專利名稱：免疫刺激性核酸分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及寡核苷酸，具體地講，涉及那些包括至少一個(gè)免疫刺激性的未甲基化CpG二核苷酸的寡核苷酸序列。本發(fā)明的背景技術(shù)在二十世紀(jì)七十年代，一些研究人員報(bào)道了高分子量DNA與細(xì)胞膜的結(jié)合(Lerner,R.A.et al.,1971.“Membran-associatedDNA in the cytoplasm of diploid human lymphocytes”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA68:l12；Agrawal,S.K.,R.W.Wagner,P.K.McAllister,and B.Rosenberg.1975.“Cell-surface-associatednucleic acid in tumorigenic cells made visible with platinum-pyrimidine complexes by electron microscopy”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA72:928)。在1985年，Bennett等人首次提出證據(jù)證明了DNA與淋巴細(xì)胞的結(jié)合相似于配體與受體的相互作用，即結(jié)合是飽和的、競(jìng)爭(zhēng)性的、并導(dǎo)致DNA細(xì)胞內(nèi)吞作用和降解為寡核苷酸(Bennett,R.M.,G.T.Gabor,and M.M.Merritt.1985.“DNA binding to human leukocytes.Evidence for receptor-mediated association,internalization,and degradation of DNA”.J.Clin.Invest.76:2182)。類似于DNA，寡脫氧核糖核酸(ODN)也能以飽和、不依賴序列、但依賴溫度和能量的形式進(jìn)入到細(xì)胞中(見(jiàn)Jaroszewski,J.W.,and J.S.Cohen.1991.“Cellular uptakeof antisense oligodeoxynucleotides”.Advanced Drug DeliveryReviews6:235；Akhtar,S.,Y.Shoji,and R.L.Juliano.1992.“Pharmaceutical aspects of the biological stability and membranetransport characteristics of antisense oligonucleotides”.In:GeneRegulation:Biology of Antisense RNA and DNA.R.P.Erickson,and J.G.Izant,eds.Raven Press,Ltd.New York,pp.133:and Zhao,Ql,T.Waldschmidt,E.Fisher,C.J.Herrera,and A.M.Krieg.,1994.“Stage specific oligonucleotide uptake in murine bone marrow Bcell precursors”.Blood,84:3660)。但是，還沒(méi)有克隆化到吸收DNA或ODN的受體，而且，還不清楚ODN結(jié)合及細(xì)胞吸收是采取與高分子量的DNA相同或不同的機(jī)制。
淋巴細(xì)胞的ODN吸收已經(jīng)被證明可由細(xì)胞活化來(lái)調(diào)節(jié)。用B細(xì)胞分裂素LPS刺激的脾細(xì)胞在B細(xì)胞群體中顯示了ODN吸收的顯著提高，而用T細(xì)胞分裂素Con A處理的脾細(xì)胞顯示的ODN吸收的提高是在T細(xì)胞中而不是在B細(xì)胞中(Krieg,A.M.,F.Gmelig-Meyling,M.F.Gourley,W.J.Kisch,L.A.Chrisey,and A.D.Steinberg.1991.“Uptake of oligodeoxyribonucleotidesby lymphoid cells is heterogeneous and inducible”.AntisenseResearch and Development 1:161)。
已經(jīng)對(duì)一些多聚核苷酸作為反應(yīng)修飾劑進(jìn)行了廣泛的研究。也許最好的例子是多聚(I,C)，這是一種IFN生產(chǎn)的強(qiáng)力誘導(dǎo)子，也是巨嗜細(xì)胞活化子和NK活性誘導(dǎo)子(Talmadge,J.E.,J.Adams,H.Phillips,M.Collins,B.Lenz,M.Schneider,E.Schlick,R.Ruffmann,R.H.Wiltrout,and M.A.Chirigos.1985.“Immunomodulatory effects in mice of polyinosinic-polycytidylicacid comlexed with poly-L-lysine and carboxymethylcellulose”.Cancer Res.“Immunomodulation of natural killer activity bypolyribonucleotides”.J.Biol.Resp.Mod.4:512；Krown,S.E.1986.“Interferons and interferon inducers in cancer treatment”.Sem.Oncol.13:207；and Ewel,C.H.,S.J.Urba,W.C.Kopp,J.W.SmithII,R.G.Steis,J.L.Rossio,D.L.Longo,M.J.Jones,W.G.Alvord,C.M.Pinsky,J.M.Beveridge,K.L.McNitt,and S.P.Creekmore.1992.“Polyinosinic-polycytidylic acid complexed with poly-L-lysine and carboxymethylcellulose in combination with interleukin-2in patients with cancer:clinical and immunological effects”.Canc.Res.52:3005)?？雌饋?lái)，這種鼠NK活化的單一原因是引入了IFN-β分泌(Ishikawa,R.,and C.A.Biron.1993.“IFN inductionand associated changes in splenic leukocyte distribution”.J.Immunol.150:3713)。這種活化是對(duì)核糖為特異的，因?yàn)閷?duì)脫氧核糖沒(méi)有效力。其體外抗腫瘤活性的效力導(dǎo)致多種采用多聚(I,C)復(fù)合多聚-L-賴氨酸和羧甲基纖維素(用以減少RNAse降解)的臨床研究(Talmadge,J.E.,et al.,1985.出處同上；Wiltrout,R.H.,et al.,1985.出處同上)；Krown,S.E.,1986.出處同上)；and Ewel.C.H.,et al.,1992.出處同上)。不幸的是，對(duì)毒性副作用的研究完全排除了多聚(I,C)成為有用的治療藥劑的可能。
在C8位發(fā)生溴或硫醇基取代的鳥嘌呤核糖核苷酸是B細(xì)胞的分裂素，并且可以取代“B細(xì)胞分化因子”(Feidbush,T.L.,andZ.K.Ballas.1985.“Lymphokine-like activity of8-mercaptoguanosine:induction of T and B cell differentiation”.J.Immunol.134:3204；and Goodman, M.G.1986.“Mechnism ofsnyergy between T cell signals and C8-substituted guaninenucleosides in humoral immunity:B lymphotropic cytokines induceresponsiveness to 8-mercaptoguanosine”.J.Immunol.136:3335 )。8-巰基鳥苷和8-溴鳥苷還可以取代細(xì)胞因子來(lái)用在MHC限制的CTL的產(chǎn)生(Feldbush,T.L.,1985.出處同上)，增大鼠NK活性(Koo,G.C.,M.E.Jewell,C.L.Manyak,N.H.Sigal,and L.S.Wicker.1988.“Activation of murine natural killer cells andmacrophages by8-bromoguanosine”.J.Immunol.140:3249)，以及與IL-2一起在誘發(fā)鼠LAK產(chǎn)生中的協(xié)同效應(yīng)(Thompson,R.A.,and Z.K.Ballas.1990.“Lymphokine-activated killer(LAK)cells.V.8-Mercaptoguanosine as an IL-2-sparing agent inLAK generation”.J.Immunol.145:3524)。這些C8取代的鳥苷的NK和LAK活性的增大看起來(lái)歸因于它們對(duì)IFN的引入(Thompson,R.A.,et al.,1990.出處同上)。近來(lái)，由分枝桿菌產(chǎn)生的5’三磷酸化胸苷被發(fā)現(xiàn)是對(duì)人γδT細(xì)胞亞類為促有絲分裂的(Constant,P.,F.Davodeau,M.A.Peyrat,Y.Poquet,G.Puzo,M.Bonneville,and J.-J.Fournie.1994.“Stimulation of humanγδTcells by nonpeptidic mycobacterial ligands”Science264:267)。該篇報(bào)道指明，免疫系統(tǒng)可能產(chǎn)生對(duì)微生物核酸的帶有傾向性的反應(yīng)方式。
一些研究已經(jīng)表明，某些DNA結(jié)構(gòu)可以還帶有活化淋巴細(xì)胞的潛力。例如，Bell等人曾經(jīng)報(bào)道，在脾細(xì)胞上清液中的核小體蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物(不是裸露的DNA)引起了B細(xì)胞的繁殖和免疫球蛋白的分泌(Bell,DA.,B.Morrison,and P.VanderBygaart.1990.“Immunogenic DNA-related factors”.J.Clin.Invest.85:1487)。在其它的情況下，裸露的DNA已經(jīng)被報(bào)道具有免疫效應(yīng)。例如，Messina等人最近曾報(bào)道說(shuō)，多聚(dG)·(dC)和多聚(dG·dC)的260至800bp的片段是對(duì)B細(xì)胞為促有絲分裂的(Messina,J.P.,G.S.Gilkeson,and D.S.Pisetsky.1993.“Theinfluence of DNA structure on the in vitro stimulation of murinelymphocytes by natural and synthetic polynucleotide antigens”.Cell.Immunol.147:148)。Tokunaga等人已經(jīng)報(bào)道了dG·dC誘導(dǎo)γ-IFN和NK活性(Tokunaga,S.Yamamoto,and K.Namba.1988.“A synthetic single-stranded DNA,poly(dG,dC),inducesinterferon-α/b and-g,augments natural killer activity,andsuppresses tumor growth”Jpn.J.Cancer Res.79:682)。除了這些人造的均聚體序列之外，Pisetsky等人報(bào)道了純凈哺乳動(dòng)物DNA沒(méi)有可檢測(cè)性免疫效應(yīng)，但是，從某些細(xì)菌來(lái)的DNA則誘導(dǎo)了B細(xì)胞的活化和免疫球蛋白的分泌(Messina,J.P.,G.S.Gilkeson,and D.S.Pisetsky.1991.“Stimulation of in vitro murinelymphocyte proliferation by bacterial DNA”.J.Immunol.147:1759)。假設(shè)這些數(shù)據(jù)不是那些特異的污染物的結(jié)果，那么，這些研究則建議，細(xì)菌DNA的特定結(jié)構(gòu)或它們的特定性質(zhì)使其能夠啟動(dòng)B細(xì)胞的活化。對(duì)分枝桿菌DNA序列的研究顯示，含有某種回文序列的ODN可以活化NK細(xì)胞(Yamamoto,S.,T.Yamamoto,T.Kataoka,E.Kuramoto,O.Yano,and T.Tokunaga.1992.“Unique palindromic sequences in syntheticoligonucleotides are required to induce INF and agument INF-meidated natural killer activity”.J.Immunol.148:4072；Kuramoto,E.,O.Yano,Y.Kimura,M.Baba,T.Makino,S.Yamamoto,T.Yamamoto,T.Kataoka,and T.Tokunaga.1991.“Oligonucleotidesequences required fro natural killer cell activation”.Jpn.J.CancerRes.83:1128)。
還報(bào)道了其它一些硫代磷酸酯修飾的ODN在體外或體內(nèi)對(duì)B細(xì)胞的刺激(Tanaka,T.,C.C.Chu,and W.E.Paul.1992.“Anantisense oligonucleotide complementary to a sequence in Ig2bincreases g2b germline transcripts,stimulates B cell DNA synthesis,and inhibits immunoglobulin secretion”.J.Exp.Med.175:597；Branda,R.F.,A.L.Moore,L.Mathews,J.J.McCormack,and G.Zon.1993.“Immune stimulaiton by an antisense oligomercomplementary to the rev gene of HIV-1”.Biochem.Pharmacol.45:2037；McIntyre,K.W.,K.Lombard-Gillooly,J.R.Perez,C.Kunsch,U.M.Sarmiento,J.D.Larigan,K.T.Landreth,and R.Narayanan.1993.“A sense phosphorothioate oligonucleotidedirected to the initiation codon of transcription factor NF-BT65causes sequence-specific immune stimulation”.Antisense Res.Develop.3:309；and Pisetsky,D.S.,and C.F.Reich.1993.“Stimulation of murine lymphocyte proliferation by aphosphorothioate oligonucleotide with antisense activity for herpessimplex virus”.Life Sciences54:101)。這些報(bào)道沒(méi)有建議出在這些ODN中有可以解釋這些效果的共同的結(jié)構(gòu)基元或序列因素。
cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白質(zhì)(CREB)和活化轉(zhuǎn)錄因子(ATF)或轉(zhuǎn)錄因子的CREB/ATF家族是普遍被表達(dá)的一類轉(zhuǎn)錄因子，其11個(gè)成員已經(jīng)被克隆化了(reviewed in de Groot,R.P.,and P.Sassone-Corsi:“Hormonal control of gene expression:Multiplicity and versatility of cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate-responsive nucler regulators”.Mol.Endocrin.7:145,1993；Lee,K.A.W.,and N.Masson:“Transcriptionalregulation by CREB and its relatives”.Biochim.Biophys.Acta1174:221,1993)。它們都屬于蛋白質(zhì)中堿性區(qū)/亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(bZip)類。所有的細(xì)胞都顯示出對(duì)一種或一種以上的CREB/ATF蛋白質(zhì)的表達(dá)，但是，所表達(dá)的成員和對(duì)mRNA剪接的調(diào)節(jié)則顯示為組織特異性的。對(duì)活化區(qū)的分化剪接可以確定某一具體的CREB/ATF蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)錄抑制子或活化子。許多的CREB/ATF蛋白質(zhì)活化病毒性轉(zhuǎn)錄，但是，有些缺少活化區(qū)的剪接變體則是抑制性的。CREB/ATF蛋白質(zhì)可以作為均二聚體或異二聚體通過(guò)cAMP效應(yīng)元件來(lái)結(jié)合DNA，而cAMP效應(yīng)元件，即CRE，其共有形式是未甲基化序列TGACGTC(如果CpG是甲基化的，則結(jié)合就被抑制)(Iguchi-Ariga,S.M.M.,andW.Schaffner:″CpG methylation of the cAMP responsiveenhancer/promoter sequence TGACGTCA abolishes specificefactor binding as well as transcriptional activation″.Genes &Develop.3:612,1989.)。
CRE的轉(zhuǎn)錄活性在B細(xì)胞活化中被提高(Xie,H.T.C.Chiles,and T.L.Rothstein:″Induction of CREB activity via the surface Igreceptor of B cells″.J.Immunol.151:880,1993)。CREB/ATF蛋白質(zhì)好象是通過(guò)CRE來(lái)對(duì)多種基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，包括免疫學(xué)上重要的基因，例如，fos、jun B、Rb-1、IL-6、IL-1(Tsukada,J.,K.Saito,W.R.Waterman,A.C.Webb,and P.E.Auron:″Transcription factors NF-IL-6 and CREB recognize a commonessential site in the human prointerleukin 1 gene″.Mol.Cell.Biol.14:7285,1994；Gray,G.D.,O.M.Hernadez,D.Hebel.M.Root,J.M.Pow-Sang,and E.Wickstrom:″antisense DNA inhibition oftumor growth induced by c-Ha-ras oncogene in nude mice″.CancerRes.53:577,1993),IFN-(Du,W.,and T.Maniatis:″AnTF/CREB binding site protein is required for virus induction ofhuman interferon B gene″.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2150,1992),TGF-1(Asiedu,C.K.,L.Scott,R.K.Assoian,M.Ehrlich:＂Binding of AP-1/CREB proteins and of MDBP to contiguous sitesdownstream of the human TGF-B1 gene″.Biochim.Biophys.Acta1219:55,1994),TGF-2,Ⅱ MHC類(Cox,P.M.,and C.R.Goding:″An ATF/CREB binding motif is required for aberrant constitutiveexpression of the MHC class Ⅱ DRa promoter and activation bySV40T-antigeh″.Nucl.Acids Res.20:4881,1992)，E-選擇素，GM-CSF,CD-8，種系Ig恒定區(qū)基因，TCR V基因，以及繁殖細(xì)胞核抗原(Huang,D.,P.M.Shipman-Appasamy,D.J.Orten,S.H.Hinrichs,and M.B.Prystowsky:″Promoter activity of theproliferating-cell nuclear antigen gene is associated with inducibleCRE-binding proteins in interleukin 2-stimulated T lymphocytes:.Mol.Cell.Biol.14:4233,1994)。除了通過(guò)cAMP途徑的活化，CREB還可以介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca++濃度變化的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答(Sheng,M.,G.McFadden,and M.E.Greenberg:″Membrane depolarizationand calcium induce c-fos transeription via phosphorylation oftranseription fector CREB″.Neuron4:571,1990)。
在CREB/ATF蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄活化中，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用顯示為極其重要角色。已經(jīng)有一些發(fā)表的研究報(bào)道了在NFKB蛋白質(zhì)和CREB/ATF蛋白質(zhì)之間的直接性或間接性相互作用[Whitley,et al.,(1994)Mol.& Cell.Biol.14:6464；Cogswell,et al.,(1994)J.Immun.153:712；Hines,et al.,(1993)Oncogene8:3189；and Du,et al.,(1993)Cell74:887]。通過(guò)環(huán)AMP途徑對(duì)CREB的活化需要蛋白質(zhì)激酶A(PKA)，其將CREB341在ser133磷酸化，并允許其與近來(lái)克隆化的蛋白質(zhì)CBP結(jié)合(Kwok,R.P.S.,J.R.Lundblad,J.C.Chrivia,J.P.Richards,H.P.Bachinger,R.G.Brennan,S.G.E.Roberts,M.R.Green,and R.H.Goodman:″Nuclear protein CBP is a coactivator for thetranscription factor CREB″.Nature370:223,1994；Arias,J.,A.S.Alberrs,P.Brindle,F.X.Claret,T.Smea,M.Karin,J.Feranmisco,and M.Montminy:″Activation of cAMP and mitogen responsivegenes relies on a common nuclear factor″.Nature370:226,1994.)。CBP隨后再與堿性轉(zhuǎn)錄因子TFIIB相互作用造成提高了的轉(zhuǎn)錄。CREB還被報(bào)道與dTAFII110相互作用，該dTAFⅡ110是一種TATA結(jié)合蛋白質(zhì)相關(guān)的因子，其結(jié)合可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄(Ferreri,K.,G.Gill,and M.Montminy:″The cAMP-regulatedtranscription factor CREB interacts with a component of the TFⅡDcomplex″.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:1210,1994)。除了這些相互作用之外，CREB/ATF蛋白質(zhì)可以特異性結(jié)合多種其它的核因子(Hoeffler,J.P.,J.W.Lustbader,and C.-Y.Chen:″Identification of multiple nuclear factors that interact with cyclicadenosine 3′,5′-monohosphate response element-binding proteinand activating transcription factor-2 by protein-proteininteractions″.Mol.Endocrinol.5:256,1991)，但是，這些相互作用中的大多數(shù)的生物學(xué)重要性還都是未知的。一般都認(rèn)為CREB與DNA的結(jié)合是均二聚體的或與其它的蛋白質(zhì)的異二聚體。另人驚奇的是，CREB單體對(duì)轉(zhuǎn)錄的活化是組成性的(Krajewski,Wl,and K.A.W.Lee:″A monomeric derivative of the cellulartranscription factor CREB functions as constitutive activator″.Mol.Cell.Biol.14:7204,1994)。
