專利名稱：使植物產(chǎn)生雜草防治化合物耐受性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于使植物產(chǎn)生雜草防治化合物耐受性的方法。
雜草防治對(duì)于提高栽培的植物產(chǎn)量和質(zhì)量來說是一項(xiàng)很重要的工作。對(duì)于這一目的來說，主要使用雜草防治化合物、諸如除草劑。然而，對(duì)于使用雜草防治化合物來說，將栽培植物與相關(guān)來源的物種區(qū)別開來以便僅能有選擇地控制雜草并不總是容易的。已經(jīng)嘗試生產(chǎn)對(duì)雜草防治化合物具有耐受性(下文稱作耐雜草防治化合物)作用的植物并且某些耐受性植物已經(jīng)得到了實(shí)際應(yīng)用。
近來，已經(jīng)將基因工程技術(shù)用于生產(chǎn)具有耐雜草防治化合物作用的植物。作為這樣一種技術(shù)，例如Hinchee,M.A.W.等公開了一種用于生產(chǎn)具有耐除草劑(草甘膦)作用的植物的方法，其中將作為草甘膦的耙酶的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因進(jìn)行誘變以便降低對(duì)草甘膦的親和性、并將該基因引入植物[Hinchee，M.A.W.等，《生物/技術(shù)》(BIO/TECHNOLOGY),6:p915(1988)]。
使植物產(chǎn)生耐雜草防治化合物作用的各種不同的公知方法不一定能滿足需要且已經(jīng)需要開發(fā)另外的用于使植物產(chǎn)生耐雜草防治化合物作用的各類方法。
本發(fā)明的主要目的是提供一種使植物產(chǎn)生耐雜草防治化合物作用的新型方法。
從下面的描述并參照附圖可以清楚地理解這一目的以及其它目的和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
附

圖1是質(zhì)粒pETBCH的限制圖。bchH是光合細(xì)菌類球紅細(xì)菌(Rhodobactore sphaeroides)的鎂螯合酶原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位基因。T7pro代表T7噬菌體的啟動(dòng)子序列，且T7ter代表T7噬菌體的終止子序列。Ampr是耐氨芐青霉素基因，lacⅠq是乳糖操縱子的阻抑蛋白基因，且ori是復(fù)制起點(diǎn)。
附圖2是質(zhì)粒pACYCSP的限制圖。PPO是大豆的原卟啉原Ⅸ氧化酶基因且lac pro代表乳糖操縱子的啟動(dòng)子序列。Cmr是耐氯霉素基因且ori是復(fù)制起點(diǎn)。
附圖3是質(zhì)粒pTVBCH的限制圖。bchH是光合細(xì)菌類球紅細(xì)菌(Rhodobactore sphaeroides)的鎂螯合酶原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位基因。lac pro代表乳糖操縱子的啟動(dòng)子序列。Ampr是耐氨芐青霉素基因且ori是復(fù)制起點(diǎn)。
附圖4是質(zhì)粒pBIBCH的限制圖。bchH是光合細(xì)菌類球紅細(xì)菌(Rhodobactore sphaeroides)的鎂螯合酶原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位基因。NP是胭脂氨酸合酶基因的啟動(dòng)子序列，NT是胭脂氨酸合酶基因的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖5是質(zhì)粒pNO的限制圖。NP是胭脂氨酸合酶基因的啟動(dòng)子序列，NT是胭脂氨酸合酶基因的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖6是質(zhì)粒pTCHLH的限制圖。TCHLH是葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)已經(jīng)缺失煙草鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位基因。lac pro代表乳糖操縱子的啟動(dòng)子序列。Amr是耐氨芐青霉素基因，Kmr耐卡那霉素基因且ori是復(fù)制起點(diǎn)。
附圖7是質(zhì)粒pBITCHLH的限制圖。TCHLH是葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)已經(jīng)缺失的煙草鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位基因。NP是胭脂氨酸合酶的啟動(dòng)子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖8是質(zhì)粒pTVGMP的限制圖。GMP是葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)和FAD結(jié)合序列已經(jīng)缺失的大豆原卟啉原Ⅸ氧化酶基因。lac pro代表乳糖操縱子的啟動(dòng)子序列。Ampr是耐氨芐青霉素基因且ori是復(fù)制起點(diǎn)。
附圖9是質(zhì)粒pBIGMP的限制圖。GMP是葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)和FAD結(jié)合序列已經(jīng)缺失的大豆原卟啉原氧化酶基因。NP是胭脂氨酸合酶的啟動(dòng)子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖10是質(zhì)粒pTVCRP的限制圖。CRP是葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)和FAD結(jié)合序列已經(jīng)缺失的Chlamydomonas reinhardtii的原卟啉原氧化酶基因。lac pro代表乳糖操縱子的啟動(dòng)子序列。Ampr是耐氨芐青霉素基因且ori是復(fù)制起點(diǎn)。
附圖11是質(zhì)粒pBICRP的限制圖。CRP是葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)和FAD結(jié)合序列已經(jīng)缺失的Chlamydomonas reinhardtii的原卟啉原氧化酶基因。NP是胭脂氨酸合酶的啟動(dòng)子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖12是質(zhì)粒pTVHVF1的限制圖。HVF是信號(hào)序列已經(jīng)缺失的大麥鐵螯合酶基因。lac pro代表乳糖操縱子的啟動(dòng)子序列。Ampr是耐氨芐青霉素基因且ori是復(fù)制起點(diǎn)。
附圖13是質(zhì)粒pBIHVF的限制圖。HVF是信號(hào)序列已經(jīng)缺失的大麥鐵螯合酶基因。NP是胭脂氨酸合酶的啟動(dòng)子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖14是質(zhì)粒pTVCSF的限制圖。CSF是信號(hào)序列已經(jīng)缺失的黃瓜鐵螯合酶基因。lac pro代表乳糖操縱子的啟動(dòng)子序列。Ampr是耐氨芐青霉素基因且ori是復(fù)制起點(diǎn)。
附圖15是質(zhì)粒pBICSF的限制圖。CSF是信號(hào)序列已經(jīng)缺失的黃瓜鐵螯合酶基因。NP是胭脂氨酸合酶的啟動(dòng)子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖16是質(zhì)粒pHEMF的限制圖。HEMF是大腸桿菌的糞卟啉原(coproporphyrinogene)Ⅲ氧化酶基因hemF。lac pro代表乳糖操縱子的啟動(dòng)子序列。Ampr是耐氨芐青霉素基因且ori是復(fù)制起點(diǎn)。
附圖17是質(zhì)粒pBIHEMF的限制圖。HEMF是大腸桿菌的糞卟啉原(coprophyrinogen)Ⅲ氧化酶基因hemF。NP是胭脂氨酸合酶的啟動(dòng)子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖18是質(zhì)粒pBIHASYS8的限制圖。HASYS8是編碼MG(HASYS)8蛋白質(zhì)的基因。NP是胭脂氨酸合酶的啟動(dòng)子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖19是質(zhì)粒pBIRASSL8的限制圖。RASSL8是可編碼MG(RASSL)8蛋白質(zhì)的基因(RASSL8 is MG(RASSL)8protein.)。NP是胭脂氨酸合酶的啟動(dòng)子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子。NPTⅡ代表耐卡那霉素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
在這些情況下，本發(fā)明者已經(jīng)進(jìn)行了集中研究以便開發(fā)一種使植物產(chǎn)生雜草防治化合物耐受性的新型方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使植物在植物細(xì)胞中產(chǎn)生某種蛋白質(zhì)而使植物產(chǎn)生雜草防治化合物耐受性。由此完成本發(fā)明。
即本發(fā)明提供了下列技術(shù)方案1．一種使植物產(chǎn)生雜草防治化合物耐受性的方法，包括下列步驟將一種可編碼一種蛋白質(zhì)的基因引入植物細(xì)胞，所述的蛋白質(zhì)具有至少下列(a)至(c)特征(a)對(duì)涉及雜草防治化合物的雜草防治活性的物質(zhì)具有特異性親和性；(b)對(duì)與所述蛋白質(zhì)具有特異親和性的物質(zhì)基本不具有修飾能力(c)基本上不含免疫球蛋白中可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)；并且，表達(dá)該基因(以下稱為本發(fā)明的第一方面)2．根據(jù)上述1的方法，其中以這樣一種方式將基因引入植物細(xì)胞、即以可操作的方式將它與均可在植物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子和終止子進(jìn)行連接。
3．根據(jù)上述1或2的方法，其中涉及雜草防治化合物的雜草防治活性的物質(zhì)是雜草防治化合物自身。
4．根據(jù)上述1或2的方法，其中涉及雜草防治化合物的雜草防治活性的物質(zhì)是衍生于一種植物的內(nèi)源性物質(zhì)。
5．根據(jù)上述1或2的方法，其中雜草防治化合物是可抑制植物卟啉的生物合成的物質(zhì)。
6．根據(jù)上述1或2的方法，其中雜草防治化合物是原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物。
7．根據(jù)上述5或6的方法，其中可導(dǎo)致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質(zhì)是原卟啉Ⅸ。
8．根據(jù)上述5或6的方法，其中蛋白質(zhì)是鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白、或?qū)υ策哂刑禺愋杂H和性的蛋白質(zhì)變體。
9．根據(jù)上述8的方法，其中蛋白質(zhì)是衍生于光合微生物的鎂螯合酶。
10．根據(jù)上述8的方法，其中蛋白質(zhì)是衍生于一種植物的鎂螯合酶。
11．根據(jù)上述8的方法，其中蛋白質(zhì)是衍生于煙草的鎂螯合酶。
12．根據(jù)上述5或6的方法，其中蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
13．根據(jù)上述5或6的方法，其中蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
14．根據(jù)上述5或6的方法，其中蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
15．根據(jù)上述5或6的方法，其中蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
16．根據(jù)上述5或6的方法，其中蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
17．根據(jù)上述5或6的方法，其中蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
18．根據(jù)上述5或6的方法，其中蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
19．根據(jù)上述5或6的方法，其中蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
20．根據(jù)上述5或6的方法，其中蛋白質(zhì)由4-100個(gè)氨基酸組成。
21．根據(jù)上述5或6的方法，其中涉及雜草防治化合物的雜草防治活性的物質(zhì)是原卟啉原Ⅸ。
22．根據(jù)上述5或6的方法，其中蛋白質(zhì)是一種對(duì)原卟啉原Ⅸ沒有氧化能力、而對(duì)原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
23．根據(jù)上述5或6的方法，其中蛋白質(zhì)是一種對(duì)原卟啉原Ⅸ沒有氧化能力、而對(duì)原卟啉Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物具有特異性親和性的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
24．根據(jù)上述22或23的方法，其中蛋白質(zhì)是一種衍生于植物的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
25．根據(jù)上述22或23的方法，其中蛋白質(zhì)是一種衍生于大豆的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
26．根據(jù)上述22或23的方法，其中蛋白質(zhì)是一種衍生于藻類的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
27．根據(jù)上述22或23的方法，其中蛋白質(zhì)是一種衍生于衣藻屬的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
28．一種使植物產(chǎn)生雜草防治化合物耐受性的方法，包括下列步驟將一種可編碼一種蛋白質(zhì)的基因引入植物細(xì)胞并且表達(dá)該基因，所述的蛋白質(zhì)具有下列(a)至(c)特征(a)對(duì)原卟啉Ⅸ具有特異性親和性；(b)對(duì)原卟啉原Ⅸ基本不具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白中可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)。
(以下稱為本發(fā)明方法的第二方面)29．根據(jù)上述28的方法，其中在植物細(xì)胞中以這樣一種方式將基因引入植物細(xì)胞、即以可操作的方式將該基因與均可在植物細(xì)胞內(nèi)起作用的啟動(dòng)子和終止子進(jìn)行連接。
30．根據(jù)上述28或29的方法，其中雜草防治化合物是可抑制植物卟啉的生物合成的物質(zhì)。
31．根據(jù)上述28或29的方法，其中雜草防治化合物是一種原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物。
32．根據(jù)上述30或31的方法，其中蛋白質(zhì)是鎂螯合酶或?qū)υ策哂刑禺愋杂H和性的所述蛋白質(zhì)的變體。
33．根據(jù)上述30或31的方法，其中蛋白質(zhì)是鐵螯合酶或?qū)υ策哂刑禺愋杂H和性的所述蛋白質(zhì)的變體。
34．根據(jù)上述30或31的方法，其中蛋白質(zhì)是衍生于一種植物鐵螯合酶。
35．根據(jù)上述30或31的方法，其中蛋白質(zhì)是衍生于大麥屬的鐵螯合酶。
36．根據(jù)上述30或31的方法，其中蛋白質(zhì)是來自黃瓜的鐵螯合酶。
37．根據(jù)上述0或31的方法，其中蛋白質(zhì)是一種由4-100個(gè)氨基酸組成的肽。
38．一種使植物產(chǎn)生雜草防治化合物耐受性的方法，包括下列步驟將一種可編碼一種蛋白質(zhì)的基因引入植物細(xì)胞并且表達(dá)該基因，所述的蛋白質(zhì)具有下列(a)至(c)特征(a)對(duì)原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性；(b)對(duì)糞卟啉原Ⅲ不具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白中可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)。
(以下稱為本發(fā)明的方法的第三部分)39．根據(jù)上述38的方法，其中以這樣一種方式將基因引入植物細(xì)胞、即以可操作的方式將該基因與均可在植物細(xì)胞內(nèi)起作用的啟動(dòng)子和終止子進(jìn)行連接。
40．根據(jù)上述38或39的方法，其中蛋白質(zhì)是糞卟啉原Ⅲ或?qū)υ策哂刑禺愋杂H和性的所述蛋白質(zhì)的變體。
41．根據(jù)上述38或39的方法，其中蛋白質(zhì)是衍生于一種微生物的糞卟啉原Ⅲ氧化酶。
42．根據(jù)上述38或39的方法，其中蛋白質(zhì)是衍生于大腸桿菌的糞卟啉原Ⅲ氧化酶。
43．一種耐雜草防治化合物的植物，其耐受性按照上述1、2、28或29的方法而產(chǎn)生。
44．一種耐雜草防治化合物的植物，其耐受性按照上述38或39的方法而產(chǎn)生。
45．一種用于保護(hù)上述43的植物的方法，包括給所述植物的生長(zhǎng)區(qū)施用所述的雜草防治化合物。
46．一種用于保護(hù)上述44的植物的方法，包括給所述植物的生長(zhǎng)區(qū)施用所述的雜草防治化合物。
47．一種用于選擇植物的方法，包括給上述43的植物和其它植物的生長(zhǎng)區(qū)施用對(duì)上述43植物來說是耐受性的雜草防治化合物、并且根據(jù)植物間的生長(zhǎng)差異來選擇植物。
48．一種用于選擇植物的方法，包括給上述44的植物和其它植物的生長(zhǎng)區(qū)施用對(duì)上述44植物來說是耐受性的雜草防治化合物、并且根據(jù)植物間的生長(zhǎng)差異來選擇植物。
49．根據(jù)上述47的方法，其中植物是植物細(xì)胞。
50．根據(jù)上述48的方法，其中植物是植物細(xì)胞。
51．根據(jù)上述1或2的方法，其中雜草防治化合物是選自下列(1)至(3)化合物的原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物；并且涉及雜草防治化合物的雜草防治活性的物質(zhì)是原卟啉Ⅸ、原卟啉原Ⅸ或一種原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物(1)氯硝醚、治草醚、草枯醚(CNP)、氟鎖草醚、5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基(nitoro)苯甲酸及其乙酯、氟鎖草醚鈉、氟硝草醚、2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯氧基)-4-三氟苯、惡草靈、3-[2,4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯基]-5-(1,1-二甲基乙基)-1,3,4-氧代二唑-2-(3H)-酮、2-[4-氯-2-氟-5-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,3,4,5,6,7-六氫化-1H-異吲哚-1,3-二酮、N-(4-氟-2-氟-5-炔丙基羥苯基)-3,4,5,6-四氫苯鄰二甲酰亞胺、N-(4-氯苯基)-3,4,5,6-四氫苯鄰二甲酰亞胺chlorphthalim、TNPP乙基2-[1-(2,3,4-三氯苯基)-4-硝基吡唑基-5-氧基]丙酸乙酯、或N3-(1-苯乙基)-2,6-二甲基-5-丙炔基(propyonyl)煙酰胺；(2)由一般通式J-G(1)所代表的化合物，其中G由下列通式G-1至G-9之任一，J由下列通式J-1至J-30之任一所代表。
其中通式J-5、J-6、J-12和J-24中的虛線代表含有單鍵的左旋環(huán)；或環(huán)中的一個(gè)鍵是碳原子間的雙鍵；X是氧原子或硫原子；Y是氧原子或硫原子；R1是氫原子或鹵原子；R2是氫原子、C1-C8烷基、C1-C8鹵代烷基、鹵原子、OH基、OR27基、SH基、S(O)pR27基、COR27基、CO2R27基、C(O)SR27基、C(O)NR29R30基、CHO基、CR27NOR36基、CH=CR37CO2R27基、CH2CHR37CO2R27基、CO2N=CR31R32基、硝基、氰基、NHSO2R33基、NHSO2NHR33基、NR27R38基、NH2基或任意用一個(gè)或多個(gè)以及相同或不同的C1-C44烷基取代的苯基；P是0、1或2；R3是C1-C2烷基、C1-C2鹵代烷基、OCH3基、SCH3基、OCHF2基、鹵原子、氰基或硝基；R4氫原子、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基或鹵原子；R5是氫原子、C1-C3烷基、鹵原子、C1-C3鹵代烷基、環(huán)丙基、乙烯基、C2炔基、氰基、C(O)R38基、CO2R38基、C(O)NR38R39基、CR34R35CN基、CR34R35C(O)R38基、CR34R35CO2R38基、CR34R35C(O)NR38R39基、CHR34OH基、CHR34OC(O)R38基或OCHR34OC(O)NR38R39基；或當(dāng)G是G-2或G-6時(shí)，R4和R5可以與連接它們的碳原子一起形成C=O基；R6是C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C2-C6烷氧基烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；X1是單鍵、氧原子、硫原子、NH基、N(C1-C3烷基)基團(tuán)、N(C1-C3鹵代烷基)基團(tuán)或N(烯丙基)基團(tuán)；R7是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、鹵原子、S(O)2(C1-C6烷基)基團(tuán)或C(=O)R40基；R8是氫原子、C1-C8烷基、C3-C8環(huán)烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C1-C8鹵代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C3-C8烷氧基烷氧基烷基、C3-C8鹵代炔基、C3-C8鹵代鏈烯基、C1-C8烷磺?；?、C1-C8鹵代烷磺?；?、C3-C8烷氧基羰基烷基、S(O)2NH(C1-C8烷基)基團(tuán)、C(O)R41基或其苯環(huán)可以被R42取代的芐基；n和m獨(dú)立地為0、1、2或3且m+n為2、3或4；Z是CR9R10基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基團(tuán)；R9各自獨(dú)立地為氫原子、C1-C3烷基、鹵原子、羥基、C1-C6烷氧基、C1-C6鹵代烷基、C1-C6鹵代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6鹵代烷基羰基氧基；R10各自獨(dú)立地為氫原子、C1-C3烷基、和羥基或鹵原子；R11和R12獨(dú)立地為氫原子、鹵原子、C1-C6烷基、C3-C6鏈烯基或C1-C6鹵代烷基；R13是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6鹵代鏈烯基、C3-C6炔基、C3-C6鹵代炔基、HC(=O)基、(C1-C4烷基)C(=O)基團(tuán)或NH2基；R14是C1-C6烷基、C1-C6烷硫基、C1-C6鹵代烷基或N(CH3)2基；W是氮原子或CR15；R15是氫原子、C1-C6烷基、鹵原子、任意被C1-C6烷基或一個(gè)或兩個(gè)鹵原子取代的苯基、C1-C6烷氧基或CF3基；
