專利名稱：標(biāo)記基因可從其上選擇性地去除的用于將基因?qū)胫参锏妮d體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用遺傳工程方法將所需基因?qū)胫参锏玫睫D(zhuǎn)基因植物的新載體。
背景技術(shù)：
利用遺傳工程對(duì)微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化目前已被應(yīng)用于生產(chǎn)用作藥品和諸如此類的生理活性物質(zhì)，因此對(duì)工業(yè)有巨大的貢獻(xiàn)。在植物育種領(lǐng)域，工業(yè)化應(yīng)用遺傳工程落后的原因是植物的生命周期比微生物等的生命周期長(zhǎng)得多。但是，由于這一技術(shù)能使所需基因直接導(dǎo)入用于育種的植物，它比需要重復(fù)雜交的經(jīng)典育種方法具有下面的優(yōu)點(diǎn)(a)能夠只導(dǎo)入一個(gè)需要改進(jìn)的特征；(b)能夠?qū)氤酥参镆酝獾钠渌锓N的特征(如微生物等)；和(c)能夠大大縮短育種周期。所以，人們已經(jīng)廣泛深入地研究了植物育種的遺傳工程方法。
具體地說(shuō)，轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)需要下面三個(gè)步驟(1)將所需基因?qū)胫参锛?xì)胞(包括將它導(dǎo)入染色體、核酸等)；(2)選擇只由其中已經(jīng)導(dǎo)入所需基因的細(xì)胞組成的植物組織；和(3)從選擇的植物組織再生植株。另外，其中在選擇已經(jīng)導(dǎo)入所需基因的組織時(shí)，通常使用可選擇的標(biāo)記基因。也就是說(shuō)，通常把可選擇標(biāo)記基因與所需基因一起導(dǎo)入植物細(xì)胞，通過在導(dǎo)入細(xì)胞以及起源于這些細(xì)胞的組織中表達(dá)可選擇標(biāo)記基因顯示的可鑒定的特征作為所需基因?qū)氲闹笜?biāo)。結(jié)果是，在至今通過遺傳工程方法轉(zhuǎn)化的植物的所有情況中，除了所需因外，也導(dǎo)入和表達(dá)了可選擇標(biāo)記基因。
但是，對(duì)于用作可選擇標(biāo)記的產(chǎn)物，只有幾個(gè)基因?qū)θ梭w的安全性已經(jīng)證實(shí)。因此，甚至是利用可選擇標(biāo)記基因?qū)肓擞杏玫奶匦陨a(chǎn)的西紅柿或土豆，只要表達(dá)了可選擇標(biāo)記基因，當(dāng)將它們作為可食產(chǎn)品提供時(shí)將要承擔(dān)許多障礙，包括顧客中莫名其妙的不安。
另外，在選擇導(dǎo)入基因的組織后，甚至對(duì)研究植物育種的研究人員來(lái)說(shuō)，可選擇標(biāo)記基因的表達(dá)將引起相當(dāng)大的障礙，那是因?yàn)橐呀?jīng)通過可選擇標(biāo)記基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物再次導(dǎo)入另一個(gè)基因時(shí)，該基因的導(dǎo)入就不能利用同一可選擇標(biāo)記基因來(lái)進(jìn)行了。換句話說(shuō)，因?yàn)榭蛇x擇標(biāo)記基因已經(jīng)存在于植物中，則它總會(huì)在植物中表達(dá)，而不管新的所需基因是否與可選擇標(biāo)記基因一起導(dǎo)入植物中。所以，這樣的可選擇標(biāo)記基因不能再用作新的所需基因?qū)氲闹笜?biāo)。結(jié)果是，在某些植物中重復(fù)基因轉(zhuǎn)移的次數(shù)自然地受到用于植物中的不同可選擇標(biāo)記基因的數(shù)目的限制。但是，至今可得的可選擇標(biāo)記基因的種類不是很多。另外，并不是所有可選擇標(biāo)記基因在目標(biāo)植物中都可使用。
為了解決上述問題從而有效地生產(chǎn)完全不受可選擇標(biāo)記基因影響的導(dǎo)入了基因的組織或植物，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了新的載體以用于將所需基因?qū)胫参锛?xì)胞(日本專利申請(qǐng)?zhí)朒07-313432)。這一載體含有所需基因、作為可選擇標(biāo)記基因的形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因和可去除的DNA元件。由于所處位置，其中形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因能完整地與可去除的DNA元件一起起作用，而所需基因則不與可去除的DNA元件一起完整地起作用。當(dāng)利用這一載體將所需基因?qū)胫参镏袝r(shí)，可選擇標(biāo)記基因是可以從它存在和發(fā)揮功能的DNA中去除的。在可選擇標(biāo)記基因通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)后，以一定比例失去功能，由導(dǎo)入了該基因的植物細(xì)胞衍生的組織的形態(tài)學(xué)變化可以檢測(cè)可選擇標(biāo)記基因的表達(dá)和其功能的丟失。也就是說(shuō)，由這一可選擇標(biāo)記基因在其中表達(dá)的細(xì)胞所衍生的組織顯示了某種不正常的形態(tài)，而且，當(dāng)通過去除可選擇標(biāo)記基因而失去其功能的細(xì)胞(即只導(dǎo)入了所需基因的細(xì)胞)從其后的組織產(chǎn)生時(shí)，從得到的細(xì)胞再生了具有正常形態(tài)的組織。因此，利用這一載體，通過簡(jiǎn)單地重復(fù)培養(yǎng)導(dǎo)入基因的細(xì)胞和通過肉眼選擇培養(yǎng)得到的組織就可以生產(chǎn)含有只導(dǎo)入有所需基因的細(xì)胞的植物組織以及隨后的植物個(gè)體。
但是，甚至在本發(fā)明人開發(fā)的這一載體中可選擇標(biāo)記基因的去除也是不能自由控制的。因此，如果可去除的DNA元件的能力較強(qiáng)的話，可選擇標(biāo)記基因?qū)⒖杀环浅？斓厝コ＠?，在與所需基因一起導(dǎo)入植物細(xì)胞后，可選擇標(biāo)記基因在它表達(dá)之前可被立即去除。在這種情況下，可以得到只導(dǎo)入有所需基因的細(xì)胞構(gòu)成的組織；但是，未發(fā)生有基因?qū)氲慕M織的導(dǎo)入了可選擇標(biāo)記基因的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果是未篩選到這樣的組織。
另外，如果可選擇標(biāo)記基因的去除是可以自由控制的，只導(dǎo)入了所需基因的細(xì)胞的產(chǎn)生和起源于這樣的細(xì)胞的植物組織的產(chǎn)生是可同時(shí)發(fā)生或適當(dāng)控制的，所以，利用這一載體在實(shí)踐中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物是非常方便的。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于在植物中導(dǎo)入基因的載體，它含有可選擇標(biāo)記基因，其中在它表達(dá)后，通過從DNA如染色體等中去除可選擇標(biāo)記基因就可以選擇性地去除與所需基因一起導(dǎo)入植物細(xì)胞的可選擇標(biāo)記基因的功能，可選擇標(biāo)記基因存在于該DNA中并在其中起作用，通過由導(dǎo)入基因的植物細(xì)胞衍生的組織的形態(tài)學(xué)變化可以檢測(cè)可選擇標(biāo)記基因的功能的表達(dá)和丟失。
