專利名稱：通過同源重組在人細(xì)胞中生產(chǎn)人突變蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過同源重組在真核細(xì)胞中生產(chǎn)真核多肽的突變蛋白的方法。本發(fā)明另外還涉及一種生產(chǎn)人細(xì)胞的方法，所述人細(xì)胞適合生產(chǎn)人突變蛋白。最后，本發(fā)明涉及通過所述方法生產(chǎn)的人細(xì)胞和可從其獲得的突變的人蛋白質(zhì)以及含這些突變蛋白的藥物制劑。
重組人蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)是生物技術(shù)領(lǐng)域中已知的。這樣獲得的蛋白質(zhì)可用作治療劑。通過缺失、添加或/和取代個別的氨基酸或整個肽片段生產(chǎn)突變的人蛋白質(zhì)(它們不同于相應(yīng)的天然人蛋白質(zhì))的重組生產(chǎn)方法也是已知的。
尤其在藥物應(yīng)用方面常需要在真核細(xì)胞中生產(chǎn)人多肽，因為與在原核細(xì)胞例如大腸埃希氏菌(E.coli)中生產(chǎn)的多肽相比，這些多肽被糖基化了，因而與在體內(nèi)內(nèi)源性地出現(xiàn)的多肽差別較小，于是更不常觀察到不希望的副作用(例如增大的免疫原性或較差的耐受性)的出現(xiàn)。
以前已通過異源重組基因表達(dá)生產(chǎn)了突變的人蛋白質(zhì)。為此，將核酸構(gòu)建物引入所期望的真核細(xì)胞，該真核細(xì)胞含有在啟動子和選擇標(biāo)記基因的控制下編碼所述突變多肽的核酸序列。在該方法中，所述核酸構(gòu)建物被位點非特異性地整合入所述細(xì)胞的基因組。
在該異源重組基因表達(dá)中，可能由于位點非特異性整合而經(jīng)常出現(xiàn)不希望的、不利的過程。例如，在整合入基因組的過程中可能在編碼蛋白質(zhì)的序列中出現(xiàn)突變且尤其是缺失。此外，所述整合可能在基因組中順式元件所處的位點上進(jìn)行，該順式元件對核酸構(gòu)建物的表達(dá)控制序列有阻抑效果，結(jié)果獲得的細(xì)胞重組蛋白質(zhì)產(chǎn)率減少了。表達(dá)構(gòu)建物整合入所述細(xì)胞的重要基因或者導(dǎo)致該細(xì)胞死亡，或者導(dǎo)致有機能障礙的重組細(xì)胞，它尤其會導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)產(chǎn)率的減少。
插入也能導(dǎo)致以這種方式獲得的細(xì)胞穩(wěn)定性的降低，于是在長時間后它們失去其表達(dá)重組蛋白質(zhì)的能力。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種在穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞中以良好的產(chǎn)率生產(chǎn)糖基化真核多肽的糖基化的方法，所述糖基化盡可能與天然蛋白的糖基化相似，所以至少部分地消除了現(xiàn)有技術(shù)的缺點。
該目的是按本發(fā)明通過生產(chǎn)真核多肽的突變蛋白的方法實現(xiàn)的，其中(i)將一種能同源重組的核酸分子引入含編碼內(nèi)源性靶多肽的靶核酸序列的真核細(xì)胞，所述核酸分子包括(a)至少一段序列片段，該序列片段與所述靶核酸序列的基因座中的序列是同源的，并且，與所述內(nèi)源性靶核酸序列相比，在成熟多肽的編碼區(qū)具有突變，以及(b)一段編碼選擇標(biāo)記的核酸片段，(ii)將所述細(xì)胞在使得被引入的核酸分子發(fā)生同源重組的條件下培養(yǎng)，于是在同源重組后該細(xì)胞含有能表達(dá)靶多肽的突變蛋白的突變靶核酸序列，(iii)選擇在其中發(fā)生了同源重組的細(xì)胞，以及(iv)從所述細(xì)胞或/和細(xì)胞上清液分離突變蛋白。
