala Gln Pro Ala Gly Arg Gly Arg Gln Gly Gln Arg Leu Arg Ala Ala355 360 365Ala Ala Asp Gly Leu Gly Gly Leu Leu Ala Val Cys Ala Ala Gly Ala370 375 380Gly Asp Val Leu Leu Arg Arg Leu His Arg Arg Gly His Arg Pro Gly385 390 395 400His Arg Ala Gln Gln Pro Leu Ala Glu Val Pro Ala Arg Arg Glu Gly405 410 415Ala Gly Arg Gly Pro Ala Arg Ala Ala Ala Gly Val Ala Gly Leu Ser420 425 430Ala Arg Trp Gln Gly Gly Val Thr Pro Ala Ser Ile Val Pro Pro Ile435 440 445Arg Lys Lys Asp Leu Pro4502)關(guān)于SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度1273個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1..1273(xi)序列描述SEQ ID NO3ATGGCCTTGC TGCAGGAGCT GCTGGACAGC GCACCCGAGA TCACCGCGCT GCGCCGCGAC 60ATACATGCCC ATCCCGAACT GTGCTTCGAG GAACTGCGCA CCGCCGACCT GGTGGCCCGG120CAGCTCGAAG GCTGGGGCAT TGCCGTGCAC CGCGGCCTGG GCCGCACGGG CGTGGTGGGC180ACCATCCACG GCCGTGACGG CGGCGCCAGC GGCCGGGCCA TCGGGCTGCG CGCCGACATG 240GACGCCCTGC CCATGCAGGA GTTCAACACC TTCGAGCACG CCAGCCGCCA CGCCGGAAAA 300ATGCATGCCT GCGGACATGA CGGCCATGTC GCCATGCTGC TGGCCGCCGC GCAGTACCTG 360GCCGTGCACC GCGACAGCTT CGAGGGCACG GTGCACCTGA TCTTCCAGCC GGCCGAAGAG 420GGCGGCGGCG GGGCGCGCGA GATGGTCGAG GACGGCCTGT TCACCCAGTT CCCCATGCAG 480GCCGTGTTCG GCATGCACAA CTGGCCGGGC ATGAAGGCCG GCACCATGCC GTGGGCCCCG 540GGCCCGGCCA TGGCGTCGAG CAACGAGTTC CGCATCGTCG TGCGCGGCAA GGGCGGCCAC 600GCGGCCATGC CGCACATGGT GATCGACCCG CTGCCCGTGG CGGCCCAGCT CATCCTGGGC 660CTGCAGACCA TCGTCAGCCG CAACGTCAAG CCCATCGAGG CGGGCGTGGT CTCGGTCACC 720ATGGTCCATG CGGGCGAGGC CACGAACGTG GTGCCCGACA GCGTGGAGCT GCAGGGCACG 780GTGCGCACCT TCACGCTGGA GGTGCTGGAC CTGATCGAGC GGCGCATGAA GGCCCTGGCC 840GAGAGCATCT GCGCGGCGCA TGACACGCGC TGCGAGTTCG AGTTCGTGCG CAACTACCCG 900CCCACCATCA ACTCCGCCCC GGAGGCCGAG TTCGCACGCC GCGTCATGGC CGAGGTCGTG 960GGCGAGGCCA ACGTGCTGCC CCAGGAGCCG TCCATGGGCG CCGAGGACTT CGCCTTCATG 1020CTGCTGGAAA AGCCCGGCGC CTACTGCTTC ATCGCCAATG GCGACGGCGA CCACCGCGCC 1080ATCGGCCACG GCGGCGGTCC CTGCACGCTG CACAACCCCA GCTACGACTT CAACGACCAG 1140CTGATTCCGC AGGGCGCCAC GTTCTGGGTG AAGCTGGCCC AGCGCTGGCT GAGCGAGCCC 1200ACGCGCTGAG GCCTTGCGGG GTCCGGCCGA CACCGGCATG TCACACACCG CACCTAGCAT 1260GCGGTCCCTG TGA 12732)關(guān)于SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度402個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..402(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Ala Leu Leu Gln Glu Leu Leu Asp Ser Ala Pro Glu Ile Thr Ala1 5 10 15Leu Arg Arg Asp Ile His Ala His Pro Glu Leu Cys Phe Glu Glu Leu20 25 30Arg Thr Ala Asp Leu Val Ala Arg Gln Leu Glu Gly Trp Gly Ile Ala35 40 45Val His Arg Gly Leu Gly Arg Thr Gly Val Val Gly Thr Ile His Gly50 55 60Arg Asp Gly Gly Ala Ser Gly Arg Ala Ile Gly Leu Arg Ala Asp Met65 70 75 80Asp Ala Leu Pro Met Gln Glu Phe