本發(fā)明的公開通過利用形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因作為可選擇標(biāo)記基因，同時(shí)將可去除DNA元件置于可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下構(gòu)建載體可以完成本發(fā)明的目的，其中對(duì)形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因的定位使它不與可去除DNA元件完整地起作用，其中所需基因的定位使它不與可去除DNA元件一起完整地起作用。
下面將詳細(xì)地討論本發(fā)明。
如本文所用，形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因是誘導(dǎo)組織的形態(tài)學(xué)異常分化如矮小、頂端優(yōu)勢(shì)的破壞、色素的變化、冠狀蟲癭的形成、有絨毛的根、波紋狀葉子等的形成。據(jù)報(bào)道，各種形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因如細(xì)胞分裂素合成基因(如ipt(異戊烯基轉(zhuǎn)移酶)基因(A.C.Smigocki,L.D.Owens,Proc,Natl.Acad.Sc.USA,85:5131,1988)),iaaM(色氨酸單加氧酶)基因(H.J.Klee等人，Genes &Development,1:86,1987)，基因5(H.Koerber等人，EMBO雜志，10:3983,1991)，基因6b(P.J.J.Hooyaas等人，Plant Mol.Biol.,11:791,1988),rol基因如rolA到D(F.F.White等人，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol),164:33,1985)等等，存在于在各種植物中誘導(dǎo)腫瘤或畸胎瘤(即形成不定枝或不定根)的土壤桿菌屬等的細(xì)茵中。另外，據(jù)報(bào)道還有薩氏假單胞茵中的iaaL(吲哚乙酸賴氨酸合成酶)基因和各種植物中的同源盒基因，光敏色素基因等等。
任何這些基因可以用于本發(fā)明。其中，在本發(fā)明中誘導(dǎo)頂端優(yōu)勢(shì)的破壞的ipt基因和誘導(dǎo)從絨毛根再生的植物的絨毛根、矮小、波紋狀葉子等的rol基因是優(yōu)選的可選擇標(biāo)記基因，因?yàn)樵诟鞣N形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因中它們誘導(dǎo)可鑒定的形態(tài)學(xué)異常。
另外，可以設(shè)計(jì)這些可選擇標(biāo)記基因的組合，以使得在特定的其中導(dǎo)入了可選擇標(biāo)記基因的植物中再分化出特異結(jié)構(gòu)如不定莖和不定根等等。在本發(fā)明中，根據(jù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的條件，例如待導(dǎo)入基因的植物的種類，可以使用形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因的組合。
本文所用的可去除DNA元件是指可以從該DNA元件在其中存在和起作用的DNA中去除的DNA序列元件。在植物中，已知存在于染色體中的轉(zhuǎn)座子就是這種元件。轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)、活性和行為已經(jīng)差不多完全被鑒定了。轉(zhuǎn)座子要起作用，基本上需要兩個(gè)成分，從轉(zhuǎn)座子中存在的基因表達(dá)的酶，它催化轉(zhuǎn)座子本身的切除和轉(zhuǎn)座(轉(zhuǎn)座酶)，以及存在于轉(zhuǎn)座子終端區(qū)的DNA結(jié)合序列，轉(zhuǎn)座酶在此基礎(chǔ)上起作用。通過這些元件，轉(zhuǎn)座子從它存在的染色體中被切除，然后通常轉(zhuǎn)座到該DNA的新位置。但是，該轉(zhuǎn)座子同時(shí)以一定的比例丟失而不轉(zhuǎn)座。本發(fā)明就利用了轉(zhuǎn)座子的這種轉(zhuǎn)座錯(cuò)誤。
轉(zhuǎn)座子可以是兩種類型中的一種，自發(fā)轉(zhuǎn)座子或非自發(fā)轉(zhuǎn)座子。自發(fā)轉(zhuǎn)座子保留了兩個(gè)元件，轉(zhuǎn)座酶和DNA結(jié)合序列。在自發(fā)轉(zhuǎn)座子中，轉(zhuǎn)座酶表達(dá)并結(jié)合到DNA結(jié)合序列上起作用，從而從染色體中自發(fā)切除轉(zhuǎn)座子。非自發(fā)轉(zhuǎn)座子保留了終端DNA結(jié)合序列，轉(zhuǎn)座酶與該序列結(jié)合起作用。在非自發(fā)轉(zhuǎn)座子中，轉(zhuǎn)座酶基因突變以致轉(zhuǎn)座酶不表達(dá)，所以轉(zhuǎn)座子不能從染色體中自發(fā)切除。但是，當(dāng)將轉(zhuǎn)座酶用于來(lái)自自發(fā)轉(zhuǎn)座子或來(lái)自獨(dú)立的轉(zhuǎn)座酶基因的非自發(fā)轉(zhuǎn)座子時(shí)，非自發(fā)轉(zhuǎn)座子與自發(fā)轉(zhuǎn)座子的行為相似。
因此，在本發(fā)明中可以使用自發(fā)和非自發(fā)的轉(zhuǎn)座子。例如，通過在其中插入形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因和從自發(fā)轉(zhuǎn)座子得到或合成的轉(zhuǎn)座酶基因后就可以使用非自發(fā)轉(zhuǎn)座子。
自發(fā)轉(zhuǎn)座子的例子包括從玉米中分離的Ac和Spm(A.Gierl和H.Saedler,植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol),19:39,1992)。通過用限制性內(nèi)切酶Sau3A消化玉米染色體wx-m7座位可以得到Ac(U.Behrens等人，Mol.Gen.Genet.,194:346,1984)。在植物轉(zhuǎn)座子中這一轉(zhuǎn)座子是分析得最多的。事實(shí)上，已經(jīng)確定了該DNA序列(M.Mueller-Neumann等人，Mol.Gen.Genet.198:19,1984)。同時(shí)，非自發(fā)轉(zhuǎn)座子的例子包括通過分別刪除Ac和Spm的內(nèi)部區(qū)得到的Ds和dSpm(H.-P.Doring和P.Starlinger,Ann.Rev.Genet.,20:175,1986)和那些從玉米以外的許多植物中分離的那些，這些植物例如金魚草和空心菜等等(例如，Y.Inagaki等人，植物細(xì)胞(Plant Cell),6:375,1994)。當(dāng)將這些轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入外源植物的染色體中時(shí)，同時(shí)從染色體中切除了這些轉(zhuǎn)座子并轉(zhuǎn)座(例如，B.Baker等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA,83:4844,1986)。
另一個(gè)不存在于植物中的可去除的DNA元件，是起源于位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)的元件。位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)包括兩個(gè)元件，具有特異性DNA序列的重組位點(diǎn)(相應(yīng)于本發(fā)明的可去除DNA元件)和與DNA序列特異結(jié)合并且如果存在兩個(gè)或更多序列時(shí)催化這些DNA序列之間的重組的酶(重組酶)。當(dāng)兩個(gè)DNA序列以同一方向位于同一DNA分子的給定間隔中時(shí)，可從DNA分子如質(zhì)粒和染色體等中切除這些DNA序列支持的區(qū)域。當(dāng)兩個(gè)DNA序列以相反的方向定位于同一DNA分子上時(shí)，將這些DNA序列支持的區(qū)域進(jìn)行顛倒。本發(fā)明利用了前面的切除過程。通過位點(diǎn)特異的重組系統(tǒng)，同源重組的結(jié)果是重組位點(diǎn)內(nèi)發(fā)生切除和倒位，這與利用轉(zhuǎn)座子的機(jī)制不同。已知重組基因不一定與重組位點(diǎn)存在于同一DNA分子上。重組酶基因只需要存在于同一細(xì)胞中并表達(dá)以便去除或顛倒兩個(gè)DNA序列支持的區(qū)域(N.L.Craig,Annu.Rev.Genet.,22:77,1988)。