突變的真核蛋白質(zhì)(尤其是突變的人蛋白質(zhì))可通過本發(fā)明的方法在同源細(xì)胞中生產(chǎn)。意外地，這使得能以高產(chǎn)率獲得具有與天然蛋白質(zhì)很相似的糖基化型式的突變蛋白。本發(fā)明方法的一個優(yōu)點在于，蛋白質(zhì)可在真核細(xì)胞中被突變，并且通過該細(xì)胞合成的突變蛋白與內(nèi)源性地出現(xiàn)的細(xì)胞蛋白質(zhì)相似。本發(fā)明方法進(jìn)一步的優(yōu)點在于，生成的細(xì)胞(該細(xì)胞生產(chǎn)突變蛋白)的性能不因位點非特異性基因整合而被不利地改變。因此，該細(xì)胞的基因組除了待表達(dá)蛋白質(zhì)的基因座以外未以任何方式改變，于是排除了相關(guān)的不利效果。
通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的人突變蛋白由于缺失、添加或/和取代個別的氨基酸或整個肽片段而不同于相應(yīng)的天然蛋白質(zhì)。優(yōu)選生產(chǎn)的突變蛋白在N端和/或C端具有突變，例如缺失、插入、取代或/和與其它蛋白質(zhì)(例如人蛋白質(zhì))融合。
本發(fā)明的突變蛋白優(yōu)選是非天然存在的多肽，并且與待突變的多肽的等位基因變異(這在其它起始細(xì)胞中是天然出現(xiàn)的)不同之處在于至少一個氨基酸不同。非天然的突變蛋白特別優(yōu)選地由于缺失、添加或/和插入個別的氨基酸或肽片段而不同于天然的等位基因變異。
應(yīng)用于本發(fā)明方法中的細(xì)胞是任意的真核細(xì)胞，它具有待突變的靶基因的至少一個內(nèi)源性拷貝。該細(xì)胞優(yōu)選是人細(xì)胞，特別優(yōu)選是無限增殖化人細(xì)胞，例如HeLa細(xì)胞、Namalwa細(xì)胞或HT 1080細(xì)胞。
意外地發(fā)現(xiàn)了，當(dāng)應(yīng)用的起始細(xì)胞含增大數(shù)量的染色體(靶基因處于其上)時，可通過同源重組生產(chǎn)細(xì)胞，與只含兩個拷貝的靶基因的細(xì)胞相比，該細(xì)胞生產(chǎn)增大產(chǎn)率的突變的人蛋白質(zhì)。這類起始細(xì)胞的實例是具有基因重排的腫瘤細(xì)胞系，例如HeLaS3(Puck等，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)103(1996)，273～284)和Namalwa(Nadkarni等，癌(Cancer)，23(1969)，64～79)，它們含增大的染色體7拷貝數(shù)。
可進(jìn)行突變靶基因的內(nèi)源基因激活以進(jìn)一步改善突變多肽的表達(dá)。
為此，可將另外的積極地影響表達(dá)產(chǎn)率的序列引入基因組，其中例如所述靶核酸序列的內(nèi)源表達(dá)控制序列被異源表達(dá)控制序列至少部分地替代。該異源表達(dá)控制序列可能含一個異源啟動子或/和增強子，該異源表達(dá)控制序列優(yōu)選含一個病毒啟動子，尤其是CMV啟動子。當(dāng)應(yīng)用合適的啟動子時，內(nèi)源啟動子的替代不但能使表達(dá)增強，還容許合成突變蛋白。所述異源啟動子可以是可調(diào)啟動子或構(gòu)建型啟動子。此外，該啟動子可用于鈍化對內(nèi)源啟動子有阻抑效果的順式元件。這還可導(dǎo)致產(chǎn)率的增大。
被引入起始細(xì)胞的核酸分子包括至少一段序列片段，該序列片段容許在靶基因的基因座中通過同源重組整合，并且適合將突變引入成熟靶多肽的編碼區(qū)。所述核酸分子優(yōu)選含兩個側(cè)翼序列，它們與靶基因座的區(qū)域是同源的。該側(cè)翼序列優(yōu)選各自具有至少150bp的長度并且含編碼成熟靶多肽的靶基因座序列的區(qū)域，該序列與天然序列相比被修飾了。
此外，所述核酸分子含一種選擇標(biāo)記基因。這可以是真核細(xì)胞的任意合適的選擇標(biāo)記基因，它導(dǎo)致在表達(dá)時的可選擇表型，例如抗生素抗性、輔源營養(yǎng)，表面蛋白的表達(dá)等。新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因是特別優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因。
此外，所述核酸分子可以任選地含一種負(fù)選擇標(biāo)記基因，例如HSV胸苷激酶基因，在選擇劑的存在下，它的表達(dá)破壞細(xì)胞。