除了在調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄中的重要作用之外，最近還證實(shí)了CREB/ATF蛋白質(zhì)被某些感染性病毒和逆病毒所破壞，使其需要病毒復(fù)制。例如，在已知的最為強(qiáng)烈的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子中，即巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子中，含有對(duì)啟動(dòng)子功能為必須的CRE的11個(gè)拷貝(Chang,Y.-N.,S.Crawfbrd,J.Stall,D.R.Rawlins,K.-T.Jeang,and G.S.Hayward:″The palindromic series Irepeats in the simian cytomegalovirus major immediate-earlypromoter behave as both strong basal enhancers and cyclic AMPresponse elements″.J.Virol.64:264,1990)。誘導(dǎo)眾多啟動(dòng)子的腺病毒ElA蛋白質(zhì)的至少一部分轉(zhuǎn)錄活化效應(yīng)歸因于其與CREB/ATF蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合區(qū)的結(jié)合，即與ATF-2的結(jié)合，其介導(dǎo)ElA可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化(Liu,F.,and M.R.Green:″Promoter targeting by adenovirus Ela through interaction withdifferent cellular DNA-binding domains″.Nature368:520,1994)。還建議的是，ElA與CREB結(jié)合蛋白質(zhì)CBP相結(jié)合(Arany,Z.,W.R.Sellers,D.M.Livingston,and R.Eckner:″ElA-associated p300and CREB-associated CBP belong to a conservedfamily of coactivators″.Cell77:799,1994)。人T嗜淋巴細(xì)胞病毒-I(HTLV-1)，即造成人T細(xì)胞白血病和熱帶痙攣輕癱的逆病毒，也需要CREB/ATF蛋白質(zhì)來(lái)復(fù)制。在這種情況下，逆病毒產(chǎn)生蛋白質(zhì)Tax，其與CREB/ATF蛋白質(zhì)結(jié)合，再指引它們從其正常的細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)改變?yōu)榇嬖谟贖TLV轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子中的不同的DNA序列(側(cè)翼序列為G-和C-富集的序列)(Paca-Uccaralertkun,S.,L.-J.Zhao,N.Adya,J.V.Cross,B.R.Cullen,I.M.Boros.and C.-Z.Giam:″In vitro selection of DNA elementshighly responsive to the human T-cell lymphotropic virus type Itranscriptional activator, Tax″. Mol.Cell.Biol.14:456,1994；Adya,N.,L.-J.Zhao,W.Huang,I.Boros,and C.-Z.Giam:″Expansion ofCREB′s DNA recognition specificity by Tax results frominteraction with Ala-Ala-Arg at positions 282-284 near theconserved DNA-binding domain of CREB″.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:5642,1994) 。本發(fā)明的概述本發(fā)明的基礎(chǔ)是發(fā)現(xiàn)了某些含有未甲基化的胞嘧啶-鳥苷(CpG)二核苷酸活化對(duì)象中的淋巴細(xì)胞并使對(duì)象的免疫系統(tǒng)由Th2轉(zhuǎn)變?yōu)門h1(例如，誘導(dǎo)單核細(xì)胞以及其它細(xì)胞產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子，包括IL-12、IFN-γ、和GM-CSF)。基于這個(gè)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明在一方面涉及新的免疫刺激性核酸組合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了被分離的免疫刺激性的含有CpG基元的核酸序列，其表達(dá)式為5′N1X1CGX2N23′其中，至少有一個(gè)核苷酸將連續(xù)的CpGs間隔開來(lái)；X1是腺嘌呤，鳥嘌呤，或胸腺嘧啶；X2是胞嘧啶或胸腺嘧啶；N是任何的核苷酸，且N1+N2是0-26堿基，條件是N1和N2都不含有CCGG四元體或多于一個(gè)的CCG或CGG三元體；并且核酸序列的長(zhǎng)度為約8-30堿基對(duì)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了被分離的免疫刺激性的含有CpG基元的核酸序列，其表達(dá)式為5′N1X1X2CGX3X4N23′其中，至少有一個(gè)核苷酸將連續(xù)的CpGs間隔開來(lái)；X1X2是選自GpT、GpG、GpA、ApT和ApA；X3X4是選自TpT或CpT；N是任何的核苷酸，且N1+N2是0-26堿基，條件是N1和N2都不含有CCGG四元體或多于一個(gè)的CCG或CGG三元體；并且核酸序列的長(zhǎng)度為約8-30堿基對(duì)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了刺激免疫活化的方法，將本發(fā)明的核酸序列提供給對(duì)象，優(yōu)選人類。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫活化產(chǎn)生主要是Th1形式的免疫活化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸序列刺激細(xì)胞因子的生產(chǎn)。具體地講，IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF是通過(guò)用本文中所述的核酸序列刺激免疫系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生的。在另一方面，本發(fā)明的核酸序列刺激天然殺死細(xì)胞(NK)的溶胞活性和B細(xì)胞的繁殖。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸序列被用作人造附劑來(lái)在哺乳動(dòng)物如小鼠或人中產(chǎn)生抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)抑制對(duì)象的對(duì)CpG介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活化的應(yīng)答來(lái)治療自體免疫紊亂。本發(fā)明提供了施加對(duì)體內(nèi)酸化的抑制物如bafilomycina，氯喹，和莫能菌素來(lái)緩解自體免疫紊亂。具體地講，用這種方式治療了系統(tǒng)性紅斑狼蒼。
本發(fā)明的核酸序列還可以用于治療、防止或緩解其它的紊亂(例如，腫瘤或癌癥，病毒性、真菌性、細(xì)菌性或寄生性感染)。此外，本發(fā)明的核酸序列可以施加給對(duì)象來(lái)刺激其對(duì)疫苗的應(yīng)答。進(jìn)一步，將對(duì)象的免疫系統(tǒng)從Th2改變?yōu)門h1，本發(fā)明的核酸序列可以治療和防止氣喘疾病。此外，本發(fā)明的核酸序列可以施加給患有過(guò)敏疾病的對(duì)象，作為消除敏感的制劑來(lái)治療或防止與氣喘相關(guān)的過(guò)敏反應(yīng)。
進(jìn)一步，本發(fā)明的核酸序列的誘導(dǎo)白血細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)的能力支持了其治療白血病的應(yīng)用，即提高了在常規(guī)的消除化療之后的白血細(xì)胞的敏感性，或者將本發(fā)明的核酸序列與其它的免疫治療物一起使用。
本發(fā)明的其它的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將可以從下面的描述和權(quán)利要求書中更為明顯地看出。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A-C用制圖說(shuō)明在消除了T細(xì)胞的脾細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)各種DNA序列的應(yīng)答的IL-6生產(chǎn)的劑量依賴情況。
圖1A是大腸桿菌DNA(1)和小牛胸腺DNA(n)序列和LPS(10倍濃度的大腸桿菌和小牛胸腺DNA)(u)。
圖1B是對(duì)照的磷酸二脂寡聚脫氧核苷酸(ODN)5′ATGGAAGGTCCAGTGTTCTC3′(SEQ ID No:1)(n)和兩個(gè)磷酸二脂CpG ODN 5′ATCGACCTACGTGCGTTCTC3′(SEQ IDNo:2)(u)和5′TCCATAACGTTCCTGATGCT3′(SEQ ID No:3)(1)。
圖1C是對(duì)照的硫代磷酸酯ODN 5′GCTAGATGTTAGCGT3′(SEQ ID No:4)(n)和兩個(gè)硫代磷酸酯CpG ODN5′GAGAACGTCGACCTTCGAT3′(SEQ ID No:5)(u)和5′GCATGACGTTGAGCT3′(SEQ ID No:6)(1)。數(shù)據(jù)代表三份的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖2圖示注射后1-8小時(shí)所確定的體內(nèi)CpG DNA誘導(dǎo)的IL-6生產(chǎn)。數(shù)據(jù)代表從兩個(gè)小鼠的血清的兩次分析的平均值。對(duì)BALB/c小鼠(每組兩只)靜脈內(nèi)注射100微升的PBS(o)或200微克的CpG硫代磷酸酯0DN5′TCCATGACGTTCCTGATGCT3′(SEQ ID No:7)(n)或非-CpG硫代磷酸酯ODN5′TCCATGAGCTTCCTGAGTCT3′(SEQ ID No:8)(u)。
圖3是放射性自顯影圖，說(shuō)明IL-6mRNA表達(dá)，由反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)確定，在肝、脾和胸腺中各個(gè)時(shí)間的情況，事先對(duì)BALB/c小鼠(每組兩只)進(jìn)行體內(nèi)刺激，靜脈內(nèi)注射100微升的PBS,200微克的CpG硫代磷酸酯ODN5′TCCATGACGTTCCTGATGCT3′(SEQ ID No:7)非-CpG硫代磷酸酯ODN5′TCCATGAGCTTCCTGAGTCT3′(SEQ ID No:8)。
圖4A是圖示抗IL-6對(duì)CpG誘導(dǎo)的IgM生產(chǎn)的劑量依賴性抑制。從DBA/2小鼠來(lái)的脾B細(xì)胞用CpG ODN5′TCCAAGACGTTCCTGATGCT3′(SEQ ID No:9)刺激，有給出濃度的中性抗-IL-6(u)或等模標(biāo)本對(duì)照Ab(1)的存在，在培養(yǎng)物上清液中的IgM水平有ELISA確定。在沒(méi)有CpG ODN存在的情況下，抗-IL-6抗體對(duì)IgM分泌沒(méi)有效應(yīng)(n)。
圖4B圖示用CpG S-ODN5′TCCATGACGTTCCTGATGCT3′(SEQ ID No:7)和抗-IL-6(u)培養(yǎng)或用抗-IL-6抗體單獨(dú)培養(yǎng)(n)的脾B細(xì)胞CpG-誘導(dǎo)的刺激指數(shù)。數(shù)據(jù)代表三份的平局值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖5是條塊圖，說(shuō)明在wEHI-231細(xì)胞中的氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)的活性，其中的細(xì)胞被不含啟動(dòng)子的CAT結(jié)構(gòu)(pCAT)、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒(RSV)、IL-6啟動(dòng)子-CAT結(jié)構(gòu)自身、以及按照給定濃度的CpG5′TCCATGACGTTCCTGATGCT3′(SEQ ID No:7)或非-CpG5′TCCATGAGCTTCCTGAGTCT3′(SEQ ID No:8)硫代磷酸酯ODN與IL-6啟動(dòng)子-CAT結(jié)構(gòu)所轉(zhuǎn)染。數(shù)據(jù)代表三份數(shù)據(jù)的平均值。
圖6是含有免疫刺激性的未甲基化CpG的核酸的免疫效果的總體圖示，該核酸可以直接活化B細(xì)胞和單核細(xì)胞(包括巨嗜細(xì)胞和樹狀細(xì)胞)。免疫刺激性寡核苷酸不直接活化純化的NK細(xì)胞，但可以使它們適合于應(yīng)答IL-12并使IFN-γ生產(chǎn)有明顯提高。由于使NK細(xì)胞被誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-12和隨后的IFN-γ分泌被提高，免疫刺激性核酸促進(jìn)了Th1類型的免疫應(yīng)答。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)高純度的T細(xì)胞可以直接活化細(xì)胞因子分泌的增加。然而，由免疫刺激性寡核苷酸所誘導(dǎo)的Th1細(xì)胞因子分泌促進(jìn)了細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生。
圖7是自顯影照相圖，顯示NFkB mRNA在單核細(xì)胞中的誘導(dǎo)結(jié)果，這些細(xì)胞被大腸桿菌(EC)DNA(含有未甲基化CpG基元)、對(duì)照(CT)DNA(不含未甲基化CpG基元)和脂多糖(LPS)等所處理并分別在接觸后的第15分鐘、30分鐘等各時(shí)間測(cè)量。
圖8A顯示流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果，使用的是小鼠B細(xì)胞，用二傾若丹明123染色來(lái)確定反應(yīng)性氧的種類和水平。在A組中的僅用了染料的情況顯示細(xì)胞對(duì)染料的陽(yáng)性背景值為28.6％。這個(gè)水平的反應(yīng)性氧種類在用PMA和離子霉素處理20分鐘的細(xì)胞中被提高到了80％，即陽(yáng)性對(duì)照(B組)。細(xì)胞用CpG寡核苷酸(TCCATGACGTTCCTGACGTT,SEQ ID No.10)處理后也顯示了反應(yīng)性氧種類水平的提高，即50％以上的細(xì)胞變?yōu)殛?yáng)性(D組)。然而，用同樣序列的寡核苷酸處理但CpGs被換為(TCCATGAGCTTCCTGAGTGCT,SEQ ID No.11)則沒(méi)有顯示反應(yīng)性氧種類水平的提高(E組)。
圖8B顯示流式細(xì)胞儀的結(jié)果，使用了小鼠B細(xì)胞，有氯喹存在，用二氫若丹明123染色來(lái)確定反應(yīng)性氧種類的水平。氯喹將細(xì)胞中背景的反應(yīng)性氧種類的水平稍微降低了一些，使在A組中的未處理的細(xì)胞僅有4.3％為陽(yáng)性。氯喹完全終止了在用CpG DNA處理的細(xì)胞(B組)中對(duì)反應(yīng)性氧種類的誘導(dǎo)，但對(duì)用PMA和離子霉素處理的細(xì)胞(E組)則沒(méi)有降低其反應(yīng)性氧種類水平。
圖9說(shuō)明用肺灌洗細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)時(shí)間的作圖。該圖顯示，當(dāng)小鼠開始被注射了Schistosoma mansoni卵這種誘導(dǎo)Th2應(yīng)答的“卵”并且隨后呼吸Schistosoma mansoni卵抗原“SEA”后(空心環(huán))，則在肺部?jī)?nèi)有眾多的發(fā)炎的細(xì)胞。然而，當(dāng)小鼠開始接受的是CpG寡核苷酸(SEQ ID No.10)以及卵時(shí)，則肺部?jī)?nèi)的發(fā)炎細(xì)胞并不隨呼吸SEA而提高(空心三角形)。
圖10說(shuō)明肺部灌洗嗜伊紅粒細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)時(shí)間的作圖。該圖顯示，當(dāng)小鼠開始注射了卵并隨后呼吸SEA(空心環(huán))，則在肺部?jī)?nèi)有眾多的嗜伊紅粒細(xì)胞存在。然而，當(dāng)小鼠開始接受的是CpG寡核苷酸(SEQ ID No.10)和卵時(shí)，則在肺部?jī)?nèi)的發(fā)炎細(xì)胞就不隨著后來(lái)呼吸SEA而增高(空心三角形)。
圖11是條塊圖，說(shuō)明巨嗜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、嗜伊紅粒細(xì)胞分別暴露于鹽水、卵加SEA、卵加SEQ ID No.11及隨后的SEA、卵加對(duì)照寡核苷酸(SEQ ID No.11)以及隨后的SEA后，誘導(dǎo)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的效應(yīng)。當(dāng)小鼠在暴露于卵的同時(shí)給予對(duì)照寡核苷酸，則吸入SEA后對(duì)嗜伊紅粒細(xì)胞在肺部?jī)?nèi)沒(méi)有明顯效應(yīng)。因此，當(dāng)小鼠在第14天或第21天呼吸卵，它們?cè)诜尾績(jī)?nèi)產(chǎn)生急性發(fā)炎。然而，如果在第0天或第7天開始接觸抗原的時(shí)候?qū)pG寡核苷酸同卵一起提供給小鼠，則就完全防止小鼠在隨后的第14天呼吸卵抗原所產(chǎn)生的嗜伊紅粒細(xì)胞增加。
圖12是一個(gè)條塊圖，說(shuō)明注射不同劑量的保護(hù)性寡核苷酸SEQ ID No.10所產(chǎn)生的嗜伊紅粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的情況。
圖13是隨時(shí)間的小鼠產(chǎn)生白細(xì)胞介素-4(IL-4)的情況(pg/ml)，其所應(yīng)答的分別是注射卵和隨后的SEA(空心菱形)；卵加SEQ ID No.10和隨后的SEA(空心環(huán))；鹽水加隨后的鹽水(空心矩形)。該圖的結(jié)果顯示，所產(chǎn)生的發(fā)炎的應(yīng)答相關(guān)于在肺部的Th2細(xì)胞因子IL-4的水平。
圖14是條塊圖，說(shuō)明隨時(shí)間的小鼠產(chǎn)生白細(xì)胞介素-12(IL-12)的情況(pg/ml)，其所應(yīng)答的分別是注射鹽水；卵和隨后的SEA；卵加SEQ ID No.10和隨后的SEA。該圖的結(jié)果顯示，注射含有未甲基化CpG基元的寡核苷酸可以實(shí)際上使肺對(duì)細(xì)胞因子的應(yīng)答變?yōu)楫a(chǎn)生IL-12，表明是Th1類型的免疫應(yīng)答。
圖15是條塊圖，說(shuō)明隨時(shí)間的小鼠產(chǎn)生伽瑪干擾素(IFN-γ)的情況(pg/ml)，其所應(yīng)答的分別是注射鹽水；卵和隨后的SEA；卵加SEQ ID No.10和隨后的SEA。該圖的結(jié)果顯示，注射含有未甲基化CpG基元的寡核苷酸還可以使肺對(duì)細(xì)胞因子的應(yīng)答變?yōu)楫a(chǎn)生IFN-γ，表明是Th1類型的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的詳細(xì)描述定義在本文中，下面各種術(shù)語(yǔ)和詞組所表達(dá)的意思定義如下術(shù)語(yǔ)“過(guò)敏原”指的是可以在易感染的對(duì)象中產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)或氣喘反應(yīng)的物質(zhì)。過(guò)敏原的名單是非常巨大的，可以包括花粉、昆蟲毒物、動(dòng)物皮、真菌孢子和藥物(青霉素)等。天然的、動(dòng)物的和植物的過(guò)敏原的實(shí)例包括對(duì)下面各屬為特異性的蛋白質(zhì)犬(Canisf familiaris)，螨(Dermatophagoides farinae),Felis(Felis domesticus)，豚草(Ambrosia artemiisfolia)，黑麥草(Lolium perenne或Lolium multiflorum)，柳杉(Cryptomeriajaponica)，鏈格孢(Alternaria alternata)，小蠹甲(Alder)，榿木(Alnus gultinosa)，樺木(Betula verrucosa)，櫟(Quercusalba)，木犀欖(Olea europa)，蒿(Artemisia vulgaris)，車前(Plantago lanceolata)，墻草(Parietaria officinalis或Parietariajudaica)，小蠊(Blattella germanica)，蜂(APis multiflorum)，柏木(Cupressus sempervirens,Cupressus arizonica和Cupressusmacrocarpa)，刺柏(Juniperus sabinoides,Juniperus virginiana,Juniperus communis和Juniperus ashei),Thuya(Thuyaorientalis)，扁柏(Chamaecyparis obtusa)，大蠊(Periplanetaamericana)，冰草(Agropyron repens)，黑麥(Secale cereale)，小麥(Triticum aestivum)，鴨茅(Dactylis glomerata)，羊茅(Festucaelatior)，早熟禾(Poapratensis或Poa compressa)，燕麥(Avenasativa)，絨毛草(Holcus lanatus)，黃花茅(Anthoxanthumodoratum)，燕麥草(Arrhenatherum elatius)，剪股穎(Agrostisalba)梯牧草(Phleum pratense),(Phalaris arundinacea)，雀稗(Paspalum notatum)，高粱(Sorghum halepensis)，以及雀麥(Bromus inermis)。
術(shù)語(yǔ)“過(guò)敏”指的是對(duì)某種物質(zhì)(過(guò)敏原)所獲得的過(guò)度敏感。過(guò)敏包括濕疹、過(guò)敏性鼻炎、枯草熱、支氣管氣喘、尋麻疹、食物過(guò)敏，以及其它的特異反應(yīng)性疾病。
術(shù)語(yǔ)“氣喘”指的是呼吸道的疾病，其特征是發(fā)炎，氣管狹窄，對(duì)吸入的物質(zhì)的反應(yīng)增加。氣喘雖然不是必然的但也是經(jīng)常地伴隨著特異反應(yīng)性或過(guò)敏性癥狀。
術(shù)語(yǔ)“免疫系統(tǒng)缺陷”指的是這樣的一些疾病或紊亂，其中，個(gè)體的免疫系統(tǒng)不能正常發(fā)揮功能，或?qū)⑹乖搨€(gè)體的免疫應(yīng)答不能對(duì)消除腫瘤或癌癥[例如，腦瘤、肺(包括小細(xì)胞和非小細(xì)胞)癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、直腸癌、以及其它的惡性瘤和肉瘤]或其它的感染而提高其有用性。
感染性的病毒的實(shí)例包括Retroviridae[例如，人免疫缺陷病毒，如HIV-1(也稱為HTLV-Ⅲ,LAV或HTLV-Ⅲ/LAV，或HIV-Ⅲ；以及其它的分離物，例如HIV-LP)]；小RNA病毒科[Picornaviridae(例如，polio病毒，甲肝病毒，腸道病毒，人柯薩奇病毒，鼻病毒)]，嵌杯樣病毒[Caliciviridae(例如，造成腸道疾病的品系)]，黃色病毒[Flaviridae，例如，登革病毒(dengue viruses)，腦病毒(encephalitis viruses)，黃熱病毒(yellow fever viruses)]，冠形病毒[Coronaviridae，例如冠形病毒(coronaviruses)]，彈狀病毒[Rhabdoviridae，例如，vesicular stomatitis viruses,rabies viruses],Filoviridae(例如，ebola viruses)，副粘病毒[Paramyxoviridae，例如，parainfluenzaviruses,mumps virus,measles virus,respiratory syncytialvirus]，亞粘病毒[Orthomyxoviridae，例如，influenza viruses],Bungaviridae[例如，Hantaan viruses,bunga viruses,phleboviruses和Nairo viruses]，嵌沙樣病毒[Arena viridae，例如，hemorrhagic fever viruses]，呼吸腸道病毒[Reoviridae，例如，reoviruses,orbiviruses和rotaviruses],Birnaviridae，肝炎病毒[Hepadnaviridae，例如，乙形肝炎病毒(Hepatitis Bvirus)]，細(xì)小病毒[Parvoviridae(parvoviruses)]，乳多孔病毒[Papovaviridae，例如，乳突病毒(papilloma viruses,polyomaviruses)]，腺病毒[Adenoviridae(most adenoviruses)]，皰疹病毒[Herpesviridae，例如，herpes simplex virus(HSV)1和2,varicella zoster virus,cytomegalovirus(CMV),herpes viruses]，痘病毒[variola viruses,vaccinia viruses,pox viruses]，和虹色病毒[Iridoviridae，例如，African swine fever virus]，以及一些未分類的病毒[例如，海綿腦病的致病劑，δ肝炎致病劑(被認(rèn)為是乙型肝炎病毒的缺陷型變體)，非甲非乙肝炎的致病劑(1類=內(nèi)部傳染，2類=腸胃外傳染(如丙型肝炎)，Norwalk病毒以及相關(guān)的病毒，和星狀病毒)]。