目前，在例如噬茵體、細(xì)菌(例如大腸桿茵)和酵母等的微生物中已經(jīng)鑒定了位點(diǎn)特異的重組系統(tǒng)。其例子包括Cre/lox系統(tǒng)、pSRl系統(tǒng)、FLP系統(tǒng)、cer系統(tǒng)和fim系統(tǒng)(例如，N.L.Craig,Annu.Rev.Genet.,22:77,1988)。當(dāng)從利用衍生于P1噬茵體的Cre/lox系統(tǒng)的微生物中分離的位點(diǎn)特異的重組系統(tǒng)(國(guó)際公開號(hào)WO93/01283)被導(dǎo)入與衍生這一系統(tǒng)的有機(jī)體不同的有機(jī)體(包括植物)中時(shí)，其行為與原始有機(jī)體中一樣。同時(shí)根據(jù)本發(fā)明可以使用酵母(zygosaccharomyces rouxii)的位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)(pSRl系統(tǒng)(H.Matsuzaki等人，細(xì)菌學(xué)雜志，172:610,1990))。這一pSRl系統(tǒng)也可以在更高等的植物中保持其固有功能(H.Onouchi等人，Nucleic Acid Res.,19:6373,1991)。
根據(jù)本發(fā)明，將這一可去除的DNA元件置于可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下。
亦即，可誘導(dǎo)啟動(dòng)子存在于范圍從原核生物有機(jī)體(例如細(xì)菌等)到真核生物有機(jī)體(例如酵母、真菌、高等植物和哺乳動(dòng)物等)之間的所有有機(jī)體中的結(jié)構(gòu)基因的上游，這些元件可單獨(dú)地或相互協(xié)調(diào)來(lái)控制某一基因或基因組的表達(dá)。例如，有時(shí)它們對(duì)應(yīng)于各個(gè)個(gè)體的分化和生長(zhǎng)時(shí)期或偶爾依賴于熱、光、金屬和諸如此類的環(huán)境因子來(lái)進(jìn)行基因表達(dá)的開和關(guān)。根據(jù)本發(fā)明，利用具有如此功能的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，在其下游的可去除的DNA元件控制表達(dá)或可移動(dòng)性。
目前已知的這種可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的例子包括那些化學(xué)物質(zhì)應(yīng)答的啟動(dòng)子，如谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶Ⅰ系統(tǒng)基因啟動(dòng)子(未審
公開日本專利申請(qǐng)?zhí)朒05-268965)、谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶Ⅱ系統(tǒng)(GST-Ⅱ)基因啟動(dòng)子(國(guó)際公開號(hào)WO93/01294)、Tet阻遏物融合類型花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(C.Gatz等人，Mol.Gen.Genet.,227:229,1991)、Lac操縱子/阻遏物系統(tǒng)啟動(dòng)子(R.J.Wilde等人，EMBO雜志，11:1251,1992)、alcR/alcA系統(tǒng)啟動(dòng)子(國(guó)際公開號(hào)WO94/03619)、糖皮質(zhì)激素系統(tǒng)啟動(dòng)子(Takushi Aoyama，蛋白質(zhì)、核酸和酶(Protein,Nucleic acid and Enzyme),41:2559,1996)等,那些熱應(yīng)答啟動(dòng)子，如hsp80啟動(dòng)子(未審
公開日本專利申請(qǐng)?zhí)朒05-276951)等和那些光應(yīng)答啟動(dòng)子，如核酮糖二磷酸羧化酶小亞基基因(rbcS)啟動(dòng)子(R.Fluhr等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:2358,1986)、果糖-1,6-二磷酸酶基因啟動(dòng)子(PCT國(guó)際公開的日本再公開專利申請(qǐng)?zhí)朒07-501921)、捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子(未審
公開日本專利申請(qǐng)?zhí)朒05-89)等。
在這些啟動(dòng)子中，在高等植物中的rbcS啟動(dòng)子作為可誘導(dǎo)啟動(dòng)子已經(jīng)得到最深入的研究并且Chua等人對(duì)其有更詳細(xì)的分析(例如，參見Matsuoka,Plant Cell Technology Supplement,3:552,1991)。由于這一原因，在本發(fā)明的實(shí)施例1中利用這一啟動(dòng)子，但是這一因子的調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)于光的基因表達(dá)的機(jī)制還沒有確立。另一方面那些應(yīng)答化學(xué)物質(zhì)的啟動(dòng)子，通常包括GST-Ⅱ基因啟動(dòng)子，其通過化學(xué)物質(zhì)的量可以相對(duì)自由地控制基因表達(dá)的誘導(dǎo)，因此在實(shí)際使用中，與不得不通過控制熱或光的來(lái)控制基因表達(dá)的熱-或光應(yīng)答啟動(dòng)子相比，他們是具有優(yōu)勢(shì)的。
在本發(fā)明中，可以將形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因插入到某一個(gè)位置上，在這一位置上該基因與可去除的DNA元件一起切除。例如，當(dāng)將轉(zhuǎn)座子用作可去除DNA元件時(shí)，形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因可以插入到不影響轉(zhuǎn)座子的切除的位置上，該位置在轉(zhuǎn)座子基因啟動(dòng)子區(qū)的上游但在轉(zhuǎn)座酶結(jié)合的終端區(qū)的下游。當(dāng)使用pSRl系統(tǒng)時(shí)，可以將形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因插入到不抑制重組酶表達(dá)的重組位置支持的區(qū)域中的任何位置上。
可以將本發(fā)明的載體用于任何通過遺傳工程方法能將基因?qū)肫渲械闹参铩８鶕?jù)本發(fā)明，所需基因可以是賦予農(nóng)業(yè)上優(yōu)良特征的任何基因和允許進(jìn)行基因表達(dá)機(jī)制等的研究的任何基因，雖然農(nóng)業(yè)上優(yōu)良的特征并非必需。