如果希望在細(xì)胞中擴增修飾的靶基因，則所述核酸分子含一種擴增基因。合適的擴增基因的實例有二氫葉酸還原酶、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。二氫葉酸還原酶基因是特別優(yōu)選的擴增基因。
當(dāng)存在擴增基因時，可在同源重組后擴增突變靶核酸序列以便增大細(xì)胞中的拷貝數(shù)。
本發(fā)明的方法能使應(yīng)用的細(xì)胞基因組中存在的全部內(nèi)源性基因突變。所述靶核酸序列優(yōu)選是組織纖溶酶原激活物(tPA)、促紅細(xì)胞生成素、胰島素、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素或白細(xì)胞介素受體序列。通過本發(fā)明的方法獲得的突變蛋白特別優(yōu)選是一種其生物性質(zhì)與相應(yīng)的天然蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同的多肽，例如得自t-PA、包括t-PA的K2域和P域的多肽(EP 0 382 174)。
可應(yīng)用已知技術(shù)分離所述突變蛋白。該突變蛋白優(yōu)選是從在懸浮液中培養(yǎng)的細(xì)胞的上清液分離的。可在懸浮液中培養(yǎng)的細(xì)胞對于大規(guī)模生產(chǎn)是特別有利的。這大為簡化了在生產(chǎn)過程中所需的培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。這導(dǎo)致大為節(jié)省生產(chǎn)時間和生產(chǎn)資源，于是顯著減少了費用。所述突變蛋白特別優(yōu)選是從在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的上清液分離的。與存在血清時培養(yǎng)的細(xì)胞相比，從無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞可以更簡便、更廉價地分離突變蛋白，因為需要更少的純化步驟。
本發(fā)明進(jìn)一步的主題是可通過前述方法之一從人細(xì)胞獲得的突變的人多肽，其特征在于人糖基化和不存在所述物種的外源多肽?！安淮嬖谒鑫锓N的外源多肽”表示相對于所需蛋白質(zhì)的量來說少于3wt％的所述物種的外源多肽雜質(zhì)，優(yōu)選少于1wt％，最優(yōu)選少于0.1wt％。
本發(fā)明進(jìn)一步的主題是生產(chǎn)一種表達(dá)人靶多肽的突變蛋白的人細(xì)胞的方法，其特征在于(i)將一種核酸分子引入含編碼內(nèi)源性靶多肽的靶核酸序列的人細(xì)胞，所述核酸分子包括(a)至少一段序列片段，該序列片段與所述靶核酸序列的基因座中的序列是同源的，并且，與所述內(nèi)源性靶核酸序列相比，在成熟靶多肽的編碼區(qū)具有突變，(b)任選地一種所述靶核酸序列的異源表達(dá)控制序列，以及(c)一段編碼選擇標(biāo)記的核酸片段，(ii)將所述細(xì)胞在使得被引入的核酸分子發(fā)生同源重組的條件下培養(yǎng)，于是在同源重組后該細(xì)胞含有能表達(dá)靶多肽的突變蛋白的突變靶核酸序列，(iii)選擇在其中發(fā)生了同源重組的細(xì)胞，以及(iv)分離這樣選擇的細(xì)胞。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸分子另外還含一種擴增基因，并且所述突變靶核酸序列在同源重組后被擴增了。
本發(fā)明又一主題是可通過前述方法獲得的人細(xì)胞，它含至少一個編碼突變的人多肽的內(nèi)源基因。
本發(fā)明的細(xì)胞可在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，并且它優(yōu)選是在懸浮液中生長的細(xì)胞，特別優(yōu)選是在無血清培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞。
本發(fā)明又一主題是通過前述方法生產(chǎn)的人細(xì)胞在生產(chǎn)人多肽的突變蛋白方面的應(yīng)用。
