使用基于分子核酸的技術(shù)確定細(xì)胞活性的改進(jìn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及從含有活細(xì)胞和死細(xì)胞的混合物中選擇性排除死細(xì)胞的新穎方法和試劑盒，所述混合物例如含有微生物細(xì)胞的臨床樣品、血液制品、醫(yī)學(xué)/生物技術(shù)制品以及食物制品，其中對(duì)選定活細(xì)胞的隨后質(zhì)詢是微生物活性存在的指標(biāo)。具體而言，本發(fā)明涉及在血液和其他體液中進(jìn)行例如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的直接核酸擴(kuò)增技術(shù)以及恒溫技術(shù)的改進(jìn)方法，以與菌血癥和真菌血癥樣品中的微生物細(xì)胞活性建立相關(guān)性。本發(fā)明所提供的改進(jìn)方法特別有利于診斷敗血癥以及確定所有其他正常無菌體液的病理學(xué)狀態(tài)。
【專利說明】使用基于分子核酸的技術(shù)確定細(xì)胞活性的改進(jìn)方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉參照
[0002]本申請(qǐng)為非臨時(shí)申請(qǐng)，其以引用的方式將2010年12月31日遞交的第61/428，892號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)并入本文中，并且主張其優(yōu)先權(quán)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及利用分子檢測(cè)從含有活細(xì)胞和死細(xì)胞的混合物中選擇性排除死細(xì)胞DNA的方法，確切地說，涉及在血液以及其他體液中進(jìn)行直接聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)以便與菌血癥、真菌血癥、病毒血癥以及其他類型的含寄生物樣品中的活微生物細(xì)胞建立相關(guān)性的改進(jìn)方法。本發(fā)明所提供的改進(jìn)方法特別有利于診斷敗血癥。
【背景技術(shù)】
[0004]診斷敗血癥時(shí),得到結(jié)果的時(shí)間(time to result ;TTR)是病人存活的最重要決定因素。目前，血液培養(yǎng)是最高準(zhǔn)則，但是其相對(duì)較慢，產(chǎn)生的的活微生物在隨后鑒定中轉(zhuǎn)為陽(yáng)性的近似中值時(shí)間為15小時(shí)(通常范圍是3小時(shí)到5天)，隨后另外增加I至2天微生物鑒定用于分析。PCR等分子方法為微生物鑒定提供了極大改進(jìn)的TTR，但是這些方法缺少特異性，這主要是由于在樣品制備期間對(duì)活微生物細(xì)胞的選擇不充分。傳統(tǒng)的血液敗血癥PCR測(cè)試按照慣例需要進(jìn)行昂貴的DNA分離以除去PCR抑制劑，但是與血液培養(yǎng)的最高準(zhǔn)則相比，分離也會(huì)造成假陽(yáng)性以及敏感度降低，這主要是由于在DNA分離過程中包含了死亡微生物細(xì)胞的DNA以及與樣品處理相關(guān)的損失。
[0005]傳統(tǒng)上，敗血癥血液樣品PCR制備總是從血液以及血液制品中分離DNA，以除去久已熟知的Taq聚合酶血液源PCR抑制劑(參見下文引述的克魯士(Klouche)以及施羅德(Schroder)論文)。近來，為試圖克服這個(gè)抑制作用，一些團(tuán)隊(duì)已開發(fā)出PCR增強(qiáng)型混合物以及修飾的熱穩(wěn)定聚合酶(例如，熟知的“omni taq”以及“Phusion”技術(shù))，這些聚合酶通過工程改造可減少血液制品對(duì)這些聚合酶的抑制作用(參見JMD，2010 ;12(2)，第152-161頁(yè))。然而，這些方法的約束條件仍然缺少敏感性，這是因?yàn)檠萘磕褪苄缘鸵约芭c分離系統(tǒng)相關(guān)的高成本及樣品損失及高復(fù)雜度。此外，DNA分離系統(tǒng)通常包括來自死細(xì)胞的無細(xì)胞DNA，結(jié)果引起混淆不清的假陽(yáng)性。
[0006]克魯士.M (Klouche, M.)以及施羅德.U (Schroder, U.)在發(fā)表于臨床化學(xué)與牟駘室醫(yī)學(xué)(Clin.Chem.Lab.Med.),2008 ;46 (7)，第888-908頁(yè)中的一篇標(biāo)題為“血流感染的快速診斷方法(Rapid methods for diagnosis of bloodstream infections)，，的論文中，披露了基于核酸直接檢測(cè)和鑒定病人血液中的微生物病原體可以是快速診斷血流感染的一種非常有前景的工具。然而，根據(jù)這篇論文，利用血流感染常規(guī)檢查中寬范圍的分子方法檢測(cè)循環(huán)細(xì)菌或真菌核酸的意義目前尚不明確?？墒箲?yīng)用于血流感染的分子診斷質(zhì)量和再現(xiàn)性改進(jìn)的鼓舞性論點(diǎn)包括:針對(duì)細(xì)菌核酸的選擇性富集程序、過量人類DNA的阻斷或消除方法，以及利用活標(biāo)記物辨別臨床上相關(guān)的發(fā)現(xiàn)，如微生物安全分析經(jīng)驗(yàn)所表明。盡管目前的工藝昂貴且技術(shù)性要求高，但針對(duì)疾病的多重PCR，病原體微陣列以及蛋白質(zhì)組學(xué)分析具有發(fā)展成診斷傳染性疾病的重要、快速且高通量診斷手段的潛能。目前，三個(gè)主要考慮妨礙了分子技術(shù)在血流感染常規(guī)診斷中的獨(dú)特應(yīng)用:難以解釋NAT結(jié)果是由于:1)外部污染風(fēng)險(xiǎn)高，感染后核酸的持久性延長(zhǎng)，以及暫時(shí)性菌血癥；2)對(duì)臨床上相對(duì)較低細(xì)菌負(fù)荷的分析靈敏度有限，以及對(duì)某些細(xì)菌和真菌的檢測(cè)有限，以及3)缺乏通過分子測(cè)試以及蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)試進(jìn)行的常規(guī)抗微生物敏感性測(cè)試。
[0007]區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞是微生物診斷學(xué)中的重要挑戰(zhàn)。代謝和復(fù)制活性以及在病原微生物情況下的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)限于混合微生物群體中的有生命部分。常規(guī)技藝中利用四種生理狀態(tài)、使用熒光染劑、以流式細(xì)胞術(shù)辨別:可復(fù)制的活細(xì)胞、代謝活躍的細(xì)胞、完整細(xì)胞以及通透化細(xì)胞。根據(jù)條件，除通透化細(xì)胞外的所有階段在復(fù)活時(shí)都具有恢復(fù)的潛能，因此須視為潛在存活的。由于細(xì)胞死亡后的DNA的持久性相對(duì)較長(zhǎng)，在數(shù)天到3周范圍內(nèi)，因此基于DNA的診斷傾向于過高估價(jià)活細(xì)胞的數(shù)目。從樣品中提取的DNA可來源于處于上述四種生理狀態(tài)下的任何一種的細(xì)胞，包括死亡的通透化細(xì)胞。然而，不想要檢測(cè)到后者。區(qū)分活細(xì)胞與不可逆損害的細(xì)胞的最重要準(zhǔn)則是細(xì)胞膜完整性。挑選出來源于膜受損細(xì)胞的噪音有助于針對(duì)細(xì)菌群落的完整存活部分指定代謝活性以及健康風(fēng)險(xiǎn)。具有完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞的特征是它們能夠排除輕易滲入死細(xì)胞或膜受損細(xì)胞中的DNA結(jié)合染料。
