專利名稱：牻牛兒基二磷酸合酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以下內(nèi)容牻牛兒基二磷酸合酶，編碼該酶的基因，包含該基因的重組載體以及分別制備牻牛兒基二磷酸合酶和牻牛兒基二磷酸的方法。
背景技術(shù)：
在有機體內(nèi)有重要功能的物質(zhì)中、有相當(dāng)數(shù)量的是由異戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)單位生物合成的。這些化合物也稱作類異戊二烯、類萜或萜。根據(jù)它們的碳原子數(shù)目可分為半萜(C5)、單萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、二倍半萜(C25)三萜(C30)四萜(C40)等。
這些物質(zhì)的實際生物合成是從異戊烯基二磷酸(IPP)，即活化的異戊二烯單位開始。因此，以前推測為可能的前體物質(zhì)的異戊二烯真正形式是IPP，即所謂的活化的異戊二烯單位。
眾所周知，二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，一種IPP的異構(gòu)體，通過與IPP縮合可以合成活化的類異戊二烯，例如牻牛兒基二磷酸，(GPP)，橙花基二磷酸、法尼基二磷酸，(FPP)，牻牛兒基牻牛兒基二磷酸，牻牛兒基牻牛兒基二磷酸(GGPP)，六(異戊二烯基)二磷酸(HexPP)或七(異戊二烯基)二磷酸(HepPP)。
許多復(fù)合物如天然橡膠，多萜醇，細菌萜醇(十一萜醇)或植物中所見的各種多萜醇(polyprenols)都是FPP，GPP之類的物質(zhì)通過順式-縮合反應(yīng)形成的。在FPP、GPP等中，一般將所有E-構(gòu)型認為是活化構(gòu)型。一般認為這些復(fù)合物是通過利用焦磷酸與分子中碳骨架間的磷酸鍵的能量經(jīng)連續(xù)縮合合成的，(因此)認為焦磷酸是縮合反應(yīng)的副產(chǎn)物。
類異戊二烯基合酶的活化形式即順序?qū)PP縮合成烯丙基底物如DMAPP，GPP，F(xiàn)PP，GGPP，GFPP等的酶稱為異戊二烯基二磷酸合酶或異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶。異戊二烯基二磷酸合酶根據(jù)它們主要反應(yīng)產(chǎn)物的碳原子有不同的命名。例如，催化生成有15個碳原子的法尼基二磷酸的酶稱作法尼基二磷酸合酶(FPP合成酶)，并且催化合成含20個碳原子的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸的酶被稱作牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶(GGPP合酶)。
各種各樣的戊二烯基二磷酸合酶基因已經(jīng)從細菌、古細菌、真菌、植物和動物中獲得。FPP合酶有關(guān)GGPP合酶、六(異戊二烯基)二磷酸合酶，七(異戊二烯基)二磷酸合酶，八(異戊二烯基)二磷酸合酶九(異戊二烯基)二磷酸合酶(茄呢基(solanesyl)二磷酸合酶)、十一(異戊二烯基)二磷酸合酶等的純化、活性測定及基因克隆和DNA測序已有報導(dǎo)。
這些異戊二烯基二磷酸合酶無論是從工業(yè)角度還是從生合科學(xué)角度來看對于各種各樣重要化合物的合成都是很重要的，然而這些酶一般都不穩(wěn)定，并且比活性低。這樣它們在工業(yè)中的應(yīng)用就受到限制。然而，近幾年來熱穩(wěn)定性的FPP合酶基因和GGPP合酶基因已經(jīng)從嗜熱細菌和古細菌中分離出來[A.Chen和D.Poulter(1993)，生物化學(xué)雜志268(15)，11002-11007，T.Koyama等，(1993)，生化雜志(東京)，113(3)，355-363；S.-i.Ohnuma等.，(1994)，生物化學(xué)雜志，269(20)，14729-14797]。因此運用異戊二烯基二磷酸合酶的條件現(xiàn)已具備。
合成C10-25的異戊二烯基二磷酸的酶是同源二聚體。讓它在體外進行反應(yīng)相對而言比較容易，已有許多關(guān)于它們反應(yīng)的報道。在這些酶中有一種酶具有特異合成GPP(一種C10異戊二烯基二磷酸)的活性，但它仍未被分離出來，雖有對它部分純化的報道(L.Heide和V.Berger.1989。生物化學(xué)和生物物理文獻.，273(2)331-8)。盡管已有報道說已從豬肝中成功地純化了GPP合酶(J.K.Dorsey等.1996生物化學(xué)雜志。241(22)5353-5360)，但是這個酶同時也催化FPP的合成。這樣，根據(jù)現(xiàn)在的異戊二烯基二磷酸合成酶的定義，這種酶應(yīng)被稱為FPP合酶。
GPP是許多已知單萜合成過程中的第一個中間物，也是單萜生物合成途徑中的最重要一個化合物。
具有代表性的單萜牻牛兒醇及其異構(gòu)物橙花醇是玫瑰油主要成分中的芳香組分。另一種代表性的單萜樟腦(從香樟(Cinnamomumcamphora)中提煉出來的)，常用作衛(wèi)生球。
然而，GPP合酶基因至今仍未分離到。
在這種情況下就迫切需要產(chǎn)生一種技術(shù)，這種技術(shù)可以人工修飾嗜熱菌來源的，穩(wěn)定的同源二聚體型的具有高比活的異戊二烯基二磷酸合酶的氨基酸序列，這樣就可以加特異催化GPP合成的同源二聚體型熱穩(wěn)定的異戊二烯基二磷酸合成酶。
嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)FPP合酶和嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius)GGPP合酶二者均是嗜熱的異戊烯基二磷酸合酶，并且二者均已被修飾。嗜酸熱硫化葉菌(S.acidocaldarius)GGPP合酶的突變體及其基因是利用其能彌補HexPP合成缺陷型啤酒糖酵母(Saccharomyces serevisiae)(出芽酵母)甘油代謝能力作為指標篩選出來的。[S.-i.Ohnuma等.，(1996)，生物化學(xué)雜志，271(31)，18831-18837]嗜熱脂肪芽孢桿菌(S.stearothermophilus)來源的具有GGPP合成活性的FPP合酶的突變體及其基因是通過利用蕃茄紅素的合成途徑作為一種指標篩選出來的。[S.-I.Ohnuma等.，(1996)，生物化學(xué)雜志，271(17)，10087-95]另外，18種可以按不同比例合成從GGPP到HexPP的突變酶及其基因也通過定點突變獲得。這些點突變位于富含Asp的保守區(qū)-I(DDXX(XX)D)的上游第5個氨基酸處。[S.-i.Ohnuma et al(1996)，JBC.chem.，271(48)30748-30750]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)富含Asp的結(jié)構(gòu)域保守區(qū)I(DDXX(XX)D)上游的第5個氨基酸殘基是調(diào)節(jié)反應(yīng)產(chǎn)物鏈長度的部位。