本發(fā)明又一主題是一種藥物制劑，其特征在于，它含作為活性物質(zhì)的前述突變蛋白，以及任選含其它活性物質(zhì)或/和常規(guī)藥物載體、輔助物質(zhì)或添加劑。
實施例含K2域和P域的t-PA突變體的構(gòu)建a)載體構(gòu)建導(dǎo)向載體包括如下元件(按5′-3′順序列出)A6kb Bg III片段，它含約3.5kb的t-PA基因5′上游區(qū)(Friezner等，1986，生物化學(xué)雜志(JBC)261(15)6972)。
B大約5.2基因激活序列(作為AgeI片段)，它含處于RSV啟動子和作為終止子的SV40的晚期聚腺苷酸化位點控制下的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NEO)基因，編碼鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)的精氨酸突變體(Simonsen等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80(1983)，2495)的基因，該基因受早期SV40啟動子和作為終止子的早期SV40聚腺苷酸化位點(Kaufmann等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)，2(1982)，1304；Okayama等，分子細(xì)胞生物學(xué)，3(1983)，280以及Schimke，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，263(1988)，5989)和巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子(Boshart等，細(xì)胞(Cell)，41(1995)，p21)的控制。
C從t-PA cDNA分離的大約200bp片段，它相應(yīng)于核苷酸位置1～199，并且它含信號序列的編碼區(qū)和成熟t-PA的最先三個氨基酸(Pennica等，1983，自然(Nature)301214)。
D大約1.5kb EcoRI片段，它含tPA基因的內(nèi)含子G的大部分(Friezner等，在上面所引的文獻(xiàn)中，Ny等，1984，PNAS，815355)。
這些元件是從合適的起始原料分離的，并且是通過PCR和適當(dāng)?shù)娜诤螾CR引物裝配的。接著將融合的元件連接入pBR322并引入大腸埃希氏菌。還可將所述片段從相應(yīng)的起始原料切割下來再通過接頭連接。
b)人細(xì)胞系將HeLa用作進(jìn)行內(nèi)源性基因激活的細(xì)胞系，其中證實t-PA基因的轉(zhuǎn)錄可通過添加醋酸佛波豆蔻酯來誘導(dǎo)(Waller和Schleuning，1985，生物化學(xué)雜志，2606354)。在通過電穿孔法引入導(dǎo)向載體后，通過添加G418選擇含該載體的細(xì)胞。通過用能檢測所需多肽的表達(dá)的ELISA(Imubind-Total tPA，American Diagnostics)測試所述細(xì)胞的上清液鑒定由于同源重組而分泌了具有t-PA的K2域和P域的多肽的細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)真核多肽的突變蛋白的方法，其中(i)將一種能同源重組的核酸分子引入含編碼內(nèi)源性靶多肽的靶核酸序列的真核細(xì)胞，所述核酸分子包括(a)至少一段序列片段，該序列片段與所述靶核酸序列的基因座中的序列是同源的，并且，與所述內(nèi)源性靶核酸序列相比，在成熟靶多肽的編碼區(qū)具有突變，以及(b)一段編碼選擇標(biāo)記的核酸片段，(ii)將所述細(xì)胞在使得被引入的核酸分子發(fā)生同源重組的條件下培養(yǎng)，于是在同源重組后該細(xì)胞含有能表達(dá)靶多肽的突變蛋白的突變靶核酸序列，(iii)選擇在其中發(fā)生了同源重組的細(xì)胞，以及(iv)從所述細(xì)胞或/和細(xì)胞上清液分離突變蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述細(xì)胞是HeLa細(xì)胞、Namalwa細(xì)胞或HT 1080細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1～3之一的方法，其中應(yīng)用了在復(fù)染色體上含靶核酸序列的起始細(xì)胞。