Asn Thr Phe Glu His Ala Ser Arg85 90 95His Ala Gly Lys Met His Ala Cys Gly His Asp Gly His Val Ala Met100 105 110Leu Leu Ala Ala Ala Gln Tyr Leu Ala Val His Arg Asp Ser Phe Glu115 120 125Gly Thr Val His Leu Ile Phe Gln Pro Ala Glu Glu Gly Gly Gly Gly130 135 140Ala Arg Glu Met Val Glu Asp Gly Leu Phe Thr Gln Phe Pro Met Gln145 150155 160Ala Val Phe Gly Met His Asn Trp Pro Gly Met Lys Ala Gly Thr Met165 170 175Pro Trp Ala Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser Ser Asn Glu Phe Arg Ile180 185 190Val Val Arg Gly Lys Gly Gly His Ala Ala Met Pro His Met Val Ile195 200 205Asp Pro Leu Pro Val Ala Ala Gln Leu Ile Leu Gly Leu Gln Thr Ile210 215 220Val Ser Arg Asn Val Lys Pro Ile Glu Ala Gly Val Val Ser Val Thr225 230 235 240Met Val His Ala Gly Glu Ala Thr Asn Val Val Pro Asp Ser Val Glu245 250 255Leu Gln Gly Thr Val Arg Thr Phe Thr Leu Glu Val Leu Asp Leu Ile260 265 270Glu Arg Arg Met Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile Cys Ala Ala His Asp275 280 285Thr Arg Cys Glu Phe Glu Phe Val Arg Asn Tyr Pro Pro Thr Ile Asn290 295 300Ser Ala Pro Glu Ala Glu Phe Ala Arg Arg Val Met Ala Glu Val Val305 310 315 320Gly Glu Ala Asn Val Leu Pro Gln Glu Pro Ser Met Gly Ala Glu Asp325 330 335Phe Ala Phe Met Leu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Tyr Cys Phe Ile Ala340 345 350Asn Gly Asp Gly Asp His Arg Ala Ile Gly His Gly Gly Gly Pro Cys355 360 365Thr Leu His Asn Pro Ser Tyr Asp Phe Asn Asp Gln Leu Ile Pro Gln370 375 380Gly Ala Thr Phe Trp Val Lys Leu Ala Gln Arg Trp Leu Ser Glu Pro385 390 395 400Thr Arg
權(quán)利要求
1.編碼具有N-乙酰基-膦絲菌素脫乙酰酶生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的DNA分子。
2.選自下列分子組的、編碼具有N-乙?；?膦絲菌素脫乙酰酶生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的DNA分子a)編碼具有SEQ ID No 2中所給定的氨基酸序列的蛋白質(zhì)及其片段和/或衍生物的DNA分子；b)編碼SEQ ID No 1中所給定的核苷酸序列的DNA分子或在遺傳密碼簡并性范圍內(nèi)偏離該序列的一些序列；c)編碼具有SEQ ID No 4中所給定的氨基酸序列的蛋白質(zhì)及其片段和/或衍生物的DNA分子；d)編碼SEQ ID No 3中所給定的核苷酸序列的DNA分子或在遺傳密碼簡并性范圍內(nèi)偏離該序列的一些序列。
3.具有高度N-乙酰基-膦絲菌素脫乙酰酶活性的微生物的分離方法。
4.寡養(yǎng)單胞菌屬種(DSM9734)和食酸叢毛單胞菌(DSM11070).
5.含有按照權(quán)利要求1的DNA分子的植物細(xì)胞或植物。
6.通過脫乙酰酶基因的特異性表達(dá)，制備其局部可被有目的地破壞了的植物的方法。
7.通過脫乙酰酶基因的特異性表達(dá)，制備雄性或雌性不育植物的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼脫乙酰酶、或具有脫乙酰酶生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的DNA分子,被本發(fā)明DNA分子轉(zhuǎn)化了的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。這些分子可以用于通過脫乙酰酶基因的特異性表達(dá),制備局部可被有目的性破壞的植物,也即雄性或雌性不育植物。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1240476SQ97180605
公開日2000年1月5日 申請日期1997年12月3日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月16日
發(fā)明者K·巴特施, G·克里特, I·布羅爾, A·普勒 申請人:赫徹斯特-舍林農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司