感染性細(xì)菌的實(shí)例包括Helicobacter pyloris，疏螺旋體(Borelia burgdorferi,Legionella pneumophilia，分桿桿菌[Mycobacteria sps.，例如，結(jié)核桿菌(M.Tuberculosis)，鳥型結(jié)核分支桿菌(M avium),M.intracellulare,M.kansaii,M.gordonae]，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)，腦膜炎雙球菌(Neisseriameningitidis)，單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)，釀膿鏈球菌[Streptococcus pyogenes(A組Streptococcus)]，無(wú)孔鏈球菌[Streptococcus agalactiae(B組Streptococcus)]，鏈球菌屬[Streptococcs(viridans組)]，糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)，牛鏈球菌(Streptococcus bovis)，鏈球菌屬(Streptococcus厭氧菌，anaerobic sps.)，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，彎曲桿菌(pathogenicCampylobacter sp.,)，腸球菌(Enterococcus sp.,)，流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)，炭疽芽孢桿菌(Bacillusantracis)，白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)，棒桿菌屬( Corynebacterium sp.,)，紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)，產(chǎn)氣英膜梭菌(Clostridium perfringers)，破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani),Enterobacter aerogenes，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，多殺巴斯德氏菌(Pasturella multocida)，擬桿菌(Bacteroides sp.,)，核粒梭形桿菌(Fusobacterium nucleatum)，念球狀鏈桿菌(Streptobacillus moniliformis)，梅毒螺旋菌(Treponemapallidium)，細(xì)弱密螺旋體(Treponema pertenue)，鉤端螺旋體(Leptospira)和伊氏放線菌(Actinomyces israelli)。
感染性真菌的實(shí)例包括新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)，英膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)，粗球孢子菌(Coccidioides immitis)，皮炎芽酵母(Blastomycesdermatitidis)，沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)，白色念球菌(Candida albicans)。其它的感染性有機(jī)體(例如，原生動(dòng)物)包括惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)和鼠弓形蟲(Toxoplasma gondii)。
術(shù)語(yǔ)“免疫刺激性核酸分子”指的是這樣的核酸分子，它們含有未甲基化的胞嘧啶，鳥嘌呤二核苷酸序列(即，“CpGDNA”或含有胞嘧啶并接著鳥苷且由磷酸鹽鍵所連接的DNA)并刺激脊椎動(dòng)物淋巴細(xì)胞(例如，具有促有絲分裂效應(yīng)，或誘導(dǎo)或提高細(xì)胞因子的表達(dá))。免疫刺激性核酸分子可以是雙鏈的或單鏈的。一般，雙鏈的分子在體內(nèi)比較穩(wěn)定，而單鏈的分子則具有提高了的免疫活性。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了被分離的免疫刺激性核酸序列，其含有的CpG基元由下式表達(dá)5′N1X1CGX2N23′其中，至少有一個(gè)核苷酸將連續(xù)的CpGs間隔開來(lái)；X1是腺嘌呤，鳥嘌呤，或胸腺嘧啶；X2是胞嘧啶或胸腺嘧啶；N是任何的核苷酸，且N1+N2是0-26堿基，條件是N1和N2都不含有CCGG四元體或多于一個(gè)的CCG或CGG三元體；并且核酸序列的長(zhǎng)度為約8-30堿基對(duì)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了被分離的免疫刺激性的含有CpG基元的核酸序列，其表達(dá)式為5′N1X1X2CGX3X4N23′其中，至少有一個(gè)核苷酸將連續(xù)的CpGs間隔開來(lái)；X1X2是選自GpT、GpG、GpA、ApT和ApA；X3X4是選自TpT或CpT；N是任何的核苷酸，且N1+N2是0-26堿基，條件是N1和N2都不含有CCGG四元體或多于一個(gè)的CCG或CGG三元體；并且核酸序列的長(zhǎng)度為約8-30堿基對(duì)。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的免疫刺激性核酸序列包括X1X2，它們選自GpT、GpG、GpA和ApA，且X3X4選自TpT、CpT和GpT(見(jiàn)表5)。為了促進(jìn)吸收到細(xì)胞中，含有免疫刺激性核酸分子的CpG優(yōu)選為8-30個(gè)堿基的長(zhǎng)度。然而，如果有足夠的免疫刺激性基元的存在，則任何長(zhǎng)度的核酸(甚至很多個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng))都可以是免疫刺激性的，因?yàn)檫@樣的大型的核酸在細(xì)胞內(nèi)被降解為寡核苷酸。優(yōu)選的合成性的寡核苷酸不含有CCGG四元體或多于一個(gè)的CCG或CGG三元體在其或靠近其5′和/或3′端，和/或其共有的促有絲分裂CpG基元不是回文結(jié)構(gòu)。當(dāng)寡核苷酸整合有磷酸鹽主鏈的修飾時(shí)，用穩(wěn)定的寡核苷酸可以獲得長(zhǎng)久的免疫刺激性。例如，當(dāng)修飾為硫代磷酸酯或硫代磷酸酯類的修飾時(shí)既是如此。另外，更具體地講，磷酸鹽主鏈修飾發(fā)生在核酸的5′端，即在核酸5′端的最初兩個(gè)核苷酸上。進(jìn)而言之，磷酸鹽主鏈修飾可以發(fā)生在核酸的3′端，即在核酸的3′端的最后5個(gè)核苷酸上。
優(yōu)選的免疫刺激性CpG DNA是寡核苷酸時(shí)，其長(zhǎng)度為8-30個(gè)堿基對(duì)。另外，CpG二核苷酸可以在質(zhì)粒中大規(guī)模生產(chǎn)，當(dāng)其被給予個(gè)體后，降解為寡核苷酸。優(yōu)選的免疫刺激性核酸分子[例如，用于提高疫苗的有效性，或在個(gè)體內(nèi)刺激抗體(例如體液的)應(yīng)答來(lái)治療免疫系統(tǒng)缺陷]具有相對(duì)高的對(duì)B細(xì)胞、單核細(xì)胞和/或天然殺死細(xì)胞反應(yīng)的刺激系數(shù)(例如，細(xì)胞因子、繁殖性、溶胞性或其它的反應(yīng))。
本發(fā)明的核酸序列刺激對(duì)象中的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。細(xì)胞因子包括但不限于IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF。這些序列的實(shí)例包括TCCATGTCGCTCCTGATGCT(SEQ ID NO:42),TCCATGTCGTTCCTGATGCT(SEQ ID NO:43)，和TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:56)。
本發(fā)明的核酸序列還可以用于刺激天然殺死細(xì)胞(NK)在如人的對(duì)象中的溶胞活性。具體的但非限制性的實(shí)例包括TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT(SEQ ID NO:57),TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:58),TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:59),GCGTGCGTTGTCGTTGTCGTT(SEQ ID NO:),
TGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT(SEQ ID NO:),TGTCGTTGTCGTTGTCGTT(SEQ ID NO:60)和TCGTCGTCGTCGTT(SEQ ID NO:61)。
本發(fā)明的核酸序列還可以用于在如人的對(duì)象中刺激B細(xì)胞繁殖。具體的但非限制性的實(shí)例包括TCCTGTCGTTCCTTGTCGTT(SEQ ID NO:62),TCCTGTCGTTTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:63),TCGTCGCTGTCTGCCCTTCTT(SEQ ID NO:64),TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT(SEQ ID NO:65),TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:66),TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:67)，和TGTCGTTGTCGTTGTCGTT(SEQ ID NO:68)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明的核酸序列可以在哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)抗體時(shí)作為附劑使用。具體的但非限制性的實(shí)例包括TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:10),GTCG(T/C)T和TGTCG(T/C)T。進(jìn)而言之，這些核酸序列可以用于治療和防止氣喘疾病的癥狀，將對(duì)象的免疫應(yīng)答從Th2型改變?yōu)門h1型。具體的實(shí)例包括TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ IDNO:10)。
具體的免疫刺激性CpG DNA的刺激指數(shù)可以用各種免疫細(xì)胞檢測(cè)來(lái)測(cè)定。優(yōu)選地，免疫刺激性CpG DNA的刺激指數(shù)對(duì)B細(xì)胞繁殖為約5，優(yōu)選至少為至少10，更優(yōu)選地為至少15，最優(yōu)選地為至少約20，由3H尿苷在B細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定，其中，在37℃下與20μM的ODN接觸20小時(shí)，并且用1μCi的3H尿苷沖擊，并按照實(shí)施例1所述在4小時(shí)后收獲和計(jì)數(shù)。對(duì)于體內(nèi)的應(yīng)用，例如，用于治療免疫系統(tǒng)缺陷刺激細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)象中的免疫反應(yīng)，重要的是，免疫刺激性CpG DNA要能夠有效地誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和/或天然殺死細(xì)胞(NK)的細(xì)胞溶胞活性。
優(yōu)選的免疫刺激性CpG核酸應(yīng)該可以產(chǎn)生至少約500pg/ml的TNF-α、15pg/ml的IFN-γ、70pg/ml的GM-CSF、275pg/ml的IL-6、200pg/ml的IL-12，具體依據(jù)治療指標(biāo)而定，可以按照實(shí)施例2中的所述的檢測(cè)來(lái)確定。其它優(yōu)選的免疫刺激性CpGDNAs要能夠產(chǎn)生至少約10％，更優(yōu)選至少約15％，而最優(yōu)選至少約20％的YAC-1細(xì)胞特異性溶胞，或至少約30％，更優(yōu)選至少約35％，和最優(yōu)選至少約40％的2C11細(xì)胞特異性溶胞，由實(shí)施例4中描述的檢測(cè)來(lái)確定。
術(shù)語(yǔ)“核酸”或“DNA”指的是多核苷酸{即，含有糖(如核糖或脫氧核糖)且通過(guò)磷酸鹽基團(tuán)連接到可交換的有機(jī)堿上的分子，其替換嘧啶[例如，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)]，或替代嘌呤[例如，腺嘌呤(A)，鳥嘌呤(G)]}。在本文中，該術(shù)語(yǔ)指的是核糖核苷酸以及寡脫氧核糖核苷酸。該術(shù)語(yǔ)應(yīng)該包括多核苷(即，多核苷酸減去一個(gè)磷酸)以及其它的含有有機(jī)堿的聚合物。核酸分子可以從已經(jīng)存在的核酸源獲得(例如，基因組或cDNA)，但是，優(yōu)選合成性的(例如，由寡核苷酸合成所產(chǎn)生的)。
術(shù)語(yǔ)“核酸釋放復(fù)合物”指的是核酸分子(通過(guò)離子鍵或共價(jià)鍵，或包埋方式)與靶向裝置[例如，對(duì)靶細(xì)胞(如B細(xì)胞和天然殺死(NK)細(xì)胞)表面有較高親和結(jié)合性和/或提高靶細(xì)胞的吸收的分子]結(jié)合在一起。核酸釋放復(fù)合物的實(shí)例包括與下列物質(zhì)結(jié)合的核酸固醇(例如，膽固醇)、脂類(例如，陽(yáng)離子脂、病毒體、或脂質(zhì)體)、或靶細(xì)胞特異性結(jié)合制劑(例如，由靶細(xì)胞特異性受體所識(shí)別的配體)。優(yōu)選的復(fù)合物必須在體內(nèi)足夠地穩(wěn)定來(lái)防止在被靶細(xì)胞內(nèi)化之前就顯著地解脫偶聯(lián)。然而，這些復(fù)合物要能夠在細(xì)胞內(nèi)適宜的條件下被剪切，使核酸以功能性的形式被釋放。
術(shù)語(yǔ)“回文序列”指的是反向的重復(fù)(即，如ABCDEE′D′C′B′A′這樣的序列，其中A和A′是能夠形成常規(guī)的watson-Crick堿基對(duì)的堿基。在體內(nèi)，這樣的序列可以形成雙鏈結(jié)構(gòu)。
術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定化的核酸分子”指的是在體內(nèi)對(duì)降解(例如，通過(guò)外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶的降解)具有相對(duì)抵抗性的核酸分子。穩(wěn)定可以是長(zhǎng)度的功能或次級(jí)結(jié)構(gòu)的功能。長(zhǎng)度為幾十個(gè)甚至上百個(gè)堿基的含有未甲基化CpG的核酸分子對(duì)體內(nèi)降解有相對(duì)的抵抗性。對(duì)于較短的免疫刺激性核酸分子，次級(jí)結(jié)構(gòu)可以穩(wěn)定和提高其功能。例如，如果核酸分子的3′端具有對(duì)上游區(qū)的自己互補(bǔ)性，則它就可以回折來(lái)形成某種莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，然后，核酸分子變?yōu)榉€(wěn)定的并從而表現(xiàn)更強(qiáng)的活性。
優(yōu)選的本發(fā)明的穩(wěn)定化核酸分子具有被修飾的主鏈。用于免疫刺激時(shí)，特別優(yōu)選的核酸分子是硫代磷酸酯(即，核酸分子的至少一個(gè)磷酸氧被硫所取代)或硫代磷酸酯修飾的核酸分子。更具體地講，磷酸主鏈修飾發(fā)生在核酸的5′端，在核酸5′端的最初兩個(gè)核苷酸上。進(jìn)而言之，磷酸主鏈修飾可以發(fā)生在核酸的3′端，發(fā)生在核酸的3′端的最后5個(gè)核苷酸上。除了穩(wěn)定的核酸分子外，正如本文中進(jìn)一步描述的那樣，硫代磷酸酯-修飾(包括二硫代磷酸酯-修飾)的核酸分子可以提高該核酸分子的免疫刺激程度，它們含有所示的未甲基化CpG二核苷酸。題目為“硫代磷酸酯寡核苷酸類似物的免疫刺激”的國(guó)際專利申請(qǐng)公開第WO95/26204號(hào)也報(bào)道了硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸的非序列特異性的免疫刺激效果。如本文所描述的，含有未甲基化CpG的并具有硫代磷酸酯主鏈的核酸分子已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)傾向于活化B細(xì)胞活性，而含有未甲基化CpG的并具有磷酸二酯主鏈的核酸分子已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)傾向于活化單核性細(xì)胞(巨嗜細(xì)胞、樹狀細(xì)胞和單核細(xì)胞)和NK細(xì)胞。帶有優(yōu)選的人基元的硫代磷酸酯CpG寡核苷酸也是單核性細(xì)胞和NK細(xì)胞的強(qiáng)活化子。
其它的穩(wěn)定的核酸分子包括非離子性DNA類似物，例如烷基或芳基的磷酸酯(其中帶電的磷酸氧被烷基或芳基所取代)，磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中的帶電的氧基團(tuán)被烷基化。帶有二醇例如四甘醇或六甘醇的核酸分子，已經(jīng)顯示在其一個(gè)終端或兩個(gè)終端都是基本抵抗核酸酶的降解的。
術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”指的是人或脊椎動(dòng)物，包括狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、雞、猴子、大鼠，和小鼠。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“載體”指的是能夠運(yùn)送與之相連的其它核酸的核酸分子。優(yōu)選的載體是能夠?qū)εc之相連的核酸進(jìn)行自我復(fù)制和表達(dá)的載體(例如，附加體)。能夠?qū)εc之可工作地相連的基因的表達(dá)進(jìn)行指導(dǎo)的載體被在本文中成為“表達(dá)載體”。總體來(lái)說(shuō)，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體經(jīng)常都是“質(zhì)?！毙问降模湟话闼傅氖请p鏈DNA的環(huán)形物，其在載體形式時(shí)不與染色體相連。在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“質(zhì)粒”和“載體”是可以相互替換的，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用形式的載體。然而，本發(fā)明也包括其它形式的載體，即它們的功能等同物，以及隨后變?yōu)楸绢I(lǐng)域所知的那些載體。某些含有未甲基化CpG并具在在體內(nèi)和體外的B細(xì)胞刺激活性的核酸在根據(jù)隨后的實(shí)施例1和2的描述所進(jìn)行的對(duì)內(nèi)源性逆病毒序列具有特異性的兩種反義寡核苷酸刺激淋巴細(xì)胞效應(yīng)的研究中，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)了在24個(gè)“對(duì)照”(包括在“反義”O(jiān)DN組中的各種雜亂的、有義的、和錯(cuò)配的對(duì)照)中的2個(gè)也能夠介導(dǎo)B細(xì)胞活化和IgM分泌，而其它的“對(duì)照”則不具有這樣的功能。
這兩個(gè)研究的結(jié)果表明，這種“對(duì)照”O(jiān)DN的B細(xì)胞活化機(jī)制可能不涉及反義效果，1)通過(guò)與基因庫(kù)(GenBank)所列的脊椎動(dòng)物DNA序列相比較，沒(méi)有顯示出比那些沒(méi)有刺激性的ODN更多的同源性，以及2)這兩個(gè)對(duì)照在使用了10μg的脾polyA+RNA的Northen印跡中沒(méi)有顯示出雜交。在不同的合成器上再次合成這些ODN，或用聚丙烯酰胺凝膠電泳或高壓液相色譜來(lái)充分提純，都得到相等的刺激，消除了雜質(zhì)的可能性。采用來(lái)自C3H/HeJ小鼠的B細(xì)胞也見(jiàn)到了類似的刺激，這消除了脂多糖(LPS)污染會(huì)影響結(jié)果的可能性。
兩個(gè)“對(duì)照”O(jiān)DN所造成B細(xì)胞活化與兩個(gè)“反義”O(jiān)DN的情況相類似的事實(shí)提出了這樣的可能性，即所有四個(gè)ODN對(duì)B細(xì)胞的刺激通過(guò)的是某種非反義機(jī)制進(jìn)行的，所涉及的序列基元在所有的其它的非刺激性對(duì)照ODN中都不存在。比較這些序列發(fā)現(xiàn)，所有四個(gè)刺激性O(shè)DN含有的CpG二核苷酸處于與非刺激性對(duì)照不同的序列位置。
為了確定存在于刺激性O(shè)DN中的CpG基元是否負(fù)責(zé)所觀察到的刺激作用，合成了超過(guò)300個(gè)的ODN，它們的長(zhǎng)度范圍是5-42個(gè)堿基對(duì)，含有甲基化或未甲基化的CpG二核苷酸，或者不含有CpG二核苷酸，并且位置也不同。這些ODN，包括兩個(gè)原始的“對(duì)照”(即ODN1和2)以及兩個(gè)原始的合成性“反義”物[ODN3D和3M；Krieg,A.M.J.Immunol.143:2448(1989)]，然后檢查它們的脾細(xì)胞體外效果(代表性序列在表1中給出)。含有CpG二核苷酸的幾種ODN誘導(dǎo)了B細(xì)胞的活化和IgM的分泌；這種刺激的程度一般可以由增加更多的CpG二核苷酸來(lái)提高(表1；比較ODN2與2a或3D與3Da和3Db)?？雌饋?lái)刺激不是反義機(jī)制或雜質(zhì)的結(jié)果。ODN沒(méi)有造成可檢測(cè)的γδ或其它的T細(xì)胞種群的繁殖。
如果CpG二核苷酸發(fā)生突變，有絲分裂ODN序列都變?yōu)榉谴碳ば缘?表1；比較ODN1與1a；3D與3Dc；3M與3Ma；以及4與4a)，或如果CpG二核苷酸的胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶取代(表1；ODN1b,2b,3Dd，和3Mb)。CpG基元的部分甲基化造成刺激效果的部分損失(比較2a與2c，表1)。相對(duì)照，對(duì)其它的胞嘧啶的甲基化沒(méi)有減少ODN活性(ODN1c,2d,3De和3Mc)。這些數(shù)據(jù)確認(rèn)了CpG基元存在于ODN中活化B細(xì)胞的重要元素。
在這些研究的過(guò)程中，變的更為清楚的是，在CpG二核苷酸側(cè)翼的堿基在由ODN誘導(dǎo)的小鼠B細(xì)胞活化的確定中起著重要的作用。最佳的刺激基元被確定包括有以兩個(gè)5′嘌呤(優(yōu)選為GpA二核苷酸)和兩個(gè)3′嘧啶(優(yōu)選TpT或TpC二核苷酸)為側(cè)翼的CpG。將CpG基元趨向靠近這種理想形態(tài)的ODN突變改善了刺激性(例如，表1，比較ODN2與2e；3M與3Md)，而那些打亂該基元的突變則減弱了刺激性(見(jiàn)表1，比較ODN 3D與3Df；4與4b,4c和4d)。另一方面，在CpG以外的突變沒(méi)有減弱刺激性(例如，表1，比較ODN1與1d；3D與3Dg；3M與3Me)。對(duì)于活化人的細(xì)胞，最佳的側(cè)翼堿基是稍有不同的(見(jiàn)表5)。
在那些實(shí)驗(yàn)過(guò)的ODNs中，長(zhǎng)度小于8個(gè)堿基對(duì)的ODN都沒(méi)有刺激性(例如，表1,ODN4e)。在所測(cè)試過(guò)的48個(gè)長(zhǎng)度為8個(gè)堿基對(duì)的ODN中，確定了具有強(qiáng)刺激性的序列是TCAACGTT(ODN4)，其含有自我互補(bǔ)的“回文序列”AACGTT。在對(duì)該基元的進(jìn)一步優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)終端都有G的ODN具有更強(qiáng)的刺激性，特別當(dāng)ODN被硫代磷酸酯修飾了終端的核苷酸間的連接而具有對(duì)核酸酶的抗性后更是如此。ODN1585[5′GGGGTCAACGTTCAGGGGGG3′(SEQ ID NO:12)]中，前兩個(gè)和最后的5個(gè)核苷酸間的連接都被硫代磷酸酯修飾了，使其在小鼠脾細(xì)胞的繁殖中平均提高了25.4倍，而相比之下，由ODN1638所造成的繁殖只增加了3.2倍，該ODN1638與ODN1585具有相同的序列，只是在兩端的第10位的G被第10位的A所取代。富含G的終端的效果是其為順式，對(duì)ODN加上多G的終端但不將CpG基元與1638一起加入細(xì)胞，也不會(huì)得到增強(qiáng)的繁殖。對(duì)于長(zhǎng)度大于8個(gè)堿基對(duì)的核酸，含有未甲基化CpG的非回文序列基元被發(fā)現(xiàn)是更具有刺激性的。
含有6個(gè)堿基回文序列以及在5′端有TpC二核苷酸的10元ODN也是活性的(見(jiàn)表1,ODN4b,4c)。在5′端的其它的二核苷酸減弱刺激性(例如，ODN4f，對(duì)所有可能的16種二核苷酸都進(jìn)行了測(cè)試)。有3′端二核苷酸存在并不足以補(bǔ)償對(duì)5′端二核苷酸的缺失(見(jiàn)表1,ODN4g)。對(duì)回文序列打亂就消除了10元ODN的刺激性(例如，表1,ODN4h)，但是，在更長(zhǎng)的ODN中，回文序列不是必須的。