Q各自獨(dú)立地為氧原子或硫原子；Q1是氧原子或硫原子；Z1是CR16R17基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基團(tuán)；R16各自獨(dú)立地為氫原子、鹵原子、羥基、C1-C6烷氧基、C1-C6鹵代烷基、C1-C6鹵代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6鹵代烷基羰基氧基；R17各自獨(dú)立地為氫原子、羥基或鹵原子；R18是C1-C6烷基、鹵原子或C1-C6鹵代烷基；R19和R20獨(dú)立地為氫原子、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基或C1-C6鹵代烷基；Z2是氧原子、硫原子、NR9基或CR9R10基；R21和R22獨(dú)立地為C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6鹵代鏈烯基、C3-C6炔基或C3-C6鹵代炔基；R23是氫原子、鹵原子或氰基；R24是C1-C6烷磺?；1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6鹵代烷氧基或鹵原子；R25是C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；R26是C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基或任意被取代基取代的苯基，所述的取代基選自由C1-C6烷基，1-2個(gè)鹵原子、1-2個(gè)硝基、C1-C6烷氧基和CF3基組成的組；W1是氮原子或CH基；T是由下列一般通式T-1、T-2和T-3所代表的任意基團(tuán)之一
(其中E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11和E12獨(dú)立地為氫原子或C1-C3烷基)；
R27是C1-C8烷基、C3-C8環(huán)烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C1-C8鹵代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C2-C8烷硫基烷基、C2-C8烷亞磺?；榛?、C2-C8烷磺?；榛1-C8烷磺?；?、其苯環(huán)可以被至少一個(gè)選自由鹵原子和C1-C4烷基組成的組的取代基取代的苯磺酰基、C4-C8烷氧基烷氧基烷基、C4-C8環(huán)烷基烷基、C6-C8環(huán)烷氧基烷基、C4-C8鏈烯基氧基烷基、C4-C8炔基氧基烷基、C3-C8鹵代烷氧基烷基、C4-C8鹵代鏈烯基氧基烷基、C4-C8鹵代炔基氧基烷基、C6-C8環(huán)烷硫基烷基、C4-C8鏈烯基硫代烷基、C4-C8炔基硫代烷基、被苯氧基取代的C1-C4烷基；其中苯氧基的苯環(huán)被至少一個(gè)選自由鹵原子、C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基組成的組的取代基取代、被芐氧基取代的C1-C4烷基；其中芐氧基的環(huán)被至少一個(gè)選自由鹵原子、C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基組成的組的取代基取代、C4-C8三烷基甲硅烷基烷基、C3-C8氰基烷基、C3-C8鹵代環(huán)烷基、C3-C8鹵代鏈烯基、C5-C8烷氧基鏈烯基、C5-C8鹵代烷氧基鏈烯基、C5-C8烷基硫代鏈烯基、C3-C8鹵代炔基、C5-C8烷氧基鏈烯基、C5-C8鹵代烷氧基鏈烯基、C5-C8烷基硫代炔基、C2-C8烷基羰基、其苯環(huán)被至少一個(gè)選自由鹵原子、C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基組成的組的取代基取代的芐基、CHR34COR28基、CHR34COOR28基、CHR34P(O)(OR28)2基、CHR34P(S)(OR28)2基、CHR34C(O)NR29R30基或CHR34C(O)NH2基；R28是C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基或四氫呋喃基；R29和R31獨(dú)立地為氫原子或C1-C4烷基；R30和R32獨(dú)立地為C1-C4烷基或其環(huán)可以被至少一個(gè)取代基取代的苯基，所述的取代基選自由鹵原子、C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基組成的組；或R29和R30一起可以形成-(CH2)5-、-(CH2)4-或-CH2CH2OCH2CH2-，或由此形成的環(huán)可以被至少一個(gè)選自由C1-C3烷基、苯基和芐基組成的組的取代基取代；或R31和R32與連接它們的碳原子一起可以形成C3-C8環(huán)烷基；R33是C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基或C3-C6鏈烯基；R34和R35獨(dú)立地為氫原子或C1-C4烷基；R36是氫原子、C1-C6烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；R37是氫原子、C1-C4烷基或鹵原子；
R38是氫原子、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6鹵代烷基、其環(huán)可以被選自由鹵原子、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基組成的組的取代基取代的苯基、-CH2CO2(C1-C4烷基)基團(tuán)或-CH(CH3)CO2(C1-C4烷基)基團(tuán)；R39是氫原子、C1-C2烷基或C(O)O(C1-C4烷基)基團(tuán)；R40是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或NH(C1-C4烷基)基團(tuán)；R41是C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C1-C6烷氧基、NH(C1-C6烷基)基團(tuán)、其環(huán)可以被選自由基團(tuán)R42、芐基和C2-C8二烷氨基組成的組的一個(gè)取代基取代的苯基；且R42是C1-C6烷氧基、一個(gè)或兩個(gè)鹵原子、C1-C6烷氧基或CF3基；(3)通式(Ⅱ)的化合物
或nipilacrofen，其中R43是C1-C4烷基；R44是C1-C4烷基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4鹵代烷硫基和C1-C4鹵代烷氧基；R43和R44一起可以形成-(CH2)3-或-(CH2)4-；R45是氫原子或鹵原子；R46是氫原子或C1-C4烷基；R47是氫原子、硝基、氰基、-COOR49、-C(=X)NR50R51基或-C(X2)R52基；R48是氫原子、鹵原子、氰基、被至少一個(gè)選自由鹵原子和羥基組成的組的取代基任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、被至少一個(gè)選自由鹵原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和鹵代C1-C4烷基組成的組的取代基任意取代的苯基、吡咯基、C2-C8烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C3-C8烷氧基、選自由C2-C8烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基和C3-C8烷氧基組成的組的一個(gè)基團(tuán)，在該基團(tuán)中至少插入一個(gè)氧原子；或R48是由下列通式所代表的任意一個(gè)基團(tuán)-NR53R54
-OR58-S(O)fR59
-(CH2)a-A-(CH2)a-O(CH2)b-R64-(CH2)a-O-R65-COR66其中R49、R50和R52相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R50和R51與連接它們的氮原子一起可以形成飽和的脂環(huán)5或6節(jié)環(huán)；R52是氫原子、C1-C4烷基或被至少一個(gè)鹵原子取代的C1-C4烷基；R53是氫原子、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C3-C6的炔基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的苯基、C3-C8環(huán)烷基、氰甲基、或R63CO-基；
R54是氫原子、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C1-C6烷基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C3-C6炔基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的苯基、C3-C8環(huán)烷基、氰甲基、C1-C4烷氧基-C1-C6烷基、二-C1-C4烷氨基-C1-C4烷基、四氫糠基甲基、C3-C6炔基氧基-C1-C4烷基、其環(huán)可以被選自由鹵原子、硝基、氰基、C1-C4烷氧基和鹵代-C1-C4烷基組成的組的取代基取代的芐基、-C(=X2)R63基、-(CH2)a-(O)d-R70基、-(CH2)a-(O)b-R70基、-(CH2)a-X2-R76基；R53和R54與連接它們的碳原子一起可以形成飽和3、5、6節(jié)脂環(huán)或芳香5或6節(jié)環(huán)，它的一個(gè)環(huán)碳原子可以被氧原子取代；R55是氫原子、C1-C4烷基、C2-C6鏈烯基或C3-C6炔基；或R55和R56一起可以形成-(CH2)e-；R56和R57獨(dú)立地為被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C3-C6炔基或被至少一個(gè)鹵原子任意取代的苯基、氫原子、C3-C6環(huán)烷基、-XR60基或-NR61R62基；R58是氫原子、C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C1-C4烷基羰基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、二C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、芐基、C1-C4烷氧基-C1-C4炔基、-(CH2)a-R75基、-(CH2)a-X2-R72基、-(CH2)a-X2-(CH2)b-R72基或-(CH2)a-X2-(CH2)b-X2-(CH2)c-R72基；R59是氫原子、C1-C4烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷基羰基-C1-C3烷基或苯基；R60是被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C1-C4烷基；R61和R62相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R63是被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷基、C1-C4烷硫基-C1-C4烷基、C3-C6環(huán)烷基、其環(huán)可以被至少一個(gè)選自由鹵原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和鹵代--C1-C4烷基組成的組的取代基取代的苯基、-NR73R74基或-(CH2)a-(O)d-R75基；R64是C1-C4烷氧基羰基或羧基；R65是氯甲基、氰甲基、至少可以插入一個(gè)氧原子的C3-C6環(huán)烷基、或C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基；R66是羥基或-NR67R68基；A是-NR67R68基或-S(O)p-R69基；R67和R68相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R69是C1-C4烷基或C1-C4鹵代烷基；R70是氫原子、羥基、鹵原子、被至少一個(gè)C1-C4烷氧基任意取代的C1-C4烷基、至少可以插入一個(gè)氧原子的C3-C6環(huán)烷基、被一個(gè)或兩個(gè)甲基任意取代的C3-C6環(huán)烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；R71和R72相同或不同、為C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；R73和R74相同或不同、為C1-C4烷基或苯基；R75是可以插入至少一個(gè)氧原子的C3-C6環(huán)烷基、被一個(gè)或兩個(gè)甲基任意取代的C3-C6環(huán)烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；R76是C1-C4烷基；a、b和c獨(dú)立地為1、2或3；d是0或1；e是2或3；f是1或2；且X2是氧原子或硫原子。
在本發(fā)明的方法中，涉及雜草防治化合物的雜草防治活性的物質(zhì)(下文稱作雜草防治物質(zhì))是構(gòu)成生物體內(nèi)代謝反應(yīng)系統(tǒng)組成部分的那些物質(zhì)，在將這些化合物施用于植物時(shí)，它們可產(chǎn)生雜草防治活性。其實(shí)例包括雜草防治化合物自身、衍生于植物的內(nèi)源性物質(zhì)等。特別是諸如衍生于植物的內(nèi)源性物質(zhì)，例如有在靶酶上起作用的底物、或當(dāng)蓄積在植物細(xì)胞內(nèi)時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞功能異常的前體或底物代謝物；由上述在植物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞功能異常的物質(zhì)產(chǎn)生的物質(zhì)等。更具體地說，已經(jīng)公知當(dāng)將具有可抑制原卟啉原Ⅸ氧化酶(EC1.3.3.4，下文稱作PPO)活性的除草活性的化合物(下文稱作除草化合物)施用于植物時(shí)，作為PPO底物的原卟啉原蓄積在植物細(xì)胞內(nèi)并且代謝成原卟啉X，隨后在細(xì)胞中在既有原卟啉X又有光存在的條件下形成活性氧，這一過程可破壞細(xì)胞功能[Jansh,MTYAMOTO編輯，AtarashiiNoyaku no Kagaku(《新農(nóng)用化學(xué)品化學(xué)》(Chemistry of NewAgrochemicals))，第3章第3.3部分，p106(1993)Hirokawa Shoten,Tokyo]。因此，這些系統(tǒng)中的原卟啉原Ⅸ、原卟啉Ⅸ和活性氧等可作為這些物質(zhì)的典型實(shí)例。
在本發(fā)明的方法中，雜草防治化合物包括具有除草活性、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)活性等的化合物。
除草化合物的實(shí)例包括抑制卟啉生物合成的化合物；抑制光合成中電子傳進(jìn)的化合物；抑制類胡蘿卜素生物合成的化合物、抑制氨基酸生物合成的化合物；抑制脂類生物合成的化合物；抑制細(xì)胞壁生物合成的化合物；影響蛋白質(zhì)生物合成、核酸生物合成和細(xì)胞分裂的化合物；具有生長(zhǎng)素拮抗活性的化合物等。更具體地說，作為抑制卟啉生物合成的化合物，例如有抑制PPO活性的化合物(PPO抑制型除草化合物)等。作為抑制光合成中電子傳遞的化合物，例如有抑制光化學(xué)系統(tǒng)Ⅰ或Ⅱ的電子傳遞的化合物、抑制可影響傳遞電子的質(zhì)體醌的生物合成的4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶(EC1.13.11.27；下文稱作4-HPPD)的化合物等。作為抑制類胡蘿卜素生物合成的化合物，例如有抑制八氫番茄紅素脫飽和酶(下文稱作PDS)的化合物等。作為抑制氨基酸生物合成的化合物，例如有抑制EPSPS、乙酸乳酸合酶(EC4.1.3.18；下文稱作ALS)、谷氨酰胺合成酶(EC6.3.1.2；下文稱作GS)、二氫蝶酸合酶(EC 2.5.1.15；下文稱作DHP)的化合物等。作為抑制脂類生物合成的化合物，例如有抑制乙酰CoA羧化酶(EC6.4.1.2；下文稱作ACC)的化合物等。作為抑制細(xì)胞壁生物合成的化合物，例如有抑制纖維素生物合成的化合物等。作為影響蛋白質(zhì)生物合成、核酸生物合成或細(xì)胞分裂的化合物，例如有抑制微管形成的化合物等。
具有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑活性的化合物實(shí)例包括具有對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的植物激素有拮抗活性的化合物等。特別地，例如有2,4-D、苯乙基烷烴羧酸、苯甲酸的衍生物、吡啶甲酸衍生物等。
作為上述PPO抑制型除草化合物，例如有Duke,S.O.,Rebeiz,C.A.在《ACS專題論文集系列559》、《殼苔酸殺蟲劑》、《化學(xué)》、《毒理學(xué)》、以及《藥物應(yīng)用》、Washington DC的美國(guó)化學(xué)會(huì)(1994)中公開的化合物等。特別地，它們的實(shí)例包括下列化合物
(1)氯硝醚、治草醚、草枯醚(CNP)、氟鎖草醚、5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基(nitoro)苯甲酸及其乙酯、氟鎖草醚鈉、氟硝草醚、2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯氧基)-4-三氟苯、惡草靈、3-[2,4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯基]-5-(1,1-二甲基乙基)-1,3,4-氧代二唑-2-(3H)-酮、2-[4-氯-2-氟-5-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,3,4,5,6,7-六氫化-1H-異吲哚-1,3-二酮、N-(4-氯-2-氟-5-炔丙基羥苯基)-3、4,5,6-四氫苯鄰二甲酰亞胺、chlorphthalim、N-(4-氯苯基)-3,4,5,6-四氫苯鄰二甲酰亞胺、TNPP乙基2-[1-(2,3,4-三氯苯基)-4-硝基吡唑基-5-氧基]丙酸乙酯、或N3-(1-苯乙基)-2,6-二甲基-5-丙炔基(propyonyl)煙酰胺；(2)由一般通式J-G(Ⅰ)所代表的化合物，其中G是以下通式G-1至G-9之任一代表的基團(tuán)，J是以下通式J-1至J-30之任一代表的基團(tuán)
其中通式J-5、J-6、J-12和J-24中的虛線代表含有單鍵的左旋環(huán)；或環(huán)中的一個(gè)鍵是碳原子間的雙鍵；X是氧原子或硫原子；Y是氧原子或硫原子；R1是氫原子或鹵原子；R2是氫原子、C1-C8烷基、C1-C8鹵代烷基、鹵原子、OH基、OR27基、SH基、S(O)pR27基、COR27基、CO2R27基、C(O)SR27基、C(O)NR29R30基、CHO基、CR27NOR36基、CH=CR37CO2R27基、CH2CHR37CO2R27基、CO2N=CR31R32基、硝基、氰基、NHSO2R33基、NHSO2NHR33基、NR27R38基、NH2基或任意用一個(gè)或多個(gè)以及相同或不同的C1-C44烷基取代的苯基；p是0、1或2；R3是C1-C2烷基、C1-C2鹵代烷基、OCH3基、SCH3基、OCHF2基、鹵原子、氰基或硝基；R4氫原子、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基或鹵原子；R5是氫原子、C1-C3烷基、鹵原子、C1-C3鹵代烷基、環(huán)丙基、乙烯基、C2炔基、氰基、C(O)R38基、CO2R38基、C(O)NR38R39基、CR34R35CN基、CR34R35C(O)R38基、CR34R35CO2R38基、CR34R35C(O)NR38R39基、CHR34OH基、CHR34OC(O)R38基或OCHR34OC(O)NR38R39基；或當(dāng)G是G-2或G-6時(shí)，R4和R5可以與連接它們的碳原子一起形成C=O基；R6是C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C2-C6烷氧基烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；X1是單鍵、氧原子、硫原子、NH基、N(C1-C3烷基)基團(tuán)、N(C1-C3鹵代烷基)基團(tuán)或N(烯丙基)基團(tuán)；R7是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、鹵原子、S(O)2(C1-C6烷基)基團(tuán)或C(=O)R40基；R8是氫原子、C1-C8烷基、C3-C8環(huán)烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C1-C8鹵代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C3-C8烷氧基烷氧基烷基、C3-C8鹵代炔基、C3-C8鹵代鏈烯基、C1-C8烷磺?；?、C1-C8鹵代烷磺?；?、C3-C8烷氧基羰基烷基、S(O)2NH(C1-C8烷基)基團(tuán)、C(O)R41基或其苯環(huán)可以被R42取代的芐基；n和m獨(dú)立地為0、1、2或3且m+n為2、3或4；Z是CR9R10基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基團(tuán)；R9各自獨(dú)立地為氫原子、C1-C3烷基、鹵原子、羥基、C1-C6烷氧基、C1-C6鹵代烷基、C1-C6鹵代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6鹵代烷基羰基氧基；R10各自獨(dú)立地為氫原子、C1-C3烷基、和羥基或鹵原子；R11和R12獨(dú)立地為氫原子、鹵原子、C1-C6烷基、C3-C6鏈烯基或C1-C6鹵代烷基；R13是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6鹵代鏈烯基、C3-C6炔基、C3-C6鹵代炔基、HC(=O)基、(C1-C4烷基)C(=O)基團(tuán)或NH2基；R14是C1-C6烷基、C1-C6烷硫基、C1-C6鹵代烷基或N(CH3)2基；W是氮原子或CR15；R15是氫原子、C1-C6烷基、鹵原子、任意被C1-C6烷基或一個(gè)或多個(gè)鹵原子取代的苯基、C1-C6烷氧基或CF3基；
Q各自獨(dú)立地為氧原子或硫原子；Q1是氧原子或硫原子；Z1是CR16R17基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基團(tuán)；R16各自獨(dú)立地為氫原子、鹵原子、羥基、C1-C6烷氧基、C1-C6鹵代烷基、C1-C6鹵代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6鹵代烷基羰基氧基；R17各自獨(dú)立地為氫原子、羥基或鹵原子；R18是C1-C6烷基、鹵原子或C1-C6鹵代烷基；R19和R20獨(dú)立地為氫原子、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基或C1-C6鹵代烷基；Z2是氧原子、硫原子、NR9基或CR9R10基；R21和R22獨(dú)立地為C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6鹵代鏈烯基、C3-C6炔基或C3-C6鹵代炔基；R23是氫原子、鹵原子或氰基；R24是C1-C6烷磺?；1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6鹵代烷氧基或鹵原子；R25是C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；R26是C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基或任意被至少一個(gè)取代基取代的苯基，所述的取代基選自由C1-C6烷基1-2個(gè)鹵原子、1-2個(gè)硝基、C1-C6烷氧基和CF3基組成的組；W1是氮原子或CH基；T是由下列一般通式T-1、T-2和T-3所代表的任意基團(tuán)之一
(其中E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11和E12獨(dú)立地為氫原子或C1-C3烷基)；