[0008]近來，據(jù)報(bào)道EMA-PCR是一種可替代顯微鏡或流式細(xì)胞分析來區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞的的易用型方法。這種基于DNA的診斷方法將辨別活-死的染料的用途與實(shí)時(shí)PCR的速度和靈敏度結(jié)合起來。就此而言，已使用單疊氮溴乙錠(EMA)，它是一種具有疊氮基團(tuán)的DNA嵌入染料，在曝露于亮可見光(460nm下的最大吸光度)時(shí)可化學(xué)共價(jià)結(jié)合到DNA。使細(xì)胞暴露于EMA5分鐘，讓染料滲入細(xì)胞壁/膜受損的死細(xì)胞中并且結(jié)合到它們的DNA。使用亮可見光使EMA發(fā)生光解，產(chǎn)生氮烯，所述氮烯可與DNA以及其他分子形成共價(jià)鍵。
[0009]據(jù)報(bào)道，光誘導(dǎo)交聯(lián)可以抑制死細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增。近來已表明，EMA與DNA交聯(lián)實(shí)際上使得DNA不能溶解，并且在基因組DNA提取期間導(dǎo)致DNA與細(xì)胞碎片一起損失。在溶液中保持游離狀態(tài)的未結(jié)合EMA可以通過與水分子反應(yīng)而同時(shí)失活。所產(chǎn)生的羥胺不再能夠共價(jià)結(jié)合到DNA。因此，曝露于光之前因細(xì)胞壁/細(xì)胞膜完整而免于接觸反應(yīng)性EMA的活細(xì)胞DNA，在細(xì)胞溶解之后未受到失活EMA的影響。因此，EMA處理包含活細(xì)胞與死細(xì)胞混合物的細(xì)菌培養(yǎng)物可選擇性除去死細(xì)胞的DNA。所測(cè)試的物種為大腸桿菌0157:H7、鼠傷寒沙門式菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌以及空腸彎曲桿菌。然而這些研究并沒有檢查死細(xì)胞DNA的選擇性損失。
[0010]雖然此項(xiàng)技術(shù)很有前景，但是已發(fā)現(xiàn)在DNA提取之前使用EMA具有嚴(yán)重的缺陷。有時(shí)候，處理還導(dǎo)致了在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收獲的活細(xì)胞的基因組DNA損失大約60%。已觀察到EMA還容易滲入其他細(xì)菌種的活細(xì)胞中，導(dǎo)致部分DNA損失。敏感性以及總體適用性的這種缺乏已產(chǎn)生新開發(fā)的替代化學(xué)測(cè)試:單疊氮溴丙錠(PMA)。在2007年9月7日公開的授予諾克(Nocker)等人的第W0/2007/100762號(hào)已公開專利申請(qǐng)中，披露了 PMA適合從具有活細(xì)胞與死細(xì)胞的定義部分的細(xì)菌培養(yǎng)物中選擇性除去檢測(cè)到的死細(xì)胞基因組DNA。PMA與碘化丙錠(PI)相同，除了另外存在疊氮基團(tuán)以便在曝露于光下時(shí)交聯(lián)到DNA。PI已廣泛用于鑒定混合群體中的死細(xì)胞。PMA分子電荷較高(兩個(gè)正電荷，相比之下，在EMA情況下僅有一個(gè)電荷)，并且由于PI對(duì)非活細(xì)胞的選擇性染色已成功地針對(duì)多種細(xì)胞類型執(zhí)行，所以使得所屬領(lǐng)域的人們相信使用PMA可以減少所觀察到的EMA缺陷。在這個(gè)已公開專利中，在將這些參數(shù)應(yīng)用于大范圍不同細(xì)菌種的研究中之前，利用一種革蘭氏陰性生物體以及一種革蘭氏陽(yáng)性生物體優(yōu)化PMA濃度以及培養(yǎng)時(shí)間。據(jù)稱，所披露的方法使分子診斷限于微生物群落中具有完整細(xì)胞膜的部分。這是通過將完整細(xì)胞與膜受損細(xì)胞混合物暴露于啡錠衍生物而實(shí)現(xiàn)。在所披露的優(yōu)選實(shí)施例中，PCR是使用混合物中的基因組DNA作為模板來執(zhí)行。
[0011]并且,2008年7月3日公開的授予洛倫茲(Lorenz)的第2008/0160528號(hào)已公開美國(guó)專利申請(qǐng)，披露了利用核酸酶，尤其是DNA降解核酸酶，在一種或若干種離液劑和/或一種或若干種表面活性劑存在的情況下使核酸降解。這個(gè)專利申請(qǐng)進(jìn)一步披露了一種從DNA和RNA混合物中純化RNA的方法以及執(zhí)行此類方法的試劑盒。還披露了一種從額外包含高等真核細(xì)胞的混合樣品中所提供的微生物細(xì)胞中分離核酸的方法以及于執(zhí)行此類方法的試劑盒。
[0012]2001年10月18日公開的授予魯?shù)?Rudi)等人的第W0/2001/077379號(hào)已公開專利申請(qǐng)披露了檢測(cè)樣品中的細(xì)胞以及獲得樣品內(nèi)關(guān)于細(xì)胞群體的定量信息的方法。具體而言，披露了一種區(qū)分樣品中活細(xì)胞與死細(xì)胞的方法。所述方法包含使樣品與修飾樣品內(nèi)死細(xì)胞核酸的活性探針接觸以及檢測(cè)樣品中的細(xì)胞核酸。還描述了一種檢測(cè)樣品中的細(xì)胞的方法，所述方法包含:(a)使樣品與標(biāo)記樣品內(nèi)死細(xì)胞核酸的活性探針接觸；(b)將細(xì)胞核酸分離為標(biāo)記部分以及未標(biāo)記部分；以及(C)檢測(cè)所述一個(gè)或兩個(gè)部分中的核酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]鑒于上述【背景技術(shù)】，可以發(fā)現(xiàn)思考模式的轉(zhuǎn)移會(huì)開發(fā)出一種方法，所述方法在基于分子核酸的分析技術(shù)之前(例如在PCR建立之前)可以有效區(qū)分活微生物細(xì)胞DNA與死微生物細(xì)胞DNA，并且所述方法規(guī)避了為除去例如PCR抑制劑并且濃縮目標(biāo)DNA所設(shè)計(jì)的傳統(tǒng)分離的高成本負(fù)面影響。出乎意料的是，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的實(shí)施，已經(jīng)表明PCR與來源于血液的活微生物細(xì)胞相關(guān)聯(lián)，其將選擇性血液細(xì)胞溶解、洗滌(和/或)脫氧核糖核酸酶以及隨后微生物細(xì)胞溶解和PCR組合使用。
[0014]因此，與上述傳統(tǒng).方法對(duì)比，本發(fā)明如下設(shè)法實(shí)現(xiàn)基于分子核酸的技術(shù)(包括PCR)的潛在TTR優(yōu)勢(shì):顯著簡(jiǎn)化昂貴的DNA分離以及樣品制備，并且不是通過分離DNA，而是通過在快速分離死亡微生物DNA以及細(xì)胞之后對(duì)粗制的微生物溶解產(chǎn)物執(zhí)行快速簡(jiǎn)單的直接分析，從而選擇性富集活微生物細(xì)胞。這出乎意料地特別有利于診斷敗血癥，并且根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例如下完成:
[0015]1.除去混雜性死亡微生物細(xì)胞DNA，隨后獲得陽(yáng)性非污染PCR結(jié)果指示存在活細(xì)胞，且因此PCR結(jié)果將指示存在敗血癥活微生物，即，血液微生物PCR=敗血癥活微生物。
[0016]I1.眾所周知，來自血液的死亡微生物細(xì)胞無法在血液培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，因此測(cè)量到單個(gè)血液培養(yǎng)瓶中的微生物特異性PCR信號(hào)顯著增強(qiáng)的任何兩個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)必須是測(cè)量活微生物。
[0017]II1.血液中的PCR抑制劑可以由化學(xué)變性劑(離液劑:清潔劑、pH、鹽類、基于經(jīng)由偶極矩進(jìn)行差別拯救的有機(jī)化合物，例如含有醇和胺的化合物，以及酶，例如核酸酶、蛋白酶等)與洗滌的簡(jiǎn)單組合來清除，從而規(guī)避了 DNA分離并且能夠進(jìn)行微生物溶解產(chǎn)物直接PCR (microbe lysate-Direct-PCR) IV.。
[0018]IV.接著可使用存在于血液以及血液培養(yǎng)液中的活/死微生物的比率作為治療有效性以及測(cè)試治療功效的量度。
[0019]因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供一種利用分子檢測(cè)從含有活細(xì)胞與死細(xì)胞混合物中選擇性排除死細(xì)胞DNA的改進(jìn)方法。
[0020]本發(fā)明的另一目標(biāo)在于提供一種改進(jìn)方法，所述方法在基于分子核酸的分析或PCR之前，有效區(qū)分活微生物細(xì)胞DNA與死微生物細(xì)胞DNA，并且還規(guī)避了傳統(tǒng)分離的高成本負(fù)面影響，例如，為除去PCR抑制劑以及濃縮目標(biāo)DNA所設(shè)計(jì)的傳統(tǒng)分離。
[0021]本發(fā)明的另一目標(biāo)在于提供如下使PCR及其他分子分析技術(shù)的結(jié)果與血液源活微生物細(xì)胞的存在相關(guān)的方法:例如，將選擇性血細(xì)胞溶解、洗滌(和/或)脫氧核糖核酸酶以及隨后微生物細(xì)胞溶解和PCR組合使用。
[0022]本發(fā)明的又一目標(biāo)在于提供在血液以及其他體液中進(jìn)行直接PCR技術(shù)以便與菌血癥的以及真菌血癥樣品中的活微生物細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的改進(jìn)方法，本發(fā)明提供的這些改進(jìn)方法特別有利于診斷敗血癥。
[0023]本發(fā)明的其他目標(biāo)和優(yōu)勢(shì)可從本發(fā)明的以下優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)說明清楚看出。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1以表格形式顯示為比較過濾-珠磨-原位微生物溶解和分析物分析(通過DNA聚合酶(PolMA))以及基因組DNA (通過定量基因特異性PCR)所執(zhí)行的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0025]圖2以圖表形式顯示根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)溶解產(chǎn)物中的微生物的策略說明。
[0026]圖3顯示的流程圖 說明根據(jù)本發(fā)明添加胰蛋白酶以及脫氧核糖核酸酶能夠明顯減少在處理兩種“困難”臨床樣品期間所觀察到的凝結(jié)。
【具體實(shí)施方式】
[0027]雖然本發(fā)明已經(jīng)進(jìn)行了描述，但是還提供以下實(shí)例以便具體說明本發(fā)明的實(shí)施例以及清晰理解。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言顯而易見的是，根據(jù)本文中所闡明的本發(fā)明傳授內(nèi)容，可以對(duì)如此所描述的這些實(shí)施例進(jìn)行某些改變和修改，而此等改變和修改不脫離本發(fā)明的精神或范圍。
[0028]離液劑，也被稱作離液試劑和離散劑，是一種能夠分裂蛋白質(zhì)、DNA或RNA等大分子的三維結(jié)構(gòu)并且使它們變性的物質(zhì)。離液劑干擾由氫鍵、范德華力以及疏水效應(yīng)等非共價(jià)力調(diào)節(jié)的分子間相互作用的穩(wěn)定。如利用圓二色性等方法檢測(cè)的常見結(jié)構(gòu)特征可以離液劑濃度依賴性方式進(jìn)行滴定。離液劑包括，例如:
[0029]尿素6_8mol/l
[0030]鹽酸胍6mol/l
[0031]高氯酸鋰4.5mol/l
[0032]變性作用(生物化學(xué))
[0033]此外，高通用性鹽通過屏蔽電荷以及防止鹽橋穩(wěn)定而可具有離液特性。氫鍵在非極性介質(zhì)中較強(qiáng)，因此，增大試劑偶極距的鹽也可以使氫鍵不穩(wěn)定。
[0034]如利用圓二色性等方法檢測(cè)的常見結(jié)構(gòu)特征可以離液劑濃度依賴性方式進(jìn)行滴定。歷史上用于生物化學(xué)以及分子生物學(xué)中的離液試劑的一些實(shí)例包括:尿素6-8mol/l、鹽酸胍6mol/l、高氯酸鋰4.5mol/l、醇類、胺類(尤其是季胺)、清潔劑(尤其是非離子型)、pH值改變、甜菜堿、脯氨酸、肉毒堿、海藻糖、NP-40等，以及BSA。根據(jù)本發(fā)明，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DoE)流程已被用于優(yōu)化多種離液劑的有效配方范圍以及范圍組合(混合物或試劑，或者“混合液”):a)使死細(xì)胞結(jié)構(gòu)變性，從而根據(jù)尺寸(過濾)以及密度(離心)而輕易地將它們與活細(xì)胞分離；以及b)形成暴露于所得離液劑混合液的活細(xì)胞分離溶液，所述溶液與下游分析擴(kuò)增試驗(yàn)(例如PCR)以及活細(xì)胞源內(nèi)生性蛋白直接相容，并且維持它們可測(cè)量的生化活性?？捎行У貎?yōu)化離液劑混合液，從而根據(jù)細(xì)胞膜完整性的差異來區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞，維持活細(xì)胞內(nèi)生性蛋白活性供活性相關(guān)性分析用。
[0035]樣品制備:
[0036]優(yōu)選的血細(xì)胞溶解條件可優(yōu)選地使血液微生物混合物中的血細(xì)胞均質(zhì)化，例如在敗血癥血液培養(yǎng)樣品中所發(fā)現(xiàn)。均質(zhì)化需要以足夠的水平發(fā)生(形成流體)，從而允許不需要的血細(xì)胞流體從進(jìn)料側(cè)(保留需要的微生物細(xì)胞)通過過濾器進(jìn)入濾液側(cè)，從而有效地分離這兩種群體。這些溶解條件能夠使微生物細(xì)胞保持完整，從而能夠通過持留微生物細(xì)胞而對(duì)均質(zhì)化的血細(xì)胞進(jìn)行快速/靈敏的過濾式分離。