關(guān)于所需基因的啟動(dòng)子和終止子，只要他們?cè)谥参镏杏泄δ?，?duì)其使用沒有任何限制。啟動(dòng)子的例子包括花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子(J.T.Odell等人，自然(倫敦)，313:810,1985)、胭脂堿合成酶的啟動(dòng)子(W.H.R.Langridge等人，Plant Cell Rep.4:355,1985)等。終止子的例子包括胭脂堿合成酶的多聚腺苷酸化信號(hào)(A.Depicker等人，J.Mol.Appl.Gen.,1:561,1982)、章魚堿合成酶的多聚腺苷酸化信號(hào)(J.Gielen等人，EMBO J.,3:835,1984)等等。
另外，如果序列已知，通過克隆cDNA或基因組DNA，或通過化學(xué)合成可以得到本發(fā)明的基因，即DNA。
通過感染植物的病毒或細(xì)菌可以間接在植物細(xì)胞中導(dǎo)入本發(fā)明的載體(I.Potrykus,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,42:205,1991)。病毒的例子包括花椰菜花葉病毒、雙粒病毒組、煙草花葉病毒、菠蘿花葉病毒(bromomosaic virus)等。細(xì)菌的例子包括根癌土壤桿菌(下文中稱為根癌土壤桿菌)和發(fā)根土壤桿菌等。已知通常用土壤桿菌屬的細(xì)菌感染雙子葉植物。最近，也已經(jīng)有通過用他們感染單子葉植物，在這些植物中導(dǎo)入基因的報(bào)道(例如，國(guó)際公開號(hào)WO94/00977)。
通過物理和化學(xué)方法如微注射、電穿孔、聚乙二醇方法、融合方法和高速?gòu)椀罎B透等可以在植物細(xì)胞中直接導(dǎo)入本發(fā)明的載體(I.Potrykus、Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,42:205,1991)。由于它們對(duì)土壤桿菌的感染有抗性，通常利用土壤桿菌屬的間接導(dǎo)入方法不能用于許多單子葉植物和雙子葉植物，而上面提到的直接導(dǎo)入方法對(duì)這些植物是有效的。
在本發(fā)明中，表達(dá)形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因使細(xì)胞生理異常。生理異常包括在植物細(xì)胞中植物生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)，結(jié)果是使含有形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因的細(xì)胞的增殖和分化混亂后誘導(dǎo)出各種形態(tài)學(xué)異常。例如，頂端優(yōu)勢(shì)破壞形成的紊亂的莖的聚集(極端多莖的表現(xiàn)型)和絨毛根等性狀可以起源于導(dǎo)入了形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因的細(xì)胞。這一表現(xiàn)型是通過上面提到的細(xì)胞的不正常增殖和分化形成的。所以，這一形態(tài)學(xué)異常組織只由含有這一基因的細(xì)胞組成。因此，如果利用這一基因作為可選擇標(biāo)記基因與所需基因一起構(gòu)建載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中，培養(yǎng)該細(xì)胞，然后只通過肉眼篩選起源于植物細(xì)胞的形態(tài)學(xué)異常組織就可以選擇只由導(dǎo)入了可選擇標(biāo)記基因和所需基因的細(xì)胞組成的組織。
另外，根據(jù)本發(fā)明可將形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因摻入到一個(gè)特定位置上，在該位置上它與可誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下的可去除DNA元件完整地起作用。當(dāng)利用具有這種構(gòu)建的載體把基因?qū)胫参镏袝r(shí)，根據(jù)所用的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的情況對(duì)轉(zhuǎn)基因后的植物細(xì)胞可人工施加適當(dāng)?shù)拇碳ぃ鐭?、光和化學(xué)物質(zhì)等可表達(dá)可去除的DNA元件，隨著可去除DNA元件以一定的比例從其導(dǎo)入和發(fā)生作用的DNA分子上的除去，作為可選擇標(biāo)記基因的形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因也失去了其功能，同時(shí)不與該(形態(tài)學(xué)誘導(dǎo))基因完整起作用的所需基因仍然保留于同一DNA分子上并保持了其功能。因此，也就是說(shuō)，保留了那些其中僅導(dǎo)入了所需基因的細(xì)胞。
而且，由于該可選擇標(biāo)記基因的功能的丟失，即形異學(xué)異常誘導(dǎo)基因的功能的丟失是可以與導(dǎo)入該基因時(shí)所用的同樣的方式通過肉眼檢測(cè)到其形態(tài)學(xué)變化的，僅由其中可選擇標(biāo)記基因的功能已丟失的細(xì)胞組成的組織，即僅由其中所需基因已導(dǎo)入的細(xì)胞組成的組織可以被明確而容易地選擇出來(lái)。也就是說(shuō)，為了獲得只由這種細(xì)胞組成的組織，先培養(yǎng)導(dǎo)入了基因的細(xì)胞，并通過肉眼選擇表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)異常的組織，然后分離選擇出的組織，這種形態(tài)學(xué)異常例如由形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因的表達(dá)引起的多莖表現(xiàn)型和絨毛根等。接著，如果根據(jù)分離組織培養(yǎng)過程中使用的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子選擇性地給予適當(dāng)?shù)拇碳?，這時(shí)可從表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)異常的組織中獲得的表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)正常的組織，同樣也可以用內(nèi)眼選擇。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示在pNPI206構(gòu)建方案中直到制備pNPI201的步驟。
圖2顯示在pNPI206構(gòu)建方案中制備pNPI201到pNPI203的步驟。
圖3顯示在pNPI206構(gòu)建方案中制備pNPI203到pNPI204的步驟。
圖4顯示在pNPI206構(gòu)建方案中制備pNPI204到pNPI206的步驟。
圖5是pNPI206結(jié)構(gòu)中T-DNA區(qū)的限制酶圖譜。
圖6顯示了pNPI125構(gòu)建方案。
圖7顯示了pNPI128的構(gòu)建方案。
圖8顯示了在pNPI123構(gòu)建方案中直到制備pIPT2的步驟。
圖9顯示了在pNPI123構(gòu)建方案中制備pIPT2到pIPT3的步驟。
圖10顯示了在pNPI123構(gòu)建方案中制備pIPT3到pNPI4的步驟。
圖11顯示了在pNPI123構(gòu)建方案中制備pIPT4到pNPI123的步驟。
圖12顯示了在pNPI303構(gòu)建方案中制備pNPI200和pGlE7到pNPI301的步驟。
圖13顯示在pNPI303構(gòu)建方案中制備pNPI123和pNPI128到pIPT8的步驟。
圖14顯示了在pNPI303構(gòu)建方案中制備pNPI301和pIPT8到pNPI302的步驟。