然而，還沒有獲得具有特異合成GPP活性的突變酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供牻牛兒基二磷酸合酶及編碼該酶的基因。
對上述問題進行廣泛和深入的研究之后本發(fā)明人成功地分離了牻牛兒基二磷酸合酶及其基因。這個牻牛兒基二磷酸合酶基因是通過替換法尼基二磷酸合酶的一段氨基酸序列得到的。這樣就完成了本發(fā)明。
本發(fā)明是關(guān)于下述重組蛋白(a)或(b)(a)一種蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO1所示；(b)一種蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO1所示同時除了82位氨基酸外至少有一氨基酸的缺失，取代或添加并且該蛋白具有牻牛兒基二磷酸合酶活性。
而且本發(fā)明涉及編碼上述重組蛋白(a)或(b)的基因。
而且本發(fā)明涉及一個牻牛兒基二磷酸合酶基因，其如SEQ ID NO2所示的包括；而且本發(fā)明涉及包含上述任何基因的重組載體。
而且本發(fā)明涉及上述重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子。
本發(fā)明涉及一種制備牻牛兒基二磷酸合酶的方法，該方法包括將上述轉(zhuǎn)化子在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且從上述培養(yǎng)物中回收牻牛兒基二磷酸合酶。
本發(fā)明涉及制備牻牛兒基二磷酸的方法，該方法包括將上述轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基中培養(yǎng)并從該培養(yǎng)基中回收牻牛兒基二磷酸。
本發(fā)明涉及制備牻牛兒基二磷酸的方法，包括上述轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物作用于異戊烯基二磷酸或其異構(gòu)物。
下文將詳細陳述本發(fā)明。
已經(jīng)知道在異戊烯基二磷酸合酶的氨基酸序列中有5個保守區(qū)域，(如果合酶在其中一個亞基的氨基酸序列中是異二聚體)。[A，Chen等，(1994)蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Sci).，3(4)，600-607]。在這5個保守區(qū)中，(保守區(qū)I-V)，有二個富含天冬氨酸殘基的區(qū)域，據(jù)信，反應(yīng)產(chǎn)物或反應(yīng)底物結(jié)合于此。這些區(qū)域稱為“天冬氨酸富含區(qū)”或“Asp-富含區(qū)”。為了區(qū)別起見在這二個區(qū)域中位于異戊二烯基二磷酸合酶氨基端的(即位于上述保守區(qū)-II)Asp-富含區(qū)稱作Asp-富含區(qū)I，[序列DDXX(XX)D，其中括號中的XX可能不存在]，羧基末端的Asp-富含區(qū)(即位于上述保守區(qū)V)被命名為Asp-富含區(qū)II。
如上所述含有Asp-富含區(qū)域的異戊二烯基二磷酸合酶的具體實例包括法尼基二磷酸合酶，牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶。六(異戊二烯基)二磷酸合成酶，七(異戊二烯基)二磷酸合酶，八(異戊二烯基)二磷酸合酶九(異戊二烯基)二磷酸合酶和十一(異戊二烯基)二磷酸合酶。更具體的實例包括嗜熱脂肪芽孢桿菌法尼基二磷酸合酶，大腸桿菌法尼基二磷酸合酶，大鼠法尼基二磷酸合酶，人法尼基二磷酸合酶，啤酒糖酵母六(異戊二烯基)二磷酸合酶等。上述例子中細菌法尼基二磷酸合酶的保守區(qū)I-IV的氨基酸序列列于表4。在表4中“1.”代表嗜熱脂肪芽孢桿菌法尼基二磷酸合酶的氨基酸序列，“2.”代表大腸桿菌法尼基二磷酸合酶的氨基酸序列。用大一點框標的區(qū)域代表Asp-富含區(qū)-I，用星號(☆)標記氨基酸殘基表示Asp-富含區(qū)-I上游的第4個氨基酸殘基。
本發(fā)明的特征用于用一種分子量較大的氨基酸殘基取代Asp-富含區(qū)I上游第4個氨基酸殘基而產(chǎn)生的牻牛兒基二磷酸合酶，另一個就是通過生產(chǎn)的牻牛兒基二磷酸合酶經(jīng)過酶反應(yīng)制備牻牛兒基二磷酸。更特異的是通過從用分子量大的氨基酸取代位于氨基端組成Asp富含區(qū)-I的DDXX(XX)D上游4個氨基酸處標有“☆”的圖4中氨基酸殘基(Ser)產(chǎn)生了一種牻牛兒基二磷酸合酶。(取代氨基酸為除了Gly和Ala之外的任何氨基酸，即下列任一種Val，Leu，Ile，Thr，Asp，Glu，Asn，Gln，Lys，Arg，Cys，Met，Phe，Tyr，Trp，His或Pro)，上述取代氨基酸只要不是Gly或Ala就沒有特別的限制。優(yōu)選使用Phe。
特別地，本發(fā)明的牻牛兒基二磷酸合酶可以通過用例如Phe取代SEQ ID NO5中所示的法尼基二磷酸合酶的第82位絲氨酸而得到。
這種取代可以通過部分修飾編碼脂肪嗜熱芽孢桿菌FPP合酶的基因得到，這種酶據(jù)報道有很高的熱穩(wěn)定性和高的比活性。(1)誘變制備靶基因?qū)⒁獙?dǎo)入突變的基因是脂肪嗜熱芽孢桿菌編碼FPP合酶的基因(下文縮寫成“BstFPS”)。BstFPS基因的全序列已知(T.Koyama等.，(1993)生化雜志.，113，355-363；SEQ ID NO4)，并以許可號NO.D13293公開于遺傳信息數(shù)據(jù)庫如DDBJ中。
因為脂肪嗜熱芽孢桿菌可以在許多菌種保藏中心，如ATCC(ATCC 10149)中均可以找到，因此BstFPS的基因通過常規(guī)基因克隆手段得到。(S.Sambrook等(編)(1989)分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約)。