表1寡核苷酸對(duì)小鼠B細(xì)胞的刺激
′刺激指數(shù)是至少三個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并且與沒(méi)有加入ODN的培養(yǎng)物的小孔進(jìn)行比較。ND=未進(jìn)行。CpG二核苷酸用下劃線標(biāo)出。黑點(diǎn)表示位置，短線表示缺失。Z代表5甲基胞嘧啶。
表2確定對(duì)小鼠IL-6生產(chǎn)和B細(xì)胞活化為最優(yōu)的CpG基元
黑點(diǎn)代表位置；CpG二核苷酸用下劃線標(biāo)出；ND=未進(jìn)行a進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)為至少三次近似的結(jié)果。CH12.LX和脾B細(xì)胞的未刺激的對(duì)照培養(yǎng)物的IL-6水平≤10pg/ml。未刺激的培養(yǎng)物的IgM水平為547±82ng/ml。CpG二核苷酸用下劃線標(biāo)出，黑點(diǎn)代表位置。b[3H]尿嘧啶吸收用對(duì)未刺激的對(duì)照(2322.67±213.68cpm)所提高的倍數(shù)表示(SI刺激指數(shù))。細(xì)胞用20μM各種CpG O-ODN刺激。數(shù)據(jù)代表三個(gè)數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。c用ELISA測(cè)定。
對(duì)淋巴細(xì)胞活化的動(dòng)力學(xué)的研究采用了小鼠脾細(xì)胞。在加入ODN的同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沖擊，4小時(shí)后收獲，已經(jīng)有了2倍的3H尿嘧啶的吸收。刺激的峰值在12-48小時(shí)，然后降低。24小時(shí)后，檢測(cè)不到完整的ODN，這也許就是當(dāng)純化的B細(xì)胞隨后在有或沒(méi)有抗-IgM(亞促有絲分裂劑量)條件下與CpG ODN一起培養(yǎng)時(shí)發(fā)生刺激性下降的原因，在48小時(shí)后，兩種促有絲分裂還造成繁殖也同時(shí)增強(qiáng)約10倍。刺激的力度依賴于濃度，并且在對(duì)兩種物質(zhì)為優(yōu)化的條件下都一致地超過(guò)LPS。含有抗核酸酶的硫代磷酸酯主鏈的寡核苷酸比未修飾的寡核苷酸強(qiáng)大約200倍。
采用細(xì)胞生長(zhǎng)循環(huán)來(lái)確定由CpG-ODN活化的B細(xì)胞的數(shù)量。CpG-ODN誘導(dǎo)了在大于95％的B細(xì)胞的循環(huán)。用流式細(xì)胞儀區(qū)分脾B淋巴細(xì)胞為CD23-(邊緣區(qū))和CD23+(小泡區(qū))亞群，它們對(duì)ODN誘導(dǎo)的刺激都有同樣的反應(yīng)，用Percoll梯度區(qū)分的B細(xì)胞類群也是休眠和活化的種群。這些研究表明，CpG-ODN誘導(dǎo)幾乎所有的B細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)。免疫刺激性核酸分子對(duì)小鼠B細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的封閉有些B細(xì)胞系，例如WEHI-231，被誘導(dǎo)經(jīng)歷生長(zhǎng)的休眠和/或編程性細(xì)胞死亡，應(yīng)答于它們的抗原受體與抗-IgM的交聯(lián)[Jakway,J.P.et al.,″Growth regulation ofthe B lymphoma cell lineWEHI-231 by anti-immunoglobulin,lipopolysaccharide and otherbacterial products″J.Immunol.137:2225(1986)；Tsubata,T.,J.Wuand T.Honio:B-cell apoptosis indueced by antigen receptorcorsslinking is blocked by a T-cell signal through CD40.″Nature364:645(1993)]。用某些刺激物如LPS和CD40配體可以將WEHI-231細(xì)胞從這種生長(zhǎng)休眠狀態(tài)下恢復(fù)出來(lái)。含有CpG基元的ODN也被發(fā)現(xiàn)可以保護(hù)WEHI-231細(xì)胞不受抗-IgM誘導(dǎo)的生長(zhǎng)休眠的影響，表明這種效果不需要輔助細(xì)胞種群。隨后的研究工作表明，CpG ODN誘導(dǎo)Bcl-x和myc表達(dá)，它們可能對(duì)抵抗編程性細(xì)胞死亡有作用。再者，CpG核酸被發(fā)現(xiàn)可以封閉人細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡。這種對(duì)編程性細(xì)胞死亡的抑制具有重要性，因?yàn)樗鼘⑻岣吆脱娱L(zhǎng)CpG DNA的免疫活化。鑒定對(duì)誘導(dǎo)小鼠IL-6和IgM分泌以及B細(xì)胞繁殖為最優(yōu)化的CpG基元為了確定最優(yōu)化的B細(xì)胞刺激性CpG基元是否與對(duì)IL-6分泌的最優(yōu)化CpG基元相同，研究了一組ODN，它們的CpG二核苷酸的側(cè)翼堿基被逐步取代。對(duì)該組ODN的研究著重于分析它們對(duì)B細(xì)胞繁殖、Ig生產(chǎn)、IL-6分泌的效應(yīng)，使用了脾B細(xì)胞和CH12.LX細(xì)胞。如表2所示，優(yōu)化的刺激性基元含有未甲基化的CpG，側(cè)翼為兩個(gè)5′嘌呤和兩個(gè)3′嘧啶。一般地說(shuō)，5′嘌呤向3′嘧啶的突變和3′嘧啶向嘌呤的突變都顯著地降低這種效應(yīng)。從5′嘌呤向C的變化是特別的有破壞性的，但是，從5′嘌呤向T的變化或3′嘧啶向嘌呤的變化所產(chǎn)生的影響就比較小。根據(jù)這些分析以及其它的ODN的結(jié)果，確定了優(yōu)化的CpG基元對(duì)誘導(dǎo)IL-6分泌為TGACGTT，其相同于優(yōu)化的促有絲分裂和IgM誘導(dǎo)性CpG基元(表2)。該基元比任何所研究過(guò)的含有回文序列的序列都更具有刺激性(1639,1707和1708)。由在細(xì)菌DNA中或寡核苷酸中的CpG基元誘導(dǎo)的小鼠細(xì)胞因子的分泌如在實(shí)施例9中所描述的那樣，以CpG DNA刺激后的脾細(xì)胞分泌的IL-6的數(shù)量用ELISA測(cè)定。采用的不是全脾細(xì)胞，而是用去除了T細(xì)胞的脾細(xì)胞培養(yǎng)物，進(jìn)行了體外研究，經(jīng)過(guò)最初的研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞對(duì)CpG DNA刺激的脾細(xì)胞生產(chǎn)IL-6沒(méi)有任何作用。如表3所示，用大腸桿菌DNA培養(yǎng)的細(xì)胞明顯地提高了IL-6的生產(chǎn)，而用小牛胸腺DNA培養(yǎng)的細(xì)胞則沒(méi)有提高。為了確認(rèn)所觀察到的用大腸桿菌DNA培養(yǎng)的細(xì)胞的IL-6生產(chǎn)的提高不是由于污染物或其它的細(xì)菌產(chǎn)物所造成的，在進(jìn)行分析之前，對(duì)DNA用DNA酶進(jìn)行處理。這種DNA酶的預(yù)處理取消了由大腸桿菌DNA誘導(dǎo)的IL-6的生產(chǎn)(表3)。此外，從LPS-非應(yīng)答C3H/HeJ小鼠來(lái)的脾細(xì)胞應(yīng)答了細(xì)菌DNA而產(chǎn)生了相似水平的IL-6。為了研究由大腸桿菌DNA誘導(dǎo)的IL-6的分泌是否由細(xì)菌DNA中的未甲基化CpG二核苷酸所介導(dǎo)，檢驗(yàn)了甲基化的大腸桿菌DNA和一組合成性O(shè)DN。如表3所示，CpG ODN顯著地誘導(dǎo)了IL-6的分泌(ODN5a,5b,5c)，而CpG甲基化大腸桿菌DNA，或含有甲基化CpG的ODN(ODN5f)，或不含CpG的ODN(ODN5d)則都沒(méi)有發(fā)生誘導(dǎo)。在CpG二核苷酸(ODN5b)以外位置的改變，以及其它的胞嘧啶的甲基化(ODN5g)都沒(méi)有減弱CpG ODN的效應(yīng)。在含有三個(gè)CpG的ODN中對(duì)一個(gè)CpG甲基化的結(jié)果是部分地降低了其刺激性(表3，比較ODN5c和5e)。
表3由在細(xì)菌DNA中或寡核苷酸中的CpG基元誘導(dǎo)的小鼠IL-6的分泌
去除了T細(xì)胞的來(lái)自DBA/2小鼠的脾細(xì)胞用磷酸二酯修飾的寡核苷酸(O-ODN)(20μM)、小牛胸腺DNA(50μg/ml)、經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)酶處理的大腸桿菌DNA(50μg/ml)、或LPS(10μg/ml)分別刺激24小時(shí)。數(shù)據(jù)代表三個(gè)數(shù)據(jù)的平均值±SD。CpG二核苷酸用下劃線標(biāo)出，黑點(diǎn)代表位置。Z表示5-甲基胞嘧啶。CpG基元可以用作人工附劑免疫應(yīng)答的非特異性刺激物是已知的附劑。使用附劑對(duì)誘導(dǎo)相對(duì)于抗原的強(qiáng)抗體應(yīng)答是重要的(Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory manual,Cold Spring harbor,N.Y.CurrentEdition；通過(guò)在此引述而合并于本文)。附劑總體效應(yīng)是強(qiáng)烈的，它們的重要性是不會(huì)被過(guò)分強(qiáng)調(diào)的。附劑的作用允許用更小劑量的抗原來(lái)產(chǎn)生更為一致的抗體應(yīng)答。對(duì)免疫應(yīng)答的非特異性活化經(jīng)?？梢苑直娉霁@得免疫應(yīng)答的成功或失敗。應(yīng)該在第一次注射的時(shí)候使用附劑，除非有非常特殊的理由來(lái)避免這樣做。大多數(shù)的附劑含有兩個(gè)成分。一個(gè)成分是用來(lái)保護(hù)抗原不被快速分解代謝[例如，脂質(zhì)體或合成的表面活性劑(Hunter et al.,1981)]。脂質(zhì)體僅僅在免疫原被整合到外脂層時(shí)有效，內(nèi)埋的分子是免疫系統(tǒng)看不見(jiàn)的。其它的成分則是非特異性刺激免疫應(yīng)答的物質(zhì)。這些物質(zhì)的作用是提高淋巴因子的水平。淋巴因子直接刺激抗原處理細(xì)胞的活性，并引起注射位置的局部發(fā)炎反應(yīng)。早期的工作完全依賴于熱殺死細(xì)菌(Dienes1936)或脂多糖(LPS)(Johnsonet al.,1956)。LPS是合理的毒性的，通過(guò)對(duì)它的結(jié)構(gòu)的分析，其作為附劑的大多數(shù)的性質(zhì)已經(jīng)被證實(shí)為在于稱作脂質(zhì)A的部分。脂質(zhì)A可以由多種合成的和天然的形式獲得，其毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于LPS，但仍然保存了其前身的LPS分子的大多數(shù)良好的附劑性質(zhì)。脂質(zhì)A化合物經(jīng)常用脂質(zhì)體提供。
近來(lái)，尋找強(qiáng)有力的并帶有更可接受的副作用的附劑的工作導(dǎo)致了新的合成附劑的產(chǎn)生。在本發(fā)明中，我們提供了序列第1826號(hào)，即TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:10)，它是一種包括了含CpG的核酸的附劑。該序列是強(qiáng)免疫活化序列，并且是非常優(yōu)秀的附劑，其效率相等于完全Freund′s，甚至超過(guò)該附劑，但是，又沒(méi)有明顯的毒性。CpG基元誘導(dǎo)小鼠IL-6生產(chǎn)的效價(jià)細(xì)菌DNA和CpG ODN在去除了T細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞中誘導(dǎo)的IL-6生產(chǎn)是屬于劑量依賴型的，但是，脊椎動(dòng)物DNA和非CpG ODN則不是(圖1)。IL-6的生產(chǎn)在大約50μg/ml細(xì)菌DNA和40μM的CpG O-ODN水平時(shí)是平臺(tái)式的。由細(xì)菌DNA和CpGODN誘導(dǎo)的IL-6的生產(chǎn)的最大值分別在1-1.5ng/ml和2-4ng/ml。這些水平比在LPS(0.35ng/ml)刺激后所見(jiàn)到的要明顯地高(圖1A)。為了評(píng)價(jià)帶有核酸酶抗性DNA主鏈的CpG ODN是否也可以誘導(dǎo)IL-6的生產(chǎn)，向去除了T細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞中加入S-ODN。CpG S-ODN也誘導(dǎo)了劑量依賴型的IL-6生產(chǎn)，并且水平也類似于CpG O-ODN，而非CpG S-ODN則沒(méi)有誘導(dǎo)IL-6的生產(chǎn)(圖1C)。濃度為0.05μM的CpG S-ODN可以在這些細(xì)胞中誘導(dǎo)最大的IL-6生產(chǎn)。這個(gè)結(jié)果表明核酸酶抗性DNA主鏈修飾保留的CpG DNA對(duì)IL-6生產(chǎn)的序列特異性能力，并且CpG S-ODN在該檢測(cè)系統(tǒng)中比CpG ODN的強(qiáng)度高出80倍以上。CpG DNA在體內(nèi)對(duì)小鼠IL-6分泌的誘導(dǎo)為了評(píng)價(jià)細(xì)菌DNA和CpG S-ODN體內(nèi)誘導(dǎo)IL-6分泌的能力，給BALB/c小鼠靜脈注射100μg大腸桿菌DNA、小牛胸腺DNA、CpG或非刺激性S-ODN,2小時(shí)后采血。在注射了大腸桿菌DNA的組中，血清內(nèi)IL-6水平為約13ng/ml，而在注射了小牛胸腺DAN的組和注射了PBS的組中，血清內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到IL-6(表4)。在注射了CpG S-ODN的組中，血清內(nèi)IL-6的水平為約20ng/ml。在注射了非刺激性S-ODN的組中，沒(méi)有檢測(cè)到IL-6(表4)。
表4．CpG DAN刺激誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)IL-6分泌<
小鼠(每組2只)接受靜脈注射100μl的PBS、200μg的大腸桿菌DNA或小牛胸腺DNA、或500μg的CpG S-ODN或非-CpG對(duì)照S-ODN。注射后2小時(shí)采血，按1∶10稀釋，每種血清用ELISA測(cè)定IL-6。ELISA測(cè)定IL-6的敏感限定為5pg/ml。CpG S-ODN的序列是5′GCATGACGTTGAGCT3′(SEQ ID NO:48)，非刺激性S-ODN的序列是5′TCTAGATGTTAGCGT3′(SEQID NO:49)。應(yīng)該注意的是，雖然在序列48中有CpG，但對(duì)于刺激效應(yīng)來(lái)講它太靠近3′端了。數(shù)據(jù)代表兩個(gè)結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至少兩次且結(jié)果類似。用CpG基元刺激后小鼠體內(nèi)分泌IL-6的動(dòng)力學(xué)為了評(píng)價(jià)CpG DNA在體內(nèi)誘導(dǎo)IL-6分泌的動(dòng)力學(xué)，對(duì)BALB/c小鼠靜脈注射CpG或?qū)φ辗?CpG S-ODN。在注射了CpGS-ODN的組中，血清IL-6水平在1小時(shí)內(nèi)就明顯提高，并且在2小時(shí)達(dá)到峰值水平約9ng/ml(圖2)。血清中IL-6蛋白質(zhì)水平在4小時(shí)后明顯下降，并在12小時(shí)后回到基礎(chǔ)水平。與CpG DNA刺激的組相反，在注射了非刺激性S-ODN或PBS的組中，血清內(nèi)IL-6沒(méi)有明顯提高(圖2)。CpG基元在體內(nèi)誘導(dǎo)的IL-6mRNA表達(dá)的動(dòng)力學(xué)和組織分布如圖2所示，在CpG DAN刺激后，血清IL-6水平迅速提高。為了調(diào)查這種血清IL-6的可能的組織起源以及CpG DNA刺激后體內(nèi)IL-6基因表達(dá)的動(dòng)力學(xué)，在刺激后的不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)BALB/c小鼠靜脈內(nèi)注射CpG或非CpG S-ODN和RNA,RNA分別取自肝、脾、胸腺、和骨髓。如圖3A所示，注射CpG S-ODN后30分鐘內(nèi)，在肝、脾、和胸腺的IL-6mRNA水平已經(jīng)明顯提高。肝內(nèi)IL-6mRNA在注射后2小時(shí)達(dá)到峰值，隨后迅速下降并在刺激后8小時(shí)回到基礎(chǔ)水平(圖3A)。脾內(nèi)IL-6mRNA在刺激后2小時(shí)達(dá)到峰值，然后逐漸降低(圖3A)。胸腺內(nèi)IL-6mRNA在注射后1小時(shí)達(dá)到峰值，然后逐漸降低(圖3A)。在注射CpG S-ODN后1小時(shí)內(nèi)，骨髓內(nèi)IL-6mRAN明顯提高，然后恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。作為對(duì)CpG S-ODN的應(yīng)答，肝、脾、和胸腺的IL-6mRNA表達(dá)的提高明顯高于骨髓。CpG DNA誘導(dǎo)的小鼠細(xì)胞因子表達(dá)的形式在體內(nèi)或在全脾細(xì)胞中，在最初的6個(gè)小時(shí)內(nèi)，下列的白細(xì)胞介素如，IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、和IL-10等都沒(méi)有檢測(cè)到其蛋白質(zhì)水平的顯著提高[Ilinman,D.M.et al.,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:2879-2883]。然而，在注射CpG ODN的小鼠血清中，TNF-α的水平在30分鐘內(nèi)明顯提高，IL-6的水平在2小時(shí)內(nèi)顯著地升高。在脾細(xì)胞中，在首先的2小時(shí)內(nèi)也檢測(cè)到IL-12和伽瑪干擾素(IFN-γ)mRNA的表達(dá)的提高。
表5．CpG寡核苷酸誘導(dǎo)人PBMC細(xì)胞因子的分泌
黑點(diǎn)代表位置，CpG二核苷酸用下劃線標(biāo)出。
1由ELISA測(cè)定，采用了從R&amp;D System的Quantikine試劑盒(pg/ml)。在收集上清液和檢測(cè)前，細(xì)胞培養(yǎng)在10％自身血清并加以給出劑量的寡脫氧核苷酸(12μg/ml)，對(duì)TNF-α為4小時(shí)，對(duì)其它的細(xì)胞因子為24小時(shí)。數(shù)據(jù)代表相對(duì)于沒(méi)有加入寡脫氧核苷酸的小孔的細(xì)胞因子的提高水平。CpG DNA誘導(dǎo)的特異性單核細(xì)胞人PBMC的細(xì)胞因子的分泌采用了與研究小鼠細(xì)胞因子表達(dá)的同一組ODN，來(lái)確定人的細(xì)胞是否也被CpG基元誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞因子(或繁殖)，并確定有關(guān)的CpG基元。寡核苷酸1619(GTCGTT)是對(duì)TNF-α和INF-γ的最好的誘導(dǎo)物，與其幾乎相等的在寡核苷酸1634中的基元(GTCGCT)則近隨其后(表5)。在寡脫氧核苷酸1637和1614中的基元(GCCGGT和GACGGT)導(dǎo)致強(qiáng)烈的IL-6分泌但對(duì)其它的細(xì)胞因子則相對(duì)沒(méi)有誘導(dǎo)。因此，這就顯示人淋巴細(xì)胞同小鼠淋巴細(xì)胞一樣，應(yīng)答于CpG二核苷酸而分泌不同的細(xì)胞因子，具體由其周圍的堿基所決定。然而，對(duì)刺激小鼠基元為最好的基元?jiǎng)t不同于對(duì)人細(xì)胞最有效的基元。某些CpG寡脫氧核苷酸對(duì)活化人細(xì)胞是很差的(寡脫氧核苷酸1707、1708，它們分別含有形成回文的序列GACGTC和CACGTG)。
對(duì)DNA應(yīng)答的細(xì)胞表現(xiàn)為單核細(xì)胞，因?yàn)橛肔-亮氨酰-亮氨酸甲基酯(L-LME)處理可以消除細(xì)胞因子的分泌，該物質(zhì)對(duì)單核細(xì)胞為選擇性毒性物(但是，也對(duì)T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞為細(xì)胞毒性的)，并不影響B(tài)細(xì)胞的Ig分泌(表6)。經(jīng)過(guò)L-LME處理而存活的細(xì)胞用錐蟲藍(lán)排斥有＞95％的存活率，這表明，這些細(xì)胞缺少細(xì)胞因子應(yīng)答并不簡(jiǎn)單反映非特異性的細(xì)胞死亡。應(yīng)答大腸桿菌DNA的細(xì)胞因子分泌需要未甲基化CpG基元，因?yàn)榧谆舜竽c桿菌DNA的作用(表6中倒數(shù)第二行)。LPS對(duì)DNA的污染并不能解釋這些結(jié)果，因?yàn)樵谔烊坏暮图谆腄NA中的污染是相同水平的，而且，加入兩倍最高水平的污染物L(fēng)PS也沒(méi)有產(chǎn)生效應(yīng)(未示出)。
表6．CpG DNA誘導(dǎo)入PBMC的細(xì)胞因子的分泌
1所有細(xì)胞因子的水平的測(cè)定都用ELISA進(jìn)行，采用的是R&amp;D Systems的Quantikine試劑盒，如同前面的表中描述的一樣。結(jié)果代表從不同的供體來(lái)的PBMC的情況。
2對(duì)細(xì)胞用L-亮氨酰-亮氨酸甲基酯(M-LME)預(yù)處理15分鐘，來(lái)確定在這樣的條件下的細(xì)胞因子的產(chǎn)生是否是從單核細(xì)胞中來(lái)的(或來(lái)自于其它的對(duì)L-LME敏感的細(xì)胞)。
3對(duì)大腸桿菌DNA用2U/μgDNA的CpG甲基酶(NewEngland Biolabs)甲基化，以HpA-Ⅱ和Msp-Ⅰ酶解來(lái)確認(rèn)甲基化。作為陰性對(duì)照，樣品內(nèi)包括的污染物L(fēng)PS量為在該實(shí)驗(yàn)條件下沒(méi)有誘導(dǎo)可檢測(cè)細(xì)胞因子生產(chǎn)的最高量大腸桿菌DNA中的污染物的兩倍。
ND=未進(jìn)行。
用L-LME處理的PBMC損失了細(xì)胞因子生產(chǎn)這個(gè)現(xiàn)象建議單核細(xì)胞也許對(duì)應(yīng)答CpG DNA的細(xì)胞因子生產(chǎn)負(fù)責(zé)。為了更直接地驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，測(cè)試了CpG DNA對(duì)高純度的人單核細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞的效果。如同所假設(shè)的那樣，CpG DNA直接活化人巨嗜細(xì)胞生產(chǎn)IL-6、GM-CSF、和TNF-α，而非CpG DNA則不能(表7)。
表7.CpG DNA誘導(dǎo)純化人巨嗜細(xì)胞分泌細(xì)胞因子
應(yīng)答CpG基元的誘導(dǎo)的小鼠IgM生產(chǎn)中的IL-6的生物學(xué)作用上述的動(dòng)力學(xué)研究揭示了在CpG刺激后1小時(shí)誘導(dǎo)了IL-6的分泌并進(jìn)而有IgM的分泌。因?yàn)閷?duì)ODN誘導(dǎo)IL-6分泌的優(yōu)化CpG基元相同于IgM的優(yōu)化基元(表2)，所以檢測(cè)了CpG基元是否單獨(dú)誘導(dǎo)IgM和IL-6生產(chǎn)，以及是否IgM的生產(chǎn)依賴于IL-6的產(chǎn)生。加入中性抗-IL-6抗體抑制了體外的由CpG ODN介導(dǎo)的劑量依賴型的IgM生產(chǎn)，但是對(duì)照抗體則不能(圖4A)。相對(duì)照的是，加入IL-6則沒(méi)有影響CpG誘導(dǎo)的B細(xì)胞的繁殖水平和其基礎(chǔ)水平(圖4B)。應(yīng)答CpG DNA的IL-6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性的提高用CpG DNA刺激后的IL-6mRNA和蛋白質(zhì)水平的提高可以是來(lái)源于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)或轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的結(jié)果。為了確定IL-6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性是否在與CpG ODN一起培養(yǎng)的B細(xì)胞中被上調(diào)，采用了應(yīng)答CpG DNA產(chǎn)生IL-6的小鼠B細(xì)胞系wEHI-231，對(duì)起用IL-6啟動(dòng)子CAT構(gòu)建物轉(zhuǎn)染[pIL-6/CAT(Pottratz,S.T.et al.,17B-estradiol)Inhibits expression of human interleuking-6-promoter-reporter constructs by a receptor-dependent mechanism.J.Clin.Invest.93:944]。CAT檢測(cè)在用各種濃度的CpG或非CpGODN刺激后進(jìn)行。如圖5所示，CpG ODN誘導(dǎo)的CAT活性的提高是劑量依賴型的，而非CpG ODN則沒(méi)有誘導(dǎo)CAT活性。這就肯定了CpG誘導(dǎo)IL-6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。CpG ODN誘導(dǎo)的B細(xì)胞活化對(duì)5′和3′硫代磷酸酯核苷酸內(nèi)連接數(shù)目的依賴為了確定ODN主鏈上的部分的硫修飾是否足以提高B細(xì)胞的活化，選取了一系列具有相同的序列但在5′和3′端的核苷酸內(nèi)連接的S數(shù)目不同的ODN，并測(cè)定了它們的效果。根據(jù)以前的對(duì)核酸酶降解ODN的研究，確定了需要在ODN的5′端有至少兩個(gè)硫代磷酸酯連接才可以保護(hù)ODN不被細(xì)胞性外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶所降解。因此，只對(duì)含有兩個(gè)5′硫代磷酸酯修飾的連接的嵌合性O(shè)DN以及各種數(shù)目的3′修飾的連接進(jìn)行了檢測(cè)。