R27是C1-C8烷基、C3-C8環(huán)烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C1-C8鹵代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C2-C8烷硫基烷基、C2-C8烷亞磺?；榛?、C2-C8烷磺酰基烷基、C1-C8烷磺?；?、其苯環(huán)可以被至少一個(gè)選自由鹵原子和C1-C4烷基組成的組的取代基取代的苯磺酰基、C4-C8烷氧基烷氧基烷基、C4-C8環(huán)烷基烷基、C6-C8環(huán)烷氧基烷基、C4-C8鏈烯基氧基烷基、C4-C8炔基氧基烷基、C3-C8鹵代烷氧基烷基、C4-C8鹵代鏈烯基氧基烷基、C4-C8鹵代炔基氧基烷基、C6-C8環(huán)烷硫基烷基、C4-C8鏈烯基硫代烷基、C4-C8炔基硫代烷基、被苯氧基取代的C1-C4烷基；其中苯氧基的苯環(huán)被至少一個(gè)選自由鹵原子、C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基組成的組的取代基取代、被芐氧基取代的C1-C4烷基；其中芐氧基的環(huán)被至少一個(gè)選自由鹵原子、C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基組成的組的取代基取代、C4-C8三烷基甲烷基烷基、C3-C8氰基烷基、C3-C8鹵代環(huán)烷基、C3-C8鹵代鏈烯基、C5-C8烷氧基鏈烯基、C5-C8鹵代烷氧基鏈烯基、C5-C8烷基硫代鏈烯基、C3-C8鹵代炔基、C5-C8烷氧基鏈烯基、C5-C8鹵代烷氧基鏈烯基、C5-C8烷基硫代炔基、C2-C8烷基羰基、其苯環(huán)被至少一個(gè)選自由鹵原子、C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基組成的組的取代基取代的芐基、CHR34COR28基、CHR34COOR28基、CHR34P(O)(OR28)2基、CHR34P(S)(OR28)2基、CHR34C(O)NR29R30基或CHR34C(O)NH2基；R28是C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基或四氫呋喃基；R29和R31獨(dú)立地為氫原子或C1-C4烷基；R30和R32獨(dú)立地為C1-C4烷基或其環(huán)可以被至少一個(gè)取代基取代的苯基，所述的取代基選自由鹵原子、C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基組成的組；或R29和R30一起可以形成-(CH2)5-、-(CH2)4-或-CH2CH2OCH2CH2-，或由此形成的環(huán)可以被至少一個(gè)選自由C1-C3烷基、苯基和芐基組成的組的取代基取代；或R31和R32與連接它們的碳原子一起可以形成C3-C8環(huán)烷基；R33是C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基或C3-C6鏈烯基；R34和R35獨(dú)立地為氫原子或C1-C4烷基；R36是氫原子、C1-C6烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；R37是氫原子、C1-C4烷基或鹵原子；
R38是氫原子、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6鹵代烷基、其環(huán)可以被選自由鹵原子、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基組成的組的取代基取代的苯基、-CH2CO2(C1-C4烷基)基團(tuán)或-CH(CH3)CO2(C1-C4烷基)基團(tuán)；R39是氫原子、C1-C2烷基或C(O)O(C1-C4烷基)基團(tuán)；R40是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或NH(C1-C4烷基)基團(tuán)；R41是C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C1-C6烷氧基、NH(C1-C6烷基)基團(tuán)、其環(huán)可以被選自由基團(tuán)R42、芐基和C2-C8二烷氨基組成的組的一個(gè)取代基取代的苯基；且R42是C1-C6烷氧基、一個(gè)或兩個(gè)鹵原子、C1-C6烷氧基或CF3基；(3)通式(Ⅱ)的化合物
或nipilacrofen，其中R43是C1-C4烷基；R44是C1-C4烷基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4鹵代烷硫基和C1-C4鹵代烷氧基；R43和R44一起可以形成-(CH2)3-或-(CH2)4-；R45是氫原子或鹵原子；R46是氫原子或C1-C4烷基；R47是氫原子、硝基、氰基、-COOR49、-C(=X)NR50R51基或-C(X2)R52基；R48是氫原子、鹵原子、氰基、被至少一個(gè)選自由鹵原子和羥基組成的組的取代基任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、被至少一個(gè)選自由鹵原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和鹵代C1-C4烷基組成的組的取代基任意取代的苯基、吡咯基、C2-C8烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C3-C8烷氧基、選自由C2-C8烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基和C3-C8烷氧基組成的組的一個(gè)基團(tuán)，在該基團(tuán)中至少插入一個(gè)氧原子；或R48是由下列通式所代表的任意一個(gè)基團(tuán)-NR53R54
-OR58-S(O)fR59
-(CH2)a-A-(CH2)a-O-(CH2)b-R64-(CH2)a-O-R65-COR66其中R49、R50和R52相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R50和R51與連接它們的氮原子一起可以形成飽和的脂環(huán)5或6節(jié)環(huán)；R52是氫原子、C1-C4烷基或被至少一個(gè)鹵原子取代的C1-C4烷基；R53是氫原子、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C3-C6的炔基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的苯基、C3-C8環(huán)烷基、氰甲基、或R63CO-基；R54是氫原子、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C1-C6烷基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C3-C6炔基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的苯基、C3-C8環(huán)烷基、氰甲基、C1-C4烷氧基-C1-C6烷基、二-C1-C4烷氨基-C1-C4烷基、四氫糠基甲基、C3-C6炔基氧基-C1-C4烷基、其環(huán)可以被選自由鹵原子、硝基、氰基、C1-C4烷氧基和鹵代-C1-C4烷基組成的組的取代基取代的芐基、-C(=X2)R63基、-(CH2)a-(O)d-R70基、-(CH2)a-(O)b-R70基、-(CH2)a-X2-R76基；R53和R54與連接它們的碳原子一起可以形成3、5或6節(jié)飽和脂環(huán)或芳香5或6節(jié)環(huán)，它的一個(gè)環(huán)碳原子可以被氧原子取代；R55是氫原子、C1-C4烷基、C2-C6鏈烯基或C3-C6炔基；或R55和R56一起可以形成-(CH2)e-；R56和R57獨(dú)立地為被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C3-C6炔基或被至少一個(gè)鹵原子任意取代的苯基、氫原子、C3-C6環(huán)烷基、XR60基或-NR61R62基；R58是氫原子、C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C1-C4烷基羰基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、二C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、芐基、C1-C4烷氧基-C1-C4炔基、-(CH2)a-R75基、-(CH2)a-X2-R72基、-(CH2)a-X2-(CH2)b-R72基或-(CH2)a-X2-(CH2)b-X2-(CH2)c-R72基；R59是氫原子、C1-C4烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷基羰基-C1-C3烷基或苯基；R60是被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C1-C4烷基；R61和R62相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R63是被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷基、C1-C4烷硫基-C1-C4烷基、C3-C6環(huán)烷基、其環(huán)可以被至少一個(gè)選自由鹵原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和鹵代-C1-C4烷基組成的組的取代基取代的苯基、-NR73R74基或-(CH2)a-(O)d-R75基；R64是C1-C4烷氧基羰基或羧基；R65是氯甲基、氰甲基、至少可以插入一個(gè)氧原子的C3-C6環(huán)烷基、或C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基；
R66是羥基或-NR67R68基；A是-NR67R68基或-S(O)f-R69基；R67和R68相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R69是C1-C4烷基或C1-C4鹵代烷基；R70是氫原子、羥基、鹵原子、被至少一個(gè)C1-C4烷氧基任意取代的C1-C4烷基、至少可以插入一個(gè)氧原子的C3-C6環(huán)烷基、被一個(gè)或兩個(gè)甲基任意取代的C3-C6環(huán)烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；R71和R72相同或不同、為C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；R73和R74相同或不同、為C1-C4烷基或苯基；R75是可以插入至少一個(gè)氧原子的C3-C6環(huán)烷基、被一個(gè)或兩個(gè)甲基任意取代的C3-C6環(huán)烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；R76是C1-C4烷基；a、b和c獨(dú)立地為1、2或3；d是0或1；e是2或3；f是1或2；且X2是氧原子或硫原子。
此外，作為其它N-取代的吡唑，有Lyga等在《殺蟲劑科學(xué)》(Pesticide,Sci.)42:p29(1994)中記載的3-取代-2-芳基-4,5,6,7-四氫吲唑等。
作為抑制光化學(xué)系統(tǒng)Ⅰ中電子傳遞的化合物的特殊實(shí)例，例如有百草枯、殺草快等。作為抑制光化學(xué)系統(tǒng)Ⅱ中電子傳遞的化合物的特殊實(shí)例，例如有三嗪類化合物(例如阿特拉津等)、脲類化合物(例如敵草隆等)、腈類化合物(例如溴苯腈和4-羥基-3,5-二碘苯甲腈)等。作為抑制4-HPPD的化合物的特殊實(shí)例，例如有異噻唑isoxaflutole、吡唑類、三酮類等。作為抑制PDS的化合物的特殊實(shí)例，例如有達(dá)草滅、氟咯草酮(flurochloridone)、氟草同、呋草酮、吡氟草胺等。作為抑制EPSPS的化合物的特殊實(shí)例，例如有草甘膦等。作為抑制ALS的化合物的特殊實(shí)例，例如有磺酰脲類、咪唑啉酮、嘧啶基硫代苯甲酸酯、三唑并嘧啶等。作為抑制GS的化合物的特殊實(shí)例，例如有雙丙氨酰膦、草銨膦等。作為抑制DHP的化合物的特殊實(shí)例，例如有黃草靈等。作為抑制ACC的化合物的特殊實(shí)例，例如有環(huán)己二酮、芳氧基苯氧基丙酸酯等。作為抑制纖維素的化合物的特殊實(shí)例，例如有敵草腈等。
用于發(fā)明中的雜草防治化合物的各種實(shí)例由下列化學(xué)結(jié)構(gòu)來表示結(jié)構(gòu)1
結(jié)構(gòu)2
結(jié)構(gòu)3
結(jié)構(gòu)4
結(jié)構(gòu)5
結(jié)構(gòu)6
結(jié)構(gòu)7
結(jié)構(gòu)8
結(jié)構(gòu)9
結(jié)構(gòu)10
結(jié)構(gòu)11
結(jié)構(gòu)12
結(jié)構(gòu)13
結(jié)構(gòu)14
結(jié)構(gòu)15
結(jié)構(gòu)16
結(jié)構(gòu)17
結(jié)構(gòu)18
結(jié)構(gòu)19
結(jié)構(gòu)20
結(jié)構(gòu)21
結(jié)構(gòu)22
結(jié)構(gòu)23
結(jié)構(gòu)24
結(jié)構(gòu)25
結(jié)構(gòu)26
結(jié)構(gòu)27
結(jié)構(gòu)28
結(jié)構(gòu)29
結(jié)構(gòu)30
結(jié)構(gòu)31
結(jié)構(gòu)32
結(jié)構(gòu)33
結(jié)構(gòu)34
結(jié)構(gòu)35
結(jié)構(gòu)36
結(jié)構(gòu)37
在本發(fā)明方法的第一個(gè)方面中，所用基因是可編碼具有至少下列(a)至(c)特征之一的蛋白質(zhì)(下文有時(shí)稱作目標(biāo)蛋白質(zhì))的那些基因(a)對(duì)雜草防治物質(zhì)具有特異性親和性；(b)對(duì)與所述蛋白質(zhì)有親和性的物質(zhì)基本不具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白的可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)。
對(duì)于上述特征(a)的雜草防治物質(zhì)來說，術(shù)語“特異性親和性”指的是酶(目標(biāo)蛋白質(zhì))與底物(雜草防治物質(zhì))、或酶(目標(biāo)蛋白質(zhì))與抑制劑或酶活性的調(diào)節(jié)物(雜草防治物質(zhì))通過酶化學(xué)方式相互結(jié)合；或者指的是目標(biāo)蛋白質(zhì)和雜草防治物質(zhì)基于親和性和特異性而相互結(jié)合，諸如用受體化學(xué)鍵、例如受體與配體間的一種鍵所表示的情況等。就具有的特異性結(jié)合雜草防治物質(zhì)的結(jié)構(gòu)來說，目標(biāo)蛋白質(zhì)可以是天然出現(xiàn)的蛋白質(zhì)；通過氨基酸的取代、加成、缺失等而引入天然出現(xiàn)的蛋白質(zhì)而獲得的其變體；以及具有在對(duì)除雜草防治物質(zhì)親和性的引導(dǎo)下所選擇的隨機(jī)氨基酸序列的人工合成蛋白質(zhì)。
在特征(b)中術(shù)語“不具有修飾能力”指的是與所述蛋白質(zhì)具有特異親和性的底物的酶化學(xué)反應(yīng)是失活的(除特征(a)中對(duì)雜草防治物質(zhì)的特異性親和性之外)。這種情況的實(shí)例包括目標(biāo)蛋白質(zhì)不具有將與所述蛋白質(zhì)具有特異親和性的物質(zhì)例如一些雜草防治物質(zhì)，以及基于對(duì)于所述蛋白質(zhì)的特異性親和力，其有底物結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化成具有不同于雜草防治物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)物質(zhì)的能力這樣一種情況“不具修飾能力”蛋白質(zhì)可通過，例如檢測(cè)刪除了編碼所述蛋白的基因的微生物的生長(zhǎng)的不可恢復(fù)性而鑒定，該微生物由于該基因的刪除因而不能在通常的，由于編碼所述蛋白的基因被導(dǎo)入微生物中并且表達(dá)的情況下生長(zhǎng)。
特征(c)中術(shù)語“基本上不含免疫球蛋白可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)”指的是目標(biāo)蛋白質(zhì)不形成對(duì)免疫球蛋白的可變區(qū)具有特異性的立體結(jié)構(gòu)。術(shù)語“免疫球蛋白可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)”指的是在從作為免疫球蛋白分子的H鏈和L鏈可變區(qū)中除去高變區(qū)后剩余的區(qū)。在這些區(qū)中，保持了相對(duì)較高的氨基酸序列且這些區(qū)對(duì)維持可變區(qū)較高的保守立體結(jié)構(gòu)起作用。由于形成了上述立體結(jié)構(gòu)，所以分別位于相應(yīng)H鏈和L鏈上三個(gè)位點(diǎn)的高變區(qū)聚集于立體結(jié)構(gòu)上的一個(gè)位點(diǎn)，從而形成抗原結(jié)合位點(diǎn)[Alberts,B.等編輯《細(xì)胞分子生物學(xué)》(Molecular Biology ofthe Cell),p979,Garland Publishing,Inc.,New York]。
具有上述特征(c)的目標(biāo)蛋白質(zhì)可以根據(jù)、例如蛋白質(zhì)的氨基酸序列來選擇。作為這種蛋白質(zhì)的特殊實(shí)例，有不含有由大于或等于約30個(gè)氨基酸組成的任意氨基酸序列并與免疫球蛋白可變區(qū)構(gòu)架區(qū)的公知氨基酸序列具有大約60％同源性的蛋白質(zhì)等。例如，上述構(gòu)架區(qū)的存在與否可以通過PCR來證實(shí)，在PCR中，使用編碼蛋白質(zhì)的基因作為模板和具有編碼衍生于免疫球蛋白H鏈或L鏈可變區(qū)的核苷酸序列的DNAs作為擴(kuò)增引物，例如Clackson,T.等在《自然》(Nature)352；p624(1991)中所述的引物VH1BACK與VH1FOR-2或VK2BACK與VK4FOR；用于克隆重組抗體基因的商購試劑盒中包含的引物、例如重組噬菌體抗體系統(tǒng)(Pharmacia Biotech)的重引物混合物或輕引物混合物，由此分析是否存在具有所得長(zhǎng)度的擴(kuò)增DNA。
與雜草防治物質(zhì)具有特異性親和性的結(jié)合蛋白的例子也包括對(duì)雜草防治物質(zhì)具有親和性的肽。
具有上述特征(a)至(c)的目標(biāo)蛋白質(zhì)的特殊實(shí)例包括對(duì)原卟啉Ⅸ具有親和性的失活型結(jié)合蛋白質(zhì)[例如底物是原卟啉Ⅸ(雜草防治物質(zhì))的失活型鎂螯合酶；失活型鐵螯合酶(正鐵血紅素鐵裂合酶；EC4.9.9.1)；可催化鈷離子與含有四吡咯環(huán)的化合物作為底物的配位反應(yīng)的失活型鈷螯合酶；對(duì)原卟啉Ⅸ具有親和性的肽、即由4-100個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(例如，對(duì)原卟啉Ⅸ具有親和性的HASYS肽、例如含有SEQ ID NO:53氨基酸序列的蛋白質(zhì)和含有SEQ ID NO:54氨基酸序列的蛋白質(zhì)；對(duì)原卟啉Ⅸ具有親和性的肽RASSL、例如含有SEQ ID NO:55氨基酸序列的蛋白質(zhì)和具有SEQ ID NO:56氨基酸序列的蛋白質(zhì)；對(duì)卟啉化合物具有親和性的肽YAGA、例如含有SEQ IDNO:57氨基酸序列的蛋白質(zhì)和具有SEQ ID NO:58氨基酸序列的蛋白質(zhì)；對(duì)卟啉化合物具有親和性的肽YAGF、例如含有SEQ ID NO:59氨基酸序列的蛋白質(zhì)和具有SEQ ID NO:60氨基酸序列的蛋白質(zhì)等)]；對(duì)原卟啉原Ⅸ具有親和性的失活型結(jié)合蛋白質(zhì)(例如，失活型PPO失活型糞卟啉原Ⅲ氧化酶)等。
上述失活型結(jié)合蛋白質(zhì)包括它們的變體，其活性已經(jīng)在天然或人工條件下通過天然出現(xiàn)的活性蛋白質(zhì)的氨基酸取代、加成、缺失、修飾等而失去。
通過在植物細(xì)胞中將這些結(jié)合蛋白質(zhì)與雜草防治物質(zhì)進(jìn)行結(jié)合可以防止由雜草防治物質(zhì)導(dǎo)致的細(xì)胞功能異常，從而表現(xiàn)出所需的雜草防治化合物耐受性。
失活型鎂螯合酶是鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)、或?qū)υ策哂刑禺愋杂H和性的其變體，且它們的特殊實(shí)例包括來自其細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)序列已經(jīng)缺失的亞單位蛋白質(zhì)等。
失活型鐵螯合酶是不具有修飾原卟啉Ⅸ的能力而對(duì)原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的其變體，且它們的特殊實(shí)例包括其中推定為鐵螯合酶的Fe離子結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)已經(jīng)被修飾的鐵螯合酶變體等。
失活型鈷螯合酶是鈷螯合酶的底物結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)、或不具有修飾原卟啉Ⅸ的能力而對(duì)原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的其變體。
失活型PPO是不具有氧化原卟啉原Ⅸ的能力而對(duì)原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的其變體，且它們的特殊實(shí)例包括其中推定為PPO的FAD結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)(具有氨基酸序列GXGXXG、其中X是任意氨基酸的區(qū)，例如含有來自擬南芥菜(擬南芥)葉綠體固定PPO的N-末端的第63至第68個(gè)氨基酸并具有GGGISG氨基酸序列的區(qū))已經(jīng)缺失的PPO變體等。
失活型糞卟啉原Ⅲ氧化酶是不具有氧化原卟啉原的能力而對(duì)原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的其變體。
編碼上述蛋白質(zhì)的基因可以通過、例如下列方式獲得。
作為編碼鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)的基因，例如那些已經(jīng)公知的基因，它們衍生于光合細(xì)菌莢膜紅球菌(基因庫登記號(hào)M74001)、擬南芥菜(基因庫登記號(hào)Z68495)、大麥(基因庫登記號(hào)U96216)、金魚草屬(金魚草)(基因庫登記號(hào)U26916)、集胞藻屬P.C.C.6803(基因庫登記號(hào)U29131)等。對(duì)于分離這類公知的基因(其核苷酸序列已經(jīng)公知)來說，可以通過下列方式進(jìn)行PCR使用具有所需基因有機(jī)體的基因組DNA或cDNA作為模板和基于相當(dāng)于由該基因編碼的約蛋白質(zhì)N-末端和C-末端的核苷酸序列產(chǎn)生的引物，從而擴(kuò)增所需的基因。此外，編碼鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)的基因可以從光合有機(jī)體而不是上述物質(zhì)獲得。例如，首先通過下列步驟來構(gòu)建cDNA文庫從所需的光合有機(jī)體中獲得mRNA、通過使用mRNA作為模板與逆轉(zhuǎn)錄酶一起合成cDNA、并將cDNA整合入噬菌體載體、諸如ZAPⅡ等或質(zhì)粒載體、諸如pUC等。為了擴(kuò)增一種DNA片段、它含有至少部分可編碼鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)的基因，可以通過使用上述構(gòu)建的cDNA文庫作為模板和基于公知基因、諸如上述基因中保持良好的核苷酸序列而設(shè)計(jì)并合成的引物來進(jìn)行PCR。通過使用由此獲得的DNA片段作為探針對(duì)cDNA文庫進(jìn)行篩選以便選擇陽性克隆。所需鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)的基因可以通過所選克隆核苷酸序列的序列測(cè)定而得到確認(rèn)。