[0037]根據(jù)本發(fā)明，采用了不同的血細(xì)胞分解以及其所得細(xì)胞碎片的充分均質(zhì)化，以將血細(xì)胞減少到能夠采用不同的可濾性的流體水平，此處過濾器將微生物保留在進(jìn)料側(cè)，從而為了隨后的無菌流體 分析而分離完整的微生物。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的過濾器孔徑，即，直徑在0.4511!11、0.2211111、0.1 um之間的孔徑是足夠的。然而，取決于微生物以及不同細(xì)胞碎片的尺寸可濾性，這些有效的孔徑也可以是小于0.1或者大于0.45的。各種條件包括但不限于清潔劑、蛋白酶、離液劑、變性劑以及核酸酶的優(yōu)化組合以獲得期望的效果。
[0038]微生物特異性原位過濾在本文中被定義為采用物理的以及生化的細(xì)胞壁溶解方法，在過濾器進(jìn)料側(cè)捕獲微生物以及/或者隨后在原位應(yīng)用的微生物特異性分析物試驗(yàn)。此外，本文中“原位”是指溶解以及/或者隨后的分析是發(fā)生在不期望的干擾細(xì)胞(即，血細(xì)胞)的差異性分離之后，而期望的微生物細(xì)胞則仍然保留在過濾器的進(jìn)料側(cè)。因此，預(yù)期所捕獲的微生物很有可能懸浮在用于加載和洗滌過濾器的殘余進(jìn)料過濾器溶液中。用于溶解這些現(xiàn)在為分離的、完整的以及進(jìn)行了過濾的微生物所采用的物理力是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的那些，包括但不限于細(xì)胞壁酶消化。此外，根據(jù)本發(fā)明，所有微生物的原位過濾器聲波降解法是通過直接探針接觸殘余液體，所述殘余液是由含有分離的微生物的過濾側(cè)上的表面張力保留的，替代性地通過聲波探針接觸過濾器的距離微生物的相對(duì)側(cè)，并且通過孔而非通過固體過濾材料來傳遞其溶解能。此外，還意外地發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和酵母的原位濾珠磨機(jī)微生物溶解的效能也發(fā)生在封閉的微離心管中，如同在捕獲刺入到血液中的微生物之后直接作用在過濾器進(jìn)料表面上，其中血細(xì)胞被分化溶解并且單獨(dú)地進(jìn)行了過濾。通過這種方式，本文中所定義的原位過濾是敗血癥樣品制備的精致的簡(jiǎn)化，帶來了具有較少的操作、較少的潛在污染風(fēng)險(xiǎn)、手動(dòng)的以及自動(dòng)裝置設(shè)計(jì)的更加靈活的模式的更加有效的處理。
[0039]如下文的實(shí)例中所使用，過濾是作為所屬領(lǐng)域中常用的術(shù)語來使用，即，用于將固體從流體(液體或氣體)中分離的機(jī)械或物理操作，方法是插入一種介質(zhì)使得只有流體能夠通過。在典型的簡(jiǎn)單過濾中，被過濾的液體中的過大尺寸的顆粒無法通過過濾器的晶格結(jié)構(gòu)，而流體以及小顆粒可以通過，成為濾過物。
[0040]實(shí)例I
[0041]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以對(duì)通過DNA聚合酶(PolMA)的原位濾珠磨機(jī)微生物溶解和分析物的分析，以及通過量化基因特異性PCR的基因組DNA進(jìn)行比較。所得結(jié)果示于附圖的圖1中描繪的表格中。
[0042]如同本文中所采用的，在比較相對(duì)qPCR值時(shí)，δ Ct值必須大于2才能夠作為顯著
性差異。
[0043]結(jié)果和結(jié)論:
[0044]起始輸入微生物刺入值與對(duì)應(yīng)的過濾后獲得的樣品之間的相對(duì)qPCR差值通常示出了刺入到血液中的多種微生物的非常高的％恢復(fù)率，所述多種微生物隨后在過濾器的進(jìn)料側(cè)被捕獲，然后在所述過濾器的進(jìn)料側(cè)被濾珠磨機(jī)溶解，這在本文中稱作“原位過濾器磨機(jī)”。在PCR可以測(cè)量的14種不同的微生物中，只有四種(所有的假絲酵母)(28%)示出了顯著的PCR恢復(fù)差異。對(duì)于這些酵母，在這些相同的樣品中存在可測(cè)量的DNA聚合酶活性的增強(qiáng)。總體上，這表明了帶來了較高的DNA聚合酶活性以及可以擴(kuò)大的基因組DNA的良好的恢復(fù)以及高效率的原位過濾器磨機(jī)。出乎意料的是，用加粗的紅色表示的顯著性負(fù)值表明根據(jù)本發(fā)明的依賴于原位過濾器的PolMA可以是微離心管中的顯著改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)研磨。
[0045]根據(jù)本發(fā)明溶解產(chǎn)物中的微生物的檢測(cè)策略可以總結(jié)在本文的附圖，即圖2中。
[0046]實(shí)例2
[0047]本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施例的該實(shí)例表明本發(fā)明的規(guī)避了傳統(tǒng)的DNA分離技術(shù)的必要性，并且能夠確保使用基于微生物溶解產(chǎn)物直接探針的PCR技術(shù)的執(zhí)行的適用性。
[0048]a.將金黃色葡萄球菌刺入到標(biāo)準(zhǔn)的血液培養(yǎng)基中(假絲酵母共有試驗(yàn)，大腸桿菌、屎腸球菌)，隨后是WBC清潔劑+底物溶解、制成小球以及洗滌。
[0049]b.發(fā)現(xiàn)的是在使用T.aqMan探針以及SYBR的直接溶解產(chǎn)物PCR之后，根據(jù)本發(fā)明的直接探針流程在每種情況下就PCR中％溶解產(chǎn)物的較高的容限(高達(dá)17%)而言具有優(yōu)勢(shì)，且在30ul PCR中在5ul研磨溶解產(chǎn)物中的至少5000個(gè)微生物中沒有檢測(cè)到抑制。
[0050]血液培養(yǎng)基陽(yáng)性瓶將含有培養(yǎng)基的大約4000個(gè)微生物/ml，在準(zhǔn)備過程中放置2ml將獲得8000個(gè)微生物/50ul溶解產(chǎn)物，其中30ul PCR反應(yīng)中的5ul=PCR中的160個(gè)微生物(上限BC水平所需要的試驗(yàn)容限)。目前估計(jì)BC檢測(cè)的限制為500個(gè)微生物/瓶或者10個(gè)微生物/ml，因此5ul=2。如果10個(gè)微生物/瓶(通常)，那么5ul=0.2微生物，那么需要翻6翻的子代數(shù)以達(dá)到=640/瓶，該數(shù)目是可以檢測(cè)到的。
[0051]c.相應(yīng)地，根據(jù)本發(fā)明示出了 SA微生物通過了(離液劑+清潔劑)Mc^Ysis緩沖物以及DNA酶處理，隨后是ITE小球以及洗滌，它們與磨機(jī)直接探針PCR兼容。本發(fā)明的新穎的改進(jìn)的方法的是通過在所使用的血液磨機(jī)直接系統(tǒng)中的改進(jìn)示出的，是就優(yōu)于傳統(tǒng)技術(shù)的敏感度以及％血液的容限而言的，方法是對(duì)沒有變性劑的血液培養(yǎng)珠磨機(jī)系統(tǒng)(貝克頓迪金森(Becton Dickinson)葡萄球菌S/R試劑盒,可從貝克頓迪金森公司購(gòu)得),其中只有1/10e6th的樣品在PCR中，與具有變性劑(DoE:胍/吐溫，氚核/NaOH，吐溫/氚核等)的本發(fā)明的改進(jìn)所提供的系統(tǒng)進(jìn)行比較。