隨后，這個基因片斷連入適當(dāng)?shù)妮d體，(如pTV118N，F(xiàn)akaraShuzo提供)構(gòu)建成進行誘變的質(zhì)粒。這個質(zhì)粒命名為pFPS。(2)誘變用寡核苷酸的合成及突變的引入設(shè)計一段誘變用的寡核苷酸，這段寡核苷酸(a)BstFPS的82位Ser的密碼子以除Gly，Ala，Ser外的任一氨基酸的密碼子取代(如Phe)取代；(b)新引入BspHI限制酶位點(5′TCA TGA3′).例如，可用下述的寡核苷酸。5′-CAT ACG TAC TTC TTG ATT CAT GATGAT TTG-3′(SEQ ID NO6)設(shè)計這段寡核苷酸從而即便在引入BspHI位點之后因為密碼子簡并性也不改變BstFPS的氨基酸序列。因為引入了這個限制酶位點，其中導(dǎo)入取代突變的質(zhì)?？梢栽贐spHI消化后用瓊脂糖電泳檢測鑒定出來。
寡核苷酸的合成可用常規(guī)的化學(xué)合成儀器合成。優(yōu)選地，合成的寡核苷酸磷酸化，并且變性(例如70℃ 10min加熱)。
隨后，用此寡核苷酸作引物向上述質(zhì)粒中引入突變。引入突變的方法并不特別限定。例如，可使用以Kunkel方法為基礎(chǔ)的商用試劑盒(美國自然科學(xué)院院報(1985)82，488)(Takara Skuzo公司的Mutan-K試劑盒)，或者也可用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。
制備單鏈DNA作模板，以上述寡核苷酸做引物與模板退火，作為DNA合成的互補鏈引物以制備雙鏈DNA。得到的DNA引入質(zhì)粒后，以這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
本發(fā)明的基因可以很容易地獲得，例如，通過定點誘變或PCR等常規(guī)方法在合酶的天然氨基酸序列(SEQ ID NO4)中引入突變。
這些得到的轉(zhuǎn)化子克隆，及核苷酸序列可以測定。測序可以用各種常規(guī)的方法，如Maxam-Gilbert法或雙脫氧法進行。通常用根據(jù)雙脫氧法的自助DNA測序儀進行測序。
SEQ ID NO2例示了本發(fā)明基因的核苷酸序列，SEQ ID NO1和3，例示了本發(fā)明中牻牛兒基二磷酸合酶的氨基酸序列，這些酶在除了82位(phe)氨基酸外可能至少有一個氨基酸突變，如缺失，替代或添加至少一個氨基酸(如一個或數(shù)個氨基酸)，這些酶盡管有突變但都有牻牛兒基二磷酸合酶活性。例如，SEQ ID NO1或3第一位Met缺失，但仍包括在本發(fā)明的牻牛兒基二磷酸合酶內(nèi)。同樣編碼這些酶的基因也包括在本發(fā)明基因內(nèi)。
這里使用的“牻牛兒基二磷酸合酶活性”是指以IPP或其異構(gòu)物(如DMAPP)為底物合成GPP的催化活性?？梢杂蒙鲜鐾瑯拥姆椒ㄒ胪蛔儭?br> 一旦本發(fā)明牻牛兒基二磷酸合酶基因的核苷酸序列已經(jīng)建立起來就可以通過化學(xué)合成，或以該基因為模板進行PCR，或者通過含該基因核苷酸序列的DNA中段作為探針進行雜交的方法獲得該基因。(3)載體的構(gòu)建本發(fā)明的重組載體可以通過將本發(fā)明基因連入一個合適的載體而建成。這種待插入本發(fā)明基因的載體只要是在宿主中可以復(fù)制的就可以，沒有特別的限制。可用堿裂解提取法或其他改進的方法從大腸桿菌等細菌中制備可用于制備本發(fā)明載體的載體。(Bimboim，H.C.&Doly，J.(1979)核酸研究。71513)。作為選擇，商用載體或可根據(jù)目的誘導(dǎo)的載體也可以使用。例如pBR322，pBR327，pKK233-2，pKK 233-3或有pMB1-來源的復(fù)制起始的pTrc99A。其它的如pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pTV118N，pTV119N，pBluescvipt，pHSG298或pHSG396(這二種均被修飾以獲得高拷貝)，或者是pSC101，COlE1因子，R1質(zhì)?；騀因子。再進一步，融合蛋白表達載體如pGEX或pMal載體這種利于表達產(chǎn)物純化的載體也可以用。
用病毒載體(如λ噬菌體或M13噬菌體)或轉(zhuǎn)化子也可以代替質(zhì)粒進行基因轉(zhuǎn)移。作為噬菌體DNA，M13mp18，M13mp19，λgt10、λgt11之類均可用。
將編碼牻牛兒基二磷酸合酶的DNA片段摻入載體可用常規(guī)的方法，使用合適的限制酶和連接酶而進行。例如，可利用將純化的DNA用合適的限制酶消化后插入合適載體的相應(yīng)酶位點之中而連接的方法。
本發(fā)明的基因連入載體中要能顯示出它的活性。因此，本發(fā)明載體可含有一個復(fù)制起點。和適用于待用宿主的表達調(diào)控序列。而且此載體要同時含轉(zhuǎn)錄啟動子，轉(zhuǎn)錄終止子，核糖體結(jié)合位點等。啟動子可用Ptac，Plac或Ptrc，終止子可用rrnB，核糖體結(jié)合位點可用SD序列(以5′-AGGAGG-3′為代表)。
作為按上述方法制備質(zhì)粒的具體實例，pFPSm作為例子列出。(4)轉(zhuǎn)化子的制備本發(fā)明轉(zhuǎn)化子可通過將本發(fā)明的重組表達載體轉(zhuǎn)入宿主菌而獲得，從而目的基因可得到表達。
宿主菌只要可以表達目的基因就可以，并沒有特別的限制。宿主菌具體實例包括埃希氏桿菌屬或芽孢桿菌屬細菌如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，短芽孢桿菌(B.brevis)，酵母屬(Saccharomyos)或畢赤酵母屬(Pichia)酵母，如啤酒糖酵母(S，cerevisiae)，巴斯德畢赤酵母(P.pastris)；曲霉曲屬的絲狀真菌，如半曲霉(A.oryzae)，黑曲霉(A.niger)；蠶的培養(yǎng)細胞，動物細胞如COS，CHO細胞或植物細胞。
當(dāng)細菌如大腸桿菌用作宿主菌時，優(yōu)選本發(fā)明的重組載體可以在此宿主內(nèi)自主復(fù)制，且同時載體由轉(zhuǎn)錄啟動子，核糖體結(jié)合位點，本發(fā)明的DNA及轉(zhuǎn)錄終止子所組成。載體還包括一個轉(zhuǎn)錄啟動子的調(diào)節(jié)基因。
啟始從DNA到mRNA轉(zhuǎn)錄的啟動子序列可用一段天然序列(如lac，trp，bla，lpp，PL，PR，T3或T7)。此外已知在本發(fā)明中還可以用它們的突變體(如lacUV5)或天然啟動子序列融合形成的序列(如tac，trc等)。