為了獲得可編碼對(duì)原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)的變體的基因，例如通過引入核苷酸取代、加成、缺失、修飾等來誘變可編碼該亞單位蛋白質(zhì)的基因，隨后按照Gibson,L.C.D.等在《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92；p1941(1995)中所述的方法等將所得基因引入大腸桿菌BL21(DE3)菌株以獲得轉(zhuǎn)化體，并在發(fā)生高表達(dá)由此引入的基因的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體。編碼對(duì)原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的亞單位蛋白質(zhì)變體的所需基因可以通過選擇一種菌株而獲得，該菌株的培養(yǎng)細(xì)胞已經(jīng)變紅并具有表現(xiàn)出原卟啉Ⅸ蓄積的熒光吸收(激發(fā)波長(zhǎng)為405nm，熒光波長(zhǎng)為630nm)。
作為編碼鐵螯合酶的基因，例如是那些已經(jīng)公知的基因，它們衍生于大腸桿菌(基因庫登記號(hào)D90259)、枯草芽孢桿菌(基因庫登記號(hào)M97208)、大豆慢生根瘤菌(基因庫登記號(hào)M92427)、酵母釀酒酵母(基因庫登記號(hào)J05395)、小鼠(基因庫登記號(hào)J05697)、人(基因庫登記號(hào)D00726)、大麥(基因庫登記號(hào)D26105)、黃瓜(基因庫登記號(hào)D26106)等。為了分離這樣一種公知的基因(其核苷酸序列已經(jīng)公知)，可以通過下列方式進(jìn)行PCR使用具有所需基因有機(jī)體的基因組DNA或cDNA作為模板和基于相當(dāng)于由該基因編碼的約蛋白質(zhì)N-末端和C-末端的核苷酸序列產(chǎn)生的引物，從而擴(kuò)增所需的基因。此外，為了獲得其它可編碼鐵螯合酶的基因，例如首先通過下列步驟來構(gòu)建cDNA文庫從所需的有機(jī)體中獲得mRNA、通過使用mRNA作為模板與逆轉(zhuǎn)錄酶一起合成cDNA、并將cDNA整合入噬菌體載體、諸如ZAPⅡ等或質(zhì)粒載體、諸如pUC等。可以將cDNA文庫引入Miyamoto,K等在《植物生理學(xué)》(Plant Physiol.)105；p769(1994)中所述的鐵螯合酶缺損的大腸桿菌菌株VS200，隨后進(jìn)行互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)以選擇含有衍生于所需有機(jī)體的鐵螯合酶基因的克隆。此外，為了擴(kuò)增DNA片段，可以通過使用上述構(gòu)建的cDNA文庫作為模板和基于公知基因、諸如上述基因中保持良好的核苷酸序列而制備的引物來進(jìn)行PCR。通過使用由此獲得的DNA片段作為探針對(duì)cDNA文庫進(jìn)行篩選以便選擇陽性克隆。所需鐵螯合酶基因可以通過所選克隆核苷酸序列的序列測(cè)定而得到確認(rèn)。
為了獲得可編碼不具有修飾原卟啉Ⅸ的能力而對(duì)原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的鐵螯合酶變體的基因(例如，編碼鐵螯合酶變體的基因、其中推定為鐵螯合酶的Fe離子結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)被修飾)，可以通過下列步驟進(jìn)行PCR制備一種用于將突變引入基于核苷酸序列的區(qū)的誘變引物、所述的核苷酸序列可編碼與該區(qū)有關(guān)的氨基酸序列；并使用商購的定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Mutan-Super Express,Takara Shuzo)，從而獲得可編碼上述變體的基因。特別地，將野生型鐵螯合酶基因插入質(zhì)粒載體pKF19K的克隆位點(diǎn)并通過使用所得質(zhì)粒DNA作為模板、上述誘變引物和用于位于pKF19K的耐卡那霉素基因上的反向琥珀突變的選擇引物來進(jìn)行PCR。將通過PCR擴(kuò)增的基因引入大腸桿菌MV1184菌株(不含抑制基因)并根據(jù)卡那霉素的耐受性來篩選轉(zhuǎn)化體以分離含有鐵螯合酶基因的大腸桿菌、其中相當(dāng)于構(gòu)成所需區(qū)的氨基酸序列的核苷酸序列已經(jīng)被修飾。所分離的基因作為編碼所需蛋白質(zhì)的基因可以通過分析大腸桿菌質(zhì)粒DNA的核苷酸序列而得到確認(rèn)。
編碼對(duì)原卟啉Ⅸ具有親和性的肽的基因、即由4-100個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)可以通過下列步驟來獲得根據(jù)例如Sugimoto,N.,Nakano,S.在《化學(xué)通訊》(Chem.Lett.)p939(1997)中所述的方法等合成一種肽文庫；選擇對(duì)雜草防治物質(zhì)基因親和性的肽；分析由此用一種肽測(cè)序儀選擇的肽的氨基酸序列；設(shè)計(jì)含有編碼氨基酸序列的核苷酸序列的基因；并用一種DNA合成儀或類似物來合成核苷酸序列。
此外，按照噬菌體展示法可以從噬菌體文庫中選擇可提供一種對(duì)雜草防治物質(zhì)具有親和性的肽的噬菌體克隆。特別地，例如通過將可編碼具有隨機(jī)氨基酸序列的核苷酸序列插入來自可編碼M13噬菌體基因包被蛋白質(zhì)pⅢ的區(qū)的上游來構(gòu)建提供在M13噬菌體顆粒表面上具有隨機(jī)氨基酸序列蛋白質(zhì)的噬菌體文庫。另一方面，將用生物素標(biāo)記的雜草防治物質(zhì)與用親和素或鏈親和素包被的平板結(jié)合以制備一種用雜草防治物質(zhì)包被的支持物。通過在用雜草防治物質(zhì)包被的平板上篩選上述噬菌體文庫可以分離提供對(duì)雜草防治物質(zhì)具有親和性的所需蛋白質(zhì)的噬菌體且所需蛋白質(zhì)的基因可以從分離的噬菌體中獲得。
例如通過下列步驟可以產(chǎn)生可編碼含有重復(fù)四次或八次由SEQ IDNO:53、55、57或59表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因選擇一種核苷酸序列、其中可編碼上述氨基酸序列的核苷酸序列在起始密碼子ATG后以給定次數(shù)重復(fù)；用一種DNA合成儀合成一種含有所選核苷酸序列的寡核苷酸和一種含有與所選核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的寡核苷酸；且然后將它們進(jìn)行退火。此外，通過下列步驟可以產(chǎn)生可編碼由SEQ ID NO:54、56、58或60表示的氨基酸序列的基因選擇一種可編碼氨基酸序列的核苷酸序列；用一種DNA合成儀合成一種含有所選核苷酸序列的寡核苷酸和另一種含有與所選核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的寡核苷酸；且然后將它們進(jìn)行退火。在這方面，例如為了選擇可編碼給定氨基酸序列的核苷酸序列，更好的情況是選擇頻繁用于衍生于植物的基因中的密碼子。
作為PPO基因，例如已經(jīng)公知那些衍生于大腸桿菌(基因庫登記號(hào)X68660)、枯草芽孢桿菌(基因庫登記號(hào)M97208)、流感嗜血菌(基因庫登記號(hào)L42023)、小鼠(基因庫登記號(hào)D45185)、人(基因庫登記號(hào)D38537)、擬南芥菜(基因庫登記號(hào)D83139)、煙草(基因庫登記號(hào)Y13465、Y13466)等的基團(tuán)。為了分離這樣一種公知的基因(其核苷酸序列已經(jīng)公知)，使用含有所需基因有機(jī)體的基因組DNA或cDNA作為模板和基于相當(dāng)于由該基因編碼的約蛋白質(zhì)N-和C-末端的核苷酸序列所產(chǎn)生的引物可以進(jìn)行PCR，從而擴(kuò)增所需的基因。此外，為了獲得其它PPO基因，例如首先根據(jù)上述方法由含有所需基因的有機(jī)體來構(gòu)建cDNA文庫。將該cDNA文庫引入Narita,S.等在《基因》(Gene)182；p169(1996)中所述的大腸桿菌PPO缺損突變體菌株VSR800，隨后進(jìn)行一種互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)以選擇含有衍生于所需有機(jī)體的PPO基因。此外，為了擴(kuò)增DNA片段，可以通過使用上述構(gòu)建的cDNA文庫作為模板和基于公知基因、諸如上述基因中保持良好的核苷酸序列制備的引物來進(jìn)行PCR。通過使用由此獲得的DNA片段作為探針對(duì)cDNA文庫進(jìn)行篩選以便選擇陽性克隆。所需PPO基因可以通過所選克隆核苷酸序列的序列測(cè)定而得到確認(rèn)。
為了獲得可編碼不具有氧化原卟啉原Ⅸ的能力而對(duì)原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的PPO變體的基因，例如通過引發(fā)核苷酸的取代、加成、缺失修飾等來誘變PPO基因并將所得修飾的基因引入上述大腸桿菌、其生長(zhǎng)通過用PPO抑制型除草化合物處理而受到光依賴性抑制。通過在氯高鐵血紅素、氨基乙酰丙酸和PPO抑制型除草化合物存在的情況下培養(yǎng)如此獲得的大腸桿菌可以選擇編碼具有原卟啉原Ⅸ結(jié)合能力的蛋白質(zhì)的基因，從而選擇一種甚至可在光下生長(zhǎng)的克隆。編碼對(duì)原卟啉原沒有氧化能力的蛋白質(zhì)的基因可以通過下列步驟來選擇在宿主、諸如大腸桿菌等中表達(dá)如此選擇的修飾基因以制備由該基因編碼的蛋白質(zhì)；并按照J(rèn)acob,N.J.和Jacobs,J.M.在《酶》(Enzyme)(1982)28,206-219所述的方法等測(cè)定其氧化原卟啉原Ⅸ的能力。更具體地說，將上述修飾的基因插入用于大腸桿菌的表達(dá)載體并引入大腸桿菌PPO基因(hemG基因座)缺失突變體、諸如Yamamoto,F.等在《日本遺傳雜志》(Japanese J.Genet.)63；p237(1988)中所述的大腸桿菌BT3菌株。將大腸桿菌在含有氯高鐵血紅素和氨基乙酰丙酸以及相當(dāng)于引入大腸桿菌的載體選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)以獲得轉(zhuǎn)化體。由該轉(zhuǎn)化體可以產(chǎn)生由修飾基因編碼的蛋白質(zhì)。此外，通過在基本上不含氯高鐵血紅素和氨基乙酰丙酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體可以獲得不補(bǔ)充宿主細(xì)胞PPO基因缺損的基因，從而鑒定未生長(zhǎng)的菌株。也可以將后一種方法用于選擇可編碼對(duì)原卟啉原Ⅸ不具有氧化能力的蛋白質(zhì)的基因。
此外，為了獲得可編碼PPO變體的基因、其中其中推定為PPO的FAD結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)(該區(qū)具有的氨基酸序列為GXGXXG，其中X是任意的氨基酸)被缺失，首先基于可編碼與該區(qū)有關(guān)的氨基酸序列的核苷酸序列來制備用于引發(fā)該區(qū)缺失突變的誘變引物。然后通過使用該誘變引物和如上所述的商購定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Mutan-Super Express,Takara Shuzo)來進(jìn)行PCR，從而獲得可編碼上述變體的蛋白質(zhì)的基因、其中該區(qū)已經(jīng)被缺失。
可以通過對(duì)用一種DNA合成儀合成的寡核苷酸進(jìn)行退火而獲得可編碼肽蛋白質(zhì)、諸如對(duì)原卟啉Ⅸ具有親和性的肽HASYS和RASSL以及對(duì)卟啉化合物具有親和性的肽YAGA和YAGF的基因等。
另外，通過下列方法等可以產(chǎn)生可編碼對(duì)其它雜草防治物質(zhì)具有親和性的未知肽蛋白質(zhì)的基因。例如，按照例如Sugimoto,N.,Nakano,S.在《化學(xué)通訊》(Chem.,Lett.)p939(1997)中所述的組合化學(xué)法等可以構(gòu)建各種肽文庫。從在對(duì)雜草防治物質(zhì)親和性指導(dǎo)下如此構(gòu)建的肽文庫中選擇肽，隨后用一種肽測(cè)序儀來分析該肽的氨基酸序列。由此，通過一種DNA合成儀可以合成編碼該肽的基因?？蛇x擇的情況是，提供對(duì)雜草防治物質(zhì)具有親和性的期限克隆(phase clone)可以通過按照噬菌體展示法選擇噬菌體文庫來獲得。特別地，例如通過將可編碼具有隨機(jī)氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核苷酸序列插入來自可編碼M13噬菌體基因包被蛋白質(zhì)pⅢ的區(qū)的上游而構(gòu)建提供在M13噬菌體顆粒表面上具有隨機(jī)氨基酸序列的蛋白質(zhì)的噬菌體文庫。另一方面，將用生物素標(biāo)記的雜草防治物質(zhì)與用親和素或鏈親和素包被的平板結(jié)合以制備一種用雜草防治物質(zhì)包被的支持物。通過在用雜草防治物質(zhì)包被的平板上篩選上述噬菌體文庫可以分離提供對(duì)雜草防治物質(zhì)具有親和性的所需蛋白質(zhì)的噬菌體且所需肽蛋白質(zhì)的基因可以從分離的噬菌體中獲得。
作為可編碼糞卟啉原Ⅲ氧化酶的基因，例如已經(jīng)公知那些衍生于大腸桿菌(基因庫登記號(hào)X75413)、鼠傷寒沙門氏菌(基因庫登記號(hào)L19503)、酵母釀酒酵母(基因庫登記號(hào)J03873)、小鼠(基因庫登記號(hào)D1633)、人(基因庫登記號(hào)D16333)、大豆(基因庫登記號(hào)X71083)、大麥(基因庫登記號(hào)X82830)、煙草(基因庫登記號(hào)X82831)等的基團(tuán)。為了分離這樣一種公知的基因(其核苷酸序列已經(jīng)公知)，通過使用含有所需基因有機(jī)體的基因組DNA或cDNA作為模板和基于相當(dāng)于由該基因編碼的約蛋白質(zhì)N-和C-末端的核苷酸序列所產(chǎn)生的引物可以進(jìn)行PCR，從而擴(kuò)增所需的基因。此外，為了獲得其它糞卟啉原Ⅲ氧化酶基因，例如首先通過下列步驟由含有所需基因的有機(jī)體來構(gòu)建cDNA文庫由所需有機(jī)體制備mRNA；使用mRNA作為模板與一種逆轉(zhuǎn)錄酶一起合成cDNA；并將它整合入一種質(zhì)粒載體、諸如Sikorski,R.S.等在《遺傳學(xué)》(Genetis)122；p19(1989)中所述的pRS313等?？梢詫⒃揷DNA文庫引入Troup,B.等在《細(xì)菌學(xué)》(Bacteriol.)176；p673(1994)中所述的酵母糞卟啉原Ⅲ氧化酶缺損突變體菌株HEM13，隨后進(jìn)行一種互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)以選擇含有衍生于所需有機(jī)體的糞卟啉原Ⅲ氧化酶的克隆。此外，為了擴(kuò)增DNA片段，可以通過使用上述構(gòu)建的cDNA文庫作為模板和基于公知基因、諸如上述基因中保持良好的核苷酸序列制備的引物來進(jìn)行PCR。通過使用由此獲得的DNA片段作為探針對(duì)cDNA文庫進(jìn)行篩選以便選擇陽性克隆。所需糞卟啉原Ⅲ氧化酶可以通過所選克隆核苷酸序列的序列測(cè)定而得到確認(rèn)。
為了獲得可編碼不具有氧化原卟啉原Ⅸ的能力而對(duì)原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的糞卟啉原(coporphyrinogen)Ⅲ氧化酶變體的基因，例如通過引發(fā)核苷酸的取代、加成、缺失修飾等來誘變糞卟啉原Ⅲ氧化酶基因并將所得修飾的基因引入上述大腸桿菌、其生長(zhǎng)通過用PPO抑制型除草化合物處理而受到光依賴性抑制。通過在氯高鐵血紅素、氨基乙酰丙酸和PPO抑制型除草劑存在的情況下培養(yǎng)如此獲得的大腸桿菌可以選擇編碼具有酚卟啉原Ⅸ結(jié)合能力的蛋白質(zhì)的基因，從而選擇一種甚至可在光下生長(zhǎng)的克隆。編碼對(duì)原卟啉原Ⅸ沒有氧化能力的基因可以通過下列步驟來選擇在宿主、諸如大腸桿菌等中表達(dá)如此選擇的修飾基因以制備由該基因編碼的蛋白質(zhì)；并按照J(rèn)acob,N.J.和Jacobs,J.M.在《酶》(Enzyme)(1982)28,206-219中所述的方法等測(cè)定其氧化原卟啉原Ⅸ的能力。
用于本發(fā)明方法第二個(gè)方面的基因是那些可編碼具有下列特征(a)至(c)的蛋白質(zhì)的基因(a)對(duì)原卟啉Ⅸ具有特異性親和性；(b)對(duì)原卟啉原Ⅸ基本不具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)。
特征(a)中術(shù)語對(duì)原卟啉Ⅸ的“特異性親和性”基本上與上述本發(fā)明方法的第一個(gè)方面中所述的內(nèi)容相同且指的是蛋白質(zhì)與原卟啉Ⅸ通過酶學(xué)方式相互結(jié)合、或蛋白質(zhì)與原卟啉Ⅸ基于如受體化學(xué)鍵中、諸如受體與配體間的一種鍵所示的親和性和特異性的相互結(jié)合等。就具有的特異性結(jié)合原卟啉Ⅸ的結(jié)構(gòu)來說，蛋白質(zhì)可以是天然出現(xiàn)的蛋白質(zhì)；將氨基酸的取代、加成、缺失修飾等引入天然出現(xiàn)的蛋白質(zhì)而獲得的其變體；以及具有在對(duì)原卟啉Ⅸ親和性的指導(dǎo)下所選擇的隨機(jī)氨基酸序列的人工合成蛋白質(zhì)。
在特征(b)中術(shù)語對(duì)原卟啉原Ⅸ“基本不具有修飾能力”指的是與蛋白質(zhì)的原卟啉Ⅸ的酶化學(xué)反應(yīng)是失活的或不存在。例如，這指的是蛋白質(zhì)不具有將原卟啉原Ⅸ轉(zhuǎn)化成具有不同于原卟啉原Ⅸ化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)的能力。
特征(c)中術(shù)語“基本上不含免疫球蛋白可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)”與上述本發(fā)明方法的第一個(gè)方面中所述的內(nèi)容相同且如上文所述蛋白質(zhì)不會(huì)形成對(duì)免疫球蛋白中的可變區(qū)具有特異性的立體結(jié)構(gòu)。
作為具有上述特征(a)至(c)的蛋白質(zhì)的特殊實(shí)例，有對(duì)原卟啉Ⅸ具有親和性的活性或失活型結(jié)合蛋白質(zhì)[例如底物是原卟啉Ⅸ的活性或失活型鎂螯合酶；活性或失活型鐵螯合酶；可催化與含有四吡咯環(huán)的化合物作為底物的鈷離子配位反應(yīng)的活性或失活型鈷螯合酶；肽、即對(duì)原卟啉Ⅸ具有親和性的由4-100個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(例如，含有至少選自對(duì)原卟啉Ⅸ具有親和性的肽HASYS中一種肽的蛋白質(zhì)、例如含有SEQ ID NO:53氨基酸序列的蛋白質(zhì)和含有SEQ IDNO:54氨基酸序列的蛋白質(zhì)；對(duì)原卟啉Ⅸ具有親和性的肽RASSL、即含有SEQ ID NO:55氨基酸序列的蛋白質(zhì)和含有SEQ ID NO:56氨基酸序列的蛋白質(zhì)；對(duì)卟啉化合物具有親和性的肽YAGA、例如含有SEQ ID NO:57氨基酸序列的蛋白質(zhì)和含有SEQ ID NO:58氨基酸序列的蛋白質(zhì)；對(duì)卟啉化合物具有親和性的肽YAGF、即含有SEQ IDNO:59氨基酸序列的蛋白質(zhì)和含有SEQ ID NO:60氨基酸序列的蛋白質(zhì)等)]；對(duì)原卟啉原Ⅸ具有親和性的失活型結(jié)合蛋白質(zhì)(例如，失活型PPO)等。
編碼上述蛋白質(zhì)的基因可以，例如，如下獲得活性型鎂螯合酶，由三種異源亞單位蛋白質(zhì)，即，原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)(H亞單位蛋白質(zhì))，I亞單位蛋白質(zhì)和D亞單位蛋白質(zhì)，其都是催化活性所必需的。三種獨(dú)立的亞單位蛋白質(zhì)由不同基因編碼。原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)基因可由PCR式篩選cDNA文庫獲得。
作用編碼鎂螯合酶的I亞單位蛋白質(zhì)的基因，例如，那些衍生于光合細(xì)菌，類球紅細(xì)菌(基因庫編號(hào)AF017642)，類膜紅細(xì)菌(基因庫編號(hào)Z11165)。擬南芥(基因庫編號(hào)D49426)，大麥(基因庫編號(hào)U26545)，大豆(基因庫編號(hào)D45857)，煙草(基因庫編號(hào)AF14053),Synechocytis P.C.C.6803(基因庫編號(hào)U35144)等是公知的，使用具所需基因的生物體的基因組DNA式cDNA為模板，基于對(duì)應(yīng)于所需基因編碼的蛋白的N式C端核苷酸序列而產(chǎn)生的模板PCR。此外，編碼鎂螯合酶的I亞單位蛋白質(zhì)的基因可從上述以外的光合生物中獲得。例如，首先，從所需光合生物體中獲得mRNA，用反轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成cDNA，將cDNA整合到噬菌體載體如IAPⅡ等，或當(dāng)質(zhì)粒載體如PUC等構(gòu)建cDNA庫。為了擴(kuò)增含有編碼鎂螯合酶I亞單位蛋白質(zhì)的編碼基因的至少一部分的DNA片段，使用上述構(gòu)建的cDNA文庫做為模板，以及基于在上述基因中已知是保守的核苷酸序列設(shè)計(jì)和合成的引物進(jìn)行PCR。通過使用如此獲得的DNA片段為探針來選擇陽性克隆而進(jìn)行cDNA文庫篩選。鎂螯合酶的I亞單位蛋白質(zhì)的所需基團(tuán)可通過確定選定克隆的核苷酸序列而確認(rèn)。
作為編碼鎂螯合酶的D亞單位蛋白的基因，例如，那些衍生自光合細(xì)菌，類球紅細(xì)菌(基因庫編號(hào)AJ001690)，類膜紅細(xì)菌(基因庫編號(hào)Z11165)，豌豆(基因庫編號(hào)AF014399)，煙草(基因庫編號(hào)Y10022)，Synechocystis P.C.C.6803(基因庫編號(hào)X95699)等是已知的。這樣已知基因(其核苷酸序列是已知的；或上述基因以外基因之分離，可以如編碼鎂螯合劑I亞單位蛋白質(zhì)的同樣方式獲得。
用于本發(fā)明方法第三個(gè)方面的基因是那些可編碼具有至少下列特征(a)至(c)的蛋白質(zhì)的基因(a)對(duì)原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性；(b)對(duì)糞卟啉原Ⅲ具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)。
特征(a)中術(shù)語對(duì)原卟啉原Ⅸ的“特異性親和性”基本上與上述本發(fā)明方法的第一個(gè)或第二個(gè)方面中所述的內(nèi)容相同且指的是蛋白質(zhì)與原卟啉原Ⅸ通過酶方式相互結(jié)合、或蛋白質(zhì)與原卟啉原Ⅸ基于如受體化學(xué)鍵中、諸如受體與配體間的一種鍵所示的親和性和特異性的相互結(jié)合等。就具有的特異性結(jié)合原卟啉原Ⅸ的結(jié)構(gòu)來說，蛋白質(zhì)可以是天然出現(xiàn)的蛋白質(zhì)；將氨基酸的取代、加成、缺失、修飾等引入天然出現(xiàn)的蛋白質(zhì)而獲得的其變體；以及具有在對(duì)原卟啉原Ⅸ親和性的指導(dǎo)下所選擇的隨機(jī)氨基酸序列的人工合成蛋白質(zhì)。
在特征(b)中術(shù)語“對(duì)糞卟啉原Ⅲ具有修飾能力”指的是與蛋白質(zhì)的糞卟啉原Ⅲ的酶化學(xué)反應(yīng)是失活的。例如，這指的是蛋白質(zhì)具有將糞卟啉原Ⅲ轉(zhuǎn)化成具有不同于糞卟啉原Ⅲ化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)的能力。
術(shù)語“基本上不含免疫球蛋白可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)”與上述本發(fā)明方法的第一個(gè)或第二個(gè)方面中所述的內(nèi)容相同且如上文所述蛋白質(zhì)不會(huì)形成對(duì)免疫球蛋白中的可變區(qū)具有特異性的立體結(jié)構(gòu)。
作為具有至少上述特征(a)至(c)之一的蛋白質(zhì)的特殊實(shí)例，有對(duì)原卟啉原Ⅸ具有親和性的活性或失活型結(jié)合蛋白質(zhì)，例如底物是原卟啉原Ⅸ的活性類糞卟啉原Ⅲ氧化酶等。
作為參考，鎂螯合酶，鐵螯合酶，鐵螯合酶或糞卟啉原Ⅲ氧化酶的活性可通過下列方法測(cè)量。
(1)鎂螯合酶編碼獨(dú)立三個(gè)亞基蛋白質(zhì)的基因被用于按Gibson.L.C.D等的方法檢測(cè)鎂螯合酶(美國(guó)國(guó)立科學(xué)院院報(bào)92；p1941(1995))等。
(2)鐵螯合酶鐵螯合酶活性可以例如按Porra.R.J(分析生物化學(xué)68；p289(1975))等檢測(cè)。
(3)糞卟啉原Ⅲ氧化酶糞卟啉原Ⅲ氧化酶活性可以例如按Yoshinaga,J.,Sano.S.，等方法檢測(cè)(生物化學(xué)雜志255；p4722(1980))。