試驗(yàn)了這些ODN對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激效果，使用了三種濃度(3.3,10，和30μM)，測(cè)定了它們?cè)谔幚磉^(guò)的脾細(xì)胞培養(yǎng)物中的總RNA合成水平(由3H尿苷整合)或DNA合成(有3H胸苷整合)水平(實(shí)施例10)。帶有CpG基元的O-ODN(0/0硫代磷酸酯修飾)對(duì)脾細(xì)胞沒(méi)有刺激，除非在加入的培養(yǎng)基中的濃度為至少10μM(實(shí)施例10)。然而，當(dāng)這個(gè)序列發(fā)生了在5′端的兩個(gè)S連接修飾和在3′端的至少3個(gè)S連接的修飾時(shí)，則在3.3μM的劑量時(shí)有顯著的刺激表現(xiàn)出來(lái)。在這種低劑量的條件下，隨著3′端修飾的堿基數(shù)目的增加有刺激水平的逐漸增加，當(dāng)達(dá)到或超過(guò)6個(gè)修飾時(shí)，刺激指數(shù)開始下降。一般地講，對(duì)脾細(xì)胞刺激的優(yōu)化的3′的S修飾數(shù)目為5。在所有測(cè)試的3種濃度中，S-ODN都比嵌合性化合物的刺激性小。CpG介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活化對(duì)主鏈修飾類型的依賴硫代磷酸酯修飾的ODN(S-ODN)比磷酸二酯修飾的ODN(O-ODN)具有更強(qiáng)的對(duì)核酸酶的抗性。因此，由S-ODN和S-O-ODN(即，嵌合性硫代磷酸酯ODN，其中的中央連接是磷酸二酯，但有2個(gè)5′和5個(gè)3′的連接是硫代磷酸酯修飾的)所造成的比O-ODN更高的免疫刺激可能是前者的對(duì)核酸酶的抗性的結(jié)果。為了確定ODN核酸酶抗性在CpG ODN的免疫刺激中的作用，測(cè)試了嵌合性O(shè)DN的刺激效果，這些ODN中的5′端和3′端都附帶有核酸酶抗性，來(lái)自于甲基磷酸酯(MP-)、甲基硫代磷酸酯(MPS-)、磷酸二酯(S-)、或二硫代磷酸酯(S2-)的核苷酸內(nèi)的連接(實(shí)施例10)。這些研究顯示，無(wú)論它們的核酸酶抗性如何，MP-O-ODN實(shí)際上都比O-ODN的免疫刺激性低。然而，通過(guò)用5′端和3′端的MPS核苷酸內(nèi)連接來(lái)取代非橋連O分子將MP和S的修飾結(jié)合起來(lái)，就使免疫刺激的水平恢復(fù)到稍微高于O-ODN的水平。
S-O-ODN比O-ODN更為具有刺激性，甚至比S-ODN更具有刺激性，至少在高于3.3μM濃度時(shí)如此。在低于3μM濃度時(shí)，帶有3M序列的S-ODN比相應(yīng)的S-O-ODN更具刺激性，而帶有3D序列的S-ODN則比相應(yīng)的S-O-ODN的刺激性弱(實(shí)施例10)。在比較這兩個(gè)序列的刺激性CpG基元時(shí)，注意到了3D序列與側(cè)翼為2個(gè)5′端嘌呤和2個(gè)3′端嘧啶的CpG這樣的基元完全吻合。然而，在ODN3D中緊靠CpG的側(cè)翼堿基不是優(yōu)化的，其具有5′端嘧啶和3′端嘌呤。根據(jù)進(jìn)一步的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)免疫刺激所需要的序列對(duì)S-ODN比對(duì)S-O-ODN和O-ODN更為嚴(yán)謹(jǐn)。S-ODN與優(yōu)化的CpG基元吻合性差就會(huì)對(duì)淋巴細(xì)胞的活化沒(méi)有刺激或很小(例如，序列3D)。然而，與基元吻合很好的S-ODN，特別是在緊靠CpG的側(cè)翼位置，都比相應(yīng)的S-O-ODN更具有刺激性(例如，序列3M，序列4和6)，雖然在高濃度(大于3μM)時(shí)的峰值效應(yīng)是S-O-ODN的更強(qiáng)(實(shí)施例10)。
S2-O-ODN具有顯著的刺激性，并且在每個(gè)測(cè)試濃度都引起比相應(yīng)的S-ODN或S-O-ODN更為強(qiáng)烈的對(duì)淋巴細(xì)胞的活化。
在帶有S或S2取代的CpG ODN中所見(jiàn)到的對(duì)B細(xì)胞刺激的升高可能是下述的一個(gè)或全部的效應(yīng)的結(jié)果核酸酶抗性、增強(qiáng)的細(xì)胞吸收、增強(qiáng)的蛋白質(zhì)的結(jié)合、和改變了的細(xì)胞間的定位。然而，核酸酶抗性不會(huì)是唯一的解釋，因?yàn)镸P-O-ODN實(shí)際上比帶有CpG基元的O-ODN的刺激性低。以前的研究已經(jīng)顯示淋巴細(xì)胞對(duì)ODN的吸收明顯地受到主鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)的影響[Zhao et al.,(1993)Comparison of cellular binding and uptake ofantisense phosphodiester,phosphorothioate,and mixedphosphorethioate and methylphosphonate olignucleotides.(Andisense Research and Development3,53-66；Zhao et al.,(1994)Stage specific oligonucleotide uptake in murine bone marrow B cellprecursors.Blood 84,3660-36666.)]。細(xì)胞膜結(jié)合和吸收的最高值見(jiàn)于S-ODN，隨后是S-O-ODN,O-ODN，和MP-ODN。這種吸收的區(qū)分與免疫刺激的程度正好相關(guān)。含有未甲基化CpG的寡核苷酸具有時(shí)NK細(xì)胞的刺激活性為了確定含有CpG的寡核苷酸除了刺激B細(xì)胞外是否還對(duì)天然殺死細(xì)胞(NK)具有刺激活性，進(jìn)行了各種實(shí)驗(yàn)。如表8所示，用CpG ODN1和3Dd培養(yǎng)的脾細(xì)胞中有明顯的NK活性的誘導(dǎo)。相比之下，用非CpG對(duì)照ODN處理的效應(yīng)物都相對(duì)沒(méi)有誘導(dǎo)。
表8.CpG寡核苷酸(ODN)誘導(dǎo)的NK活性
由含有CpG基元的DNA而不是非CpG DNA誘導(dǎo)的NK活性在37℃下對(duì)細(xì)菌DNA培養(yǎng)18小時(shí)，然后測(cè)定殺死K562(人)或Yac-1(小鼠)靶細(xì)胞在去除了B細(xì)胞的脾細(xì)胞中和在人PBMC細(xì)胞中誘導(dǎo)的溶胞活性，但是，脊椎動(dòng)物的DNA沒(méi)有這種效果(表9)。為了確定細(xì)菌DNA的刺激活性是否歸因于其未甲基化CpG二核苷酸水平的提高，對(duì)含有未甲基化CpG二核苷酸、甲基化的CpG二核苷酸、或沒(méi)有CpG二核苷酸的50個(gè)以上的合成性O(shè)DN進(jìn)行了測(cè)驗(yàn)。結(jié)果如表9所示，顯示了合成的ODN可以顯著地刺激NK活性，只要它們含有至少一個(gè)未甲基化CpG二核苷酸即可。在CpG處于回文序列中的ODN(例如ODN1585，其含有回文序列AACGTT)與沒(méi)有回文序列的ODN(例如ODN1613或1619)之間沒(méi)有觀察到明顯的刺激性的區(qū)別，要注意的是，優(yōu)化的刺激一般見(jiàn)于那些CpG側(cè)翼為2個(gè)5′端嘌呤或5′端GpT二核苷酸和2個(gè)3′端嘧啶的ODN中。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明NK活性的峰值出現(xiàn)在加入OND后的約18小時(shí)處。數(shù)據(jù)指出小鼠NK應(yīng)答依賴于在先的CpG DNA對(duì)單核細(xì)胞的活化，導(dǎo)致的IL-12、THF-α、和IFN-α/b的生產(chǎn)(實(shí)施例11)。表9．含有CpG基元的DNA但不是非CpG DNA誘導(dǎo)的NK活性
在ODN中的CpG二核苷酸用下劃線標(biāo)出；Z代表甲基胞嘧啶。小寫字母代表核酸酶抗性硫代磷酸酯修飾的核苷酸內(nèi)連接，其在效價(jià)實(shí)驗(yàn)中顯示了比非修飾的ODN強(qiáng)20倍以上的力度，具體根據(jù)側(cè)翼堿基來(lái)決定。多G結(jié)尾(g)用在了某些ODN中，因?yàn)樗鼈冿@著地提高了ODN吸收水平。
從所有這些研究中，得到了對(duì)CpG DNA的免疫效應(yīng)的更為全面的理解，并將其總結(jié)于圖6中。
CpG基元的免疫活化可能依賴于CpG側(cè)翼的堿基，在ODN中的CpG的數(shù)量和間隔。雖然在理想的堿基成分中的單一CpG可以很強(qiáng)并且是有用的免疫活化子，但在含有幾個(gè)CpG并帶有適宜的側(cè)翼堿基和間隔的ODN中能見(jiàn)到更為優(yōu)越的效果。對(duì)B細(xì)胞的活化來(lái)講，優(yōu)化的CpG基元是TGACGTT。
下面所進(jìn)行的研究是為了確定對(duì)刺激人細(xì)胞為優(yōu)化的ODN序列，檢驗(yàn)了變換CpG二核苷酸的數(shù)目、間隔和側(cè)翼堿基的效果。確定帶有對(duì)活化人NK細(xì)胞為優(yōu)化的CpG基元的硫代磷酸酯ODN要想應(yīng)用于臨床，則ODN必須以不受核酸酶降解的形式提供給對(duì)象。用磷酸二酯ODN來(lái)達(dá)到這個(gè)目的的方法是本領(lǐng)域所熟知的，包括將其包被在脂質(zhì)中或在釋放系統(tǒng)中，例如，在納米顆粒中。這種保護(hù)還可以利用對(duì)DNA的化學(xué)修飾來(lái)達(dá)到，例如，修飾的DNA主鏈包括那些核苷酸間連接為抗核酸酶的。有些修飾可以賦予另外的所需性質(zhì)，例如提高細(xì)胞吸收。磷酸二酯連接可以通過(guò)用硫替代非橋連氧原子中的一個(gè)來(lái)進(jìn)行修飾，從而得到硫代磷酸酯DNA。如果硫代磷酸酯DNA具有CpG基元，則其具有提高了的細(xì)胞吸收(Krieg et al.,Antisense Res.Dev.6:133,1996)和改善了的B細(xì)胞刺激性。因?yàn)镹K活化相關(guān)于體內(nèi)的附劑效應(yīng)，所以確定那些可以活化人NK細(xì)胞的硫代磷酸酯ODN是十分重要的。
檢驗(yàn)了不同的硫代磷酸酯ODNs-即在各種堿基成分中含有CpG二核苷酸-對(duì)人NK細(xì)胞活化的效果(表10)。ODN1840含有2份TGTCGTT基元，具有明顯的NK溶胞活性(表10)。為了進(jìn)一步確定其它的對(duì)NK活化為優(yōu)化的ODN，對(duì)大約100個(gè)含有不同數(shù)量和間隔的CpG基元的ODN進(jìn)行了檢測(cè)，并以O(shè)DN1982作為對(duì)照。結(jié)果列于表11。
有效的ODNs以TC或TG作為5′端開始，然而，這個(gè)要求不是必須的。帶有內(nèi)含CpG基元的ODNs(例如，ODN1840)一般是比GTCGCT基元緊靠5′端的ODN較弱的刺激物(例如，ODN1967和1968)。ODN1968在其3′端的那一半具有第二個(gè)GTCGTT基元，其始終比不含第二個(gè)基元的ODN1967更具有刺激性。然而，ODN1967比實(shí)驗(yàn)1和3中比ODN1968稍強(qiáng)，在實(shí)驗(yàn)2中則不是。ODN2005具有第三個(gè)GTCGTT基元，其所誘導(dǎo)的NK活性平均比1968稍高。然而，ODN2006中GTCGTT基元之間的間隔由于在每個(gè)基元之間都加入了兩個(gè)T而被增加了，其比ODN2005和ODN2007更為優(yōu)越，后者只有一個(gè)基元添加了間隔性的2個(gè)T。在CpG基元之間的最小可接受的間隔是一個(gè)核苷酸，只要該ODN在3′端有兩個(gè)嘧啶(優(yōu)選T)即可(如ODN2015)。令人驚奇的是，用5′端的T來(lái)把兩個(gè)GTCGTT基元對(duì)頭連接起來(lái)也創(chuàng)造了對(duì)NK活性為合理強(qiáng)度的誘導(dǎo)物(例如，ODN2016)。選擇胸腺嘧啶(T)來(lái)分開相連的CpG二核苷酸不是絕對(duì)的，因?yàn)镺DN2002誘導(dǎo)的相當(dāng)?shù)腘K活化，雖然其中是由腺嘌呤(A)將其CpGs(即CGACGTT)間隔開來(lái)。還應(yīng)該注意的是，不含CpG的ODN(例如ODN1982)，含有成串的CpGs的ODN，以及CpGs存在于壞的序列中的ODN(例如，ODN2010)都沒(méi)有對(duì)NK活化的刺激效應(yīng)。
表10.ODN誘導(dǎo)NK溶胞活性(LU
1溶胞單位(LU)按照所述(8)進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，從正常的供體收集PBMC，用Ficoll離心，然后采用或不采用給定劑量的ODN(加入的劑量為6μg/ml)培養(yǎng)24小時(shí)。確定它們的對(duì)51Cr-標(biāo)記的K562細(xì)胞的溶胞能力。給出的結(jié)果是從幾個(gè)不同的正常人供體獲得的典型的結(jié)果。2該寡核苷酸混合物含有的是在每個(gè)位置上從4種堿基中隨機(jī)選擇的堿基。
表11．帶有良好基元的硫代磷酸酯CpG ODN誘導(dǎo)NK LU
1PBMC基本如本文所述。結(jié)果是6個(gè)分別的實(shí)驗(yàn)的代表；每個(gè)實(shí)驗(yàn)代表不同的供體。2這是甲基化形式的ODN1840；Z=5-甲基胞嘧啶，LU是溶胞單位，ND=未進(jìn)行，CpG二核苷酸用下劃線標(biāo)出。確定帶有對(duì)人B細(xì)胞繁殖活化為優(yōu)化的CpG基元的硫代磷酸酯ODNCpG ODN誘導(dǎo)B細(xì)胞繁殖的能力是其附劑潛力的良好指標(biāo)。具有強(qiáng)附劑效應(yīng)的ODN一般都誘導(dǎo)B細(xì)胞繁殖。為了確定誘導(dǎo)B細(xì)胞繁殖的優(yōu)化的CpG ODN是否與誘導(dǎo)NK細(xì)胞活性的ODN相同，測(cè)試了相似的一組ODN(表12)。表現(xiàn)出最為一致的刺激性的ODN是ODN2006(表12)。
表12．硫代磷酸酯CpG ODN對(duì)人B細(xì)胞繁殖的誘導(dǎo)<
細(xì)胞=手術(shù)中收集的并儲(chǔ)存于-70℃的人脾細(xì)胞，或從正常供體采集的PBMC細(xì)胞并經(jīng)過(guò)Ficoll離心。細(xì)胞培養(yǎng)在96孔U底微滴盤逼供內(nèi)加入或不加入給定劑量的ODN(加入的劑量為6μml)。N=12個(gè)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)4-7天，用1μCi的3H胸苷沖擊18小時(shí)然后收獲并閃爍計(jì)數(shù)。刺激指數(shù)=不加入ODN小孔中的cpm與在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中用給定ODN刺激的小孔的cpm的比率(一旦建立培養(yǎng)物后就沒(méi)有再加入進(jìn)一步的ODN)。ND=未進(jìn)行。
確定誘導(dǎo)人IL-2分泌的硫代磷酸酯ODNCpG ODN誘導(dǎo)IL-12分泌的能力是其附劑潛力的良好指標(biāo)，特別從其誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答這種高度依賴IL-12的能力的角度來(lái)講更是如此。因此，檢驗(yàn)了某一組硫代磷酸酯ODN誘導(dǎo)人PBMC體外分泌IL-12的能力(表13)。這些實(shí)驗(yàn)顯示在某些人PBMC細(xì)胞中，大多數(shù)CpG ODN可以誘導(dǎo)IL-12的分泌(例如，實(shí)驗(yàn)1)。然而，其它的供體只應(yīng)答少數(shù)的CpG ODN(例如，實(shí)驗(yàn)2)。從大多數(shù)對(duì)象來(lái)的ODN2006則始終誘導(dǎo)IL-2分泌(表13)。
表13．硫代磷酸酯CpG ODN誘導(dǎo)人IL-12分泌
1PBMC采集于正常供體并用Ficoll離心，然后以106細(xì)胞/孔培養(yǎng)在96孔微滴盤中，加入或不加入給定的ODN，如果加入ODN，其劑量為6μg/ml。24小時(shí)后收獲上清液，用ELISA方法檢測(cè)IL-12的水平。對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其代表不同的供體。確定對(duì)B細(xì)胞和單核細(xì)胞/NK細(xì)胞為特異性的寡核苷酸如圖6所示，CpG DNA可以直接活化高純度B細(xì)胞和單核細(xì)胞。CpG DNA活化這些種類細(xì)胞的機(jī)制中有很多相似之處。例如，都需要NFkB活化，對(duì)此在下面給予解釋。
在對(duì)CpG DNA的不同免疫效應(yīng)的進(jìn)一步研究中，發(fā)現(xiàn)有多于一種以上的CpG基元。具體地講，寡核苷酸1668帶有最佳的小鼠B細(xì)胞基元，它是對(duì)B細(xì)胞和天然殺死細(xì)胞(NK)的活化的強(qiáng)誘導(dǎo)物，而寡核苷酸1758是對(duì)B細(xì)胞的弱活化物，但仍然誘導(dǎo)很好的NK應(yīng)答(表14)。
表14．刺激優(yōu)化小鼠B細(xì)胞和NK活化的不同的CpG基元
CpG二核苷酸用下劃線標(biāo)出，寡核苷酸是合成的并有硫代磷酸酯修飾的主鏈來(lái)改善其核酸酶抗性。1按照實(shí)施例1所述用200nM的寡脫氧核苷酸培養(yǎng)48小時(shí)后的3H胸苷吸收來(lái)進(jìn)行測(cè)定。2按照溶胞單位來(lái)測(cè)定。免疫刺激核酸的目的論基礎(chǔ)脊椎動(dòng)物DNA是高度甲基化的，并且CpG二核苷酸是不足表達(dá)的。然而，刺激性CpG基元是在微生物基因組DNA中常見(jiàn)的，但是在脊椎動(dòng)物DNA中就很少見(jiàn)。此外，細(xì)菌DNA已經(jīng)被報(bào)道可以誘導(dǎo)B細(xì)胞繁殖和免疫球蛋白(Ig)的生產(chǎn)，而哺乳動(dòng)物DNA則不行[Messina,J.P.et al.,J.Immunol.147:1759(1991)]。在實(shí)施例3中進(jìn)一步描述的實(shí)驗(yàn)中，用CpG甲基化酶對(duì)細(xì)菌DNA的甲基化被發(fā)現(xiàn)是消除了有絲分裂的，這就證實(shí)了CpG狀態(tài)的差異是細(xì)菌DNA引起B(yǎng)細(xì)胞刺激的原因。這個(gè)數(shù)據(jù)支持了下面的結(jié)論即存在于細(xì)菌DNA中的未甲基化CpG二核苷酸負(fù)責(zé)了細(xì)菌DNA的刺激效應(yīng)。
就目的論而言，看起來(lái)CpG基元造成的淋巴細(xì)胞活化代表了免疫防御機(jī)制，其可以區(qū)分細(xì)菌DNA和宿主DNA。宿主DNA一般由于編程性細(xì)胞死亡而存在于很多發(fā)炎的組織和區(qū)域中，但它通常不誘導(dǎo)或很少誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化，因?yàn)镃pG被抑制和甲基化。然而，含有未甲基化CpG基元的細(xì)菌DNA的存在可以準(zhǔn)確地在感染的區(qū)域引起淋巴細(xì)胞活化，這則是有益的。這種新的活化途徑提供了T細(xì)胞依賴抗原對(duì)特異性B細(xì)胞活化的快速替代途徑。由于CpG途徑通過(guò)抗原受體協(xié)同了B細(xì)胞的活化，帶有對(duì)細(xì)菌抗原為特異性抗原受體的B細(xì)胞將通過(guò)其細(xì)胞膜Ig接受一個(gè)活化信號(hào)以及從細(xì)菌DNA來(lái)的第二個(gè)信號(hào)，并從而傾向于有區(qū)分地被活化。這個(gè)途徑與其它的B細(xì)胞活化途徑的相互作用提供了使用多克隆抗原來(lái)誘導(dǎo)抗原特異性應(yīng)答的生理學(xué)機(jī)制。
然而，B細(xì)胞活化似乎不是完全非特異性的。帶有對(duì)細(xì)菌產(chǎn)物為特異性抗原受體的B細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞膜Ig接受一個(gè)活化信號(hào)，以及從細(xì)菌DNA來(lái)的第二信號(hào)，從而更強(qiáng)烈地啟動(dòng)抗原特異性免疫應(yīng)答。如同其它的免疫防御機(jī)制，對(duì)細(xì)菌DNA的應(yīng)答可以具有在某些位置的非理想序列。例如，對(duì)自身抗原的自身免疫應(yīng)答將還傾向于由細(xì)菌感染來(lái)區(qū)分性地啟動(dòng)，因?yàn)樽陨砜乖€可以由細(xì)菌DNA啟動(dòng)來(lái)向自身接受性B細(xì)胞提供第二活化信號(hào)。確實(shí)，細(xì)菌感染對(duì)自身免疫的誘導(dǎo)是臨床觀察中常見(jiàn)的。例如，自身免疫系統(tǒng)性紅斑狼瘡，其本身是1)以產(chǎn)生抗-DNA抗體為特征，2)由抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的藥物所誘導(dǎo)[Comacchia,E.J.et al.,J.Clin.Invest.92:38(1993)]，以及3)與被減少的DNA甲基化有關(guān)[Richardson,B.,L.et al.,Arth.Rheum 35:647(1992)]，所以，它可以部分地由對(duì)DNA為特異性的B細(xì)胞通過(guò)由CpG基元提供的刺激信號(hào)的活化來(lái)啟動(dòng)，以及由細(xì)菌DNA同抗原受體的結(jié)合來(lái)啟動(dòng)。
此外，膿毒病，其特征是由于大量的對(duì)免疫系統(tǒng)的非特異性活化而導(dǎo)致高度發(fā)病率和死亡率，在死亡的細(xì)菌達(dá)到了足以直接活化許多淋巴細(xì)胞的濃度而釋放出細(xì)菌DNA和其它的產(chǎn)物時(shí)而活化免疫系統(tǒng)。在膿毒病綜合癥中CpG DNA作用的進(jìn)一步證據(jù)可見(jiàn)于CoWdery,J.等人的文獻(xiàn)[Cowdery,J.,et al.,(1996)TheJournal of Immunolgy 156:4570-4575]。
與抗原通過(guò)其表面Ig受體來(lái)啟動(dòng)B細(xì)胞不同的是，CpG-ODN不誘導(dǎo)任何可檢測(cè)到的Ca2+流，在蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化中的改變，或IP3的產(chǎn)生。以帶有或不帶有CpG基元的ODN與FITC共軛進(jìn)行的流式細(xì)胞儀測(cè)定按照Z(yǔ)hao,Q等人所述進(jìn)行[Amisense Research and Development3:53-66(1993)]，并且顯示了相等的膜結(jié)合，細(xì)胞吸收，外流，以及胞內(nèi)定位。這就建議，也許不存在對(duì)CpG ODN為特異性的細(xì)胞膜蛋白質(zhì)。不同于經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜來(lái)起作用，這些數(shù)據(jù)建議的是含有未甲基化CpG的寡核苷酸需要細(xì)胞吸收來(lái)發(fā)揮活性與固體Teflon支持物共價(jià)連接的ODN是非刺激性的，如同在抗生物素蛋白小珠或抗生物素蛋白涂布的培養(yǎng)皿上固定化的生物素化的ODN一樣。與FITC或生物素共軛的CpG ODN保留了全部的有絲分裂性質(zhì)，表明沒(méi)有立體性妨礙。
最近的數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄因子NFkB的介入是CpG效應(yīng)的直接或間接的介導(dǎo)物。例如，用CpG DNA處理B細(xì)胞或單核細(xì)胞15分鐘后，NFkB結(jié)合活性的水平被提高了(圖7)。然而，這種提高不是由于那些不含CpG基元的DNA所導(dǎo)致的。此外，還發(fā)現(xiàn)的是，NFkB活化的兩個(gè)不同的抑制物，即PDTC和膠毒素，完全封閉了CpG DNA對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激，由測(cè)定B細(xì)胞繁殖或單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子而證實(shí)，這就建議兩種細(xì)胞都需要NFkB活化。
對(duì)NFkB的活化可能有幾種機(jī)制。它們包括通過(guò)對(duì)各種蛋白質(zhì)激酶的活化，或通過(guò)反應(yīng)性氧的產(chǎn)生。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在CpG DNA處理B細(xì)胞或單核細(xì)胞后立即誘導(dǎo)蛋白質(zhì)激酶活化的任何證據(jù)，而且蛋白質(zhì)激酶A、蛋白質(zhì)激酶C，以及蛋白質(zhì)酪氨酸激酶的抑制物都對(duì)CpG誘導(dǎo)的活化沒(méi)有任何影響。然而，CpG DNA在B細(xì)胞和單核細(xì)胞中都快速誘導(dǎo)反應(yīng)性氧的生產(chǎn)，用按照Royall,J.A.所述的敏感性熒光染料二氫若丹明123檢測(cè)所證實(shí)[Royall,J.A.,and Ischiropoulos,H.(Archives of Biochemistry andBiophysics 302:348-355(1993))]。然而，對(duì)產(chǎn)生這些反應(yīng)性樣的抑制物完全封閉了NFkB的誘導(dǎo)以及隨后的CpG DNA對(duì)細(xì)胞繁殖和細(xì)胞因子分泌的誘導(dǎo)。