至于調(diào)控由mRNA到蛋白質(zhì)合成能力的序列，現(xiàn)在已知核糖體結(jié)合位點(GAGG或相似序列)和起始密碼子(ATG或GTG)之間的距離很重要。更進一步說，現(xiàn)在眾所周知3′端的轉(zhuǎn)錄終止子(如rrnBT1T2)影響重組子中的蛋白合成效率。因此本發(fā)明中可通過運用這些序列使得基因表達有效地進行。
作為將外源基因?qū)爰毦械姆椒?，各種將DNA導(dǎo)入細菌中的方法都可以用。例如用鈣離子(美國自然科學(xué)院院報692110-2114(1972))，電穿孔等均可以。
若用酵母作宿主菌，YEp13，YEp24，YCp50等可用作表達載體。至于用于這種情形下的啟動子，只要在酵母菌中可以引導(dǎo)目的基因表達的啟動子均可用。例如，gal 1啟動子，gal 10啟動子熱休克蛋白啟動子，MFα1啟動子等均可用。
至于將外源基因?qū)虢湍钢械姆椒?，任何將DNA導(dǎo)入酵母的方法均可用，如電穿孔[酶學(xué)方法，194182-7(1990)]，原生質(zhì)球法，[美國自然科學(xué)院院報841929-1933(1978)]，醋酸鋰法，[細菌學(xué)雜志(J.Bacteriod)，153163-168(1983)]等。
當(dāng)用動物細胞作宿主時，pcDNAI/Amp，pcDNAI等可用作表達載體，在這種情況下，可用人細胞肥大病毒早期基因啟動子等作為啟動子。
作為將外源基因轉(zhuǎn)入動物細胞的方法，如電穿孔，磷酸鈣法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等可用。
作為將外源基因轉(zhuǎn)入植物細胞的方法，用土壤桿菌感染法廣泛應(yīng)用。直接導(dǎo)入的方法，如原生質(zhì)體法，電穿孔法，粒子轟擊法等均可以。
本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，[命名為pFPSm(S82F)/DH5α]，根據(jù)布達佩斯條約于1997年12月12日保藏于國立生命科學(xué)及人體技術(shù)研究所，工業(yè)科技院，(日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號)，保藏號為FERM BP-6551。(5)牻牛兒基二磷酸合酶的制備本發(fā)明的牻牛兒基二磷酸合酶可通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化子并從得到培養(yǎng)物中回收該合酶而獲得。
本發(fā)明轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)從與通常宿主菌的培養(yǎng)方法相似的方法進行。
作為培養(yǎng)獲自微生物宿主如大腸桿菌或酵母的轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基。只要培養(yǎng)基須含有可被微生物吸收的碳源、氮源及無機鹽以便重組子的培養(yǎng)有效地進行，天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基都可以。
碳源可用碳水化合物如葡萄糖，果糖，蔗糖，淀粉，有機酸可用醋酸，丙酸，檸檬酸；醇類可用甘油，甲醇，乙醇，丙醇。
氮源可用氨，無機酸或有機酸的銨鹽，如氯化銨，硫酸銨，醋酸銨，磷酸銨；或其他含氮化合物；蛋白胨；肉提取物；谷物浸汁等。
無機物可用磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，磷酸鎂，硫酸鎂，氯化鎂，氯化鈉，硫酸亞鐵(II)，硫酸錳，硫酸銅，碳酸鈣，氯化鈣等。
當(dāng)大腸桿菌用作宿主時，通常都是在需氧條件下(如搖瓶培養(yǎng)或通氣培養(yǎng))37℃培養(yǎng)16-24小時。在培養(yǎng)過程中pH值維持在6-8。pH值的調(diào)節(jié)可用無機或有機鹽，堿溶液，緩沖液之類進行調(diào)節(jié)。培養(yǎng)過程中若有必要要加入氨芐青霉素或四環(huán)素至培養(yǎng)基中。
若有必要培養(yǎng)帶有可誘導(dǎo)的啟動子表達載體轉(zhuǎn)化的微生物時，就要在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物。例如，培養(yǎng)若具有l(wèi)ac啟動子載體轉(zhuǎn)化的微生物時，培養(yǎng)基中可加入異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)等，若培養(yǎng)具有trp啟動子載體轉(zhuǎn)化的微生物時，可加入吲哚丙烯酸(IAA)等。
若培養(yǎng)宿主細胞是動物細胞的轉(zhuǎn)化時，可以使用通常用的RPMI1640或DMEM培養(yǎng)基，或補充胎牛血清的上述之一培養(yǎng)基。
通常培養(yǎng)條件是5％ CO2，37℃培養(yǎng)2-20天，在培養(yǎng)過程中加入卡那霉素或青霉素(如需要的話)。
若培養(yǎng)以植物細胞作宿主的轉(zhuǎn)化子時，使用常用的補充卡那霉素，各種植物激素MS培養(yǎng)基或MS培養(yǎng)基。通常在20-30℃培養(yǎng)3至14天。
培養(yǎng)之后，如果合酶在微生物或細胞內(nèi)，則通過裂解微生物或細胞來回收本發(fā)明的牻牛兒基二磷酸合酶。如果該合酶在微生物或細胞外產(chǎn)生，則通過離心法等去除微生物或細胞而收集培養(yǎng)上清。然后收集物(即細胞提取物或培養(yǎng)上清)用常規(guī)分離純化蛋白的方法進行分離純化。這些技術(shù)包括鹽析，有機溶劑沉淀法，凝膠層析，親和層析，硫水相互作用層析，離子交換層析。這些方法可以單獨用，也可以適當(dāng)組合以從培養(yǎng)物中分離和純化本發(fā)明牻牛兒基二磷酸合酶。
需要指出的是，本發(fā)明的牻牛兒基二磷酸合酶在未純化時就有活性。因此，只要它有合成酶活性細胞提取物或培養(yǎng)上清可作為粗酶溶液不需要純化。(6)異戊二烯基二磷酸的制備根據(jù)本發(fā)明通過培養(yǎng)從本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的宿主可以在培養(yǎng)物中積累GPP，并可通過回收此積累的GPP而制備之。