在本發(fā)明的方法(包括上述第一至第三個(gè)方面)中，為了將編碼具有特征(a)至(c)的蛋白質(zhì)的基因引入植物細(xì)胞，可以引入可編碼一種蛋白質(zhì)的基因。此外，可以將編碼不同蛋白質(zhì)的多個(gè)基因引入植物細(xì)胞。可以通過常規(guī)的基因工程技術(shù)來進(jìn)行這類將基因引入植物細(xì)胞的過程，例如農(nóng)桿菌屬感染法(JP-B2-58917和JP-A60-70070)、進(jìn)入原生質(zhì)體的電穿孔法(JP-A60-251887和JP-A5-68575)、基因槍法(JP-A5-508316和JP-A63-258525)等。優(yōu)選的情況是，將引入植物細(xì)胞的基因整合入含有選擇標(biāo)記基因的載體，所述含有選擇標(biāo)記的基因諸如可以使植物細(xì)胞對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑產(chǎn)生耐受性的基因。
為了要植物細(xì)胞中表達(dá)該基因，可以通過同源重組將基因引入植物細(xì)胞的染色體[Fraley,R.T.等，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acd.Sci.USA),80；p4803(1983)]以選擇表達(dá)該基因的植物細(xì)胞。可選擇的情況是，以這樣一種形式將基因引入植物細(xì)胞、即以可操作的方式將它與均可以在植物細(xì)胞中起作用啟動(dòng)子和終止子連接。
本文所用的術(shù)語“可操作地連接”指的是上述啟動(dòng)子和終止子以這樣一種形式連接、即在植物細(xì)胞中將引入的基因在該啟動(dòng)子和該終止子的控制下進(jìn)行表達(dá)的方式。
作為可以在植物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子，例如有衍生于T-DNA的組成型啟動(dòng)子，諸如胭脂氨酸合酶基因啟動(dòng)子、章魚氨酸合酶基因啟動(dòng)子等；衍生于植物病毒的啟動(dòng)子，諸如衍生于花椰菜花葉病毒的19S和35S啟動(dòng)子等；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，諸如苯丙氨酸脫氨酶基因啟動(dòng)子、抑素合酶基因啟動(dòng)子、與病理相關(guān)的蛋白質(zhì)基因啟動(dòng)子等；以及類似的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子不限于這些啟動(dòng)子且可以使用其它的啟動(dòng)子。
作為可以在植物細(xì)胞中起作用的終止子，例如由有衍生于T-DNA的終止子，諸如胭脂氨酸合酶終止子等；衍生于植物病毒的終止子，諸如衍生于大蒜病毒GV1、GV2等的終止子等。終止子不限于這些終止子且可以使用其它的終止子。
作為引入基因的植物細(xì)胞，例如有植物組織、完整植物體、培養(yǎng)的細(xì)胞、種子等。引入基因的植物物種的實(shí)例包括諸如煙草、棉花、油菜子、制糖甜菜、擬南芥菜、canola、亞麻、向日葵、馬鈴薯、苜蓿、萵苣屬、香蕉、大豆、豌豆、莢果、松屬、楊樹、蘋果、葡萄、桔果、堅(jiān)果等這樣的雙子葉植物以及諸如玉米、稻、小麥、大麥、黑麥、燕麥、高粱屬、甘蔗、菌苔等這樣的單子葉植物。
表達(dá)基因的轉(zhuǎn)化體植物細(xì)胞可以通過下列步驟獲得、其中所述的基因可編碼具有(a)至(c)特征之一的結(jié)合蛋白質(zhì)在相當(dāng)于與基因上基因座連接的選擇標(biāo)記的選擇培養(yǎng)基(例如，含有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑的培養(yǎng)基等)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)入了基因的細(xì)胞；并分離能夠在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的克隆?？蛇x擇的情況是，通過下列步驟可以選擇上述轉(zhuǎn)化體植物細(xì)胞在含有產(chǎn)生耐受性雜草防治化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)引入了基因的植物細(xì)胞并分離能夠在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的克隆。所需耐雜草防治化合物植物可以由轉(zhuǎn)化體細(xì)胞獲得，所述的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞通過按照(例如)《用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法》(Method for Producing TransgenicPlants)的“植物基因操作說明”(Plant Gene Manipulation Manual)(UCHIMIYA，Kodansha Scientmc(1996))中所述的常規(guī)植物細(xì)胞培養(yǎng)法使植物體再生而獲得。因此，可以獲得轉(zhuǎn)化的植物，轉(zhuǎn)入植物組織、植物個(gè)體、培養(yǎng)的細(xì)胞、種子等。
例如，按照《模型植物的實(shí)驗(yàn)方案》(Experimental Protocol of ModelPlants)-《稻米和擬南芥菜》版(Rice and Mouse-Ear Cress Edition)(監(jiān)制人Koh SHIMAMOTO和Kiyotaka OKADA,Shuzun-sha,1996)第4章所述的方法可以獲得表達(dá)可編碼上述蛋白質(zhì)的基因的稻米和擬南芥菜。此外，按照J(rèn)P-A3-291501中所述的方法，通過用一種基因槍將基因引入大豆無定形胚而獲得表達(dá)可編碼結(jié)合蛋白質(zhì)的基因的大豆。同樣，按照Fromm,M.E.等在《生物/技術(shù)》(Bio/Tchnology)8；p838(1990)中所述的方法，通過用一種基因槍將基因引入無定形胚可以獲得表達(dá)可編碼上述蛋白質(zhì)的基因的棉花。按照TAKUMI等在《繁殖協(xié)會(huì)雜志》(Journal of Breeding Society)(1995)44附卷1,p57中所述的常規(guī)方法，通過用一種基因槍將基因引入無菌培養(yǎng)的小麥未成熟鱗片可以獲得表達(dá)可編碼上述蛋白質(zhì)的基因的小麥。同樣，按照HAGIO等在《繁殖協(xié)會(huì)雜志》(Journal of Breeding Society)(1995)44附卷1,p67中所述的常規(guī)方法，通過用一種基因槍將基因引入大麥的未成熟鱗片可以獲得表達(dá)可編碼上述蛋白質(zhì)的基因的大麥。
為了證實(shí)表達(dá)可編碼上述蛋白質(zhì)的基因的植物對(duì)雜草防治化合物的耐受性，優(yōu)選通過施用產(chǎn)生耐受性的雜草防治化合物以評(píng)價(jià)植物生殖的程度而使植物再生。為了更加定量地進(jìn)行證實(shí)，例如就具有PPO抑制型除草活性的化合物的耐受性來說，優(yōu)選將植物的葉片浸入不同濃度的含有具有PPO抑制型除草活性的化合物的水溶液中、或?qū)⒑芯哂谐莼钚缘幕衔锏乃芤簢娫谥参锏娜~片上，隨后在室溫和光下使之維持在瓊脂培養(yǎng)基上。幾天后，按照Mackenney,G.在《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)140,p315(1941)中所述的方法從植物的葉中提取葉綠素以測(cè)定葉綠素的含量。
由于通過本發(fā)明方法(包括第一至第三個(gè)方面)獲得的耐雜草防治化合物植物(例如植物組織、植物個(gè)體、培養(yǎng)的細(xì)胞、種子等)表現(xiàn)出對(duì)雜草防治化合物的耐受性，所以甚至在將雜草防治化合物施用于生長(zhǎng)區(qū)(例如栽培區(qū)、繁殖區(qū)等)的情況下，該植物仍可以生長(zhǎng)。由此，當(dāng)將雜草防治化合物施用于所需耐雜草防治化合物植物的生長(zhǎng)區(qū)時(shí)，可使所需植物避免對(duì)雜草防治植物沒有耐受性的不利影響。例如，通過在對(duì)雜草防治化合物具有耐受性的植物的生長(zhǎng)區(qū)噴灑雜草防治化合物可以有效地控制雜草。
此外，通過對(duì)用本發(fā)明方法(包括第一至第三個(gè)方面)獲得的耐雜草防治化合物植物和其它植物(例如那些對(duì)雜草防治化合物沒有或具有弱耐受性的植物)的生長(zhǎng)區(qū)施用雜草防治化合物，可以根據(jù)生長(zhǎng)中的差異來選擇這些植物之一。例如，通過對(duì)用本發(fā)明方法獲得的耐雜草防治化合物植物和其它植物(例如那些對(duì)雜草防治化合物沒有或具有弱耐受性的植物)的栽培區(qū)施用(添加)雜草防治化合物，可以根據(jù)生長(zhǎng)中的差異來有效地選擇這些植物細(xì)胞之一。
下面的實(shí)施例更進(jìn)一步來解釋本發(fā)明，但它們不用來限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)基因的分離使用用于基因組DNA制備的ISOPLANT試劑盒(由Nippon Gene生產(chǎn))來制備光合細(xì)菌類球紅細(xì)菌ATCC17023的基因組DNA。然后，按照Gibson,L.C.D.等在《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.USA)92；p1951(1995)中所述，通過使用約1μg所述基因組DNA作為模板以及10pmol由SEQ ID NO:1代表的核苷酸序列組成的寡核苷酸和10pmol由SEQ ID NO:2代表的核苷酸序列組成的寡核苷酸作為引物來進(jìn)行PCR，從而擴(kuò)增含有鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)基因bchH的DNA片段。用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394DNA/RNA合成儀)來制備寡核苷酸并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)它進(jìn)行純化。通過下列步驟來進(jìn)行PCR反應(yīng)在94℃下維持2分鐘、在96℃下維持40秒且然后在68℃下維持7分鐘；將在96℃下維持40秒且然后在68℃維持7分鐘的一個(gè)循環(huán)重復(fù)28次；且最后在96℃下維持40秒、在68℃下維持7分鐘且然后在72℃下維持10分鐘。
實(shí)施例2大腸桿菌(下文縮寫為E.coli)中鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)基因的表達(dá)按照Gibson,L.C.D.等在《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.USA)92；p1941(1995)中所述，用限制酶NdeⅠ和BglⅡ來消化實(shí)施例1中制備的含有bchH基因的DNA片段。將所得DNA片段插入表達(dá)載體pET11a(由Stratagene生產(chǎn))的NdeⅠ限制位點(diǎn)與BamHⅠ限制位點(diǎn)之間以獲得質(zhì)粒pETBCH(附圖1)。按照與感受態(tài)細(xì)胞相關(guān)的操作指南將這種質(zhì)粒pETBCH引入大腸桿菌BL21(DE3)菌株感受態(tài)細(xì)胞(由Stratagene生產(chǎn))，從而獲得大腸桿菌BL21(DE3)/pETBCH菌株。將該菌株接種入試管(14×10mm)內(nèi)含有100μg/ml氨芐青霉素的1.5ml LB液體培養(yǎng)基(1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)，將該試管用鋁箔覆蓋(下文稱作在黑暗條件下)，在37℃、熒光燈(約8000勒)的光下通過振搖進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)液體培養(yǎng)基在600nm處的吸收度變?yōu)榧s0.6時(shí)，將異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)加入到液體培養(yǎng)基中，使得最終的濃度為0.4mM，并將該培養(yǎng)過程另外持續(xù)約20小時(shí)。此后，大腸桿菌變紅并且觀察到表現(xiàn)原卟啉Ⅸ在大腸桿菌中蓄積的熒光吸收(激發(fā)波長(zhǎng)405nm，熒光波長(zhǎng)630nm)。除不加入IPTG外，當(dāng)按照相同的方式培養(yǎng)大腸桿菌BL21(DE3)/pETBCH菌株時(shí)，大腸桿菌沒有變紅并且沒有檢測(cè)到上述熒光吸收。與此相反，除不用鋁箔覆蓋(下文稱作光條件)外，當(dāng)按照相同的方式(含有IPTG)培養(yǎng)大腸桿菌BL21(DE3)/pETBCH菌株時(shí)，大腸桿菌生長(zhǎng)并且如上所述變紅。
實(shí)施例3衍生于大豆的PPO基因在hemG基因缺損大腸桿菌中的表達(dá)將大豆(甘氨酸最大變種Williams82)種植且在25℃下培養(yǎng)20天并收集綠葉。用液氮冷凍收集的綠葉并用研杵和研缽研磨冷凍的綠葉。通過使用RNA提取試劑ISOGEN(由Nippon Gene生產(chǎn))、按照附于其中的操作指南從磨碎的葉中提取RNA。將所得RNA液體提取物進(jìn)行乙醇沉淀以收集總RNA，然后通過使用聚腺苷酸RNA分級(jí)分離試劑盒即BIOMAG mRNA純化試劑盒(由Perceptive Bio System生產(chǎn))、按照附于其中的操作指南來對(duì)總RNA進(jìn)行分級(jí)分離以收集聚腺苷酸RNA級(jí)分。使用1μg這種聚腺苷酸RNA級(jí)分作為模板，用MarathoncDNA擴(kuò)增試劑盒(由Clothech生產(chǎn))中含有的cDNA合成試劑、按照附于其中的操作指南來合成cDNA。通過使用所得cDNA作為模板和由SEQ ID NO:3核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:4核苷酸序列組成的寡核苷酸作為引物來進(jìn)行PCR以擴(kuò)增含有葉綠體類原卟啉原Ⅸ氧化酶基因的DNA片段。用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394DNA/RNA合成儀)制備上述寡核苷酸并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC注)對(duì)其進(jìn)行純化。通過下列步驟來進(jìn)行PCR反應(yīng)在94℃下維持1分鐘且然后在65℃下維持5分鐘；將在94℃下維持15秒且然后在65℃維持5分鐘的一個(gè)循環(huán)重復(fù)29次。PCR反應(yīng)后，通過用MicroSpin S-400HR(由Pharmacia Biotech生產(chǎn))過濾反應(yīng)混合物而對(duì)擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行純化，并將該DNA片段與由限制酶SalⅠ切割的質(zhì)粒pCR2.1(由Invitrogen生產(chǎn))連接以獲得質(zhì)粒pSPPO-P。然后，將該質(zhì)粒引入大腸桿菌INVαF’菌株(由Invitrogen生產(chǎn))的感受態(tài)細(xì)胞并選擇耐氨芐青霉素菌株。接著，通過使用染料終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒(由PE應(yīng)用生物系統(tǒng)生產(chǎn))和DNA測(cè)序儀373S(由PE應(yīng)用生物系統(tǒng)生產(chǎn))來對(duì)所選耐氨芐青霉素菌株中含有的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示出了SEQ ID NO:5的核苷酸序列，由此證實(shí)質(zhì)粒pSPPO-P含有大豆的葉綠體類原卟啉原Ⅸ氧化酶基因。
用限制酶PshBⅠ消化質(zhì)粒pSPPO-P，通過使用T4DNA聚合酶使所得DNA片段鈍端化并進(jìn)一步用SphⅠ消化以分離含有大豆的葉綠體類PPO基因和lac啟動(dòng)子的DNA片段。然后，用限制酶NruⅠ和SphⅠ來消化質(zhì)粒pACYC184(由Nippon Gene生產(chǎn))以除去410bp的片段而代之插入上述DNA片段以獲得質(zhì)粒pACYCSP(附圖2)。接著，按照Hanahan,D.J.在《分子生物學(xué)》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，將質(zhì)粒pACYCSP引入PPO基因(hemG基因的基因座)缺損突變體大腸桿菌BT3菌株(Yamamoto,F.等在《日本遺傳學(xué)雜志》(Japanese J.Genet.)63；p237(1988)等)。在含有15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培養(yǎng)基(5g/升酵母(east)提取物、5g/升胰化蛋白胨、5g/升胨、10g/升NaCl,pH7.0)中培養(yǎng)所得大腸桿菌以選擇對(duì)氯霉素和卡那霉素具有耐受性的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株，通過衍生于大豆的PPO基因?qū)ζ鋒emG基因缺損進(jìn)行了補(bǔ)充。
實(shí)施例4產(chǎn)生雜草防治混合物耐受性能力的鎂螯合酶原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)的試驗(yàn)將實(shí)施例3中制備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株接種入YPT培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有10或1ppm的由上述結(jié)構(gòu)8所代表的PPO抑制型除草化合物、10μg/ml氯高鐵血紅素、50μg/ml氨基乙酰丙酸、15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素；按照與實(shí)施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進(jìn)行培養(yǎng)。作為對(duì)照組，在同樣條件下，在與上述不含除草化合物的相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。然后，在培養(yǎng)開始18小時(shí)后，在600nm處測(cè)定液體培養(yǎng)基的吸收度。將不含除草化合物的培養(yǎng)基的吸收度看作1，計(jì)算含有除草化合物培養(yǎng)基的吸收度的相應(yīng)值。結(jié)果如表1中所示。
表1
通過下列步驟來構(gòu)建質(zhì)粒pTVBCH(附圖3)使用由SEQ ID NO:1核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:2核苷酸序列組成的寡核苷酸、按照與實(shí)施例1中相同的方式來擴(kuò)增含有衍生于光合細(xì)菌類球紅細(xì)菌的bchH基因的DNA片段；用限制酶NcoⅠ和BglⅡ來消化所得DNA片段并將消化的DNA片段引入質(zhì)粒pTV118N(由Takara ShuzoCo.,Ltd.生產(chǎn))的NcoⅠ限制位點(diǎn)與BamHⅠ限制位點(diǎn)之間。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學(xué)》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法將質(zhì)粒pTVBCH和pTV118N引入實(shí)施例3中制備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。在含有100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得大腸桿菌以獲得具有質(zhì)粒pACYCSP和pTVBCH的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTVBCH菌株以及具有質(zhì)粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些菌株接種入YPT培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有10或1ppm的由上述結(jié)構(gòu)8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照與實(shí)施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進(jìn)行培養(yǎng)。然后，在培養(yǎng)開始后18小時(shí)，在600nm處測(cè)定液體培養(yǎng)基的吸收度。將不含除草化合物的培養(yǎng)基的吸收度看作1，計(jì)算含有除草化合物培養(yǎng)基的吸收度的相應(yīng)值。結(jié)果如表2中所示。
表2
此外，將運(yùn)些菌株接種入YPT培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有分別由上述結(jié)構(gòu)1、14、15、18-22、29、32、33、34和36所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照與實(shí)施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進(jìn)行培養(yǎng)。然后，在培養(yǎng)開始18小時(shí)后，在600nm處測(cè)定液體培養(yǎng)基的吸收度。將不含除草化合物的培養(yǎng)基的吸收度看作1，計(jì)算含有除草化合物培養(yǎng)基的吸收度的相應(yīng)值。結(jié)果如表3中所示。
表3
<p>實(shí)施例5將編碼鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)的基因引入煙草通過農(nóng)桿菌屬感染法構(gòu)建用于將bchH基因引入植物的質(zhì)粒。首先，用限制酶SacⅠ消化二元載體pBI121(由Clonetech生產(chǎn))，并插入KpnⅠ接頭(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產(chǎn))以制備質(zhì)粒pBIK，其中除去pBI121的SacⅠ識(shí)別位點(diǎn)而添加KpnⅠ識(shí)別位點(diǎn)。另一方面，按照與實(shí)施例1中所述相同的方式，通過使用光合細(xì)菌類球紅細(xì)菌作為模板以及由SEQ ID NO:7核苷酸序列組成的寡核苷酸引物和由SEQ IDNO:8核苷酸序列組成的寡核苷酸引物來進(jìn)行PCR，從而擴(kuò)增含有bchH基因的DNA片段。然后，用限制酶XbaⅠ和KpnⅠ消化上述質(zhì)粒pBIK以除去β-葡糖苷酸酶基因、并替換，將通過用限制酶XbaⅠ和KpnⅠ消化上述含有bchH基因的DNA片段而獲得的DNA片段插入以產(chǎn)生質(zhì)粒pBIBCH(附圖4)，其中bchH基因與來自35S啟動(dòng)子的下游連接。還用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化二元載體pBI121(由Clonetech生產(chǎn))以除去β-葡糖苷酸酶基因，通過使用T4 DNA聚合酶使所得DNA片段鈍端化，隨后用TADNA連接酶自環(huán)化以構(gòu)建質(zhì)粒pNO(附圖5)。將該質(zhì)粒用作bchH表達(dá)質(zhì)粒pBIBCH的載體對(duì)照。
分別將質(zhì)粒pBIBCH和pNO引入根癌土壤桿菌LBA4404。通過在含有300μg/ml鏈霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化體并選擇所需轉(zhuǎn)化體而將具有pBIBCH的土壤桿菌屬菌株和具有pNO的土壤桿菌屬菌株進(jìn)行分離。