下一個(gè)問(wèn)題是，CpG DNA如何快速地導(dǎo)致了反應(yīng)性氧的產(chǎn)生。本發(fā)明人的前述研究證實(shí)了寡核苷酸和質(zhì)粒或細(xì)菌DNA被細(xì)胞內(nèi)吸到核內(nèi)體中。這些核內(nèi)體迅速地在細(xì)胞內(nèi)被酸化。為了確定這個(gè)酸化步驟是否在CpG DNA活化反應(yīng)性氧的機(jī)制中是重要的，用核內(nèi)體酸化的特異性抑制物封閉該酸化步驟，包括氯喹、莫能菌素、和bafilomycin等，它們通過(guò)不同的機(jī)制工作。圖8A顯示了流式細(xì)胞儀的研究結(jié)果，其中采用了小鼠B細(xì)胞以及二氫若丹明123染料來(lái)確定反應(yīng)性氧的水平。該圖內(nèi)在A組中僅僅含有染料的樣品顯示了細(xì)胞對(duì)染料的陽(yáng)性背景水平為28.6％。正如所預(yù)期的，反應(yīng)性氧的這個(gè)水平在用PMA和離子霉素處理細(xì)胞20分鐘后被大大地提高到80％，即陽(yáng)性對(duì)照(B組)。用CpG寡核苷酸處理的細(xì)胞也顯示反應(yīng)性氧水平的提高，使大于50％的細(xì)胞變?yōu)殛?yáng)性(D組)。然而，用除了CpG改變之外序列完全相同的寡核苷酸處理的細(xì)胞沒(méi)有顯示這種顯著的反應(yīng)性氧水平的提高(E組)。
在有氯喹存在時(shí)，這些結(jié)果非常不同(圖8B)。氯喹將細(xì)胞中反應(yīng)性氧的背景水平稍微的降低了一些，使在A組中的未處理的細(xì)胞只有4.3％為陽(yáng)性。氯喹完全消除了在用CpG DNA處理的細(xì)胞中的反應(yīng)性氧的誘導(dǎo)(B組)，但是對(duì)用PMA和離子霉素處理的細(xì)胞中的反應(yīng)性氧的水平?jīng)]有減弱(E組)。這就證明，與PMA加上離子霉素不同，用CpG DNA處理B細(xì)胞后的反應(yīng)性氧的產(chǎn)生需要DNA在核內(nèi)體中經(jīng)歷酸化步驟。這是淋巴細(xì)胞活化的全新的機(jī)制。氯喹、莫能菌素、以及bafilomycin還顯示對(duì)CpG DNA活化NFkB的封閉，以及對(duì)隨后的繁殖和細(xì)胞因子分泌的誘導(dǎo)的封閉。CpG DNA的慢性免疫活化以及自身免疫疾病CpG DNA對(duì)B細(xì)胞的活化協(xié)同于通過(guò)B細(xì)胞受體的信號(hào)。這就提出了這樣的可能，即DNA特異性B細(xì)胞可以通過(guò)將細(xì)菌DNA與其抗原受體結(jié)合以及同時(shí)的CpG介導(dǎo)的信號(hào)的刺激來(lái)活化。此外，CpG DNA誘導(dǎo)B細(xì)胞變?yōu)榭咕幊趟劳龅?，這種機(jī)制被認(rèn)為在防止對(duì)自身抗原如DNA的免疫應(yīng)答中是重要的。確實(shí)，對(duì)bDNA的暴露可以啟動(dòng)抗-DNA的抗體的產(chǎn)生。假定CpGDNA具有促進(jìn)自身免疫的這種潛在能力，那么值得注意的是，患有自身免疫疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者都具有持續(xù)的升高水平的循環(huán)血漿DNA，其在高甲基化CpG中被富集。這個(gè)發(fā)現(xiàn)建議了在狼瘡疾病發(fā)病機(jī)理中CpG DNA造成的慢性免疫活化所可能扮演的角色。
治療狼瘡疾病的一類有效藥劑是抗瘧疾藥物，例如，氯喹。雖然這些藥物的治療機(jī)制還不清楚，但是已知的是它們抑制核內(nèi)體內(nèi)的酸化。CpG DNA對(duì)淋巴細(xì)胞的活化不是通過(guò)與細(xì)胞表面受體的結(jié)合所介導(dǎo)的，而是需要細(xì)胞吸收來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這種細(xì)胞吸收通過(guò)將吸收性內(nèi)吞到酸化的氯喹敏感的胞內(nèi)小室而發(fā)生。這就建議一種假說(shuō)，即CpG DAN對(duì)淋巴細(xì)胞的活化可能在發(fā)生時(shí)相關(guān)于酸化的核內(nèi)體，并且甚至可能是依賴于pH的。為了檢驗(yàn)這個(gè)假說(shuō)，采用了對(duì)DNA酸化為特異性的抑制物來(lái)確定B細(xì)胞或單核細(xì)胞是否可能在酸化被抑制的條件下應(yīng)答于CpG DNA。
被檢測(cè)到的對(duì)CpG DNA應(yīng)答的最早的淋巴細(xì)胞活化現(xiàn)象是反應(yīng)性氧(ROS)的產(chǎn)生，其在脾細(xì)胞以及B細(xì)胞和單核細(xì)胞中都是在5分鐘內(nèi)被誘導(dǎo)出來(lái)的。核內(nèi)體內(nèi)部酸化的抑制物包括氯喹、bafilomycin A，以及莫能菌素，它們具有不同的作用機(jī)制，對(duì)CpG誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生有封閉作用，但是對(duì)由PMA、與CD40或IgM配合等所介導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生沒(méi)有影響。這些研究顯示ROS的產(chǎn)生是通過(guò)多種途徑的淋巴細(xì)胞活化中一種所共有的現(xiàn)象。這種ROS的產(chǎn)生一般獨(dú)立于核內(nèi)體中的酸化，而酸化是應(yīng)答CpGDAN的ROS中所需要的。應(yīng)答CpG的ROS的生產(chǎn)并不被NFkB抑制物如膠霉毒素所抑制，確認(rèn)其不是NFkB活化的次級(jí)現(xiàn)象。
為了確定CpG DAN在核內(nèi)體中的酸化是否對(duì)其所起到的其它免疫刺激效果是必須的，進(jìn)行了各種實(shí)驗(yàn)。LPS和CpG DNA都誘導(dǎo)相似快速的NFkB活化，提高了原癌基因mRNA水平，以及細(xì)胞因子分泌。DNA對(duì)NFkB的活化依賴于CpG基元，因?yàn)槠洳槐挥肅pG甲基酶處理的bDAN誘導(dǎo)，也不被因?yàn)閴A基變換而打亂了CpG的ODN所誘導(dǎo)。采用特異性抗體的超遷移實(shí)驗(yàn)指出，被活化的NFkB復(fù)合物包括p50和p60組分。并非出人意料的是，在LPS或CpG處理的細(xì)胞中的NFkB活化伴隨有IkBα和IkBβ的降解。然而，核內(nèi)體酸化的抑制物選擇性地封閉了所有的CpG誘導(dǎo)的活化，但沒(méi)有對(duì)任何LPS誘導(dǎo)的胞內(nèi)活化現(xiàn)象進(jìn)行了封閉。值得注意的是，已經(jīng)確定的是很低濃度的氯喹(＜10μM)抑制了CpG介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的活化，因?yàn)樵搫┝窟h(yuǎn)遠(yuǎn)低于治療瘧疾和記性其它的被報(bào)道的免疫效應(yīng)所需要的劑量(例如，100-1000μM)。這些實(shí)驗(yàn)支持了在CpG DNA刺激效果的介導(dǎo)中依賴于pH的信號(hào)機(jī)制的角色。
表15．核內(nèi)體酸化或NFkB活化的抑制物時(shí)CpG誘導(dǎo)的TNF-α和IL-12表達(dá)的特異性封閉
表15給出了IL-2和TNF-α的檢測(cè)小鼠單核細(xì)胞系J774(對(duì)IL-12為1×105細(xì)胞/毫升，對(duì)TNF-α為1×106細(xì)胞/毫升)，在有給出的濃度的抑制物或沒(méi)有抑制物的條件下培養(yǎng)2小時(shí)，然后用CpG寡核苷酸(ODN)1826(TCCATGACGTTCCTGACGTTSEQ ID NO:10)刺激，劑量為2μM，對(duì)LPS為(10μg/ml)，對(duì)TNF-α為4小時(shí)，對(duì)IL-12為24小時(shí)，收集上清液。對(duì)上清液用ELISA檢測(cè)IL-12或TNF-α(pg/ml)，操作參見(jiàn)以前的文獻(xiàn)[A.K.Krieg,A.-K.Yi,S.Matson,T.J.Waldschmidt,G.A.Bishop,R.Teasdale,G.Koretzky and D.Klinman,Nature374,546(1995)；Yi,A.-K.,D.M.Klinman,T.L.Martin,S.Matson and A.M.Krieg,J.Immunol,157:5394-5402(1996)；Krieg,A.M.,J.Lab.Clin.Med.,128,128-133(1996)]。用不含有CpG基元的ODN培養(yǎng)細(xì)胞沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌。在IL-6的檢測(cè)中也見(jiàn)到了相似的CpG應(yīng)答的特異性抑制，也見(jiàn)于采用原脾細(xì)胞或B細(xì)胞系CH12.LX和wEHI-231的實(shí)驗(yàn)中。2.5μg/ml氯喹相當(dāng)于＜5μM。NFkB活化的其它抑制物包括PDTC和鈣蛋白酶抑制物Ⅰ和Ⅱ，都給出了相似的抑制效果。給出的數(shù)據(jù)代表在10個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)中所得到的結(jié)果。
過(guò)量的CpG基元的免疫活化可能對(duì)自身免疫疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病有作用，其伴隨著升高水平的循環(huán)高甲基化CpGDNA。氯喹和有關(guān)的抗瘧疾化合物是對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡和其它的一些自身免疫疾病的有效的治療藥物，雖然它們的作用機(jī)制尚不明了。我們對(duì)極低濃度氯喹可以特異性抑制CpG介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活化的能力的確定，建議出了一種新的有效的機(jī)制。值得注意的是，狼瘡的經(jīng)常復(fù)發(fā)被認(rèn)為是微生物感染啟動(dòng)的。在感染的組織中存在的bDNA水平可以是足以誘導(dǎo)局部發(fā)炎應(yīng)答的。與在膿毒綜合癥和其它的疾病中CpG DNA起者介導(dǎo)物的作用相結(jié)合，我們的研究建議了抗瘧疾藥物作為核內(nèi)體酸化的抑制物的新的醫(yī)藥用途。
CpG誘導(dǎo)的ROS生產(chǎn)可能是細(xì)胞活化的偶然結(jié)果，或者是介導(dǎo)這種活化的信號(hào)。ROS的清除物N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)封閉CpG誘導(dǎo)的NFkB活化，細(xì)胞因子的產(chǎn)生，以及B細(xì)胞的繁殖，這就建議了在這些途徑中ROS生產(chǎn)的起因角色。這些數(shù)據(jù)與前面的支持ROS在活化NFkB中的角色的證據(jù)相吻合。WEHI-231B細(xì)胞(5×105細(xì)胞/毫升)在有或沒(méi)有氯喹[5μg/ml(＜10μM)]或膠霉毒素(0.2μg/ml)條件下預(yù)培養(yǎng)30分鐘。然后對(duì)細(xì)胞等份試樣按照上述在RPMI培養(yǎng)基中10分鐘，添加或不添加CpG ODN(1826)或非CpN ODN(1911)1μM，或佛波醇豆蔻乙酸酯(PMA)加離子霉素(iono)。然后對(duì)細(xì)胞用二氫若丹明123染色并用流式細(xì)胞儀分析胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，具體操作按照以前所述的進(jìn)行[A.K.Krieg,A.-K.Yi,S.Matson,T.J.Waldschmidt,G.A.Bishop,R.Teasdale,G.Koretzky and D.Klinman,Nature374,546(1995)；Yi,A.-K.,D.M.Klinman,T.L.Martin,S.Matson and A.M.Krieg,J.Immunol,157:5394-5402(1996)；Krieg,A.M.,J.Lab.Clin.Med.,128,128-133(1996)]。J774細(xì)胞，一種單核細(xì)胞系，顯示了相似的依賴pH的CpG誘導(dǎo)的ORS應(yīng)答。與之相對(duì)照，CpG DNA沒(méi)有誘導(dǎo)胞間ROS的產(chǎn)生，也沒(méi)有任何可檢測(cè)的嗜中性白細(xì)胞ROS。這些氯喹的濃度(以及那些與其它的核內(nèi)體酸化抑制物一起使用的濃度)防止了內(nèi)化的CpG DNA的酸化，用熒光偶聯(lián)ODN如Tonkinson等人所述的進(jìn)行了證實(shí)[Tonkinson et al.,Nucl.Acids Res.22,4268(1994)；A.M.Krieg,In:Delivery Strategies for Antisense OligonucleotideTherapeutics.Editor,S.Akhtar,CRC Press,Inc.,pp.177(1995)]。用高于抑制核內(nèi)體酸化所需濃度，觀察到了非特異性的抑制效果。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行至少三次并得到相似結(jié)果。
雖然已知NFkB對(duì)基因表達(dá)是重要的調(diào)節(jié)物，但其在對(duì)CpGDNA的應(yīng)答中的角色卻始終不清楚。為了確定這個(gè)NFkB活化對(duì)CpG介導(dǎo)的基因表達(dá)是必須的，對(duì)細(xì)胞在有或沒(méi)有二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)這種IkB磷酸化抑制物存在的條件下用CpG DNA活化。這些NFkB活化的抑制物完全封閉了CpG誘導(dǎo)的原癌基因和細(xì)胞因子mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，顯示NFkB在這些現(xiàn)象中作為介導(dǎo)物的基本作用。在這些研究所用的條件中，沒(méi)有任何一個(gè)抑制物減弱了細(xì)胞的生存力。J774，一種小鼠單核細(xì)胞系，以5μg/ml的水平在有小牛胸腺(CT)、大腸桿菌(EC)、或甲基化大腸桿菌(mEC)DNA(用CpG甲基化酶進(jìn)行甲基化4)存在的條件下培養(yǎng)，或與0.75μM的CpG寡核苷酸(ODN1826,表15)或非CpG ODN(TCCATGAGCTTCCTGAGTCT；ODN1745)培養(yǎng)1小時(shí)，然后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行溶胞，制備核酸提取物。含有共同NFkB位點(diǎn)的雙鏈ODN被5′端放射性標(biāo)記，用作EMSA的探針，具體操作按照以前所述進(jìn)行[J.D.Dignam,R.M.Lebovitz and R.G.Roeder,Nucliec Acids Res.11,1475(1983)；M.Briskin,M.Damore,R.Law,G.Lee,P.W.Kincade,C.H.Sibley,M.Kuehl and R.Wall,Mol.Cell.Biol.10,422(1990)]。p50/p65異源雙體的位置用對(duì)p65和p50的特異性抗體以超遷移方法確定[Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA]。用J774細(xì)胞建立氯喹對(duì)CpG誘導(dǎo)的但不是LPS誘導(dǎo)的NFkB活化的抑制。將細(xì)胞在有或沒(méi)有氯喹(20μg/ml)存在的條件下預(yù)培養(yǎng)2小時(shí)，然后按照上述用EC DNA、CpG ODN、非CpG ODN或LPS(1μg/ml)刺激1小時(shí)。在B細(xì)胞系、WEHI-231和原脾細(xì)胞中見(jiàn)到了相似的氯喹敏感性CpG誘導(dǎo)的對(duì)NFkB的活化。這些實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行三次，氯喹的濃度范圍是2.5至20μg/ml，得到了相似的結(jié)果。
還明白了的是，CpG刺激的mRNA表達(dá)需要核內(nèi)體酸化以及在B細(xì)胞和單核細(xì)胞中的NFkB活化。J774細(xì)胞(2×106細(xì)胞/毫升)在有或沒(méi)有氯喹[2.5μg/ml(＜5μM)]，或N-甲苯磺?；?L-苯并氨酸氯甲酮(TPCK,50μM)，這是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶抑制物，其防止IkB蛋白水解并因此而封閉NFkB活化。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，使用的是大腸桿菌DNA(EC,50μg/ml)、小牛胸腺DNA(CT,50μg/ml)、LPS(10μg/ml)、CpG ODN(1826,1μM)、或?qū)φ盏姆荂pG ODN(1911,1μM),進(jìn)行3小時(shí)。wEHI-231B細(xì)胞(5×105細(xì)胞/毫升)在有或沒(méi)有膠霉毒素(0.1μM)或雙膠霉毒素(0.1μg/ml)存在的條件下培養(yǎng)2小時(shí)，然后進(jìn)行刺激，使用的是CpG ODN(1826)，或?qū)φ盏姆荂pG ODN(1911,TCCAGGACTTTCCTCAGGTT)，用量為0.5μM，時(shí)間為8小時(shí)。在這兩種情況下，細(xì)胞被收集后，用RNAzol按照廠商的說(shuō)明書來(lái)制備RNA。進(jìn)行多探針Rnase保護(hù)檢測(cè)，操作按照以前所述的進(jìn)行[A.-K.Yi,P.Hornbeck,D.E.Lafrenz and A.M.Krieg,J.Immunol.,157,4918-4925(1996)]。將可比數(shù)量的RNA裝入每條道內(nèi)，用核糖體μRNA作為加載對(duì)照(L32)。對(duì)這些實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，得到相似的結(jié)果。
這些結(jié)果表明淋巴細(xì)胞對(duì)CpG DNA的應(yīng)答是通過(guò)新的途徑完成的，涉及了依賴pH的胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。依賴pH的步驟可能是CpG DNA的運(yùn)轉(zhuǎn)或加工步驟，ROS的產(chǎn)生，或某些其它的現(xiàn)象。ROS被廣泛地認(rèn)為是在多種類型細(xì)胞中的信號(hào)途徑的第二信使，但是在此之前還沒(méi)有被證明是可以在B細(xì)胞中介導(dǎo)刺激信號(hào)的。
假設(shè)在核內(nèi)體之中或其附近有一種蛋白質(zhì)，它特異性識(shí)別含有CpG基元的DNA，并導(dǎo)致反應(yīng)性氧的產(chǎn)生。為了探測(cè)細(xì)胞的胞質(zhì)中能夠特異性結(jié)合CpG DNA的蛋白質(zhì)，進(jìn)行了電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)，其中使用的是以5′放射性標(biāo)記的帶有或不帶有CpG基元的寡核苷酸。發(fā)現(xiàn)有一條帶似乎代表與具有CpG基元的單鏈寡核苷酸特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，但其不與缺少CpG基元的寡核苷酸結(jié)合，也不與含有被甲基化了的CpG基元的寡核苷酸結(jié)合。這個(gè)結(jié)合活性在加入了過(guò)量的含有NFkB結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸時(shí)被封閉。這就建議NFkB或相關(guān)的蛋白質(zhì)是與刺激性CpG寡核苷酸結(jié)合的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合體的組成部分。
在NFkB被強(qiáng)烈活化的時(shí)間點(diǎn)上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CREB/ATF蛋白質(zhì)被活化。因而，這些數(shù)據(jù)沒(méi)有提供NFkB蛋白質(zhì)實(shí)際上結(jié)合CpG核酸的證據(jù)，而是說(shuō)明了CpG活性在某種方式上需要該蛋白質(zhì)。可能的是，CREB/ATF或相關(guān)的蛋白質(zhì)與NFkB蛋白質(zhì)或其它的蛋白質(zhì)以某種方式相互作用，這樣可以解釋CREB蛋白質(zhì)的結(jié)合基元與優(yōu)化的CpG基元的顯著的相似性。還可能的是寡核苷酸結(jié)合CREB/ATF或相關(guān)的蛋白質(zhì)，并導(dǎo)致NFkB的活化。
另外，很可能的是，CpG核酸可以與TRAF蛋白質(zhì)中的一種相結(jié)合，該蛋白質(zhì)與CD40的胞質(zhì)區(qū)結(jié)合，并在CD40被交聯(lián)時(shí)調(diào)節(jié)NFkB活性。這樣的TRAF蛋白質(zhì)的例子包括TRAF-2和TRAF-5。制備免疫刺激性核酸的方法在本發(fā)明中，核酸可以使用本領(lǐng)域熟知的任何數(shù)目的方法全程合成。例如，可以采用b-氰乙基氨基磷酸酯法[S.L.Beaucageand M.H.Caruthers,(1986)Tet.Let.22:1859]，核苷H-磷酸酯法[Caregg et al.,(1986)Tet.Let.27:4051-4054；Froehler et al.,(1986)Nucl.Acid.Res.14:5399-5407；Caregg et al.,(1986)Tet.Let.27:4055-4058,Gaffney et al.,(1988)Tet.Let.29:2619-2622]。這些化學(xué)合成可以用市售的各種自動(dòng)化寡核苷酸合成儀還完成。另外，也可以用已知的方法從已經(jīng)存在的核酸序列(例如，基因組DNA或cDNA)中制備出來(lái)，例如，那些利用限制性酶，核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶的技術(shù)。
為了用于體內(nèi)，核酸優(yōu)選具有相當(dāng)?shù)目菇到庑?例如，對(duì)核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶的降解有抗性的)核酸。次級(jí)結(jié)構(gòu)，例如莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，可以穩(wěn)定核酸來(lái)抵抗降解。另外，核酸的穩(wěn)定化可以通過(guò)磷酸酯主鏈修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的穩(wěn)定核酸具有至少部分的硫代磷酸酯修飾的主鏈。硫代磷酸酯可以用自動(dòng)化技術(shù)由氨基磷酸酯或H-磷酸酯來(lái)化學(xué)合成。芳基的和?；牧姿狨タ梢酝ㄟ^(guò)如美國(guó)專利第4,469,863號(hào)所描述的方法來(lái)制備，并且，芳基磷酸三酯(其中的帶電的氧基團(tuán)被美國(guó)專利第5,023,243號(hào)和歐洲專利第092,574號(hào)所述的方法所烷基化)可以用市售的制劑以自動(dòng)化固相合成法來(lái)制備。進(jìn)行其它的DNA主鏈修飾和替換的方法已經(jīng)被描述了[Uhlmann,E.and Peyman,A.(1990)Chem.Rev.90:544；Goodchild,J.(1990)Bioconjugate Chem.1:165]。帶有CpG基元的2′-O-甲基核酸還引起免疫活化，環(huán)氧修飾的CpG核酸也如此。事實(shí)上，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何主鏈的修飾可以完全消除CpG效應(yīng)，雖然用5-甲基的C取代C可以極大地消弱之。
為了體內(nèi)給藥，核酸可以結(jié)合有能與靶細(xì)胞[例如，B細(xì)胞，單核細(xì)胞和天然殺死細(xì)胞(NK)]表面更高度親和的分子和/或提高靶細(xì)胞的細(xì)胞吸收而形成“核酸釋放復(fù)合體”的分子。核酸可以是離子性地或共價(jià)地與適宜的分子通過(guò)本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)連接起來(lái)?？梢允褂玫挠懈鞣N的偶聯(lián)和交聯(lián)制劑，例如，蛋白質(zhì)A，碳二亞胺，N-琥珀?；?3-(2-吡啶二硫基)丙酸鹽(SPDP)。核酸還可以用熟知的技術(shù)包埋在脂質(zhì)體或病毒體中。免疫刺激性核酸分子的醫(yī)療應(yīng)用根據(jù)免疫刺激性核酸分子的性質(zhì)，可以將含有至少一個(gè)未甲基化CpG二核苷酸的核酸分子給對(duì)象體內(nèi)給藥來(lái)治療“免疫系統(tǒng)缺陷”疾病。另外，含有至少一個(gè)未甲基化CpG二核苷酸的核酸分子可以同來(lái)自免疫系統(tǒng)缺陷疾病的患者的淋巴細(xì)胞(例如，B細(xì)胞，單核細(xì)胞或NK細(xì)胞)在體外接觸來(lái)活化這些淋巴細(xì)胞，然后再將這些淋巴細(xì)胞送回到對(duì)象體內(nèi)。
正如本文所描述的，作為對(duì)含有未甲基化CpG的核酸分子的應(yīng)答，有更多數(shù)量的脾細(xì)胞分泌了IL-6、IL-12、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-1、IL-3、IL-10、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、RANTES、甚至還有其它的物質(zhì)。在B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了IL-6表達(dá)的提高。
免疫刺激性核酸分子還可以同疫苗一起提供給對(duì)象來(lái)促進(jìn)其免疫系統(tǒng)并從而產(chǎn)生對(duì)疫苗的更好的應(yīng)答。優(yōu)選的是，將免疫刺激性核酸分子與疫苗一起或稍微提前一點(diǎn)提供給對(duì)象。常規(guī)的附劑可以同疫苗一起使用，其一般包括抗原，常規(guī)的附劑可以通過(guò)提高抗原的吸收來(lái)進(jìn)一步改善免疫疫苗的效果。
如果疫苗是DNA疫苗，則至少有兩個(gè)成分決定其效率。首先，由疫苗編碼的抗原決定免疫應(yīng)答的特異性。其次，如果質(zhì)粒的主鏈含有CpG基元，其就作為疫苗的附劑起作用。因此，CpGDNA起著有效的“危險(xiǎn)信號(hào)”的作用，并引起免疫系統(tǒng)對(duì)該區(qū)域內(nèi)的新抗原產(chǎn)生強(qiáng)烈的反應(yīng)。這種作用方式似乎是CpG DNA對(duì)樹枝狀細(xì)胞和其它的“專業(yè)”抗原提呈細(xì)胞的局部刺激性效應(yīng)以及對(duì)B細(xì)胞的共同刺激效應(yīng)的結(jié)果。