根據(jù)本發(fā)明，也可以通過本發(fā)明的酶作用于IPP或DMAPP來制備GPP，IPP和DMAPP是該酶的底物。在本方法中，本發(fā)明酶與反應(yīng)底物在溶劑中反應(yīng)，特別是水溶液中反應(yīng)。這樣目的異戊二烯基二磷酸便可在反應(yīng)溶液中得到回收。反應(yīng)中的酶不僅可以用純化的酶，而且半純化至各階段的粗酶或含酶物如培養(yǎng)細胞，細胞培養(yǎng)物等含酶物都可以用。進一步而言，通過固定上述酶而得到的固定化酶，粗酶或各種常規(guī)方法得到的含酶物均可以用。
至于底物，可用IPP和/或DMAPP。反應(yīng)溶劑可用水或水性緩沖液如Tris緩沖液或磷酸緩沖液。
附圖簡述

圖1示突變型BstFPS和野生型BsrFPS的酶活性。
圖2是薄層層析譜的照片。
圖3示突變型BstFPS和野生型BsrFPS反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。
圖4示法尼基二磷酸合酶的氨基酸序列比較。
完成本發(fā)明的最好方式在下文中將通過參照實施例對本發(fā)明進行更為詳細地說明。然而本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限于下列例子。
氨基酸用下文單字符或三字符表示。A；Ala；丙氨酸C；Cys；半胱氨酸D；Asp；天冬氨酸E；Glu；谷氨酸F；Phe；苯丙氨酸G；Gly；甘氨酸H；His；組氨酸I；Ile；異亮氨酸K；Lys；賴氨酸L；Leu；亮氨酸M；Met；甲硫氨酸N；Asn；天冬酰氨P；Pro；脯氨酸Q；Gln；谷氨酰胺R；Arg；精氨酸S；Ser；絲氨酸T；Thr；蘇氨酸V；Val；纈氨酸W；Trp；色氨酸Y；Tyr；酪氨酸在此文中，氨基酸殘基的替換用單字符以下列順序表示“替換前殘基”“氨基酸殘基的位置”和“替換后殘基”。
例如，當(dāng)82位Ser由Phe替換時，該替換表示為“S82F”。實施例1含有FPP合酶基因的質(zhì)粒的制備將嗜熱脂肪芽孢桿菌-來源的FPP合酶BstFPS基因亞克隆于質(zhì)粒載體pTV118N(PTV118N購于Takara Shuzo公司)的NcoI-Hind III位點之中。這個質(zhì)粒DNA命名為pFPS。BstFPS基因全核苷酸序列由T·Koyama等公布(生物化學(xué)雜志(J.Biochem)，113，355-363，(1993))或在遺傳信息庫如DDBJ中公布，許可號為D13293。實施例2突變用寡核苷酸的合成合成下列核苷酸以便向?qū)嵤├?中獲得的基因引入突變。
5′-CAT ACG TAC TTC TTG ATT CAT GAT GAT TTG-3′(SEQ ID NO6)設(shè)計上述寡核苷酸中從而(a)BstFPS的82位Ser的密碼子替換成Phe密碼子；和(b)引入了新的限制酶位點BspHI(5′-TCATGA3′)因為密碼子的簡并性，BspHI位點的引入并沒有導(dǎo)致BstFPS所編碼氨基酸序列的改變。因為這個限制位點的引入，可以在BspHI消化之后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測到引入突變的克隆。
合成的寡核苷酸在下列反應(yīng)溶液中37℃磷酸化30min。然后70℃10min使酶失活。
10pmol/μl寡核苷酸 2μl10×激活緩沖液 1μl1000mM Tris-Cl(pH8.0)100mM MgCl270mM DTT二硫蘇糖醇10mM ATP 1μlH2O 5μlT4多核苷酸激酶 1μl實施例3向BstFPS基因82位氨基酸殘基的密碼子引入替代突變根據(jù)Kunkel的方法，用實施例2合成的寡核苷酸作引物，在實施例1制備的質(zhì)粒中引入替代突變。本實施方法中，使用Takara Shuzo的Mutan-K試劑盒。實驗操作過程如試劑盒中所帶的實驗手冊進行。
簡而言之，單鏈DNA用大腸桿菌CJ-236作宿主菌制備，在位于質(zhì)粒pFPS DNA中的此單鏈DNA中胸腺嘧啶被脫氧尿嘧啶代替。
以此單鏈DNA作模板與用于合成互補鏈的引物DNA(即上述寡核苷酸)在下列溶液中退火。
單鏈DNA 0.6pmol退火緩沖液 1μl200mM Tris-Cl(pH8.0)100mM MgCl2500mM NaCl10mM DTT引物DNA(來自實施例2) 1μlH2O 以得到10μl的終體積然后，在上述溶液中加入25μl延伸緩沖液，60單位大腸桿菌DNA連接酶和1單位T4DNA聚合酶，25℃ 2hr以合成互補鏈。延伸緩沖液組成如下，50mM Tris-Cl(pH8.0)，60mM乙酸銨，5mM MgCl，5mM DTT，1mM NAD，0.5mM dNTP。
加入3μl 0.2M EDTA(pH8.0)然后65℃處理5分鐘以終止反應(yīng)。實施例4BstFPS基因82位氨基酸殘基密碼子發(fā)生替代突變的轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建大腸桿菌DH 5α用下述CaCl2方法用實施例3中的DNA溶液進行轉(zhuǎn)化。簡言之，將DNA溶液加入用50mM CaCl2處理的DH 5α感受態(tài)細胞懸液中。然后懸浮液置冰浴30分鐘。
將得到的轉(zhuǎn)化子鋪于含有氨芐青霉素(轉(zhuǎn)化子選擇標記)的瓊脂平板，并于37℃過夜培養(yǎng)。提取含有氨芐抗性的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA。用BspHI消化后質(zhì)粒DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，然后從轉(zhuǎn)化子中篩選BstFPS編碼序列中有BspHI位點的替代突變子。
然后用雙脫氧法對相當(dāng)于BstFPS基因82位氨基酸處的密碼子周圍的核苷酸序列進行測定。由此獲得了質(zhì)粒pFPS，該質(zhì)粒含有替換突變的BstFPS基因(SEQ ID NO2)，該基因82位Ser密碼子(TCT)變?yōu)镻he密碼子(TTC)。這個突變子命名為S82F，質(zhì)粒為pFPSm。實施例5突變體BstFPS活性的測定用下述方法從不同的轉(zhuǎn)化子中獲取粗酶液，這些轉(zhuǎn)化子分別包括由實施例4獲得的含突變BstFPS基因和野生型BstFPS基因的轉(zhuǎn)化子，和僅包括載體pTV118N的轉(zhuǎn)化子。