圖15顯示了在pNPI303構(gòu)建方案中制備pNPI302到pNPI303的步驟。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式[實(shí)施例]在下面的實(shí)施例中，根據(jù)分子克隆，第二版(Sambrook等人，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，1989)的指導(dǎo)，或通過制造商的另外說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例11．構(gòu)建載體從日本專利申請(qǐng)?zhí)朒07-313432敘述的質(zhì)粒pNPI125中利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和EcoRⅠ切下酵母位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)(pSR1系統(tǒng))的重組酶基因(下文中稱為“R基因”)和與其連接的胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號(hào)，并將它們插入到pHSG398(從Takara Shuzo有限公司購(gòu)買)的XbaⅠ-EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間得到質(zhì)粒pNPI200。
另一方面，利用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ消化含有核酮糖二磷酸羧化酶小亞基基因啟動(dòng)子(rbcS-3B)的質(zhì)粒(從名古屋大學(xué)的Mamoru Sugita博士處得到)，利用T4聚合酶Ⅰ(大亞基)消化，以將所得的粘性末端形成平末端。然后，在得到的平末端之間插入5’-磷酸SalⅠ接頭得到質(zhì)粒pRBCS，利用限制性內(nèi)切酶SalⅠ從pRBCS切下rbcS-3B，并將它插入pNPI200的SalⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)間得到質(zhì)粒pNPI201。
同時(shí)，rbcS-3B是來(lái)源于西紅柿(蕃茄VFNTLA 1221)的光應(yīng)答的啟動(dòng)子。除了這一啟動(dòng)子，西紅柿有五個(gè)其它類似于rbcS的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子啟動(dòng)子(rbcS-1、-2、-3、-3A和-3C)，Sugita等人已經(jīng)分析了它們的表達(dá)方式(M.Sugita等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7104,1987)。
然后，利用限制性內(nèi)切酶PstⅠ和BamHⅠ消化質(zhì)粒pNPI201，利用T4聚合酶Ⅰ(大亞基)，通過消化將所得的粘性末端變成平末端，然后連接，得到質(zhì)粒pNPI202。利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ，從質(zhì)粒pNPI202中切下含有rbcS-3B、R基因和胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號(hào)的片段并將它們插入到pUC119(從Takara Shuzo有限公司購(gòu)買)的EcoRⅠ-HindⅢ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間以得到質(zhì)粒pNPI203，再次利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ從質(zhì)粒pNPI203中切出含rbcS-3B、R基因和胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號(hào)的片段并將它們插入日本專利申請(qǐng)?zhí)朒07-313432所述的質(zhì)粒pNPI128的EcoRⅠ-HindⅢ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間，得到質(zhì)粒pNPI204。
然后，在所得的質(zhì)粒pNPI204的HindⅢ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)中插入含有花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(CaMV35S)和與其連接的ipt基因的片斷，它們是利用限制性內(nèi)切酶HindⅢ從也是日本專利申請(qǐng)?zhí)朒07-313432中敘述的質(zhì)粒pNPI123中切下的，如此得到了質(zhì)粒pNPI205。
利用限制性內(nèi)切酶PstⅠ從質(zhì)粒pNPI205切下與CaMV35S啟動(dòng)子連接的ipt基因、R基因和與RbcS-3B連接的胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號(hào)和位于其兩末端的酵母位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的重組序列Rs，將它們插入用于把基因轉(zhuǎn)入到植物中(購(gòu)自TOYOBO有限公司)的載體質(zhì)粒pBI121(從TOYOBO有限公司購(gòu)買)上的SseⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。這樣就得到了所需的稱為質(zhì)粒pNPI206的載體。當(dāng)利用含有這一質(zhì)粒的根癌土壤桿茵感染植物時(shí)，在這種情況下，植物染色體中整合了存在于質(zhì)粒RB位點(diǎn)和LB位點(diǎn)之間的T-DNA區(qū)及從nptⅡ基因(新霉素磷酸化酶基因)到GUS基因(β-半乳糖苷酶基因)的約12.5kb的區(qū)域。
同時(shí)，在大腸桿茵JM109菌株中導(dǎo)入質(zhì)粒pNPI206，得到的菌株以大腸桿菌JM109(pNPI206)用于國(guó)際保藏[國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部，工業(yè)科學(xué)和技局，國(guó)家生物科學(xué)和人技術(shù)研究所(Higashi1-1-3,Tsukuba-shi,Ibaraki，日本，305)國(guó)際登記號(hào)FERM BP-5518，根據(jù)布達(dá)佩斯條約原始保藏于1996年4月24日)。
圖1到4顯示了pNPI206的構(gòu)建方案，圖5顯示了它的T-DNA區(qū)域的限制性酶切圖譜。同時(shí)，圖6顯示了pNPI125的構(gòu)建方案，圖7顯示了pNPI128的構(gòu)建方案，圖8到11顯示了pNPI123的構(gòu)建方案。在這些附圖中，“35S-P”代表花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子，“NOS-P”代表了胭脂堿合成酶啟動(dòng)子，“T”代表了胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號(hào)，“圓圈T”代表了ipt基因本身的多聚腺苷酸化信號(hào)，“半著色點(diǎn)網(wǎng)三角”代表重組序列Rs與其序列方向。如圖5所示，這一質(zhì)粒在其T-DNA區(qū)域含有作為可選擇標(biāo)記基因的ipt基因和作為所需基因的模型的nptⅡ基因和GUS基因，T-DNA區(qū)域也就是整合進(jìn)植物染色體中的區(qū)域。這一ipt基因是致病原根癌土壤桿茵具有的腫瘤誘導(dǎo)基因中的一個(gè)，將它導(dǎo)入植物細(xì)胞后可誘導(dǎo)植物激素即細(xì)胞分裂素的過度生產(chǎn)，并導(dǎo)致細(xì)胞朝著形成極端多莖的方向分化。同時(shí)，賦予卡那霉素抗性的nptⅡ基因和通過代謝特異底物在含有該基因的細(xì)胞中生產(chǎn)藍(lán)色色素的GUS基因是通常用于分析植物中基因表達(dá)的基因。