然后，按照“植物基因的基因操作說明”(Manual for Plant Gene ofGene Manipulation)(Hirofumi UCHIMIYA,Kodan-sha Scientific,1992)中所述的方法，將基因引入煙草。在28℃下將具有質(zhì)粒pBIBCH的土壤桿菌屬(Abrobacterium)菌株在LB培養(yǎng)基(0.5％酵母提取物、1.0％細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨、0.5％NaCl)培養(yǎng)過夜且然后將無菌培養(yǎng)的煙草葉片浸入液體培養(yǎng)基中。在室溫下將葉片在含有0.8％瓊脂、0.1mg/升萘乙酸和0.1mg/ml芐基氨基嘌呤的Murashige-Skoog培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，Murashige T.和Skoog F.在《植物生理學(xué)》(Physiol.Plant.)(1962)15,p473中所述)培養(yǎng)2天。接著，將葉片用無菌水洗滌并在含有0.8％瓊脂、0.1mg/升萘乙酸、0.1mg/升芐基氨基嘌呤和500μg/ml頭孢氨噻的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天。將該葉片移植到含有0.8％μg/ml頭孢氨噻的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天。將該葉片移植到含有0.8％瓊脂、0.1mg/升萘乙酸、0.1％mg/升芐基氨基嘌呤、500μg/ml頭孢氨噻和100μg/ml卡那霉素的MS培養(yǎng)基(下文稱作選擇性MS培養(yǎng)基)上并通過每1個(gè)月將煙草葉片移植到新鮮選擇性MS培養(yǎng)基上的方式在培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)4個(gè)月。在培養(yǎng)期間，從煙草葉片中出現(xiàn)莖-葉分化的嫩枝，將這些嫩枝移植到含有0.8％瓊脂、300μg/ml頭孢氨噻和50μg/ml卡那霉素的MS培養(yǎng)基上并將根制成再生的個(gè)體。將所得再生的個(gè)體移植到含有0.8％瓊脂和50μg/ml卡那霉素的MS培養(yǎng)基上并培養(yǎng)以獲得引入了bchH基因的煙草個(gè)體。類似地，用具有pNO的農(nóng)桿菌屬菌株感染煙草葉片以由煙草葉片和煙草個(gè)體獲得再生的個(gè)體(下文稱作對(duì)照重組煙草)。
實(shí)施例6具有可編碼鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)的引入基因的煙草對(duì)除草化合物的耐受性的試驗(yàn)分別收集引入了bchH基因的煙草葉和實(shí)施例5中獲得的重組煙草葉并沿主脈將葉各自分成左右相等的片。對(duì)一片施用含有0.3ppm的結(jié)構(gòu)8的PPO抑制型除草化合物的水溶液，而對(duì)另一片不施用該化合物。將這些葉片放在含有0.8％瓊脂的MS培養(yǎng)基上并使之在光處、室溫下維持7天。然后，用研杵和研缽將每一葉片在5ml 80％的丙酮水溶液中研磨以提取葉綠素。按照Macknney G.在《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)(1941)140,p315中所述的方法用80％的丙酮水溶液稀釋該提取液并在750nm、663nm和645nm處測(cè)定吸收度以計(jì)算總?cè)~綠素含量。將從引入了bchH基因煙草的4個(gè)克隆中獲得的結(jié)果(BCH1-4)和對(duì)照重組煙草的結(jié)果列在表4中。在該表中，對(duì)除草化合物的耐受程度通過用除草化合物處理葉片的總?cè)~綠素含量與未處理葉片的總?cè)~綠素含量之比的百分?jǐn)?shù)來表示。
表4
按照相同的方式用含有由上述結(jié)構(gòu)3、7、10、11、13、17、23、24、25、27、28、30或35所代表的PPO抑制型除草化合物的溶液處理引入了bchH基因的煙草克隆和對(duì)照重組煙草，并測(cè)定對(duì)每一除草化合物的耐受程度。結(jié)果如表5中所示。在該表中，對(duì)除草化合物的耐受程度通過用除草化合物處理葉片的總?cè)~綠素含量與未處理葉片的總?cè)~綠素含量之比的百分?jǐn)?shù)來表示。
表5
實(shí)施例7分離可編碼煙草鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)變體的基因使用Rneasy植物試劑盒(由QIAGEN生產(chǎn))、按照附于其中的操作指南由煙草的葉組織(煙草變種(Nicotiana tabacum cv.SR1)制備總RNAs。通過使用RNALAPCR試劑盒(AMV)Ver1.1(Taraka ShuzoCo.,Ltd.生產(chǎn))、按照附于其中的操作指南來獲得DNA片段，它含有可編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)已經(jīng)缺失的煙草鎂螯合酶原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白質(zhì)的基因(下文稱作煙草螯合酶亞單位變體)。首先，通過使用煙草總RNAs作為模板和上述試劑盒中含有的寡核苷酸dT-銜接頭引物作為引物與上述試劑盒中含有的逆轉(zhuǎn)錄酶一起來合成第一鏈cDNA。然后，通過使用第一鏈cDNA作為模板和上述試劑盒中含有的LA Taq聚合酶來進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，它含有可編碼煙草螯合酶亞單位變體的基因。在這種PCR中，使用的是由SEQ ID NO:9的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物和由SEQ ID NO:10的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物。通過使用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸并用移植寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)其進(jìn)行純化。通過下列步驟來進(jìn)行PCR反應(yīng)在94℃下維持2分鐘且然后將在94℃下維持30秒、在50℃下維持30秒且然后在72℃維持7分鐘的一個(gè)循環(huán)重復(fù)30次。PCR反應(yīng)后，通過使用TA克隆試劑盒(Invitrogen生產(chǎn))、按照附于其中的操作指南將PCR反應(yīng)擴(kuò)增的DNA片段克隆入質(zhì)粒pCR2.1。用限制酶KpnⅠ消化所得質(zhì)粒并通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。將來自所檢測(cè)的8.0kbDNA片段的質(zhì)粒稱作pTCHLH。該質(zhì)粒具有這樣一種結(jié)構(gòu)、即在lac啟動(dòng)子控制下已經(jīng)以定向表達(dá)的方式插入了可編碼煙草螯合酶亞單位的基因。用限制酶KpnⅠ消化質(zhì)粒pTCHLH，隨后進(jìn)行自身連接，從而獲得質(zhì)粒pTCHLH1(附圖6)，其中由約60個(gè)核苷酸組成的DNA片段已經(jīng)從質(zhì)粒pTCHLH中缺失。
實(shí)施例8對(duì)除草化合物生產(chǎn)耐受性能力的煙草螯合酶亞單位變體的試驗(yàn)按照Hanahan,D.J.在《分子生物學(xué)》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，分別將實(shí)施例7中制備的質(zhì)粒pTCHLH1和pCR2.1引入實(shí)施例3中制備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100Pg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的YPT培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述菌株而分別獲得具有質(zhì)粒pACYCSP和pTCHLH1的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTCHLH1菌株以及具有質(zhì)粒pACYCSP和pCR2.1的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pCR2.1菌株。
將這些菌株接種入YPT培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有10或1ppm的由上述結(jié)構(gòu)8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照與實(shí)施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進(jìn)行培養(yǎng)。然后，在培養(yǎng)開始18小時(shí)后，在600nm處測(cè)定液體培養(yǎng)基的吸收度。將不含除草化合物的培養(yǎng)基的吸收度看作1，計(jì)算含有除草化合物培養(yǎng)基的吸收度的相應(yīng)值。結(jié)果如表6中所示。
表6
實(shí)施例9將可編碼煙草鎂螯合酶亞單位變體的基因引入煙草構(gòu)建通過農(nóng)桿菌屬感染法將可編碼煙草鎂螯合酶亞單位蛋白質(zhì)的基因引入煙草的質(zhì)粒。首先，通過用限制酶KpnⅠ和SalⅠ消化實(shí)施例7中制備的質(zhì)粒pTVBCH1來制備DNA片段，它含有可編碼煙草鎂螯合酶亞單位蛋白質(zhì)變體的基因。另一方面，用限制酶SamⅠ消化二元載體pBI121(由Clonetech生產(chǎn))并將KpnⅠ接頭(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產(chǎn))插入這部分以制備質(zhì)粒pBI121K，其中除去pBI121的SmaⅠ識(shí)別位點(diǎn)而添加KpnⅠ識(shí)別位點(diǎn)。用限制酶SacⅠ消化質(zhì)粒pBI121K，隨后通過用DNA聚合酶Ⅰ將核苷酸添加到雙鏈DNA缺口上而使DNA鈍端化。然后，用衍生于牛腸的堿性磷酸酶使DNA去磷酸化并通過插入磷酸化SalⅠ接頭(4680P，由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產(chǎn))而使之環(huán)化，從而構(gòu)建質(zhì)粒pBI121KS。用限制酶KpnⅠ和SalⅠ消化二元載體pBI121KS以除去β-葡糖醛酸酶(β-glucronidase)基因并將編碼煙草螯合酶亞單位的基因插入這部分以制備質(zhì)粒pBITCHLH(附圖7)。
將質(zhì)粒pBITCHLH引入根癌土壤桿菌LBA4404。在含有300μg/ml鏈霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，隨后選擇所需的轉(zhuǎn)化體以分離具有pBITCHLH的農(nóng)桿菌屬菌株。
用農(nóng)桿菌屬菌株感染無菌培養(yǎng)的煙草葉片并按照與實(shí)施例5中相同的方式獲得引入了可編碼煙草鎂螯合酶亞單位蛋白質(zhì)變體的基因的煙草。
實(shí)施例10具有可編碼煙草鎂螯合酶亞單位蛋白質(zhì)變體的引入基因的煙草對(duì)除草化合物耐受性的確認(rèn)按照與實(shí)施例6中相同的方式、通過檢測(cè)實(shí)施例9中制備的引入了可編碼煙草鎂螯合酶亞單位蛋白質(zhì)變體的基因的煙草而定量地確定對(duì)除草化合物的耐受程度。
實(shí)施例11分離編碼對(duì)原卟啉原Ⅸ沒有氧化能力而對(duì)原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的大豆PPO蛋白質(zhì)變體的基因通過下列方式進(jìn)行PCR使用實(shí)施例3中制備的質(zhì)粒pSPPO-P作為模板和由SEQ ID NO:11的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ IDNO:12的核苷酸序列組成的寡核苷酸作為引物，從而擴(kuò)增DNA片段，它可編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)和FAD結(jié)合序列已經(jīng)缺失的大豆PPO(下文稱作大豆PPO變體)。用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394DNA/RNA合成儀)來制備寡核苷酸并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)它進(jìn)行純化。通過將在94℃下維持1分鐘、在55℃下維持2分鐘且然后在72℃下維持3分鐘的一個(gè)循環(huán)重復(fù)30次來進(jìn)行PCR反應(yīng)。用限制酶NcoⅠ和SalⅠ消化擴(kuò)增的DNA片段并引入質(zhì)粒pTV118N(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產(chǎn))的NcoⅠ限制位點(diǎn)和SalⅠ限制位點(diǎn)，從而構(gòu)建質(zhì)粒pTVGMP(附圖8)。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學(xué)》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，將質(zhì)粒pTVGMP引入大腸桿菌PPO基因缺損突變體系BT3菌株。當(dāng)在含有100μg/ml氨芐青霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的大腸桿菌時(shí)，互補(bǔ)克隆沒有生長(zhǎng)。
實(shí)施例12大豆PPO變體對(duì)除草化合物產(chǎn)生耐受性作用的試驗(yàn)按照Hanahan,D.J.在《分子生物學(xué)》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，分別將實(shí)施例11中制備的質(zhì)粒pTVGMP和pTV118N引入實(shí)施例3中制備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的YPT培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述菌株而獲得具有質(zhì)粒pACYCSP和pTVGMP的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTVGMP菌株以及具有質(zhì)粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些菌株接種入YPT培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有10或1ppm的由結(jié)構(gòu)8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照與實(shí)施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進(jìn)行培養(yǎng)。然后，在培養(yǎng)開始18小時(shí)后，在600nm處測(cè)定液體培養(yǎng)基的吸收度。將不含除草化合物的培養(yǎng)基的吸收度看作1，計(jì)算含有除草化合物培養(yǎng)基的吸收度的相應(yīng)值。結(jié)果如表7中所示。
表7
實(shí)施例13將可編碼大豆PPO變體的基因引入煙草構(gòu)建通過農(nóng)桿菌屬感染法將可編碼大豆PPO變體的基因引入植物的質(zhì)粒。通過使用實(shí)施例3中制備的質(zhì)粒pSPPO-P作為模板、由SEQ IDNO:13的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物和由SEQ ID NO:14的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物來進(jìn)行PCR，從而擴(kuò)增可編碼大豆PPO變體的基因的DNA片段。然后，用限制酶KpnⅠ和SacⅠ消化實(shí)施例9中制備的質(zhì)粒pBI121K以除去β-葡糖醛酸酶(β-glucronidase)基因，并將通過用限制酶KpnⅠ和SacⅠ消化含有可編碼大豆PPO變體的上述基因的DNA片段而獲得的DNA片段插入這部分以制備質(zhì)粒pBIGMP(附圖)，其中基因與35S啟動(dòng)子的下游連接。
將質(zhì)粒pBIGMP引入根癌土壤桿菌LBA4404。在含有300μg/ml鏈霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，隨后選擇所需的轉(zhuǎn)化體以分離具有pBIGMP的農(nóng)桿菌屬菌株。
用農(nóng)桿菌屬菌株感染無菌培養(yǎng)的煙草葉片并按照與實(shí)施例5中相同的方式獲得引入了可編碼大豆PPO變體的基因的煙草。
實(shí)施例14具有可編碼大豆PPO變體的引入基因的煙草對(duì)除草化合物耐受性的確認(rèn)通過檢測(cè)按照與實(shí)施例6中相同的方式引入了實(shí)施例13中制備的可編碼大豆PPO變體的基因的煙草而定量地確定對(duì)由結(jié)構(gòu)8代表的抑制型除草化合物的耐受程度。將從引入了可編碼大豆PPO變體的基因的煙草4個(gè)克隆(GMP1-4)和對(duì)照重組煙草獲得的結(jié)果列在表8中。在該表中，對(duì)除草化合物的耐受程度通過用除草化合物處理葉片的總?cè)~綠素含量與未處理葉片的葉綠素含量之比的百分?jǐn)?shù)來表示。
表8
實(shí)施例15分離衣藻屬的PPO基因從衣藻屬遺傳中心(地址DCMB小組，植物系，91000信箱，Duke大學(xué)，Durham,NC2708-1000,USA)獲得雷氏衣藻CC407菌株，在200μE/m2/s光合有效光下將該菌株在含有7mM NH4Cl、0.4mMMgSO4·7H2O、0.34mM CaCl2·2H2O、25 mM磷酸鉀、0.5mM Tris(pH7.5)、1ml/升Hatner痕量元素和1ml/升冰醋酸的TAP液體培養(yǎng)基(E.H.Harris，《衣藻屬參考資料》(The Chlamydomonas Sourcebook),Academic Press,San Diego,1989,p576-577)中培養(yǎng)5天，從而獲得200ml(1.0×106細(xì)胞/ml)含有早期穩(wěn)定生長(zhǎng)期細(xì)胞的液體培養(yǎng)基。
通過使用ISOGEN(Nippon Gene)、按照附于其中的操作指南，由這些細(xì)胞制備總RNAs。此外，使用BioMag mRNA純化試劑盒(Perceptive Bio System)、按照附于其中的操作指南對(duì)聚腺苷酸RNA進(jìn)行分級(jí)分離。通過使用Marathon cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clonetech)、按照附于其中的操作指南從所得聚腺苷酸RNA合成cDNA并將cDNA用作PCR的模板。
作為PCR引物，制備由SEQ ID NO:15的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:16的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394DNA/RNA合成儀)來制備寡核苷酸并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)它們進(jìn)行純化。
通過下列步驟來進(jìn)行PCR使用有效cDNA PCR試劑盒(Clonetech)、按照附于其中的操作指南來制備反應(yīng)液；接著在94℃下維持1分鐘和在65℃下維持5分鐘后，將在94℃下維持15秒且然后在65℃維持5分鐘的一個(gè)循環(huán)重復(fù)29次。在PCR反應(yīng)后，通過用MicroSpin S-400HR(由Pharmacia Biotech生產(chǎn))過濾反應(yīng)液而對(duì)擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行純化，并通過使用TA克隆試劑盒(由Invitrogen生產(chǎn))、按照附于其中的操作指南而將DNA片段克隆入質(zhì)粒pCR2.1以構(gòu)建質(zhì)粒pCPPO。
通過使用染料終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒(由PE應(yīng)用生物系統(tǒng)生產(chǎn))和DNA測(cè)序儀373S(由PE應(yīng)用生物系統(tǒng)生產(chǎn))來測(cè)定所得質(zhì)粒pCPPO中含有的DNA片段的核苷酸序列。結(jié)果顯示出SEQ ID NO:17的核苷酸序列，由此證實(shí)質(zhì)粒pCPPO含有雷氏衣藻的全長(zhǎng)PPO cDNA。
實(shí)施例16分離可編碼沒有能力氧化原卟啉原Ⅸ而對(duì)原卟啉原Ⅸ基因特異性親和性的雷氏衣藻PPO蛋白質(zhì)變體的基因通過下列方式進(jìn)行PCR；使用實(shí)施例15中制備的質(zhì)粒pSPPO作為模板和由SEQ ID NO:19的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ IDNO:20的核苷酸序列組成的寡核苷酸作為引物，從而擴(kuò)增DNA片段，它可編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)和FAD結(jié)合序列已經(jīng)缺失的雷氏衣藻PPO(下文稱作雷氏農(nóng)藻PPO變體)。用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394DNA/RNA合成儀)來制備寡核苷酸并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)它進(jìn)行純化。通過將在94℃下維持1分鐘、在55℃下維持2分鐘且然后在72℃下維持3分鐘的一個(gè)循環(huán)重復(fù)30次來進(jìn)行PCR反應(yīng)。用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化擴(kuò)增的DNA片段并將其插入質(zhì)粒pTV118N(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產(chǎn))的BamHⅠ限制位點(diǎn)與SacⅠ限制位點(diǎn)之間，從而構(gòu)建質(zhì)粒pTVCRP(附圖10)。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學(xué)》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，將質(zhì)粒pTVCRP引入大腸桿菌PPO基因缺損突變體系BT3菌株。當(dāng)在含有100μg/ml氨芐青霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的大腸桿菌時(shí)，互補(bǔ)克隆沒有生長(zhǎng)。
實(shí)施例17對(duì)除草化合物產(chǎn)生耐受性能力的修飾的雷氏衣藻PPO變體的試驗(yàn)按照Hanahan,D.J.在《分子生物學(xué)》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法分別將實(shí)施例16中制備的質(zhì)粒pTVCRP和pTV118N引入實(shí)施例3中制備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述菌株而獲得具有質(zhì)粒pACYCSP和pTVCRP的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTVCRP菌株以及具有質(zhì)粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些菌株接種入YPT培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有10或1ppm的由結(jié)構(gòu)8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照與實(shí)施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進(jìn)行培養(yǎng)。然后，在培養(yǎng)開始18小時(shí)后，在600nm處測(cè)定液體培養(yǎng)基的吸收度。將不含除草化合物的培養(yǎng)基的吸收度看作1，計(jì)算含有除草化合物培養(yǎng)基的吸收度的相應(yīng)值。結(jié)果如表9中所示。
表9<