將每個轉(zhuǎn)化子細胞在2×LB培養(yǎng)基中隔夜培養(yǎng)的細胞，離心收集后重懸于細胞裂解液中[50mM Tris-Cl(pH8.0)，10mM硫基乙醇，1mM EDTA]。細胞懸液超聲裂解后10,000rpm 4℃離心10分鐘。裂解液上清55℃處理30分鐘使來自細菌的異戊二烯基二磷酸合酶失活。這種上清經(jīng)上述同樣條件離心后得到的上清作為酶的粗提物。這種酶提取物在下列反應(yīng)溶液中55℃反應(yīng)15分鐘。[1-14C]-IPP(1Ci/mol) 25nmol烯丙二磷酸(DMAPP或GPP或FPP) 25nmolTris-Cl(pH8.5) 50mMMgCl25mMNH4Cl 50mMβ-巰基乙醇 50mM酶溶液 50μlH2O以得到1ml總體積反應(yīng)后，在反應(yīng)液中加入3ml水飽和的丁醇以便將反應(yīng)產(chǎn)物萃取到丁醇溶液層中。每1ml丁醇溶液中加入3ml液閃溶液，然后混合物用液閃計數(shù)器測定放射活性。
結(jié)果如圖1所示。圖1示突變體S82F BstFPS和野生型BsrFPS的酶活性。樣品Nos1、4和7代表由僅含載體pTV118N的宿主中制備的酶，樣品Nos2、5和8代表由含突變體S82F BstFPS的宿主中制備的酶。樣品Nos3、6和9代表從包括編碼野生型BstFPS基因宿主中制備的酶。進一步，樣品Nos1、2和3代表以DMAPP為烯丙基底物時的結(jié)果，樣品Nos4、5和6代表FPP為烯丙基底物的結(jié)果。樣品7，8，9代表以FPP為烯丙基底物時的結(jié)果。
從圖1可以看出，野生型的酶可以以DMAPP和GPP為烯丙基底物，而不可以用FPP。相反，S82F突變體以GPP為烯丙基底物的能力是非常低的。
隨后，分別如上所示制備反應(yīng)液。反應(yīng)后立即加入1ml土豆酸磷酸酶溶液[2mg/ml土豆酸磷酸酶，0.5M醋酸鈉(pH4.7)]至反應(yīng)液中，37℃進行去磷酸化，然后用3ml戊烷提取。提取物用薄層層析分析[反相TLC板LKC18(Whatman)；展層劑丙酮/水＝9/1]。展層后的去磷酸化反應(yīng)產(chǎn)物用Bioimage Analyzer BAS2000(Fuji photofilm)分析放射性活性的位置及相對數(shù)量。
結(jié)果示于圖2和3。圖3顯示了當(dāng)作用單獨的烯丙基底物時，其磷酸化的突變體PstFPS反應(yīng)產(chǎn)物的展層方式。為了比較，從含有野生型BstFPS基因的宿主菌和只含有載體的宿主菌均制備了樣品，其展層效果均得到展示。在這幅圖中，“s.f.”代表溶劑前沿，“ori”代表展層起點，“GOH”代表牻牛兒醇標準品的展層位置；且“FOH”代表法尼醇標準品的展層位置?！耙吧?Willd type)”表示用野生型BstFBS時的結(jié)果，“S82F”顯示用突變S82F BstFPS時的結(jié)果；且“載體(Vector)”表示使用的酶是從僅含該載體的宿主菌制備的?！皀.d.”表示活性未檢測。圖3顯示了野生型BstFPS和突變型BstFPS反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。這個圖顯示了當(dāng)以IPP和DMAPP為底物時GGPP，F(xiàn)PP和GPP的產(chǎn)生率。
圖2和3所示結(jié)果說明，野生型BstFPS特異性催化FPP的合成而S82F突變型BstFPS已經(jīng)變成特異性合成GPP。這意味著S82F突變型BstFPS已變成一種可被稱為牻牛兒基二磷酸合酶的酶。工業(yè)應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)在可分別提供牻牛兒基二磷酸合酶，此合酶編碼基因，含有此基因的重組載體，制備牻牛兒基二磷酸合酶和牻牛兒基二磷酸的方法。
因為本發(fā)明的酶可用于代謝工程和酶工程以合成單萜，因此本發(fā)明的酶是有用的。序列表之外的文本SEQ ID NO1Xaa代表Val，Leu，Ile，Thr，Asp，Glu，Asn，Gln，Lys，Arg，Cys，Met，Phe，Tyr，Trp，His或Pro。
SEQ ID NO6根據(jù)FPP合酶的氨基酸序列設(shè)計的寡核苷酸，并含有BspHI位點。
序列列表<110>豐田自動車株式會社<120>牻牛兒基二磷酸合成酶基因<130>PH-586<140><141><150>JP97/346686<151>1997-12-16<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>297<212>蛋白質(zhì)<213>嗜熱脂肪芽孢桿菌<220><221>肽<222>82<223>Xaa代表Val，Leu，Ile，Thr，Asp，Glu，Asn，Gln，Lys，Arg，Cys，Met，Phe，Tyr，Trp，His或Pro。<400>1Val Ala Gln Leu Ser Val Glu Gln Phe Leu Asn Glu Gln Lys Gln Ala1 5 10 15Val Glu Thr Ala Leu Ser Arg Tyr Ile Glu Arg Leu Glu Gly Pro Ala20 25 30Lys Leu Lys Lys Ala Met Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Gly Gly Lys Arg35 40 45Ile Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Val Arg Ala Leu Gly Lys Asp50 55 60Pro Ala Val Gly Leu Pro Val Ala Cys Ala Ile Glu Met Ile His Thr65 70 75 80