另外，由于在酵母位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)(pSR1系統(tǒng))中的一對(duì)重組序列Rs之間的區(qū)域在質(zhì)粒中以可去除的DNA元件起作用插入ipt基因的形式是夾在方向相同的Rs重組序列之間。但同時(shí)，R基因作為催化去除Rs之間的區(qū)域的酶的基因被連接到可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，也就是光應(yīng)答啟動(dòng)子rbcS-3B的下游，因此除非將它置于適當(dāng)?shù)墓鈼l件下通過調(diào)節(jié)啟動(dòng)子可使該基因發(fā)生表達(dá)，或發(fā)生Rs之間的去除，否則將不會(huì)發(fā)生這些事件。
Ⅱ．在土壤桿菌中導(dǎo)入pNPI206在10毫升YEB液體培養(yǎng)基(含有5克/升牛肉提取物，1克/升酵母提取物，1克/升蛋白胨，5克/升蔗糖，和2毫摩爾/升MgSO4,pH7.2,22℃(下面使用22℃的pH，除非另外說(shuō)明))中接種根癌土壤桿菌菌株LBA4404(購(gòu)自CLONTECH CO.LTD)，在28℃培養(yǎng)直到OD630在0.4到0.6范圍內(nèi)。然后，在4℃，6900×g離心培養(yǎng)物10分鐘，收集細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮于20毫升10毫摩爾/升Tris-HCl(pH8.0)中，在4℃，6900×g再離心懸浮液10分鐘。隨后，將收集的細(xì)胞再懸浮于200微升的YEB液體培養(yǎng)基中，并將這一懸浮液用作導(dǎo)入質(zhì)粒的細(xì)胞懸浮液。
將用于質(zhì)粒導(dǎo)入的200微升細(xì)胞懸浮液與6微克上述步驟Ⅰ中得到的pNPI206在15毫升容量試管(Falcon制造)中混合，將試管浸入已在液氮中預(yù)冷30到40分鐘的乙醇中5分鐘冷卻混合物，將試管在29℃的水浴中放置25分鐘，在試管中加入750微升YEB液體培養(yǎng)基，然后于29℃在搖床上把細(xì)胞在試管中培養(yǎng)1小時(shí)從而將PNPI206導(dǎo)入土壤桿菌中。
Ⅲ．來(lái)自土壤桿茵的pNPI206在煙草中的導(dǎo)入、導(dǎo)入pNPI206的煙草細(xì)胞的培養(yǎng)和所得組織的形態(tài)學(xué)將在溫室中生長(zhǎng)的煙草(煙草栽培種SRl)的成熟葉子在1v/v％的氯化鈉水溶液中浸泡滅菌，用無(wú)菌水洗滌三次。然后，去除葉子的中肋，以便形成約8平方毫米的葉盤。然后將所得葉盤在上述步驟Ⅱ中導(dǎo)入了pNPI206的根癌土壤桿菌菌株LBA4404的細(xì)胞懸浮液中浸泡約1分鐘，由此被感染(在YEB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后用OD630=0.25的無(wú)菌水稀釋懸浮液)。將感染葉盤置于無(wú)茵濾紙上以便去除任何額外的細(xì)胞懸浮液。然后將它置于無(wú)激素的MS瓊脂培養(yǎng)基上(T.Murashige和F.Skoog,Physiol.Plant.,15:473,1962(假如在其中加入了0.8w/v％的瓊脂))，該培養(yǎng)基含有50毫克/升的乙酰丁香酮，葉子的背面朝上，在暗處25℃，培養(yǎng)3天(下文中，植物組織的培養(yǎng)溫度是25℃，除非另外說(shuō)明)。其次，當(dāng)將這一葉子移植到只含有500毫克/升的羧芐青霉素的無(wú)激素MS瓊脂培養(yǎng)基中，在約7到10微摩爾/秒/米2量的光下培養(yǎng)，同時(shí)用含有同樣成分的培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，在感染后三個(gè)月得到了225個(gè)極端多莖表現(xiàn)型系，其中的126個(gè)系分成兩組，將各組在約7到10微摩爾/秒/米2或約70微摩爾/秒/米2量的光下，利用含有同樣成分的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
結(jié)果是，在約70微摩爾/秒/米2量的光下培養(yǎng)的系中，在感染約6個(gè)月后，從43個(gè)極端多莖表現(xiàn)型系中產(chǎn)生具有肉眼可見的正常表現(xiàn)型(下文中稱為“正常個(gè)體”)，而在約7到10微摩爾/秒/米2量的光下培養(yǎng)的這些系中，在同樣的時(shí)期后，只有12個(gè)極端多莖表現(xiàn)型系產(chǎn)生正常個(gè)體。
結(jié)果如表1所示。
表1在用pNPI206轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)煙草組織中的正常個(gè)體的光條件和產(chǎn)生的比例

在L2條件下培養(yǎng)三個(gè)月，然后在L1或L2條件下培養(yǎng)三個(gè)月。
*1光條件L2；約7到10微摩爾/秒/米2量的光L1；約70微摩爾/秒/米2量的光*2(產(chǎn)生正常個(gè)體的系的數(shù)目/用于檢測(cè)光條件的極端多莖表現(xiàn)型系的數(shù)目)×100正如從上面的表中顯示的結(jié)果可以看出，當(dāng)用本發(fā)明的載體pNPI206轉(zhuǎn)移的培養(yǎng)煙草組織在低光條件下培養(yǎng)，然后在高光條件下培養(yǎng)時(shí)，正常個(gè)體產(chǎn)生的比例差不多是低光條件下連續(xù)培養(yǎng)(所產(chǎn)生正常個(gè)體)的4倍。因此，這表明在利用pNPI206導(dǎo)入基因的組織中，用于調(diào)節(jié)可去除DNA元件的光應(yīng)答啟動(dòng)子rbcS-3B控制了用作可選擇標(biāo)記基因的形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因的行為，并且通過將導(dǎo)入基因組織的光條件從低光量轉(zhuǎn)換到高光量可以加速它的去除。
實(shí)施例21．構(gòu)建載體用PstⅠ消化實(shí)施例1中得到的質(zhì)粒pNPI200，利用T4聚合酶Ⅰ(大亞基)把所得的粘性末端消化變成平末端。利用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ從質(zhì)粒pGlE7(購(gòu)自Zeneca有限公司)中切下GST-Ⅱ27RD亞基基因(GST-Ⅱ-27)啟動(dòng)子(PCT國(guó)際
公開日本國(guó)內(nèi)再公開的專利申請(qǐng)?zhí)朒06-511385，第7頁(yè)右下欄15到17行)，同時(shí)利用T4聚合酶Ⅰ(大亞基)將得到的粘性末端進(jìn)行平齊化，隨后插入pNPI200的平末端之間以得到質(zhì)粒pNPI300。其次，利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ從所得的pNPI300中切下含有GST-Ⅱ-27啟動(dòng)子-R基因和胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號(hào)的片斷，并插入到pUC18(購(gòu)自TakaraShuzo有限公司)的EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)內(nèi)以得到質(zhì)粒pNPI301。
GST-Ⅱ是存在于玉米等中的酶，是有關(guān)除草劑解毒的GST的同工酶之一。同時(shí)，GST-Ⅱ-27啟動(dòng)子控制了作為GST-Ⅱ亞基之一的27kD的亞基的基因表達(dá)，已知通過存在除草劑解毒劑如2,2,5-三甲基-3-(二氯乙酰)-1,3-噁唑烷或其類似物(PCT國(guó)際