<p>實(shí)施例18將可編碼雷氏衣藻PPO變體的基因引入煙草構(gòu)建通過農(nóng)桿菌屬感染法將可編碼雷氏衣藻PPO變體的基因引入植物的質(zhì)粒。通過用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化實(shí)施例16中制備的質(zhì)粒pTVCRP來制備DNA片段，它含有可編碼雷氏衣藻PPO變體的基因。用限制酶BamHⅠ和SalⅠ消化二元載體pBI121(由Clonetech生產(chǎn))以除去β-葡糖醛酸酶(β-glucronidase)基因并將上述編碼雷氏衣藻PPO變體的基因插入這部分以制備質(zhì)粒pBICRP(附圖11)。
將質(zhì)粒pBICRP引入根癌土壤桿菌LBA4404。在含有300μg/ml鏈霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，隨后選擇所需的轉(zhuǎn)化體以分離具有pBICRP的農(nóng)桿菌屬菌株。
用農(nóng)桿菌屬菌株感染無菌培養(yǎng)的煙草葉片并按照與實(shí)施例5中相同的方式獲得引入了可編碼雷氏衣藻PPO變體的基因的煙草。
實(shí)施例19具有可編碼雷氏衣藻PPO變體(varian)的引入基因的煙草對(duì)除草化合物耐受性的確認(rèn)通過檢測(cè)按照與實(shí)施例6中相同的方式引入了實(shí)施例18中制備的可編碼雷氏衣藻PPO變體的基因的煙草而定量地確定對(duì)由結(jié)構(gòu)8代表的抑制型除草化合物的耐受程度。將從引入了可編碼雷氏衣藻PPO變體的基因的煙草4個(gè)克隆(CRP1-4)和對(duì)照重組煙草獲得的結(jié)果列在表10中。在該表中，對(duì)除草化合物的耐受程度通過用除草化合物處理葉片的總?cè)~綠素含量與未處理葉片的葉綠素含量之比的百分?jǐn)?shù)來表示。
表10
實(shí)施例20對(duì)原卟啉原Ⅸ具有親和性的大麥鐵螯合酶蛋白質(zhì)變體特別對(duì)除草化合物產(chǎn)生耐受能力的試驗(yàn)通過Miyamoto,K等在《植物生理學(xué)》(Plant Physiol.)105；p769(1994)中所述的方法來制備具有大麥鐵螯合酶基因的質(zhì)粒。用限制酶NspⅠ和EcoRⅠ消化所得的質(zhì)粒以獲得DNA片段，它含有可編碼信號(hào)序列已經(jīng)缺失的大麥鐵螯合酶的基因(下文稱作大麥鐵螯合酶變體)。將這種DNA片段插入質(zhì)粒pTV119N(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產(chǎn))的SphⅠ限制位點(diǎn)與EcoRⅠ限制位點(diǎn)之間，從而構(gòu)建質(zhì)粒pTVHVF1(附圖12)。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學(xué)》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法分別將質(zhì)粒pTVHVF1和pTV118N引入實(shí)施例3中制備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述菌株而獲得具有質(zhì)粒pACYCSP和pTVHVF1的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTVHVF1菌株以及具有質(zhì)粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些菌株接種入YPT培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有10或1ppm的由結(jié)構(gòu)8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照與實(shí)施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進(jìn)行乙酰丙酸；按照與實(shí)施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進(jìn)行培養(yǎng)。然后，在培養(yǎng)開始18小時(shí)后，在600nm處測(cè)定液體培養(yǎng)基的吸收度。將不含除草化合物的培養(yǎng)基的吸收度看作1，計(jì)算含有除草化合物培養(yǎng)基的吸收度的相應(yīng)值。結(jié)果如表11中所示。
表11
實(shí)施例21將可編碼大麥鐵螯合酶變體的基因引入煙草構(gòu)建通過農(nóng)桿菌屬感染法將可編碼大麥鐵螯合酶的基因引入煙草的質(zhì)粒。用限制酶NcoⅠ消化實(shí)施例20中所述的質(zhì)粒pTVHVF1，隨后用DNA聚合酶Ⅰ、通過將核苷酸添加到雙鏈DNA缺口上而使DNA鈍端化。然后，用衍生于牛腸的堿性磷酸酶使DNA去磷酸化并通過插入磷酸化BamHⅠ接頭(4610P，由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產(chǎn))而使之環(huán)化，從而構(gòu)建質(zhì)粒pTVHVF2。用限制酶EcoRⅠ消化pTVHVF2，隨后用DNA聚合酶Ⅰ、通過將核苷酸添加到雙鏈DNA缺口上而使DNA鈍端化。此外，用衍生于牛腸的堿性磷酸酶使DNA去磷酸化并通過插入磷酸化SalⅠ接頭(4680P，由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產(chǎn))而使之環(huán)化，從而構(gòu)建質(zhì)粒pTVHVF3。用限制酶BamHⅠ和SalⅠ消化實(shí)施例9中制備的質(zhì)粒pBI121KS以除去β-葡糖苷酸酶基因。通過用限制酶BamHⅠ和SalⅠ消化上述pTVHVF3來制備DNA片段，它含有可編碼大麥鐵螯合酶變體的基因。通過置換β-葡糖醛酸酶(β-glucronidase)基因的方式將所得DNA片段插入質(zhì)粒pBI121KS以制備質(zhì)粒pBIHVF(附圖13)，其中bchH基因連接在35S啟動(dòng)子的下游。
將質(zhì)粒pBIHVF引入根癌土壤桿菌LBA4404。在含有300μg/ml鏈霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，隨后選擇所需的轉(zhuǎn)化體以分離具有pBIHVF的農(nóng)桿菌屬菌株。
用所述的農(nóng)桿菌屬菌株感染無菌培養(yǎng)的煙草葉片并按照與實(shí)施例5中相同的方式獲得引入了可編碼大麥鐵螯合酶變體的基因的煙草。
實(shí)施例22具有可編碼大麥鐵螯合酶變體的引入基因的煙草對(duì)除草化合物耐受性的確認(rèn)通過檢測(cè)按照與實(shí)施例6中相同的方式引入了實(shí)施例21中制備的可編碼大麥鐵螯合酶變體的基因的煙草而定量地確定對(duì)由結(jié)構(gòu)8代表的PPO抑制型除草化合物的耐受程度。將從引入了可編碼大麥鐵螯合酶變體的基因的煙草4個(gè)克隆(HVF1-4)和對(duì)照重組煙草獲得的結(jié)果列在表12中。在該表中，對(duì)除草化合物的耐受程度通過用除草化合物處理葉片的總?cè)~綠素含量與未處理葉片的葉綠素含量之比的百分?jǐn)?shù)來表示。
表12
實(shí)施例23對(duì)原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的黃瓜鐵螯合酶的蛋白質(zhì)變體對(duì)除草化合物產(chǎn)生耐受能力的試驗(yàn)通過下列方式來進(jìn)行PCR通過使用由Miyamoto,K等在《植物生理學(xué)》(Plant Physiol.)105；p769(1994)中所述方法分離的黃瓜鐵螯合酶cDNA克隆作為模板、由SEQ ID NO:21的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:22的核苷酸序列組成的寡核苷酸作為引物，從而擴(kuò)增DNA片段，它可編碼信號(hào)序列已經(jīng)缺失的黃瓜鐵螯合酶(下文稱作黃瓜鐵螯合酶變體)。用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394 DNA/RNA合成儀)來制備寡核苷酸并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)它們進(jìn)行純化。通過將在94℃下維持1分鐘、在55℃下維持2分鐘且然后在72℃下維持3分鐘的一個(gè)循環(huán)重復(fù)30次來進(jìn)行PCR反應(yīng)。用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化擴(kuò)增的DNA片段并將其插入質(zhì)粒pTV119N(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產(chǎn))的BamHⅠ限制位點(diǎn)與之間SacⅠ限制位點(diǎn)，從而構(gòu)建質(zhì)粒pTVCSF(附圖14)。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學(xué)》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，分別將質(zhì)粒pTVCSF和pTV118N引入大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的YPT培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述菌株而獲得具有質(zhì)粒pACYCSP和pTVCSF的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTVCSF菌株以及具有質(zhì)粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些菌株接種入YPT培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有10或1ppm的由結(jié)構(gòu)8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照與實(shí)施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進(jìn)行培養(yǎng)。然后，在培養(yǎng)開始18小時(shí)后，在600nm處測(cè)定液體培養(yǎng)基的吸收度。將不含除草化合物的培養(yǎng)基的吸收度看作1，計(jì)算含有除草化合物培養(yǎng)基的吸收度的相應(yīng)值。結(jié)果如表13中所示。
表13
實(shí)施例24將可編碼黃瓜鐵螯合酶的基因引入煙草構(gòu)建通過農(nóng)桿菌屬感染法將可編碼本修飾的黃瓜鐵螯合酶的基因引入煙草的質(zhì)粒。用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化質(zhì)粒pBI121(由Clonetech生產(chǎn))以除去β-葡糖苷酸酶基因。通過用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化實(shí)施例23中所述的質(zhì)粒pTVHCSF來制備DNA片段，它含有可編碼黃瓜鐵螯合酶變體的基因。通過置換β-葡糖苷酸酶基因的方式將所得DNA片段插入質(zhì)粒pBI121KS以制備質(zhì)粒pBICSF(附圖13)，其中黃瓜鐵螯合酶基因與35S啟動(dòng)子的下游連接。
將質(zhì)粒pBICSF引入根癌土壤桿菌LBA4404。在含有300μg/ml鏈霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，隨后選擇所需的轉(zhuǎn)化體以分離具有pBICSF的農(nóng)桿菌屬菌株。
按照與實(shí)施例5中相同的方式用所述的農(nóng)桿菌屬菌株感染無菌培養(yǎng)的煙草葉片以獲得引入了可編碼本修飾的黃瓜鐵螯合酶的基因的煙草。
實(shí)施例25具有可編碼黃瓜鐵螯合酶變體的引入基因的煙草對(duì)除草化合物耐受性的確認(rèn)通過檢測(cè)按照與實(shí)施例6中相同的方式引入了實(shí)施例24中制備的可編碼本修飾的黃瓜鐵螯合酶的基因的煙草而定量地確定對(duì)PPO抑制型除草化合物的耐受程度。
實(shí)施例26大腸桿菌糞卟啉原Ⅲ氧化酶(hemF)基因的分離使用用于基因組DNA制備的試劑盒ISOPLANT(由Nippon Gene生產(chǎn))由大腸桿菌LE392菌株制備基因組DNA。由SEQ ID NO:23的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物和由SEQ ID NO:24的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物根據(jù)在基因庫登記的大腸桿菌hemF基因(登記號(hào)X75413)及其5’和3’區(qū)的核苷酸序列來合成。用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394DNA/RNA合成儀)來制備寡核苷酸并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)它們進(jìn)行純化。通過使用約1μg大腸桿菌LE392菌株基因組DNA作為模板和上述寡核苷酸(各10pmol)為引物來進(jìn)行PCR以擴(kuò)增含有大腸桿菌hemF基因的DNA片段。通過將在96℃下維持1分鐘、在55℃下維持2分鐘且然后在72℃下維持1分鐘的一個(gè)循環(huán)重復(fù)30次來進(jìn)行PCR反應(yīng)。
實(shí)施例27對(duì)除草化合物產(chǎn)生耐受能力的大腸桿菌hemF蛋白質(zhì)的試驗(yàn)用限制酶FbaⅠ和PstⅠ消化含有由實(shí)施例26中所述方法擴(kuò)增hemF基因的DNA片段，并將其插入商購質(zhì)粒pUC118(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產(chǎn))的BamHⅠ限制位點(diǎn)與PstⅠ限制位點(diǎn)之間以構(gòu)建質(zhì)粒pHEMF(附圖16)。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學(xué)》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法分別將質(zhì)粒pHEMF和pTV118N引入實(shí)施例3中制備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述菌株而獲得具有質(zhì)粒pACYCSP和pHEMF的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pHEMF菌株以及具有質(zhì)粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些大腸桿菌菌株接種入YPT培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有10或1ppm的由結(jié)構(gòu)8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照與實(shí)施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進(jìn)行培養(yǎng)。然后，在培養(yǎng)開始18小時(shí)后，在600nm處測(cè)定液體培養(yǎng)基的吸收度。將不含除草化合物的培養(yǎng)基的吸收度看作1，計(jì)算含有除草化合物培養(yǎng)基的吸收度的相應(yīng)值。結(jié)果如表14中所示。
表14
實(shí)施例28將大腸桿菌hemF基因引入煙草構(gòu)建通過農(nóng)桿菌屬感染法將大腸桿菌hemF基因引入植物的質(zhì)粒。首先，為了獲得大腸桿菌hemF基因，用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394DNA/RNA合成儀)來合成由SEQ ID NO:25的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物和由SEQ ID NO:26的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)其進(jìn)行純化。通過使用這些寡核苷酸、按照與實(shí)施例26中相同的方式來進(jìn)行PCR以擴(kuò)增含有大腸桿菌hemF基因的DNA片段。
用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化質(zhì)粒pBI121(由Clonetech生產(chǎn))以除去β-葡糖苷酸酶基因。將通過用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化上述PCR擴(kuò)增的DNA片段而制備含有可編碼大腸桿菌hemH基因的DNA片段。通過置換β-葡糖苷酸酶基因的方式將所得DNA片段引入質(zhì)粒pBI121以制備質(zhì)粒pBIHEMF(附圖17)，其中大腸桿菌hemF基因連接于35S啟動(dòng)子的下游。
將質(zhì)粒pBIHEMF引入根癌土壤桿菌LBA4404。在含有300μg/ml鏈霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，隨后選擇所需的轉(zhuǎn)化體以分離具有pBIHEMF的農(nóng)桿菌屬(Abrobacterium)菌株。
按照與實(shí)施例5中相同的方式用農(nóng)桿菌屬(Abrobacterium)菌株感染無菌培養(yǎng)的煙草葉片以獲得制備的引入了大腸桿菌hemF基因的煙草。
實(shí)施例29引入大腸桿菌hemF基因的煙草對(duì)除草化合物耐受性的確認(rèn)按照與實(shí)施例6中相同的方式、通過檢測(cè)引入了大腸桿菌hemF基因的煙草而定量地確定對(duì)PPO抑制型除草化合物的耐受程度。
實(shí)施例30卟啉化合物結(jié)合蛋白質(zhì)與原卟啉原Ⅸ的結(jié)合測(cè)試按照KITANO等在Nihon Kagakukai(日本化學(xué)協(xié)會(huì))1998年第74屆春季會(huì)議預(yù)出版年報(bào)的報(bào)告Ⅱ中的摘要p1353,4G511中所述的方法來制備可提供含有由5個(gè)隨機(jī)氨基酸組成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的噬菌體文庫和可提供含有氨基酸序列HASYS或RASSL(其中H是組氨酸、A是丙氨酸、S是絲氨酸、R是精氨酸、Y是酪氨酸、L是亮氨酸)的蛋白質(zhì)的噬菌體文庫，它們可以特異性地結(jié)合卟啉化合物5,10,15,20-四(N-甲基吡啶鎓-4-基)-21H,23H-卟吩(H2TMpyP)。
首先，構(gòu)建可提供含有由5個(gè)隨機(jī)氨基酸組成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的噬菌體文庫。合成由SEQ ID NO:27的核苷酸序列組成的混合的寡核苷酸和由SEQ ID NO:28的核苷酸序列組成的混合的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394 DNA/RNA合成儀)來合成混合的寡核苷酸并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)其進(jìn)行純化。通過用T4DNA激酶處理而分別使上述混合的寡核苷酸(各50pmol)在5’端磷酸化。將它們混合并且在70℃下加熱10分鐘后通過以0.5℃/分鐘的速率緩慢冷卻至室溫而將它們退火。用限制酶SfiⅠ和NotⅠ消化質(zhì)粒pCANTAB5E(由Pharmacia Biotech生產(chǎn))以除去重組抗體基因ScFv。將上述磷酸化并退火的寡核苷酸對(duì)插入上述重組抗體基因ScFv的部分以制備一種質(zhì)粒，它含有可編碼由5個(gè)隨機(jī)氨基酸序列和與之連接的M13噬菌體表面蛋白質(zhì)的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。按照Hanahan,D.J.在《分子生物學(xué)》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法將該質(zhì)粒引入大腸桿菌TG-1菌株并在含有100μg/ml氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基(10g/升酵母(east)提取物、15g/升胰化蛋白胨和5g/升NaCl，pH7.2)中培養(yǎng)以獲得重組大腸桿菌TG-1菌株。將重組大腸桿菌TG-1菌株接種入含有100μg/ml氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基并通過振搖的方式進(jìn)行培養(yǎng)。然后，在培養(yǎng)開始1小時(shí)后，將6×1010pfu輔助噬菌體M13K07(由Pharmacia Biotech生產(chǎn))接種入該培養(yǎng)基并通過振搖的方式將培養(yǎng)再持續(xù)18個(gè)小時(shí)。接著，以1,000×g將液體培養(yǎng)基離心20分鐘以收集可提供含有由5個(gè)隨機(jī)氨基酸組成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的噬菌體文庫。
為了制備可提供含有氨基酸序列HASYS(SEQ ID NO:53)的蛋白質(zhì)的噬菌體克隆，合成由SEQ ID NO:29的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:30的核苷酸序列組成的寡核苷酸。并且，為了制備可提供含有氨基酸序列RASSL(SEQ ID NO:55)的蛋白質(zhì)的噬菌體克隆，合成由SEQ ID NO:31的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:32的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)它們進(jìn)行純化。通過與上述獲得可提供含有由5個(gè)隨機(jī)氨基酸組成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的噬菌體文庫相同的操作方式來獲得可提供含有氨基酸序列HASYS或RASSL的蛋白質(zhì)的噬菌體克隆。
將可提供含有氨基酸序列HASYS的蛋白質(zhì)的噬菌體克隆、可提供含有氨基酸序列RASSL的蛋白質(zhì)的噬菌體克隆或可提供含有由5個(gè)隨機(jī)氨基酸組成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的噬菌體文庫制成噬菌體懸浮液，將這些懸浮液(滴度105pfu)點(diǎn)滴在硝酸纖維素膜(由Schleicher &amp;Schuell生產(chǎn))上，然后通過將它們?cè)诤?％牛血清白蛋白的PBT緩沖液(137mM NaCl,8.10mM Na2HPO4,2.68mM Kcl,1.47mMKH2PO4,0.05％ Tween20,pH7.2)中振搖而將硝酸纖維素膜阻塞。用PBT緩中液洗滌該硝酸纖維素膜并將它們?cè)诤?0μM原卟啉Ⅸ的2×SSC緩中液(0.3M NaCl,0.03M檸檬酸鈉)中振搖18小時(shí)。此外，用2×SSC緩中液洗滌所述的硝酸纖維素膜、干燥并在紫外光(365nm)下檢測(cè)衍生于原卟啉Ⅸ的熒光。
噬菌體文庫的斑點(diǎn)沒有顯現(xiàn)出熒光，而可提供含有氨基酸序列HASYS的蛋白質(zhì)的噬菌體克隆和可提供含有氨基酸序列RASSL的蛋白質(zhì)的噬菌體克隆顯現(xiàn)出清楚的熒光。
實(shí)施例31對(duì)除草化合物產(chǎn)生耐受性能力的原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白質(zhì)的試驗(yàn)首先，制備一種質(zhì)粒，它可以表達(dá)可編碼含有氨基酸序列HASYS(SEQ ID NO:53)、或氨基酸序列RASSL(SEQ ID NO:55)的蛋白質(zhì)的基因。為了制備能夠表達(dá)可編碼由SEQ ID NO:54氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(下文稱作蛋白質(zhì)MGHASYS)的基因，合成由SEQ IDNO:33的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:34的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)它們進(jìn)行純化。通過用T4 DNA激酶處理而分別使上述寡核苷酸(各50pmol)在5’端磷酸化。將它們混合并且在70℃下加熱10分鐘后通過以0.5℃/分鐘的速率緩慢冷卻至室溫而將它們退火。用限制酶NotⅠ和NcoⅠ消化質(zhì)粒pTV118N以除去由16個(gè)堿基對(duì)組成的基因片段。通過將上述磷酸化并退火的寡核苷酸對(duì)插入上述16個(gè)堿基對(duì)的位置來制備能夠表達(dá)可編碼蛋白質(zhì)MGHASYS的基因的質(zhì)粒pHASYS。