Tyr Xaa Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ser Met Asp Asn Asp Asp Leu85 90 95Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys Val Phe Gly Glu Ala Met Ala100 105 110Ile Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu Thr Tyr Ala Phe Gln Leu Ile Thr115 120 125Glu Ile Asp Asp Glu Arg Ile Pro Pro Ser Val Arg Leu Arg Leu Ile130 135 140Glu Arg Leu Ala Lys Ala Ala Gly Pro Glu Gly Met Val Ala Gly Gln145 150 155 160Ala Ala Asp Met Glu Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Leu165 170 175Glu Tyr Ile His Arg His Lys Thr Gly Lys Met Leu Gln Tyr Ser Val180 185 190His Ala Gly Ala Leu Ile Gly Gly Ala Asp Ala Arg Gln Thr Arg Glu195 200 205Leu Asp Glu Phe Ala Ala His Leu Gly Leu Ala Phe Gln Ile Arg Asp210 215 220Asp Ile Leu Asp Ile Glu Gly Ala Glu Glu Lys Ile Gly Lys Pro Val225 230 235 240Gly Ser Asp Gln Ser Asn Asn Lys Ala Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Ser245 250 255Leu Ala Gly Ala Lys Glu Lys Leu Ala Phe His Ile Glu Ala Ala Gln260 265 270Arg His Leu Arg Asn Ala Asp Val Asp Gly Ala Ala Leu Ala Tyr Ile275 280 285Cys Glu Leu Val Ala Ala Arg Asp His290 295<210>2<211>894<212>DNA<213>嗜熱脂肪芽孢桿菌<220><221>CDS<222>(1)..(894)<400>2gtg gcg cag ctt tca gtt gaa cag ttt ctc aac gag caa aaa cag gcg 48Val Ala Gln Leu Ser Val Glu Gln Phe Leu Asn Glu Gln Lys Gln Ala1 5 10 15gtg gaa aca gcg ctc tcc cgt tat ata gag cgc tta gaa ggg ccg gcg 96Val Glu Thr Ala Leu Ser Arg Tyr Ile Glu Arg Leu Glu Gly Pro Ala20 25 30aag ctg aaa aag gcg atg gcg tac tca ttg gag gcc ggc ggc aaa cga 144Lys Leu Lys Lys Ala Met Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Gly Gly Lys Arg35 40 45atc cgt ccg ttg ctg ctt ctg tcc acc gtt cgg gcg ctc ggc aaa gac 192Ile Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Val Arg Ala Leu Gly Lys Asp50 55 60ccg gcg gtc gga ttg ccc gtc gcc tgc gcg att gaa atg atc cat acg 240Pro Ala Val Gly Leu Pro Val Ala Cys Ala Ile Glu Met Ile His Thr65 70 75 80tac ttc ttg atc cat gat gat ttg ccg agc atg gac aac gat gat ttg 288Tyr Phe Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ser Met Asp Asn Asp Asp Leu85 90 95cgg cgc ggc aag ccg acg aac cat aaa gtg ttc ggc gag gcg atg gcc 336Arg Arg Gly Lys Pro Thr 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His Leu Arg Asn Ala Asp Val Asp Gly Ala Ala Leu Ala Tyr Ile275 280 285Cys Glu Leu Val Ala Ala Arg Asp His290 295<210>4<211>894<212>DNA<213>嗜熱脂肪芽孢桿菌<220><221>CDS<222>(1)..(894)<400>4gtg gcg cag ctt tca gtt gaa cag ttt ctc aac gag caa aaa cag gcg 48Val Ala Gln Leu Ser Val Glu Gln Phe Leu Asn Glu Gln Lys Gln Ala1 5 10 15gtg gaa aca gcg ctc tcc cgt tat ata gag cgc tta gaa ggg ccg gcg 96Val Glu Thr Ala Leu Ser Arg Tyr Ile Glu Arg Leu Glu Gly Pro Ala20 25 30aag ctg aaa aag gcg atg gcg tac tca ttg gag gcc ggc ggc aaa cga 144Lys Leu Lys Lys Ala Met Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Gly Gly Lys Arg35 40 45atc cgt ccg ttg ctg ctt ctg tcc acc gtt cgg gcg ctc ggc aaa gac 192Ile Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Val Arg Ala Leu Gly Lys Asp50 55 60ccg gcg gtc gga ttg ccc gtc gcc tgc gcg att gaa atg atc cat acg 240Pro Ala Val Gly Leu Pro Val Ala Cys Ala Ile Glu Met Ile His Thr65 70 75 80tac tct ttg atc cat gat gat ttg ccg agc atg gac aac gat gat ttg 