免疫刺激性寡核苷酸和含有未甲基化CpG的疫苗直接活化淋巴細(xì)胞并共同刺激抗原特異性應(yīng)答，這是與常規(guī)的附劑(例如，鋁沉淀物)完全不同的，常規(guī)附劑在單獨(dú)注射時(shí)被認(rèn)為是通過(guò)吸附抗原來(lái)起作用并從而使其對(duì)免疫細(xì)胞更為有效。進(jìn)而言之，常規(guī)附劑只對(duì)某些抗原有效，僅僅誘導(dǎo)抗體(體液)免疫應(yīng)答(Th2)，并且在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答(Th1)方面很差。對(duì)于許多的致病物，體液應(yīng)答對(duì)防御僅有很小的作用，有時(shí)甚至是有害的。
此外，免疫刺激性寡核苷酸可以在化療或免疫治療之前、之中或之后給藥，來(lái)提高腫瘤細(xì)胞對(duì)以后的化療或免疫治療的應(yīng)答，或通過(guò)誘導(dǎo)恢復(fù)性細(xì)胞因子如GM-CSF來(lái)加速骨髓的恢復(fù)。CpG核酸還提高天然殺死細(xì)胞的溶胞活性和依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)。對(duì)NK活性和ADCC的誘導(dǎo)可以獨(dú)自或與其它的治療一起在癌癥的免疫治療中帶來(lái)有益效果。
所述的免疫刺激性核酸分子的另外的一種應(yīng)用是對(duì)過(guò)敏的去敏感化治療，過(guò)敏一般由對(duì)無(wú)害的過(guò)敏原產(chǎn)生IgE抗體所導(dǎo)致的。由未甲基化CpG核酸誘導(dǎo)的細(xì)胞因子主要是屬于“Th1”類型的，其最主要的特點(diǎn)是細(xì)胞免疫應(yīng)答并與IL-12和IFN-γ有關(guān)。其它的主要類型的免疫應(yīng)答被稱為“Th2”免疫應(yīng)答，其更多地相關(guān)于抗體免疫應(yīng)答并產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-10。一般來(lái)講，所有的過(guò)敏疾病都表現(xiàn)為Th2類型免疫應(yīng)答介導(dǎo)的和Th1免疫應(yīng)答介導(dǎo)的自身免疫疾病。根據(jù)免疫刺激性核酸分子將對(duì)象的免疫應(yīng)答從Th2(其與IgE抗體的產(chǎn)生和過(guò)敏有關(guān))轉(zhuǎn)換為Th1應(yīng)答(其對(duì)抵抗過(guò)敏反應(yīng))的能力，可以單獨(dú)向?qū)ο筇峁┯行┝康拿庖叽碳ば院怂峄蚺c免疫原一起提供來(lái)治療或防止過(guò)敏。
含有未甲基化CpG基元的核酸還具有在治療氣喘中的重要的應(yīng)用。Th2細(xì)胞因子，特別是IL-4和IL-5，都是在氣喘病人的呼吸道中呈增高量的。這些細(xì)胞因子促進(jìn)了氣喘發(fā)炎反應(yīng)的重要的方面，包括IgE同種型之間的變換，嗜伊紅粒細(xì)胞趨化性和活化，以及掩飾細(xì)胞的生長(zhǎng)等。Th1細(xì)胞因子，特別是IFN-γ和IL-12，可以對(duì)Th2克隆的形成和Th2細(xì)胞因子的生產(chǎn)進(jìn)行抑制。
如同在下面的實(shí)施例12中所具體描述的那樣，含有未甲基化CpG基元的寡核苷酸(即，TCCATGACGTTCCTGACGTT,SEQ ID NO:11)，但不是對(duì)照寡核苷酸(TCCATGAGCTTCCTGAGTCT SEQ ID NO:11，)，可以在小鼠氣喘模型中防止發(fā)炎細(xì)胞浸入和嗜伊紅粒細(xì)胞化。進(jìn)而言之，對(duì)嗜伊紅粒細(xì)胞性發(fā)炎的抑制是相關(guān)于對(duì)Th2應(yīng)答的抑制和對(duì)Th1應(yīng)答的誘導(dǎo)的。
在治療應(yīng)用中，有效劑量的適宜的免疫刺激性核酸分子自己或是其與釋放復(fù)合體的制劑可以用任何能夠讓寡核苷酸被適宜的靶細(xì)胞(例如，B細(xì)胞和單核細(xì)胞)吸收的方式向?qū)ο蠼o藥。其它的給藥的途徑包括注射(皮下、靜脈內(nèi)、腸胃外、腹膜內(nèi)、胸內(nèi)，等)。注射可以一次給足，也可以連續(xù)滲透。
核酸自己或其與釋放復(fù)合體一起，都可以與藥理學(xué)可接受的載體一同給藥。在本文中，術(shù)語(yǔ)“藥理學(xué)可接受的載體”指的是那些能夠同核酸或核酸釋放復(fù)合體一起給藥并使核酸可以發(fā)揮其有關(guān)功能的物質(zhì)。這樣的載體的例子包括溶液、溶劑、分散介質(zhì)、延緩制劑、乳液，等等。根據(jù)藥理學(xué)活性物質(zhì)來(lái)選用這樣的介質(zhì)是本領(lǐng)域熟知的。其它的適合用于核酸的常規(guī)載體也都在本發(fā)明所包括的范圍之內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)核酸分子的“有效劑量”指的是對(duì)實(shí)現(xiàn)所需要的生物學(xué)效果為必須的或充足的劑量。例如，對(duì)含有至少一個(gè)未甲基化CpG的核酸用于治療免疫系統(tǒng)缺陷來(lái)講，該劑量是對(duì)消除腫瘤、癌癥、或細(xì)菌的、病毒的、或真菌感染為必須的劑量。對(duì)于用作疫苗附劑來(lái)講，有效劑量是可以促進(jìn)對(duì)象對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答的劑量。對(duì)于治療氣喘的“有效劑量”則是講與氣喘相關(guān)的Th2類型的免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變?yōu)門h1類型的應(yīng)答所需要的劑量。對(duì)于任何具體的應(yīng)用的有效劑量，可以根據(jù)諸多因素來(lái)決定，例如，需要治療的疾病或狀態(tài)，具體使用的核酸(例如，含有的未甲基化CpG基元的數(shù)目或它們?cè)诤怂嶂械奈恢?，治療對(duì)象的身高和體重，以及疾病的程度等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員不需要進(jìn)行非必須的實(shí)驗(yàn)就可以確定具體的寡核苷酸的實(shí)際用量。
本發(fā)明將由下面的實(shí)施例中給予更為細(xì)致的描述，這些實(shí)施例不從任何角度限制本發(fā)明。在本申請(qǐng)全文中所提到的文獻(xiàn)(包括文獻(xiàn)材料，授權(quán)的專利，公開的專利申請(qǐng)，和共懸未決的專利申請(qǐng))都通過(guò)在此引述而合并于本文。實(shí)施例實(shí)施例1:ODN對(duì)B細(xì)胞總RNA合成以及細(xì)胞循環(huán)的效應(yīng)從不帶有特異性病原體的6-12周齡的DBA/2或BXSB小鼠(飼養(yǎng)在Iowa大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的品系差異)的脾中獲得B細(xì)胞，用抗-Thy-1.2消除T細(xì)胞，對(duì)淋巴細(xì)胞M離心(Cedarlane Laboratories,Hornby,Ontario,Canada)(此后稱為“B細(xì)胞”)。B細(xì)胞中含有少于1％的CD4+或CD8+細(xì)胞。8×104個(gè)B細(xì)胞分三份加入96孔微滴盤中，每孔中含有100μl的RPMI，其中含有10％的FBS(在65℃下熱滅活30分鐘)，50μM的2-巰基乙醇，100U/ml的青霉素，100μg/ml鏈霉素，以及2mM的L-谷氨酸。在進(jìn)行37℃下的20小時(shí)培養(yǎng)的開始時(shí)刻，加入20μM的ODN，給細(xì)胞加以1μCi的3H尿苷，4小時(shí)后收獲細(xì)胞。將全脾細(xì)胞用20μM的ODN培養(yǎng)48小時(shí)后，對(duì)分泌Ig的B細(xì)胞用ELISA點(diǎn)檢測(cè)法計(jì)數(shù)。表1給出了有關(guān)的結(jié)果，數(shù)據(jù)代表與未用ODN培養(yǎng)的細(xì)胞比較得到的刺激指數(shù)。3H胸苷吸收檢測(cè)顯示了相似的結(jié)果，但是有從降解的ODN釋放的胸苷造成的非特異性抑制[Matson.S and A.M.Krieg(1992)Nonspecificsuppression of3H-thymidine incorporation by controloligonucleotides.Antisense Research and Development 2:325]。
實(shí)施例2:ODN對(duì)B細(xì)胞生產(chǎn)IgM的效應(yīng)從新殺死的小鼠獲得的脾制備單個(gè)細(xì)胞的懸浮液，用抗-Thyl，抗-CD4，和抗-CD8和補(bǔ)體處理，具體方法見(jiàn)Leibson等人的文獻(xiàn)[Leibson et al.,J.Exp.Med.154:1681(1981)]。按照DeFranco等人的程序[DeFranco et al.,J.Exp.Med.155:1523(1982)]從不連續(xù)Percoll梯度的63-70％的帶中分離休眠的B細(xì)胞(T細(xì)胞污染＜0.2％)。這些都按照上述用30μM的ODN或20μg/ml的LPS培養(yǎng)48小時(shí)。正在分泌IgM的B細(xì)胞數(shù)在此時(shí)為最大，有ELISA點(diǎn)檢測(cè)法確定[Klinman,D.M.et al.,J.Immunol.144:506(1990)]。在這個(gè)檢測(cè)中，B細(xì)胞在抗-Ig涂布的微滴盤上培養(yǎng)6小時(shí)。它們所產(chǎn)生的Ig(＞99％的IgM)用磷酸酶-標(biāo)記的抗-Ig檢測(cè)[Southern Biotechnology Associated,Birmingham,AL]。每個(gè)B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體用加入BCIP(Sigma Chemical Co.,St.Louis MO)來(lái)觀察，在有磷酸酶存在時(shí)，形成不溶性蘭色沉淀。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行稀釋后，產(chǎn)生了20-40點(diǎn)孔的結(jié)果，用其來(lái)確定樣品中分泌抗體的B細(xì)胞的總數(shù)。所有的檢測(cè)都進(jìn)行三次(數(shù)據(jù)給出在表1)。在有些實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)物上清液被用ELISA來(lái)檢測(cè)IgM，顯示了應(yīng)答CpG-ODN的相似結(jié)果。
實(shí)施例3細(xì)菌DNA對(duì)B細(xì)胞的刺激對(duì)DBA/2B細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，不加入DNA，或加入50μg/ml的a)Micrococcus lysodeikticus；b)NZB/N小鼠脾；c)NFS/N小鼠脾基因組DNA，培養(yǎng)48小時(shí)后，加入3H胸苷，4小時(shí)后收獲細(xì)胞。對(duì)雙份的DNA樣品用DNASE I在37℃下酶解30分鐘，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)物。用ELISA-點(diǎn)檢測(cè)法確定了在48小時(shí)的時(shí)候，大腸桿菌DNA誘導(dǎo)分泌IgM的B細(xì)胞數(shù)目提高了8.8倍。
對(duì)DBA/2的B細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，不加入任何物質(zhì)，或加入50μg/ml的LPS，或20μM的ODN1、1a、4、或4a。培養(yǎng)細(xì)胞并在第4、8、24和48小時(shí)收集細(xì)胞。對(duì)BXSB細(xì)胞按照實(shí)施例1所述進(jìn)行培養(yǎng)，分別加入5、10、20、40、80μM的ODN 1、1a、4、4a或LPS。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)加入ODN的小孔中為3833cpm。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行至少三次，得到了相似的結(jié)果。重復(fù)的三個(gè)小孔的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5％。
實(shí)施例4:ODN對(duì)天然殺死細(xì)胞(NK)活性的效應(yīng)10×106個(gè)C57BL/6脾細(xì)胞培養(yǎng)在2ml的RPMI中(按照實(shí)施例1進(jìn)行補(bǔ)充)，加入或不加入40μM的CpG或非-CpG ODN，培養(yǎng)48小時(shí)。洗過(guò)細(xì)胞后，用于在短期51Cr釋放檢測(cè)中作為效應(yīng)細(xì)胞，檢測(cè)中使用了YAC-1和2C11這兩種NK敏感靶細(xì)胞系[Balias,Z.K.et al.(1993)J.Immunol.150:17]。加入的效應(yīng)細(xì)胞濃度不同，直至在V底微滴盤中達(dá)到每0.2ml含有104個(gè)51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞，在37℃溫度于5％的CO2下培養(yǎng)4小時(shí)。然后離心，對(duì)上清液的等份試樣計(jì)數(shù)放射活性。特異性溶胞的百分?jǐn)?shù)的計(jì)算是，在有效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)的51Cr釋放減去靶細(xì)胞自己培養(yǎng)時(shí)的51Cr釋放，與用2％乙酸溶胞后的總釋放量減去細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的51Cr cpm釋放相比。
實(shí)施例5對(duì)CpG硫代磷酸酯ODN的體外研究對(duì)小鼠稱重，腹腔內(nèi)注射0.25ml的無(wú)菌PBS或給定劑量的硫代磷酸酯ODN溶于PBS。24小時(shí)后，收獲脾細(xì)胞，洗過(guò)之后染色，進(jìn)行流式細(xì)胞儀測(cè)定，使用藻紅蛋白偶連6B2，來(lái)控制B細(xì)胞，以及生物素偶連的抗Ly-6A/E或抗-Iad(Pharmingen,SanDiego,CA)或抗-Bla-1[Hardy,R.R.et al.,J.Exp.Med.159:1169(1984)]。每種條件都實(shí)驗(yàn)了兩只小鼠，每只小鼠單獨(dú)進(jìn)行分析。
實(shí)施例6硫代磷酸酯ODN對(duì)B細(xì)胞刺激的效價(jià)用硫代磷酸酯ODN培養(yǎng)B細(xì)胞，ODN帶有對(duì)照ODN1a的序列，或CpG ODN1d的序列，或是帶有3Dd的序列，20小時(shí)后，加入3H尿苷，或44小時(shí)后加入3H胸苷，然后收獲細(xì)胞并確定cpm。
實(shí)施例7挽救B細(xì)胞干編程性死亡WEHI-231細(xì)胞(5×104個(gè)/孔)于37℃下培養(yǎng)1小時(shí)，存在或不存在LPS、對(duì)照ODN1a、CpG ODN1d、3Dd，然后加入抗-IgM(1μ/ml)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí)，加入2μCi/孔的3H胸苷4小時(shí)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有ODN的細(xì)胞或有抗-IgM的細(xì)胞得到了90.4×103cpm的3H胸苷吸收。表1中給出的磷酸二酯ODN也給予了相似的保護(hù)，雖然由于ODN的降解有一些非特異性抑制。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行至少3次，得到相似結(jié)果。
實(shí)施例8體內(nèi)誘導(dǎo)小鼠IL-6DBA/2雌性小鼠(2月齡)腹膜內(nèi)注射500g CpG或?qū)φ樟虼姿狨DN。在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠采血。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)研究2只小鼠。用Elisa測(cè)定IL-6,IL-6的濃度用與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來(lái)計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)曲線用重組的IL-6獲得。該檢測(cè)的敏感度為10pg/ml。 8小時(shí)后無(wú)法檢測(cè)。
實(shí)施例9系統(tǒng)性誘導(dǎo)小鼠IL-6轉(zhuǎn)錄小鼠和細(xì)胞系.DBA/2,BALB/c，和C3H/HeJ小鼠，5-10周齡，用作淋巴細(xì)胞來(lái)源。所有的小鼠都來(lái)自于The JacksonLaboratory(Bar Harbor,ME)，并在Iowa大學(xué)的動(dòng)物飼養(yǎng)中心的無(wú)特異性病原體條件下培育和飼養(yǎng)。小鼠B細(xì)胞系CH12.LX由Bishop博士(Iowa大學(xué))慷慨提供。
制備細(xì)胞。對(duì)小鼠折頸處死。從小鼠的脾無(wú)菌制備單個(gè)細(xì)胞的懸浮液。使用抗-Thy-1.2和補(bǔ)體制備消除了T細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞，并對(duì)淋巴細(xì)胞M(Cedarlane Laboratories,Hornby,Ontairo,Canada)離心，具體如前人所述[Krieg,A.M.et al.,(1989)A rolefor endogenous retroviral sequences in the regulation of lymphocyteactivation.J.Immunol.143:2448]。
ODN和DNA.磷酸二酯寡核苷酸(O-ODN)和主鏈修飾的硫代磷酸酯ODN(S-ODN)得自于Iowa大學(xué)DNA中心機(jī)構(gòu)或Operon Technologies(Alameda,CA)。大腸桿菌DNA(菌系B)和小牛胸腺DNA購(gòu)自于Sigma公司(St.Louis,MO)。所有的DNA和ODN都被純化，使用的是酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)和/或乙醇沉淀。在使用前，對(duì)大腸桿菌DNA和小牛胸腺DNA煮沸10分鐘，冰冷卻5分鐘，使它們成為單鏈。對(duì)于某些實(shí)驗(yàn)，大腸桿菌DNA和小牛胸腺DNA都用DNaseⅠ(2U/μg DNA)酶解，37℃下2小時(shí)，在1X SSC中，有5mM MgCl2存在。為了對(duì)大腸桿菌DNA中的CpG二核苷酸內(nèi)的胞嘧啶甲基化，將大腸桿菌DNA用C:G甲基酶(M.SssⅠ；2U/μg的DNA)于NE緩沖液內(nèi)處理，補(bǔ)充以160μM的S-腺苷甲硫氨酸，37℃下過(guò)夜培養(yǎng)。對(duì)甲基化的DNA的純化按照上述進(jìn)行。甲基化的效率有HpaⅡ酶解，凝膠電泳分析來(lái)確定。所有的酶都購(gòu)自于New EnglandBiolabs(Beverly,MA)。在ODN中的LPS水平低于12.5ng/ml,大腸桿菌DNA和小牛胸腺DNA中含有少于2.5ng的LPS/mg的DNA，由鱟檢測(cè)確定。
細(xì)胞培養(yǎng)物。所有的細(xì)胞都在潤(rùn)濕箱中的5％的CO2內(nèi)以37℃培養(yǎng)，加入RPMI-1640并補(bǔ)充以10％(v/v)的熱滅活小牛血清(FCS),1.5mM L-谷氨酸(50μg/ml),CpG或非CpG磷酸二酯ODN(O-ODN)(20μM)，硫代磷酸酯ODN(S-ODN)(0.5μM)，或大腸桿菌DNA(50μg/ml)或小牛胸腺DNA(50μg/ml),37℃下24小時(shí)(對(duì)IL-6生產(chǎn))，或5天(對(duì)IgM生產(chǎn))。刺激物濃度的選擇按照以前的研究和滴定來(lái)決定。在某些情況下，細(xì)胞用CpG O-ODN處理，加入不同濃度(1-10μg/ml)的中性的大鼠IgGl抗小鼠IL-6抗體(雜交瘤MP5-20F3)或?qū)φ沾笫驣gGl單克隆抗大腸桿菌b-半乳糖苷酶(雜交瘤GL113；ATCC,Rockville,MD)(20),5天。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，對(duì)培養(yǎng)物上清液用ELISA按照下述進(jìn)行分析。
體內(nèi)誘導(dǎo)IL-6和IgM.BALB/c小鼠靜脈注射PBS，小牛胸腺DNA(200μg/100μl PBS/小鼠)，大腸桿菌DNA(200μg/100μl PBS/小鼠)，或CpG或非CpG S-ODN(200μg/100μl PBS/小鼠)。小鼠(2只/每組)在不同的時(shí)間點(diǎn)后眶采血并折頸處死。取出肝，脾，胸腺，骨髓，從這些器官中用RANzol根據(jù)廠商的說(shuō)明(Tel-Test,Friendswood,TX)制備RNA。
ELISA.平底Immun 1盤(Dynatech Laboratories,Inc.,Chantilly,VA)被涂布，使用的是100μl/孔抗-小鼠IL-6單克隆抗體(MP5-20F3)(2μg/ml)，或抗小鼠IgMμ-鏈特異性(5μg/ml；Sigma,St.Louis,MO)在碳酸酯-碳酸氫酯，pH9.6緩沖液(15nMNa2CO3,35mM NaHCO3),4℃過(guò)夜。然后，用TPBS(0.5mMMgCl2O6H2O,2.68mM KCl,1.47mM KH2PO4,0.14M NaCl,6.6mM K2HPO4,0.5％Tween20)洗該盤，用10％FCS在TPBS中室溫下封閉該盤2小時(shí)，然后再次洗該盤。培養(yǎng)物上清、小鼠血清、重組的小鼠IL-6(Pharmingen,San Diego,CA)或純化的小鼠IgM(Calbiochem,San Diego,CA)都用10％FCS進(jìn)行適宜的稀釋，加入到小孔中，三份重復(fù)，室溫下培育6小時(shí)。洗該盤，生物素化大鼠抗-小鼠IL-6單克隆抗體(MP5-32C11,Pharmingen,SanDiego,CA)(1μg/ml在10％FCS中)或生物素化的抗-小鼠Ig(Sigma,St.Louis,MO)以100μl/孔的劑量加入到各個(gè)小孔中，室溫下培育45分鐘，然后用TPBS洗。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)共軛的抗生物素蛋白(Bio-rad Laboratories,Hercules,CA)以1∶4000的比例在10％FCS(100μl/孔)中稀釋，加入到小孔中，室溫下培育30分鐘。洗盤后，加入苯基二胺二鹽酸化物(OPD,Sigma,St.Louis MO),0.05M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液，pH5.0,30分鐘。加入0.67N的H2SP4終止反應(yīng)，用微滴盤讀數(shù)儀(Cambridge Technology,Inc.,Watertown,MA)在490-600nm處讀盤。結(jié)果在圖1和2中給出。
RT-PCR.有義引物、反義引物、以及IL-6的內(nèi)部寡核苷酸探針都用公開的序列來(lái)合成[Montgomery,RA.and M.S.Dallman(1991),Analysis of cytokine gene expression during fetalthymic ontogeny using the polymerase chain reaction(J.Immunol.)147:554]。cDNA合成以及IL-6的PCR都基本按照Montgomery和Dallman所述的方法進(jìn)行[Montgomery,R.A.and M.S.Dallman(1991),Analysis of cytokine gene expression during fetal thymicontogeny using the polymerase chain reaction(J.Immunol.)147:554]，采用了RT-PCR試劑，該試劑來(lái)自Perkin-Elmer公司(Hayward,CA)。擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后分析樣品，采用了凝膠電泳和非印跡(unblot)分析方法[Stoye,J.P.et al.,(1991)DNAhybridization in dried gels with fragmented probes:animprovement over blotting techniques,Techniques3:123]。簡(jiǎn)言之，凝膠在變性緩沖液(0.05M NaOH,1.5M NaCl)中于室溫下雜化30分鐘，然后在復(fù)性緩沖液(1.5M NaCl,1M Tris,pH8)中培育30分鐘，再用雙蒸水洗。干燥凝膠后，在47℃預(yù)雜化2小時(shí)，雜化緩沖液(5X SSPE,0.1％SDS)含有10μg/ml的變性大麻哈魚精子DNA。對(duì)凝膠用2×106cpm/ml的IL-6[(5′CATTTCCACGATTTCCCA3′)SEQ ID NO:56]的g-[32P]ATP終端標(biāo)記的內(nèi)部寡核苷酸在47℃過(guò)夜雜交，室溫下洗4次(2XSSC,0.2％SDS)，然后放射性自顯影。結(jié)果在圖3中給出。
細(xì)胞繁殖檢測(cè)。DBA/2小鼠脾B細(xì)胞(5×104個(gè)細(xì)胞/100μl/孔)在37℃下用培養(yǎng)基、CpG或非CpG S-ODN(0.5μM)或O-ODN(20μM)處理24小時(shí)。最后4小時(shí)，加入[3H]胸苷或[3H]尿苷(1μCi/孔)。吸收的[3H]數(shù)量用液相閃爍分析儀(PackardInstrument Co.,Downers Grove,IL)測(cè)定。