[0052]實(shí)例3
[0053]在本發(fā)明的發(fā)展期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明胰蛋白酶以及DNA水解酶的添加確保了在根據(jù)本發(fā)明對(duì)兩種“困難的”臨床樣品進(jìn)行處理期間觀察到的堵塞的顯著減少，如同本文所附的圖3中的流程圖所示。
[0054]對(duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言應(yīng)理解的是本發(fā)明的廣泛的基本原理以及教示能夠應(yīng)用于對(duì)多種生物組織樣品(包括，但不局限于，血液、體液，以及軟組織)的啟用變性劑的原始分解產(chǎn)物(珠磨機(jī)以及超聲波)直接探針/SYBR-PCR的所有變體進(jìn)行優(yōu)化，所針對(duì)的不僅是上文具體描述的SA，還可以針對(duì)多種病原體，例如，任何細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等。
[0055]上述實(shí)例還表明本發(fā)明所提供的實(shí)踐可以有效地壓制特定的信號(hào)，所述信號(hào)是來自界定的混合物中被殺死的細(xì)胞或者是穿刺有活細(xì)胞以及被殺死的細(xì)胞的界定的混合物的環(huán)境樣品。還值得注意的是根據(jù)本發(fā)明的樣品處理是將細(xì)胞膜受損的細(xì)胞排除于分析之外的較好的方式。
[0056]綜上所述，本發(fā)明提供了能夠確保在進(jìn)一步的下游分析之前的細(xì)菌種群的快速且易于執(zhí)行的預(yù)處理的新穎的方法。雖然對(duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言本發(fā)明的多種潛在的應(yīng)用是顯而易見的，但是本發(fā)明所提供的方法可以對(duì)多個(gè)領(lǐng)域中的基于DNA的診斷造成重大的影響，包括病原體診斷、生物恐怖主義以及微生物生態(tài)學(xué)。
[0057]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的實(shí)踐中，顯而易見的是由于細(xì)胞不會(huì)生長(zhǎng)，使用來自單個(gè)血細(xì)胞培養(yǎng)基的單獨(dú)的但是相等的整除數(shù)的示出了微生物目標(biāo)信號(hào)的顯著的增長(zhǎng)的在至少兩個(gè)單獨(dú)的時(shí)間點(diǎn)處的任何PCR測(cè)量結(jié)果，一定是由于微生物生長(zhǎng)造成的，從而指示了活性微生物的存在(不考慮污染的影響)。應(yīng)理解在活性細(xì)胞溶解以及PCR建立(排除了任何由PCR過程造成的污染)之前，當(dāng)所有的死細(xì)胞DNA已被清除時(shí)，血液的基于非生長(zhǎng)的單個(gè)點(diǎn)陽(yáng)性PCR分析將指示活性微生物的存在。這可以通過DNA酶解以及洗滌掉死細(xì)胞DNA來說明。
[0058]雖然本文是專門參考PCR的，但是還應(yīng)理解本發(fā)明的改進(jìn)并不局限于PCR或者類似的方法。在本發(fā)明中使用的構(gòu)思出的擴(kuò)增試驗(yàn)包括，但不局限于，其他熟知的核酸類技術(shù)，例如，DNA擴(kuò)增試驗(yàn)、并入熱穩(wěn)定聚合酶的PCR試驗(yàn)以及恒溫?cái)U(kuò)增方法。應(yīng)理解所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以構(gòu)思出可用于本發(fā)明的實(shí)踐中的多種適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法，因此本發(fā)明并非意圖局限于此。
[0059]應(yīng)理解本發(fā)明可以應(yīng)用于涉及DNA診斷的所有方法、流程以及過程中。此類應(yīng)用的實(shí)例包括，但不局限于那些涉及食品、水安全、生物恐怖主義、醫(yī)學(xué)/藥學(xué)以及/或者任何涉及病原體檢測(cè)的應(yīng)用。在食品工業(yè)中，本發(fā)明可以用于監(jiān)測(cè)防腐劑的功效。本發(fā)明所述的方法具有應(yīng)用到所有細(xì)胞中的潛能。雖然在實(shí)例中列舉的是細(xì)菌細(xì)胞，但是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以輕易地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法可以應(yīng)用到多種其他細(xì)胞類型中。本發(fā)明還可以用于對(duì)干擾細(xì)胞膜和/或殺死細(xì)胞，例如，細(xì)菌細(xì)胞，的物質(zhì)進(jìn)行鑒別。由于多藥耐藥性生物體的繁盛以及在衛(wèi)生機(jī)構(gòu)與病人中的傳播，新的消毒劑和/或抗生素的鑒別已成為目前的優(yōu)選考慮事項(xiàng)。
[0060]還應(yīng)理解本發(fā)明的方法與量化PCR結(jié)合起來形成的一種工具，能夠快速且成功地識(shí)別消毒劑和/或抗生素的影響，而無需花費(fèi)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞并且等待細(xì)胞生長(zhǎng)。在一些實(shí)例中，可能需要花費(fèi)很多天甚至很多周來培養(yǎng)生物體，因此將要花費(fèi)大量的時(shí)間來觀察候選物質(zhì)是否能夠殺死微生物等細(xì)胞。在其他實(shí)例中，某些生物體不會(huì)在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因此難以確定某一物質(zhì)是否是有效的。因此，采用本發(fā)明的新穎的方法可以節(jié)省鑒別新型的消毒劑和/或抗生素的時(shí)間以及資源。
[0061]根據(jù)本發(fā)明的新穎的方法的另一優(yōu)勢(shì)在于易于使用。例如，通過使用這些方法，可以輕易地針對(duì)活性細(xì)胞(例如，細(xì)菌)的存在對(duì)大量的樣品進(jìn)行檢測(cè)。例如，可以針對(duì)具有完整的細(xì)胞膜的潛在存活的細(xì)菌的存在來對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。在另一實(shí)施例中，可以針對(duì)活性細(xì)胞(例如，細(xì)菌)的存在對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行測(cè)試。這些樣品可以是，例如，從土壤或者植物的一部分中收集的。根據(jù)本發(fā)明的方法還可以用于在排放之前和之后對(duì)處理過的污水進(jìn)行檢測(cè)。