288Tyr Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ser Met Asp Asn Asp Asp 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Lys Ala Met Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Gly Gly Lys Arg35 40 45Ile Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Val Arg Ala Leu Gly Lys Asp50 55 60Pro Ala Val Gly Leu Pro Val Ala Cys Ala Ile Glu Met Ile His Thr65 70 75 80Tyr Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ser Met Asp Asn Asp Asp Leu85 90 95Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys Val Phe Gly Glu Ala Met Ala100 105 110Ile Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu Thr Tyr Ala Phe Gln Leu Ile Thr115 120 125Glu Ile Asp Asp Glu Arg Ile Pro Pro Ser Val Arg Leu Arg Leu Ila130 135 140Glu Arg Leu Ala Lys Ala Ala Gly Pro Glu Gly Met Val Ala Gly Gln145 150 155 160Ala Ala Asp Met Glu Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Leu165 170 175Glu Tyr Ile His Arg His Lys Thr Gly Lys Met Leu Gln Tyr Ser Val180 185 190His Ala Gly Ala Leu Ile Gly Gly Ala Asp Ala Arg Gln Thr Arg Glu195 200 205Leu Asp Glu Phe Ala Ala His Leu Gly Leu Ala Phe Gln Ile Arg Asp210 215 220Asp Ile Leu Asp Ile Glu Gly Ala Glu Glu Lys Ile Gly Lys Pro Val225 230 235 240Gly Ser Asp Gln Ser Asn Asn Lys Ala Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Ser245 250 255Leu Ala Gly Ala Lys Glu Lys Leu Ala Phe His Ile Glu Ala Ala Gln260 265 270Arg His Leu Arg Asn Ala Asp Val Asp Gly Ala Ala Leu Ala Tyr Ile275 280 285Cys Glu Leu Val Ala Ala Arg Asp His290 295<210>6<211>30<212>DNA<213>修飾后序列<220><223>基于FPP合成酶氨基酸序列設(shè)計的寡核苷酸，含BspHI位點。<400>6catacgtact tcttgattca tgatgatttg 30
權(quán)利要求
1.下列重組蛋白(a)或(b)(a)由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列所組成的蛋白；(b)由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列所組成但在除82位氨基酸外至少有一個氨基酸的缺失，替換或添加的突變的蛋白且該蛋白具牻牛兒基二磷酸合酶活性。
2.編碼下列重組蛋白(a)或(b)的基因。(a)含由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列所組成的蛋白；(b)由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列所組成但在除82位氨基酸外至少有一個氨基酸的缺失，替換或添加的突變的蛋白，并且該蛋白具牻牛兒基二磷酸合酶活性。
3.牻牛兒基二磷酸合酶基因，其包括由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
4.含權(quán)利要求2或3中基因的重組載體。
5.由權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化子。
6.制備牻牛兒基二磷酸合酶的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求5中轉(zhuǎn)化子以及從得到的培養(yǎng)物中回收牻牛兒基二磷酸合酶。
7.制備牻牛兒基二磷酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求5中轉(zhuǎn)化子以及從得到的培養(yǎng)物中回收牻牛兒基二磷酸。
8.制備牻牛兒二磷酸的方法，包括使權(quán)利要求5中轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物作用于異戊二烯二磷酸或其異構(gòu)物。
全文摘要
具有通過以較Ser更大分子量的另一種氨基酸取代82位的氨基酸而源自法尼基二磷酸合酶氨基酸序列的氨基酸序列的牻牛兒基二磷酸合酶。更為具體地,為下面的重組蛋白(a)和(b)及編碼它們的基因:(a)具有由SEQ ID NO:1所示表氨基酸序列的蛋白;和(b)具有通過在82位缺失、取代或添加至少一個氨基酸而源自由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸序列并顯示出牻牛兒基二磷酸合酶活性的蛋白。
文檔編號C12R1/19GK1252838SQ9880422
公開日2000年5月10日 申請日期1998年12月10日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月16日
發(fā)明者大音德, 成田啟之, 西野德三, 大沼信一 申請人:豐田自動車株式會社