轉(zhuǎn)染和CAT檢測(cè)。WEHI-231細(xì)胞(107細(xì)胞)用電穿孔加入20μg對(duì)照的或人IL-6啟動(dòng)子-CAT構(gòu)建物(由阿肯色大學(xué)的S.Manolagas慷慨提供)[Pottratz,S.T.et al.,(1994)17B-estradiolinhibits expression of human interleukin-6 promoter-reporterconstructs by a receptor-dependent mechanism.J.Clin.Invest.93:944],250mV和960μF。電穿孔后，對(duì)細(xì)胞用各種濃度的CpG或非-CpG ODN刺激。轉(zhuǎn)染16小時(shí)后，用溶液檢測(cè)法來(lái)測(cè)定氯霉素?；D(zhuǎn)移酶(CAT)的活性[Seed,B.and J.Y.Sheen(1988)Asingle phase-extraction assay for chloramphenical acetyl transferaseactivity.Gene76:271]。結(jié)果在圖5中給出。
實(shí)施例10決定CpG基元對(duì)B細(xì)胞刺激程度的寡脫氧核苷酸修飾采用標(biāo)準(zhǔn)程序在Applied Biosystem公司(Applied BiosystemsInc.,Foster City,CA)的型號(hào)為380A、380B、或394的DNA合成儀對(duì)ODN進(jìn)行了合成[Beacage and Caruthers(1981)Deoxynucleoside phosphoramidites--A new class of keyintermediates for deoxypolynucleotide syntheses.TetrahedronLetters22,1859-1862]。對(duì)磷酸二酯ODN用標(biāo)準(zhǔn)的β-氰乙基氨基磷酸酯化學(xué)方法合成。硫代磷酸酯連接用元素硫氧化亞磷酸連接來(lái)加入，而不是采用常規(guī)的碘氧化法。四種常見(jiàn)的核苷酸氨基磷酸酯購(gòu)自于Applied Bisystem公司。所有含OND的磷酸二酯和硫代磷酸酯都用濃氨水在55℃處理12小時(shí)來(lái)去保護(hù)。對(duì)ODN用凝膠排阻層析提純并在使用前冷凍干燥二硫代磷酸酯連接用脫氧核苷酸S-(b-苯甲?；鶐€基乙基)吡咯烷硫代氨基磷酸硫酯來(lái)加入[Wiesler,W.T.et al.,(1993)In Methods in MolecularBiology:Protocols for Oligonucleotides and Analogs-Synthesis andProperties,Agrawal,S.(ed),Humana Press,191-206.]。含有ODN的二硫酯用濃氨水在55℃處理12小時(shí)去保護(hù)，然后用反向HPLC提純。
為了合成在所需要的核苷酸間的連接位置含有甲基硫代磷酸酯或甲基磷酸酯以及磷酸二酯的ODN，采用了兩種不同的合成途徑。這兩種途徑的主要區(qū)別是對(duì)二烷基氨基甲基核苷酸磷化氫采用了偶連試劑，而對(duì)甲基硫代磷酸酯采用了氧化試劑。為了合成它們的衍生物，對(duì)二烷基氨基甲基核苷酸磷化氫延長(zhǎng)了其縮化時(shí)間，因?yàn)榕歼B動(dòng)力學(xué)比較緩慢[Jager and Engels,(1984)Synthesis of deoxynucleoside methylphophonates via aphosphonamidite approach.Tetrahedron Letters27,1437-1440]。在偶連步驟完成后，對(duì)甲基磷酸二酯用硫化試劑處理[5％元素硫，100mM的N,N-二甲基氨基吡咯烷，存在于二硫化碳/吡啶/三乙胺中]，四個(gè)連續(xù)的450秒處理，每次都產(chǎn)生了甲基硫代磷酸酯。為了產(chǎn)生硫代磷酸酯連接，對(duì)甲基磷酸二酯用標(biāo)準(zhǔn)的氧化試劑處理(0.1M碘，在四氫呋喃/2,6-二甲基吡啶/水中)。
對(duì)硅膠結(jié)合的寡聚物用蒸餾吡啶/濃氨水為1∶1(v/v)在4℃下處理4天。上清液真空干燥后，溶解于水中，在G50/50的Sephadex柱上色譜。
在本文中，O-ODN指的是磷酸二酯ODN；S-ODN指的是完全硫代磷酸酯修飾的ODN；S-O-ODN指的是嵌合性O(shè)DN，其中的中央連接是磷酸二酯，但是5′和3′端的兩個(gè)連接是硫代磷酸酯修飾的；S2-O-ODN指的是嵌合性O(shè)DN，其中的中央連接是磷酸二酯，但5′和3′端的兩個(gè)連接是二硫代磷酸酯修飾的；MP-O-ODN是嵌合性O(shè)DN，其中的中央連接是磷酸二酯，但5′和3′端的兩個(gè)連接是甲基磷酸酯修飾的。所研究的ODN序列(對(duì)CpG二核苷酸用下劃線標(biāo)出)包括3D(5″GAGAACGCTGGACCTTAT),(SEQ ID NO.14)；3M(5′TCCATGTCGGTCCTGATGCT),(SEQ ID NO.31)；5(5′GGCGTTATTCCTGACTCGCC),(SEQ ID NO.57)；6(5′CCTACGTTGTATGCGCCCAGCT),(SEQ ID NO.58)。這些序列基本上代表了在這些研究過(guò)程上所測(cè)驗(yàn)過(guò)的百種CpG和非-CpG的ODN。
小鼠。DBA/2或BXSB來(lái)自于The Jackson Laboratory(BarHarbor,ME)，飼養(yǎng)在沒(méi)有特異性病原體的條件下，用5-10周齡的小鼠作淋巴細(xì)胞來(lái)源，得到類似的結(jié)果。
細(xì)胞繁殖檢測(cè)。對(duì)于細(xì)胞繁殖檢測(cè)，將小鼠脾細(xì)胞(5×104個(gè)細(xì)胞/100μl/孔)于37℃的5％CO2潤(rùn)濕箱中培養(yǎng)于RPMI-1640中，補(bǔ)充以10％(v/v)熱滅活小牛血清(對(duì)O-ODN實(shí)驗(yàn)加熱到65℃，對(duì)僅僅使用修飾的ODN的實(shí)驗(yàn)加熱到56℃),1.5μM L-谷氨酸，50μM的2-巰基乙醇，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，按照給出的要求培養(yǎng)24小時(shí)或48小時(shí)。每個(gè)小孔中加入1μCi的3H尿苷或胸苷(按給出的要求進(jìn)行)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，收獲細(xì)胞。對(duì)過(guò)濾物用閃爍儀計(jì)數(shù)。三份重復(fù)的小孔的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5％。結(jié)果在圖6-8中給出。
實(shí)施例11:NK活性的誘導(dǎo)磷酸二酯ODN購(gòu)自于Operon Technologies公司(OperonTechnologies,Alameda,CA)。硫代磷酸酯ODN購(gòu)自于Iowa大學(xué)的DNA中心機(jī)構(gòu)，或購(gòu)自于Midland Cerrified ReagentCompany(Midland,TX)。大腸桿菌(菌系B)DNA和小牛胸腺DNA購(gòu)自于Sigma公司(Sigma,St.Louis,MO)。所有的DNA和ODN都用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)萃取和/或乙醇沉淀來(lái)純化。在ODN中的LPS水平低于12.5ng/ml，所含有的大腸桿菌DNA和小牛胸腺DNA低于2.5ngLPS/mg DNA，由鱟檢測(cè)方法確定。
不含有病毒的4-6周齡的DBA/2小鼠、C57BL/6(B6)小鼠，以及先天無(wú)胸腺的BALB/C小鼠都根據(jù)合同通過(guò)VeteransAffairs來(lái)自于National Cancer Institute(Bethesda,MD)。C57BL/6SCID小鼠飼養(yǎng)在Iowa大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)站的SPF封閉飼養(yǎng)設(shè)施中。
人外周血單核淋巴細(xì)胞(PBMC)按照前述獲得[Ballas,Z.K.et al.,(1990)J.Allergy Clin.Immunol.85:453；Ballas,Z.K.and W.Rasmussen(1990)J.Immunol.145:1039；Ballas,Z.K.and W.Rasmussen(1993)J.Immunol.150:17]。人或小鼠的細(xì)胞按5×106個(gè)細(xì)胞/孔的數(shù)量放在24孔微滴盤中的小孔內(nèi)，培養(yǎng)于37℃的5％CO2的潤(rùn)濕箱中[Ballas,Z.K.et al.,(1990)J.Allergy Clin.Immunol.85:453；Ballas,Z.K.and W.Rasmussen(1990)J.Immunol 145:1039；and Ballas,Z.K.and W.Rasmussen(1993)J.Immunol.150:17]，僅加入培養(yǎng)基，或加入CpG或非CpG ODN，劑量按給出的數(shù)據(jù)辦理，或加入大腸桿菌DNA或小牛胸腺DNA(50μg/ml)并在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。所有的培養(yǎng)物在18小時(shí)后收獲，將這些細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，按照以前的描述用在標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)51Cr-釋放檢測(cè)中來(lái)針對(duì)K562(人)或YAC-1(小鼠)靶細(xì)胞。在計(jì)算溶胞單位(LU)時(shí)，1LU定義為30％特異性溶胞所需要的細(xì)胞數(shù)。如同所給出的那樣，在開始培養(yǎng)的時(shí)候，加入中性的抗IFN-β抗體(Lee Biomolecular,San Diego,CA)，或IL-12(C15.1,C15.6,C17.8，和C17.15；來(lái)自于Giorgio Trinchieri博士，The Wistar Institute,Philadelphia,PA)，或加入它們的同型物對(duì)照，直至濃度為10μg/ml。在加入抗-IL-12時(shí)，同時(shí)加入4中單克隆抗體(MAB)(或它們的同型物對(duì)照)各10μg。重組的人IL-2的使用濃度為100U/ml。
實(shí)施例12在小鼠氣喘模型中防止發(fā)炎細(xì)胞的侵入和嗜伊紅粒細(xì)胞化的發(fā)生6-8周齡的C56BL/6小鼠(來(lái)自The Jackson Laboratory,BarHarbor,ME)在第0天和第7天腹膜內(nèi)注射5000血吸蟲卵(Schistosoma mansoni eggs)進(jìn)行免疫。這些血吸蟲卵含有抗原[血吸蟲卵抗原(SEA)]，其誘導(dǎo)Th2免疫應(yīng)答(例如，IgE抗體的生產(chǎn))。IgE抗體的產(chǎn)生是已知的氣喘的重要誘因。
然后，對(duì)免疫的小鼠用寡核苷酸(30μg在200μl鹽水中，注射)處理，這些寡核苷酸中要么含有未甲基化CpG基元(即，TCCATGACGTTCCTGACGTT；SEQ ID NO.10)，或不含這種基元(即，對(duì)照物，TCCATGAGCTTCCTGAGTCT；SEQ ID NO.11)。溶解性SEA(10μg在25μl鹽水中)在笫14天和第21天鼻內(nèi)滴入給藥。鹽水用作對(duì)照。
經(jīng)過(guò)呼吸道的攻擊后，在不同的時(shí)間點(diǎn)處死小鼠。進(jìn)行全肺灌洗，收集呼吸道和肺泡的發(fā)炎細(xì)胞。用ELISA測(cè)定灌洗液的細(xì)胞因子水平。從全肺洗液中分離RNA，進(jìn)行Northern分析和RT-PCR研究，使用了CsCl梯度。對(duì)肺部組織充氣并灌注4％仲甲醛來(lái)進(jìn)行組織學(xué)檢查。
圖9顯示的是，小鼠開始被腹膜內(nèi)注射了血吸蟲卵，然后吸入血吸蟲卵抗原(空心環(huán))，則在肺部有很多的發(fā)炎細(xì)胞。然而，當(dāng)小鼠在開始的時(shí)候，與血吸蟲卵一起接受了含有未甲基化CpG基元的核酸，則在隨后吸入血吸蟲卵抗原(空心三角形)后，肺部沒(méi)有發(fā)炎細(xì)胞的增多。
圖10顯示的是，測(cè)定肺部灌洗液中嗜伊紅粒細(xì)胞所獲得的相似的結(jié)果。嗜伊紅粒細(xì)胞是與氣喘非常相關(guān)的發(fā)炎細(xì)胞。
圖11顯示，當(dāng)小鼠在開始的時(shí)候用對(duì)照寡核苷酸與血吸蟲卵一起處理，在吸入了SEA后，對(duì)隨后的嗜伊紅粒細(xì)胞侵入肺部沒(méi)有效應(yīng)。因此，當(dāng)小鼠在第14天和第21天吸入血吸蟲卵后，它們發(fā)生了肺部的急性發(fā)炎反應(yīng)。然而，在第0天和第7天開始接觸抗原的時(shí)候?qū)pG寡核苷酸與血吸蟲卵一起提供給小鼠的話，則幾乎徹底消除了在第14天吸入血吸蟲卵抗原所造成的嗜伊紅粒細(xì)胞的增高。
圖12顯示，很低劑量的寡核苷酸(＜10μg)就可以提供這樣的保護(hù)。
圖13顯示，所發(fā)生的發(fā)炎應(yīng)答相關(guān)于肺部Th2細(xì)胞因子IL-4的水平。
圖14顯示，提供含有未甲基化CpG基元的寡核苷酸可以實(shí)際上將肺部的細(xì)胞因子應(yīng)答改變?yōu)镮L-12的生產(chǎn)，標(biāo)明Th1類型的免疫應(yīng)答。
圖15顯示，提供含有未甲基化CpG基元的寡核苷酸還可以將肺部的細(xì)胞因子應(yīng)答改變?yōu)镮FN-γ的生產(chǎn)，標(biāo)明Th1類型的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例13:CpG寡核苷酸誘導(dǎo)人PRMC分泌細(xì)胞因子對(duì)Ficoll的Hypaque用常規(guī)離心從全血中制備人PBMC。細(xì)胞(5×105/ml)在96孔微滴盤內(nèi)，與10％自身血清，CpG或?qū)φ展押塑账?對(duì)磷酸二酯寡核苷酸為24μg/ml，對(duì)核酸酶抗性硫代磷酸酯寡核苷酸為6μg/ml)一起培養(yǎng)，在TNF-α?xí)r為4小時(shí)，在其它的細(xì)胞因子時(shí)為24小時(shí)，然后收獲上清并用ELISA檢測(cè)，使用Quantikine試劑盒，或使用來(lái)自R&amp;D Systems(pg/ml)的試劑，或使用來(lái)自Biosource的細(xì)胞因子ELISA試劑盒(對(duì)IL-12檢測(cè))。各檢測(cè)都按照廠商的說(shuō)明書進(jìn)行。表6提供了這些實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，以比沒(méi)有加入寡脫氧核苷酸的小孔高出的細(xì)胞因子水平來(lái)表達(dá)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠采用不超過(guò)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)來(lái)認(rèn)識(shí)或確定那些本發(fā)明描述的具體實(shí)施方案的眾多等同物。這些等同物都是包括在本發(fā)明的權(quán)利要求書中的。
權(quán)利要求
1．一種被分離的核酸序列，其含有至少一個(gè)未甲基化CpG二核苷酸，其通式如下5′N1X1CGX2N23′其中至少一個(gè)核苷酸將連續(xù)的CpGs分開；X1是腺嘌呤，鳥嘌呤，或胸腺嘧啶；X2是胞嘧啶或胸腺嘧啶；N是核苷酸，并且N1+N2是約0-26個(gè)堿基，條件是N1和N2不含有CCGG四元體或多于一個(gè)的CCG或CGG三元體；并且核酸序列的長(zhǎng)度為約8-30個(gè)堿基。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中的X1是胸腺嘧啶。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中所述的X2是胸腺嘧啶。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸序列，其是GTCG(T/C)T或是TGACGTT。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中的所述的序列是TGTCG(T/C)T。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中所述的序列是TCCATGTCGTTCCTGTCGTT。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中所述的序列是TCCTGACGTTCCTGACGTT。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中所述的序列是TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT。
9．一種被分離的核酸序列，其含有至少一個(gè)未甲基化CpG二核酸，其通式如下5′NX1X2CGX3X4N3′其中至少一個(gè)核苷酸將連續(xù)的CpGs分開；X1X2選自GpT、GpG、GpA、ApT和ApA；X3X4選自TpT或CpT；N是核苷酸，并且N1+N2是約0-26個(gè)堿基，條件是N1和N2不含有CCGG四元體或多于一個(gè)的CCG或CGG三元體；并且核酸序列的長(zhǎng)度為約8-30個(gè)堿基。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸序列，其中所述的分離至少兩個(gè)連續(xù)的CpGs的核苷酸是胸腺嘧啶。
11．根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸序列，其中所述的X3和X4是胸腺嘧啶。
12．根據(jù)權(quán)利要求1或9中的任何一個(gè)所述的核酸序列，其中至少一個(gè)核苷酸具有磷酸主鏈修飾。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的核酸序列，其中所述的磷酸主鏈修飾是硫代磷酸酯修飾或磷酸二酯修飾。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的核酸序列，其中所述的磷酸主鏈修飾發(fā)生在核酸的5′端。
15．根據(jù)權(quán)利要求14所述的核酸序列，其中所述的磷酸主鏈修飾發(fā)生在核酸的5′端的前兩個(gè)核苷酸間的連接。
16．根據(jù)權(quán)利要求13所述的核酸序列，其中所述的磷酸主鏈修飾發(fā)生在核酸的3′端。
17．根據(jù)權(quán)利要求16所述的核酸序列，其中所述的磷酸主鏈修飾發(fā)生在核酸的3′端的最后5個(gè)核苷酸間的連接。
18．一種刺激對(duì)象的免疫活化的方法，其中所述的刺激主要是Th1類型的免疫活化，該方法包括向?qū)ο筇峁┚哂袡?quán)利要求1或9所述的核酸序列。
19．根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的對(duì)象是人。
20．一種刺激對(duì)象的細(xì)胞因子生產(chǎn)的方法，該方法包括給對(duì)象提供權(quán)利要求1或9所述的核酸序列。
21．根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的細(xì)胞因子選自包括IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF的一組。
22．根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的對(duì)象是人。
23．根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的核酸序列選自包括下述序列的一組TCCATGTCGCTCCTGATGCT,TCCATAACGTTCCTGATGCT,TCCATGACGATCCTGATGCTTCCATGGCGGTCCTGATGCTTCCATGTCGGTCCTGATGCTTCCATAACGTCCCTGATGCTTCCATGTCGTTCCTGATGCT，以及TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT。
24．一種刺激對(duì)象的NK溶胞活性的方法，該方法包括向?qū)ο筇峁┚哂袡?quán)利要求1或9的通式的核酸序列。
25．根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的對(duì)象是人。
26．根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的核酸序列選自包括下述序列的一組TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT,TCCATGACGGTCCTGATGCT,TCCATGACGATCCTGATGCT,TCCATGACGCTCCTGATGCT,TCCATGACGTTCCTGATGCT,TCCATAACGTTCCTGATGCT,TCCATCACGTGCCTGATGCT,GGGGTCAACGTTGAGGGGGG,TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT,TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT,GCGTGCGTTGTCGTTGTCGTT,TGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT,TGTCGTTGTCGTTGTCGTT，以及TCGTCGTCGTCGTT。
27．一種刺激對(duì)象的B細(xì)胞繁殖的方法，該方法包括向?qū)ο筇峁┚哂袡?quán)利要求1或9的通式的核酸序列。
28．根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的對(duì)象是人。
29．根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的核酸序列選自包括下述序列的一組TCCTGTCGTTCCTTGTCGTT,TCCTGTCGTTTTTTGTCGTT,TCGTCGCTGTCTGCCCTTCTT,TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT,TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT,TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT，以及TGTCGTTGTCGTTGTCGTT。
30．一種刺激對(duì)象的免疫活化的方法，該方法包括向?qū)ο筇峁┚哂袡?quán)利要求1或9的通式的核酸序列，其中所述的核酸序列起附劑的作用。
31．根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的對(duì)象是哺乳動(dòng)物。
32．根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的核酸序列選自包括下述序列的一組TCCATGACGTTCCTGACGTT,GTCG(T/C)T，以及TGTCG(T/C)T。
33．一種治療患有氣喘疾病的對(duì)象的方法，該方法包括向該對(duì)象提供處于藥理學(xué)可接受的載體中的具有權(quán)利要求1或9的通式的核酸序列。
34．根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的對(duì)象是人。
35．根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的核酸序列是TCCATGACGTTCCTGACGTT。
36．一種通過(guò)對(duì)CpG介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活化的抑制來(lái)治療患有自身免疫疾病或其它的與CpG相關(guān)的疾病的對(duì)象的方法，該方法包括向該對(duì)象提供處于藥理學(xué)可接受的載體中的核內(nèi)體酸化抑制物。
37．根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的對(duì)象是人。
38．根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的抑制物選自包括bafilomycin、氯喹、和莫能菌素的一組。
39．根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的抑制物的提供劑量小于約10μM。
40．根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中的疾病選自包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、膿毒癥、腸炎、牛皮癬、齦炎、關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病(Crohn′s disease)、格雷夫斯氏病(Grave′s disease)、和氣喘的一組。
41．根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述的疾病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有未甲基化的CpG二核苷酸的核酸序列,其中的CpG二核苷酸調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),包括刺激Th1類型的免疫活化、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、NK溶胞活性、以及B細(xì)胞的繁殖。這些序列可以用作合成附劑。
文檔編號(hào)C12N15/117GK1235609SQ97199352
公開日1999年11月17日 申請(qǐng)日期1997年10月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月30日
發(fā)明者阿撒爾·M·科瑞格, 約爾·N·科里尼 申請(qǐng)人:艾奧華大學(xué)研究基金會(huì)