[0062]根據(jù)本發(fā)明的方法還可以用于檢測(cè)醫(yī)藥學(xué)樣品，例如，糞便樣品、血液培養(yǎng)物、唾液、組織樣品(以及切片)、創(chuàng)傷材料、尿液、以及來自呼吸道、植入物和導(dǎo)管表面的樣品。
[0063]根據(jù)本發(fā)明的方法的另一應(yīng)用領(lǐng)域可以是食品控制。在其他實(shí)施例中，食物樣品是從牛奶或乳制品(酸奶、乳酪、甜乳酪、黃油以及脫脂乳)、飲用水、飲料(梓檬水、啤酒以及果汁)、焙烤產(chǎn)品或者肉制品中獲得的。本發(fā)明的方法可以確定食物中的防腐劑或者食物的殺菌處理(例如，巴氏殺菌)能否能夠阻止細(xì)胞的生長(zhǎng)。根據(jù)本發(fā)明的方法的另一應(yīng)用領(lǐng)域是藥學(xué)產(chǎn)品以及化妝品的分析，例如，軟膏、乳膏、酊劑、汁液、溶液、液滴等。
[0064]本發(fā)明的方法解決了較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間(在許多天的范圍內(nèi))的問題，使得老式的方法不適于及時(shí)的警告以及防范措施。此外，基于當(dāng)前PCR的方法可以給出假陽(yáng)性的結(jié)果(針對(duì)某一生物體測(cè)試出陽(yáng)性，但是該生物體并不是活性的)。此外，近期的研究表面一些生物體可以在某些情況下喪失復(fù)制的能力，即使它們?nèi)匀皇腔钚缘?。這些“存活但是無法進(jìn)行培養(yǎng)”(VBNC)的細(xì)菌是無法使用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法來檢測(cè)的，但是如果將它們轉(zhuǎn)移到更加合適的環(huán)境中，那么它們可能重新獲得生長(zhǎng)的能力。這些缺點(diǎn)的解決可以通過采用分子學(xué)方法，基于對(duì)這些生物體的基因材料/DNA的檢測(cè)并結(jié)合本發(fā)明的方法。因此，涉及例如，污染的水、廢水、食物、藥品和/或化妝品等樣品中的活性生物體的快速和精確的結(jié)果，可以防止被污染的物質(zhì)被釋放到公共環(huán)境中。與目前耗時(shí)較多的方法相比，本發(fā)明的方法可以節(jié)約資源，通過的是將假陽(yáng)性(針對(duì)某一病原體測(cè)試結(jié)果為陽(yáng)性，盡管該病原體并非是活性的)結(jié)果最小化以及樣品的快速檢測(cè)。
[0065]此外，本發(fā)明的方法可以識(shí)別用于生態(tài)學(xué)研究、農(nóng)業(yè)上特定土壤的健康以及/或者生態(tài)系統(tǒng)的微生物群落的潛在的具有活性成員。傳統(tǒng)上，細(xì)菌群落的識(shí)別是使用基于培養(yǎng)的方法或者平板計(jì)數(shù)來進(jìn)行 的。計(jì)數(shù)的種群越多，則會(huì)在原始的樣品中估計(jì)出越多的細(xì)菌，然而，有時(shí)由于較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間(在很多天的范圍內(nèi))引發(fā)的問題使得這種方法不適于即使的且精確的結(jié)果。需要使用本發(fā)明的方法來克服這些缺點(diǎn)。
[0066]可以使用本發(fā)明的方法來進(jìn)行分析的或者使用本發(fā)明的方法在樣品中檢測(cè)潛在活性的細(xì)菌的非限制性實(shí)例，除了上文描述的SA之外，還包含:百日咳桿菌、鉤端螺旋體波莫納群、甲、乙、丙型副傷寒沙門菌、白喉?xiàng)U菌、破傷風(fēng)桿菌、肉毒菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、氣腫疽梭菌以及其他氣性壞疽細(xì)菌、炭疽桿菌、鼠疫桿菌、敗血性巴氏桿菌、腦膜炎雙球菌、奈瑟氏淋球菌、流感嗜血桿菌、放線菌(例如，諾卡氏菌)、不動(dòng)桿菌、芽孢桿菌(例如，炭疽桿菌)、擬桿菌(例如，脆弱擬桿菌)、芽生菌、博德氏桿菌、疏螺旋體(例如，伯氏疏螺旋體)、布魯氏菌、彎曲桿菌、衣原體、球孢子菌、棒狀桿菌(例如，白喉?xiàng)U菌)、大腸桿菌(例如，腸毒性大腸桿菌以及腸出血性大腸桿菌)、腸桿菌(例如，產(chǎn)氣腸桿菌)、腸桿菌(克雷伯氏菌)、沙門氏菌(例如，傷寒桿菌、腸炎沙門氏菌、沙雷氏菌、耶爾森氏菌、志賀氏桿菌)、丹毒絲菌、嗜血桿菌(例如，B型流感嗜血桿菌)、螺桿菌、軍團(tuán)桿菌(例如，嗜肺軍團(tuán)桿_、鉤端螺旋體、李斯特菌(例如，單核細(xì)胞增生李斯特菌)、支原體、分枝桿菌(例如，麻風(fēng)分枝桿菌以及結(jié)核分枝桿菌)、弧菌(例如，霍亂弧菌)、巴斯德氏菌、變形桿菌、假單孢菌(例如，綠膿桿菌)、立克次氏體、螺旋體(例如，密螺旋體屬、鉤端螺旋體屬、疏螺旋體屬)、志賀氏桿菌屬、腦膜炎球菌、肺炎球菌以及所有的鏈球菌(例如，肺炎鏈球菌以及A3、B，以及C類鏈球菌)、脲原體、梅毒螺旋體、金黃色葡萄球菌、溶血性巴式桿菌、棒狀桿菌、白喉類毒素、腦膜炎球菌多糖、百日咳桿菌、肺炎鏈球菌、破傷風(fēng)桿菌類毒素，以及牛型結(jié)核桿菌。上述列表僅僅是說明性的，而并非意圖將本發(fā)明限制為檢測(cè)這些特定的細(xì)菌生物體。
[0067]本發(fā)明的一項(xiàng)尤其優(yōu)選的實(shí)施例使用的是PCR。PCR的常規(guī)的流程教示于第4，683，195號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)案(穆利斯等人)以及第4，683，202號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)案(穆利斯等人)。然而，用于每次擴(kuò)增反應(yīng)的最佳PCR條件通常是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的或者是使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常采用的計(jì)算機(jī)軟件來評(píng)估的。多種參數(shù)都會(huì)影響反應(yīng)的成功。它們中的一些是退火溫度和時(shí)間、延伸時(shí)間、Mg2+、pH以及引物、模板、脫氧核苷酸的相對(duì)濃度。通常，模板核酸的變性是通過在聚合酶反應(yīng)之前在至少大約95°C下加熱I至10分鐘進(jìn)行的。執(zhí)行大約20-99個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，使用的是在90°C至96°C的范圍內(nèi)的大約0.05分鐘至I分鐘的變性，在48°C至72°C的溫度范圍內(nèi)的大約0.05分鐘至2分鐘的退火，以及具有最佳末循環(huán)的在68°C至75°C的范圍內(nèi)的至少01分鐘的延伸。在一項(xiàng)實(shí)施例中，PCR反應(yīng)可以含有大約IOOng模板核苷酸、20uM的上游引物和下游引物，以及每種類型的0.05至0.5mm dNTP，以及0.5至5單元的可購(gòu)得的熱穩(wěn)定DNA聚合酶。