公開日本再公開的專利申請(qǐng)?zhí)朒06-511385)時(shí)誘導(dǎo)GST-Ⅱ-27的表達(dá)，這一啟動(dòng)子可顯著增加GST-Ⅱ的活性從而提高玉米等對(duì)除草劑的抗性。
另一方面，利用限制性內(nèi)切酶HindⅢ從質(zhì)粒pNPI123中切下CaMV35S啟動(dòng)子和與其連接的ipt基因，并插入到pNPI128的HindⅢ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)中，得到質(zhì)粒pIPT8。隨后，利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ從pNPI301中切下含有GST-Ⅱ-27啟動(dòng)子、R基因和胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號(hào)的片斷并插入到所得的pIPT8的EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)中以獲得質(zhì)粒pNPI302。
利用限制性內(nèi)切酶SseⅠ從質(zhì)粒pNPI302切下與CaMV35S啟動(dòng)子連接的ipt基因、R基因和與GST-Ⅱ-27啟動(dòng)子和定位于兩端的酵母位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)的重組序列Rs連接的胭脂堿合成酶多聚腺苷酸化信號(hào)，并將它們插入到用于在植物中導(dǎo)入基因的載體質(zhì)粒pBI121的SseⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)中，就可以得到所需載體，將所得的所需載體命名為質(zhì)粒pNPI303。即在這一質(zhì)粒pNPI303中，用GST-Ⅱ-27啟動(dòng)子而不是用pNPI206的tbcS-3B用于控制R基因。圖12到15顯示了pNPI303的構(gòu)建方案。用于這些附圖中的符號(hào)與用于圖1到11的那些相同。
而且，同時(shí)在大腸桿菌JM109菌株中導(dǎo)入質(zhì)粒pNPI303。并且將得到的大腸桿菌作為大腸桿菌JM109(pNPI303)用于國(guó)際保藏[國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)局，國(guó)家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所(Higashi 1-1-1,Tsukuba-shi,Ibaraki，日本，305)，國(guó)際登記號(hào)FERM BP-5927，于1997年4月23日根據(jù)布達(dá)佩斯條約原始保藏]。
Ⅱ．在煙草中導(dǎo)入pNPI303和導(dǎo)入有pNPI303的煙草的分析以與實(shí)施例1的步驟Ⅱ和Ⅲ所述相同的方式，將質(zhì)粒pNPI303導(dǎo)入根癌土壤桿菌菌株LBA4404，用得到的根癌土壤桿菌菌株LBA4404感染煙草的葉盤，然后將這一感染的葉盤平放在含有50毫克/升的乙酰丁香酮的無(wú)激素MS瓊脂培養(yǎng)基上，在光下培養(yǎng)3天。其次，當(dāng)將得到的被感染的葉子移植到只含有500毫克/升羧芐青霉素的無(wú)激素MS瓊脂培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)同樣的時(shí)期時(shí)，得到了極端多莖的表現(xiàn)型，在培養(yǎng)2個(gè)月后得到30個(gè)極端莖表現(xiàn)型系，將它們分成4組，將每組放在含有500毫克/升羧芐青霉素的無(wú)激素MS瓊脂培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)基中另外加入0、10、20或30毫克/升的2,2,5-三甲基-(二氯乙酰)-1,3-噁唑烷，以便檢測(cè)正常個(gè)體的產(chǎn)生比例。
表2顯示了在存在2,2,5-三甲基-3-(二氯乙酰)-1,3-噁唑烷時(shí)培養(yǎng)1個(gè)月后的結(jié)果。在這種情況下，為了證實(shí)用作實(shí)施例中所需基因的模型的GUS基因的表達(dá)，肉眼進(jìn)行正常個(gè)體的檢測(cè)，并根據(jù)Jefferson等人的方法，進(jìn)行GUS活性試驗(yàn)。
表2用pNPI303轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)煙草組織中正常個(gè)體的產(chǎn)生比例和2,2,5-三甲基-3-(二氯乙酰)-1,3-噁唑烷的濃度<

>存在2,2,5-三甲基-3-(二氯乙酰)-1,3-噁唑烷時(shí)培養(yǎng)后1個(gè)月*1產(chǎn)生正常個(gè)體的系的數(shù)目*2產(chǎn)生正常個(gè)體的莖的數(shù)目
*3在作為正常個(gè)體產(chǎn)生的莖中顯示GUS活性的個(gè)體數(shù)目如表2顯示的結(jié)果可以看出，當(dāng)沒有加入2,2,5-三甲基-3-(二氯乙酰)-1,3-噁唑烷時(shí)沒有產(chǎn)生正常個(gè)體。另一方面，當(dāng)它以10毫克/升的量加入時(shí)產(chǎn)生正常個(gè)體，當(dāng)它以20毫克/升的量加入時(shí)產(chǎn)生比例進(jìn)一步增加。結(jié)果是，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在這種情況下，作為用于調(diào)節(jié)可去除DNA元件的化學(xué)物質(zhì)應(yīng)答啟動(dòng)子的GST-Ⅱ-27啟動(dòng)子可以正常地起作用，于是當(dāng)通過pNPI303在植物組織中導(dǎo)入基因并將所得組織在存在適當(dāng)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，它誘導(dǎo)可去除DNA元件的表達(dá)和加速它的去除，并且進(jìn)一步將作為可選擇標(biāo)記基因的形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因去除。
另一方面，在約一半作為正常個(gè)體產(chǎn)生的莖中證實(shí)了GUS活性的表達(dá)，也就是所需基因的存在和表達(dá)，在其余一半中檢測(cè)不到GUS活性。雖然其中的原因仍未清楚，但是，例如，如果通過相互連接，優(yōu)選在煙草染色體中導(dǎo)入多個(gè)pNPI303的T-DNA區(qū)，在T-DNA區(qū)內(nèi)的重組序列Rs之間不發(fā)生同源重組，而在互不相同的T-DNA區(qū)的重組序列之間發(fā)生，從而導(dǎo)致去除的區(qū)域夾在這樣的序列中間。結(jié)果是，不僅ipt基因而且GUS基因也可以包括在與可去除DNA元件一起去除的區(qū)域中，在這種情況下，與這一實(shí)施例的情況相同，從極端多莖表現(xiàn)型中將產(chǎn)生正常但沒有GUS活性的個(gè)體。
同時(shí)，將顯示GUS活性的正常個(gè)體之一以PCR進(jìn)行DNA分析，在DNA水平證實(shí)了GUS基因的存在和作為可選擇標(biāo)記基因的ipt基因與可去除DNA元件一起去除了。
工業(yè)應(yīng)用性當(dāng)利用本發(fā)明的載體把基因?qū)胫参锛?xì)胞中時(shí)，通過在基因?qū)牒髮?duì)細(xì)胞施加特定刺激，如熱、光和化學(xué)物質(zhì)等可使得與所需基因一起導(dǎo)入的可選擇標(biāo)記基因的功能在其存在和起功能的DNA上以一定的比率去除后被消除。因此，僅僅通過改變用于導(dǎo)入的所需基因的部分而不改變可選擇標(biāo)記基和其它的結(jié)構(gòu)就可以使該載體在特定植物中實(shí)現(xiàn)該基因的重復(fù)導(dǎo)入。于是，重復(fù)導(dǎo)入的進(jìn)行就可以不受次數(shù)限制了。