5.前述權(quán)利要求之一的方法，其中另外，所述靶核酸序列的表達(dá)是通過引入異源表達(dá)控制序列而激活的。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述異源表達(dá)控制序列是病毒啟動子，并且特別是CMV啟動子。
7.前述權(quán)利要求之一的方法，其中所述編碼選擇標(biāo)記的核酸片段是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
8.前述權(quán)利要求之一的方法，其中所述被引入細(xì)胞的核酸分子另外還含一種擴增基因，并且所述突變靶核酸序列在同源重組后被擴增了。
9.權(quán)利要求8的方法，其中二氫葉酸還原酶基因被用作擴增基因。
10.前述權(quán)利要求之一的方法，其中所述靶核酸序列是組織纖溶酶原激活物(t-PA)、促紅細(xì)胞生成素、胰島素、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素或白細(xì)胞介素受體序列。
11.權(quán)利要求1～9之一的方法，其中所述突變蛋白是得自t-PA、包括t-PA的K2域和P域的多肽。
12.前述權(quán)利要求之一的方法，其中所述突變蛋白是從在懸浮液中培養(yǎng)的細(xì)胞的上清液分離的。
13.前述權(quán)利要求之一的方法，其中所述突變蛋白是從在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的上清液分離的。
14.可通過權(quán)利要求1～13之一的方法從人細(xì)胞獲得的突變的人多肽，其特征在于人糖基化和不存在所述種的外源多肽。
15.生產(chǎn)一種表達(dá)人靶多肽的突變蛋白的人細(xì)胞的方法，其中(i)將一種核酸分子引入含編碼內(nèi)源性靶多肽的靶核酸序列的人細(xì)胞，所述核酸分子包括(a)至少一段序列片段，該序列片段與所述靶核酸序列的基因座中的序列是同源的，并且，與所述內(nèi)源性靶核酸序列相比，在成熟靶多肽的編碼區(qū)具有突變，(b)任選地一種所述靶核酸序列的異源表達(dá)控制序列，以及(c)一段編碼選擇標(biāo)記的核酸片段，(ii)將所述細(xì)胞在使得被引入的核酸分子發(fā)生同源重組的條件下培養(yǎng)，于是在同源重組后該細(xì)胞含有能表達(dá)靶多肽的突變蛋白的突變靶核酸序列，(iii)選擇在其中發(fā)生了同源重組的細(xì)胞，以及(iv)分離這樣選擇的細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述核酸分子另外還含一種擴增基因，并且所述突變靶核酸序列在同源重組后被擴增了。
17.權(quán)利要求16的方法，其中二氫葉酸還原酶基因被用作擴增基因。
18.可通過權(quán)利要求15～17之一的方法獲得的人細(xì)胞，它含至少一種編碼突變的人多肽的內(nèi)源性基因。
19.權(quán)利要求18的人細(xì)胞在生產(chǎn)人多肽的突變蛋白方面的應(yīng)用。
20.藥物制劑，其中它含有作為活性物質(zhì)的、權(quán)利要求14的突變蛋白以及任選含其它活性物質(zhì)或/和常規(guī)藥物載體、輔助物質(zhì)或添加劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過同源重組在真核細(xì)胞中生產(chǎn)真核多肽的突變蛋白的方法。本發(fā)明另外還涉及一種生產(chǎn)人細(xì)胞的方法,所述人細(xì)胞適合生產(chǎn)人突變蛋白。最后,本發(fā)明涉及通過所述方法生產(chǎn)的人細(xì)胞和可從其獲得的突變的人蛋白質(zhì)以及含這些突變蛋白的藥物制劑。
文檔編號C12N15/10GK1265152SQ98807438
公開日2000年8月30日 申請日期1998年7月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月23日
發(fā)明者A·斯特恩, K·霍諾德 申請人:羅切診斷學(xué)有限公司