[0068]傳統(tǒng)的PCR的一項(xiàng)變體是逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)(RT-PCR)，其中逆轉(zhuǎn)錄酶首先將RNA分子轉(zhuǎn)化為單鏈的cDNA分子，隨后將該cDNA作為模板用于聚合酶鏈反應(yīng)中隨后的擴(kuò)增。RNA的分離是所屬領(lǐng)域中所熟知的。為了執(zhí)行RT-PCR，通常在目標(biāo)核酸經(jīng)加熱變性之后將逆轉(zhuǎn)錄酶添加到反應(yīng)樣品中。隨后將反應(yīng)維持在適當(dāng)?shù)臏囟?例如，30-45°C)下足夠的時(shí)間(10-60分鐘)以在計(jì)劃的擴(kuò)增循環(huán)開始之前生成cDNA模板。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員會(huì)理解如果期望獲得定量的結(jié)果，那么必須小心地使用一種方法以維持或者控制擴(kuò)增的核酸的相對(duì)的拷貝?！岸俊睌U(kuò)增的方法是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。例如，定量PCR可以涉及使用相同的引物的同時(shí)對(duì)已知量的對(duì)照序列進(jìn)行共同擴(kuò)增。這提供了可以用于校準(zhǔn)PCR反應(yīng)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
.[0069]PCR的另一替代方案是定量PCR (qPCR)。qPCR可以使用競(jìng)爭(zhēng)性技術(shù)來進(jìn)行，采用的是通過小片段的插入或者刪除而與目標(biāo)產(chǎn)物尺寸不同的內(nèi)部同源對(duì)照。然而，也可以使用非競(jìng)爭(zhēng)性以及動(dòng)態(tài)定量PCR。實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)PCR檢測(cè)與可以和目標(biāo)序列同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的內(nèi)部同源對(duì)照的組合會(huì)是非常有利的。
[0070]PCR、RT-PCR和/或qPCR的引物是從某些區(qū)域或者特定的細(xì)菌中選擇的，所述引物僅對(duì)為特定的生物體選擇的DNA區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增?；蛘?，所選擇的引物會(huì)對(duì)所有生物體通用的DNA部分進(jìn)行雜交和擴(kuò)增。引物的選擇和構(gòu)建是所屬領(lǐng)域所熟知的。通常，一種引物位于待擴(kuò)增的序列的每一端。此類引物的長(zhǎng)度通常在10至35個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)，并且具有的優(yōu)選的長(zhǎng)度在18至22個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)。可以進(jìn)行擴(kuò)增的最小的序列的長(zhǎng)度為大約50個(gè)核苷酸(例如，正向引物和反向引物的長(zhǎng)度都為20個(gè)核苷酸，所述引物在序列中的位置至少由10個(gè)核苷酸隔開)。可以對(duì)更長(zhǎng)的序列進(jìn)行擴(kuò)增。一種引物被稱作“正向引物”并且位于待擴(kuò)增的區(qū)域的左端。正向引物的序列與DNA的上游鏈的區(qū)域中的序列相同(當(dāng)按照慣例描繪雙鏈DNA時(shí)，其中上游鏈被示為具有5’到3’方向的極性)。所述正向引物的序列使得它與同DNA的上游鏈互補(bǔ)的DNA鏈雜交。另一種引物被稱作“反向引物”并且位于待擴(kuò)增的區(qū)域的右端。反向引物的序列使得它在序列上互補(bǔ)于DNA的上游鏈中的一個(gè)區(qū)域，即，它是DNA的上游鏈中的一個(gè)區(qū)域中的序列的反向互補(bǔ)。反向引物與DNA的上游端雜交。還可以根據(jù)多種其他條件來選擇PCR引物。PCR引物應(yīng)該足夠長(zhǎng)(優(yōu)選地為10到30個(gè)核苷酸長(zhǎng))，以對(duì)雜交進(jìn)行最小化，使其大于模板中的一個(gè)區(qū)域。如果可能的話，應(yīng)該避免具有較長(zhǎng)的單個(gè)堿基的引物。引物優(yōu)選地具有大約在40%至60%之間的百分G+C含量。如果可能的話，引物的3’端的百分G+C含量應(yīng)該大于引物的5’端的百分G+C含量。引物不應(yīng)具有可以在該引物中與另一序列雜交的序列(即，回文序列)。在相同的PCR反應(yīng)中使用的兩個(gè)引物不應(yīng)具有彼此雜交的能力。雖然優(yōu)選地為根據(jù)上述推薦內(nèi)容來選擇PCR引物，但是引物也不一定必須符合于這些條件。其他引物也可能是可行的，但是獲得較好結(jié)果的幾率較低。
[0071 ] 可以用于在給定的序列中擴(kuò)增DNA的PCR引物的選擇可以使用能夠獲得的多種計(jì)算機(jī)程序中的一種。此類程序可以選擇出用于給定序列的擴(kuò)增的最佳引物(即，此類程序根據(jù)上述條件，外加可以使PCR引物的功效最大化的其他條件來選擇引物)。一種計(jì)算機(jī)程序是遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(Genetics Computer Group) (GCG最近成為Accelry)分析程序包,其具有用于選擇PCR引物的例程。
[0072]下文所披露的寡核苷酸引物和探針可以按多種方式制備。制備這些寡核苷酸的一種方式是使用可購(gòu)得的核酸合成儀來合成它們。存在多種此類合成儀，并且它們是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。
[0073]可以用于與本發(fā)明結(jié)合使用的PCR的另一種替代物是用于檢測(cè)特定DNA或RNA目標(biāo)的恒溫核酸擴(kuò)增試驗(yàn)。核酸的恒溫?cái)U(kuò)增的非限制性實(shí)例是均一實(shí)時(shí)鏈取代擴(kuò)增、用于DNA測(cè)序的模板的基于Phi29DNA聚合酶的滾環(huán)擴(kuò)增，由PNA開放劑協(xié)助的雙螺旋DNA序列的滾環(huán)擴(kuò)增或者DNA分析物的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增。
[0074]還可以通過雜交方法類檢測(cè)核酸。在這些方法中，可以將標(biāo)記的核酸添加到含有標(biāo)記的或者未標(biāo)記的核酸探針的底物中?；蛘撸梢詫⑽礃?biāo)記的核酸添加到含有標(biāo)記的核酸探針的底物中。雜交方法披露于，例如，馬克?索那(Marc Schena)的微陣列分析(MicroArray Analysis),約翰?威利父子出版公司(John Wiley and Sons),新澤西州霍博肯,2003。