另外，因?yàn)閷⑿螒B(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因用作可選擇標(biāo)記基因，利用組織的形態(tài)學(xué)變化作為指標(biāo)可以進(jìn)行只由導(dǎo)入可選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞形成的組織(也就是只由導(dǎo)入所需基因的細(xì)胞形成的組織)的篩選，以及以在可選擇標(biāo)記基因的功能消失后還能夠表達(dá)的方式單獨(dú)導(dǎo)入的所需基因的細(xì)胞形成的組織的篩選。結(jié)果是，可以確定地和容易地選擇只起源于在染色體等中僅導(dǎo)入了所需基因的細(xì)胞的組織，并且不存在選擇過程中減弱植物細(xì)胞的活性的問題，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)基中不必要加入用于篩選的抗生素。因此，可以有效地進(jìn)行基因的重復(fù)導(dǎo)入，不經(jīng)過雜交步驟也可以得到由只這些細(xì)胞組成的轉(zhuǎn)基因個(gè)體，也就是消除了可選擇標(biāo)記基因的影響及完全清除有關(guān)基因產(chǎn)物的憂慮的個(gè)體。
另外，根據(jù)本發(fā)明的載體，去除可選擇標(biāo)記基因是可以人工控制的。結(jié)果，即使在可去除DNA元件具有非常優(yōu)良的去除能力因而該可選擇的標(biāo)記基因可快速被去除，同時(shí)當(dāng)不能進(jìn)行如此調(diào)控而要獲得僅由其中導(dǎo)入了所需基因的細(xì)胞組成的組織變得相當(dāng)困難的情況下，其能力在本發(fā)明中仍然可被用作可去除的DNA元件。另一方面，由于利用本發(fā)明的載體可以有選擇地進(jìn)行同步化地或有控制地產(chǎn)生這種細(xì)胞以及這些細(xì)胞組成的植物組織，可以非常方便地在實(shí)踐中來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株。例如，當(dāng)ipt基因被用作形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因即可選擇的標(biāo)記基因時(shí)，在無(wú)植物激素條件下，它可誘導(dǎo)在其中導(dǎo)入了該基因的細(xì)胞的相當(dāng)活躍的生長(zhǎng)，并且引起不定牙等的分化。因此，在維持可選擇的標(biāo)記基因的前期條件下通過持續(xù)培養(yǎng)可大量生產(chǎn)能產(chǎn)生當(dāng)有必要時(shí)在任何時(shí)候都可在其中導(dǎo)入所需基團(tuán)的細(xì)胞的組織。
權(quán)利要求
1．一種用于將所需基因與可選擇標(biāo)記基因一起導(dǎo)入植物細(xì)胞的載體，其中可選擇標(biāo)記基因在它存在和起作用的DNA中是可選擇地去除的，并且在表達(dá)后失去其功能，通過起源于導(dǎo)入了可選擇標(biāo)記基因的植物細(xì)胞的組織中的形態(tài)學(xué)變化可以檢測(cè)可選擇標(biāo)記基因的表達(dá)和其功能的丟失。
2．一種用于在植物中導(dǎo)入基因的載體，它包括所需基因、作為可選擇標(biāo)記基因的形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因以及置于可誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下的可去除DNA元件，其中形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因所處的位置使它與可去除DNA元件完整地起作用，而所需基因所處的位置使它不與可去除DNA元件一起完整地作用。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于在植物中導(dǎo)入基因的載體，其中形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因存在于可去除DNA元件內(nèi)。
4．根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用于在植物中導(dǎo)入基因的載體，其中控制可去除DNA元件的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子是核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(rbcS)的啟動(dòng)子。
5．根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用于在植物中導(dǎo)入基因的載體，其中控制可去除DNA元件的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子是谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶Ⅱ系統(tǒng)(GST-Ⅱ)基因的啟動(dòng)子。
6．根據(jù)權(quán)利要求2、3、4或5所述的用于在植物中導(dǎo)入基因的載體，其中可去除DNA元件來(lái)自于位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)。
7．根據(jù)權(quán)利要求2、3、4、5或6所述的用于在植物中導(dǎo)入基因的載體，其中形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因從屬于土壤桿菌屬的細(xì)菌中得到。
8．根據(jù)權(quán)利要求2、3、4、5、6或7所述的用于在植物中導(dǎo)入基因的載體，其中形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因是細(xì)胞分裂素合成基因。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的用于在植物中導(dǎo)入基因的載體，其中細(xì)胞分裂素合成基因是存在于根癌土壤桿菌的T-DNA中的ipt基因，即異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因。
全文摘要
一個(gè)用于將基因轉(zhuǎn)入到植物中的載體,該載體在必要時(shí)可使在表達(dá)后從標(biāo)記基因存在和發(fā)揮功能的染色體的DNA上切除與目的基因一起轉(zhuǎn)入到植物中的標(biāo)記基因,因而也消除了其功能,以及在其中導(dǎo)入了基因的植物細(xì)胞所衍生的組織的形態(tài)變化的基礎(chǔ)上來(lái)檢測(cè)該標(biāo)記基因的表達(dá)和消除。該載體的構(gòu)建利用了一個(gè)作為標(biāo)記基因的能誘導(dǎo)形態(tài)學(xué)異常及控制一個(gè)能與調(diào)控器一塊消失的DNA因子的基因。由于其所處位置,該形態(tài)學(xué)異常誘導(dǎo)基因能與該DNA因子一起起作用,而該目的基因并不處于這樣一個(gè)位置上故其不與該DNA因子一起作用。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1225133SQ9719598
公開日1999年8月4日 申請(qǐng)日期1997年5月9日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月9日
發(fā)明者杉田耕一, 上杉干子, 松永悅子, 海老沼宏安 申請(qǐng)人:日本制紙株式會(huì)社 被以下專利引用 (1),