[0075]檢測(cè)核酸的方法可以包括標(biāo)記的使用。例如，可以使用感光膜或者磷光影像分析儀(用于對(duì)并入的放射性磷進(jìn)行檢測(cè)和量化)來檢測(cè)放射性同位素標(biāo)記?？梢允褂霉馓綔y(cè)器對(duì)熒光標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)和量化以檢測(cè)發(fā)射的光(參見第5，143，854號(hào)美國(guó)專利，作為示例性儀器)。酶標(biāo)記的檢測(cè)通常是通過提供與底物一起的酶，并且對(duì)所述酶在底物上的反應(yīng)所生成的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)量。通過簡(jiǎn)單的 將彩色的標(biāo)記可視化就可以檢測(cè)出比色標(biāo)記。在一項(xiàng)實(shí)施例中，擴(kuò)展的核酸分子的可視化是通過直接用核酸嵌入染料對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行染色。對(duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見的是，示例性染料包括，但不局限于，SYBR green,SYBR blue、DAP1、碘化丙錠、Hoeste, SYBR gold以及溴化乙錠。嵌入到擴(kuò)增的DNA分子中的發(fā)光染料的量與擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比，可以方便地使用Flurolmager (分子動(dòng)力學(xué))或者根據(jù)制造商說明書的其他等效的裝置來量化所述染料。這種方法的一個(gè)變體為擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳，隨后是選定的嵌入染料的染色和可視化?；蛘?，標(biāo)記的寡核苷酸雜交探針(例如，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET )探針以及比色探針等熒光探針)可以用于檢測(cè)擴(kuò)增。如果需要的話，那么代表被檢測(cè)的生物實(shí)體的基因組序列的特異性擴(kuò)增的證實(shí)，可以通過測(cè)序或者表明擴(kuò)增產(chǎn)物具有預(yù)測(cè)的大小、展現(xiàn)出預(yù)測(cè)的限制性降解模式，或者與正確的克隆的核苷酸序列進(jìn)行雜交。
[0076]本發(fā)明還包含試劑盒。例如，所述試劑盒可以包含用于對(duì)與特定的生物體或通常的生物體對(duì)應(yīng)的核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增的引物、用于分離DNA的緩沖液和試劑，以及用于PCR的試劑。所述試劑盒還可以包括可以檢測(cè)到的標(biāo)記的寡核苷酸，所述寡核苷酸被雜交到一條核酸序列上，所述核酸序列對(duì)與關(guān)注的生物體相對(duì)應(yīng)的多肽進(jìn)行編碼。所述試劑盒還可以包含一種對(duì)照樣品或者一系列對(duì)照樣品，可以對(duì)所述對(duì)照樣品進(jìn)行分析并且與所含有的測(cè)試樣品進(jìn)行比較。所述試劑盒的每種組分都可以封裝在獨(dú)立的容器中，并且所有這些容器與用于理解使用所述試劑盒所進(jìn)行的分析的結(jié)果的說明書一起可以存在于一個(gè)單個(gè)的包裝中。
[0077]本申請(qǐng)文件中引用的所有的參考、專利案以及公開專利申請(qǐng)案的內(nèi)容在本文中以引用的方式并入，如同每個(gè)獨(dú)立的公開案、專利案或?qū)＠暾?qǐng)案都是特定的且獨(dú)立的以參考文件的方式并入的。
[0078]上述細(xì)節(jié)描述僅僅是出于便于理解的目的而給出的，而不應(yīng)從中理解出任何不必要的限制，而對(duì)其進(jìn)行的修改對(duì)于所屬領(lǐng)域的專業(yè)人員而言是顯而易見的。不應(yīng)認(rèn)為本文所提供的任何信息為現(xiàn)有技術(shù)或者關(guān)聯(lián)于當(dāng)前主張的發(fā)明，或者任何明確的或者暗示的參考的公開案為現(xiàn)有技術(shù)。
[0079]除非另外界定，否則本文中所使用的所有技術(shù)和科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的相同含義。
[0080]雖然本發(fā)明是結(jié)合其特定的實(shí)施例來描述的，但是應(yīng)理解可以做出進(jìn)一步的修改，并且本申請(qǐng)文件意圖涵蓋大體上遵照本發(fā)明的原理的本發(fā)明的任何變體、應(yīng)用，或者調(diào)整，并且包括本披露的此類擴(kuò)展內(nèi)容，即在本發(fā)明所涉及的領(lǐng)域內(nèi)的已知的或者慣常的實(shí)踐的范圍內(nèi)的、可以應(yīng)用到上文提出的基本特征并且遵照所附權(quán)利要求書的范圍的。
[0081]并且，雖然上文描述了且具體實(shí)例化了本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施例，但是這并非意圖將本發(fā)明限制于此類實(shí)施例，并且任何此類的限制僅包含在上文的權(quán)利要求書中。
【權(quán)利要求】
1.一種利用分子檢測(cè)從含有活細(xì)胞和死細(xì)胞的混合物中選擇性排除死細(xì)胞DNA的方法，所述方法包含除去死亡微生物細(xì)胞，隨后從核酸擴(kuò)增試驗(yàn)中獲得陽(yáng)性未污染結(jié)果，從而指示存在活細(xì)胞；從所述擴(kuò)增試驗(yàn)中測(cè)量到兩個(gè)或更多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的微生物特異性信號(hào)增強(qiáng)作為活微生物存在的指示；通過添加化學(xué)變性劑從所述混合物中清除擴(kuò)增試驗(yàn)抑制劑；以及確定所述混合物中存在的活微生物和死微生物的比率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述混合物中存在的活微生物與死微生物的比率的確定可以用作治療有效性或治療功效的量度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化學(xué)變性劑包含一種或多種化學(xué)試劑的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述擴(kuò)增試驗(yàn)為PCR試驗(yàn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述混合物包含血液以及其他體液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中執(zhí)行所述PCR試驗(yàn)提供與菌血癥以及真菌血癥樣品中的活微生物細(xì)胞的相關(guān)性以便診斷敗血癥。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中抑制所述混合物中死細(xì)胞的信號(hào)，并且從分析中排除所述混合物中的膜 受損細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】G01N33/48GK103476945SQ201180065315
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月31日
【發(fā)明者】肖恩·馬克·奧哈拉 申請(qǐng)人:宙斯科技公司