然后，為了制備能夠表達(dá)可編碼由SEQID NO:54氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(下文稱作蛋白質(zhì)MGRASSL)的基因的質(zhì)粒，合成由SEQID NO:35的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:34的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394 DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)它們進(jìn)行純化。通過與制備質(zhì)粒pHASYS相同的過程來制備能夠表達(dá)可編碼蛋白質(zhì)MGRASSL的基因的質(zhì)粒pRASSL。
制備能夠表達(dá)可編碼含有氨基酸序列YAGY或YAGF(其中Y是酪氨酸、A是丙氨酸、G是甘氨酸、F是苯丙氨酸)(Sugimoto,N.,Nakano.S.,《化學(xué)通訊》(Chem.Lett.)p939,1997)的蛋白質(zhì)的基因的質(zhì)粒，其中所述的氨基酸序列YAGY或YAGF能夠結(jié)合卟啉化合物H2TMpyP。為了制備能夠表達(dá)可編碼由SEQ ID NO:58氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(下文稱作蛋白質(zhì)MGYAGF)的基因的質(zhì)粒，合成由SEQ IDNO:37的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:38的核苷酸序列組成的寡核苷酸。為了制備能夠表達(dá)可編碼由SEQ ID NO:60氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(下文稱作蛋白質(zhì)MGYAGF)的基因的質(zhì)粒，合成由SEQ ID NO:39的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:40的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394 DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)它們進(jìn)行純化。通過與制備質(zhì)粒pHASYS相同的過程來制備能夠表達(dá)可編碼蛋白質(zhì)MGYAGY的基因的質(zhì)粒pYAGY和能夠表達(dá)可編碼蛋白質(zhì)MGYAGF的基因的質(zhì)粒pYAGF。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學(xué)》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法分別將上述質(zhì)粒pHASYS、pRASSL、pYAGY、pYAGF和pTV118N引入實(shí)施例3中制備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述菌株而獲得具有質(zhì)粒pACYCSP和pHASYS的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pHASYS菌株、具有質(zhì)粒pACYCSP和pRASSL的大腸桿菌BT/pACYCSP+pYAGY株，其載有質(zhì)粒pACYCSP和pYAGY大腸桿菌BT3/pACYCSP+pRASSL菌株、具有質(zhì)粒pACYCSP和pYAGF的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pYAGF菌株以及具有質(zhì)粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些大腸桿菌菌株接種入YPT培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有1ppm的由結(jié)構(gòu)8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素、10βg/ml卡那霉素、10lμg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照與實(shí)施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進(jìn)行培養(yǎng)。然后，在培養(yǎng)開始18小時(shí)后，在600nm處測(cè)定液體培養(yǎng)基的吸收度。將不含除草化合物的培養(yǎng)基的吸收度看作1，計(jì)算含有除草化合物培養(yǎng)基的吸收度的相應(yīng)值。結(jié)果如表15中所示。
表15
此外，在一種能夠表達(dá)可編碼含有氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因的質(zhì)粒中，一個(gè)單位的氨基酸序列HASYS或RASSL相互重復(fù)連接。為了制備能夠表達(dá)可編碼由SEQ ID NO:61氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(下文稱作蛋白質(zhì)MG(HASYS)4,(HASYS)n稱作肽HASYS相互重復(fù)連接n次的序列)的基因的質(zhì)粒，合成由SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394 DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)它們進(jìn)行純化。首先，通過用T4 DNA激酶處理而分別使由SEQ ID NO:42的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:43的核苷酸序列組成的寡核苷酸在5＇端磷酸化。此后，將由SEQ ID NO:41的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:42的核苷酸序列組成的寡核苷酸或由SEQ ID NO:43以及由SEQ ID NO:44的核苷酸序列組成的寡核苷酸的磷酸化的核苷酸組成的寡核苷酸混合(各300pmol)，并且在70℃下加熱5分鐘后通過以0.5℃/分鐘的速率緩慢冷卻至室溫而將它們退火。將上述兩種退火的寡核苷酸對(duì)混合并用T4DNA連接酶將它們偶聯(lián)，然后用T4DNA激酶使所得DNA片段在5’端磷酸化。另一方面，用限制酶NotⅠ和EcoRⅠ消化載體pTV118N以除去由16個(gè)堿基對(duì)的DNA片段并將上述磷酸化的DNA片段插入這部分以獲得表達(dá)可編碼蛋白質(zhì)MG(HASYS)4的基因的質(zhì)粒pHASYS4。
此外，為了制備能夠表達(dá)可編碼由SEQ ID NO:62氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(下文稱作蛋白質(zhì)MG(HASYS)8)的基因的質(zhì)粒，合成由SEQ ID NO:45的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:46的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)它們進(jìn)行純化。首先，通過用T4 DNA激酶處理而使上述寡核苷酸在5’端磷酸化。此后，將由SEQ ID NO:41的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:42的磷酸化的核苷酸序列組成的寡核苷酸混合(各300pmol)，將由SEQ IDNO:43的磷酸化的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:44的核苷酸序列組成的寡核苷酸混合(各300pmol)，且進(jìn)一步將由SEQID NO:45的磷酸化的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:46的磷酸化的核苷酸序列組成的寡核苷酸混合(各600pmol)。將這三種混合物在70℃下加熱5分鐘并通過以0.5℃/分鐘的速率緩慢冷卻至室溫而將它們退火。將上述三種退火的寡核苷酸對(duì)混合、用T4DNA連接酶將它們偶聯(lián)、且然后用T4DNA激酶使所得DNA片段在5’端磷酸化。按照與制備上述質(zhì)粒pHASYS4相同的方式來制備能夠表達(dá)蛋白質(zhì)MG(HASYS)8的質(zhì)粒pHASYS8。
然后，為了制備能夠表達(dá)可編碼由SEQ ID NO:63氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(下文稱作蛋白質(zhì)MG(RASSL)4,(RASSL)n稱作肽RASSL相互重復(fù)連接n次的序列)的基因的質(zhì)粒，合成由SEQ ID NO:47、SEQID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的核苷酸序列組成的寡核苷酸。此外，為了制備能夠表達(dá)可編碼由SEQ ID NO:64氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(下文稱作蛋白質(zhì)MG(RASSL)8)的基因的質(zhì)粒，合成由SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；型號(hào)394DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸并用一種寡核苷酸純化柱(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)；OPC柱)來對(duì)它們進(jìn)行純化。
按照與制備上述質(zhì)粒pHASYS4相同的方式來制備能夠表達(dá)蛋白質(zhì)MG(RASSL)4的質(zhì)粒pRASSL4。還按照與制備上述質(zhì)粒pHASYS8相同的方式來制備能夠表達(dá)蛋白質(zhì)MG(RASSL)8的質(zhì)粒pRASSL8。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學(xué)》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法分別將上述質(zhì)粒pHASYS4、pRASSL4、pRASSL8和pTV118N引入實(shí)施例3中制備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素和10μg/ml卡那霉素的YPT培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述菌株而獲得具有質(zhì)粒pACYCSP和pHASYS4的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pHASYS4菌株、具有質(zhì)粒pACYCSP和pRASSL4的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pRASSL4菌株、具有質(zhì)粒pACYCSP和pRASSL8的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pRASSL8菌株以及具有質(zhì)粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些大腸桿菌菌株接種入YPT培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有1ppm的由結(jié)構(gòu)8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨芐青霉素、15μg/ml氯霉素、10μg/ml卡那霉素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙酰丙酸；按照與實(shí)施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進(jìn)行培養(yǎng)。然后，在培養(yǎng)開始18小時(shí)后，在600nm處測(cè)定液體培養(yǎng)基的吸收度。將不含除草化合物的培養(yǎng)基的吸收度看作1，計(jì)算含有除草化合物培養(yǎng)基的吸收度的相應(yīng)值。結(jié)果如表16中所示。
表16<
<p>實(shí)施例32將可編碼原卟啉Ⅸ結(jié)合肽的基因引入煙草構(gòu)建通過農(nóng)桿菌屬感染法將可編碼原卟啉Ⅸ結(jié)合肽的基因引入煙草的質(zhì)粒。用限制酶NcoⅠ消化實(shí)施例31中制備的質(zhì)粒pHASYS8，隨后通過用DNA聚合酶將核苷酸加入到雙鏈DNA缺口上而使DNA鈍端化。然后，用衍生于牛腸的堿性磷酸酶使DNA去磷酸化并通過插入磷酸化的BamHⅠ接頭(4610P，由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產(chǎn))而使之環(huán)化，從而構(gòu)建質(zhì)粒pHASYS8B。用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化質(zhì)粒pBI121(由Clonetech生產(chǎn))以除去β-葡糖苷酸酶基因。另一方面，用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化質(zhì)粒pHASYS8B以制備含有可編碼蛋白質(zhì)MG(HASYS)8的基因的DNA片段，通過置換β-葡糖苷酸酶基因的方式將所得DNA片段插入質(zhì)粒pBI121以制備質(zhì)粒pHASYS8(附圖18)，其中可編碼原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白質(zhì)MG(HASYS)8的基因與35S啟動(dòng)子的下游連接。
構(gòu)建通過農(nóng)桿菌屬感染法將可編碼原卟啉Ⅸ結(jié)合肽MG(HASYS)8的基因引入植物的質(zhì)粒。按照與制備pBIHASYS8相同的方式，由pRASSL8來制備質(zhì)粒pBRASSL8(附圖19)，其中可編碼原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白質(zhì)MG(RASSL)8的基因與35S啟動(dòng)子的下游連接。
分別將質(zhì)粒pBIHASYS8和pBIHASYS8引入根癌土壤桿菌LBA4404。在含有300μg/ml鏈霉素、100μg/ml利福霉素和25μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所需轉(zhuǎn)化體、隨后選擇所需轉(zhuǎn)化體，從而分離分別具有pBIHASYS8和pBIRASSL8的土壤桿菌屬(Abrobacterium)菌株。
按照與實(shí)施例2中相同的方式，用所述的農(nóng)桿菌屬(Abrobacterium)菌株感染無菌培養(yǎng)的煙草葉片以獲得引入了可編碼原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白質(zhì)MG(HASYS)8的基因的煙草以及引入了可編碼原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白質(zhì)MG(RASSL)8的基因的煙草。
實(shí)施例33具有可編碼原卟啉Ⅸ結(jié)合肽的引入基因的煙草對(duì)除草混合物耐受性的確認(rèn)按照與實(shí)施例14中相同的方式、通過檢測(cè)引入了實(shí)施例32中制備的可編碼原卟啉Ⅸ結(jié)合肽的基因的煙草而定量地確定對(duì)除草化合物的耐受程度。
正如本文所述的，根據(jù)本發(fā)明，可以產(chǎn)生耐雜草防治化合物的植物。
不含序列表的內(nèi)容SEQ ID NO:1為擴(kuò)增bchH基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:2為擴(kuò)增bchH基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:3為擴(kuò)增大豆PPO基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:4為擴(kuò)增大豆PPO基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:7為擴(kuò)增bchH基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:8為擴(kuò)增bchH基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:9為擴(kuò)增具有煙草chlH基因部分序列的DNA片段而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:10為擴(kuò)增具有煙草chlH基因部分序列的DNA片段而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:11為擴(kuò)增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:12為擴(kuò)增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:13為擴(kuò)增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:14為擴(kuò)增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:15為擴(kuò)增衣藻屬PPO基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:16為擴(kuò)增衣藻屬PPO基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:19為擴(kuò)增具有衣藻屬PPO基因部分序列的DNA片段而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:20為擴(kuò)增具有衣藻屬PPO基因部分序列的DNA片段而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:21為擴(kuò)增具有黃瓜鐵螯合酶基因部分序列的DNA片段而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:22為擴(kuò)增具有黃瓜鐵螯合酶基因部分序列的DNA片段而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:23為擴(kuò)增大腸桿菌hemF基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:24為擴(kuò)增大腸桿菌hemF基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:25為擴(kuò)增大腸桿菌hemF基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:26為擴(kuò)增大腸桿菌hemF基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物SEQ ID NO:27為合成可編碼含有5個(gè)氨基酸的隨機(jī)肽的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:28為合成可編碼含有5個(gè)氨基酸的隨機(jī)肽的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸
SEQ ID NO:29為合成可編碼肽HASYS的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:30為合成可編碼肽HASYS的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:31為合成可編碼肽RASSL的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:32為合成可編碼肽RASSL的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:33為合成可編碼肽MGHASYS的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:34為合成可編碼肽MGHASYS的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:35為合成可編碼肽MGRASSL的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:36為合成可編碼肽MGRASSL的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:37為合成可編碼肽MGYAGY的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:38為合成可編碼肽MGYAGY的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:39為合成可編碼肽MGYAGF的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:40為合成可編碼肽MGYAGF的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:41為合成可編碼肽MG(HASYS)4的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:42為合成可編碼肽MG(HASYS)4的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:43為合成可編碼肽MG(HASYS)4的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:44為合成可編碼肽MG(HASYS)4的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:45為合成可編碼肽MG(HASYS)8的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:46為合成可編碼肽MG(HASYS)8的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸
SEQ ID NO:47為合成可編碼肽MG(RASSL)4的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:48為合成可編碼肽MG(RASSL)4的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:49為合成可編碼肽MG(RASSL)4的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:50為合成可編碼肽MG(RASSL)4的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:51為合成可編碼肽MG(RASSL)8的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:52為合成可編碼肽MG(RASSL)8的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸SEQ ID NO:53原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白質(zhì)HASYSSEQ ID NO:54原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白質(zhì)MGHASYSSEQ ID NO:55原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白質(zhì)RASSLSEQ ID NO:56原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白質(zhì)MGRASSLSEQ ID NO:57H2TmpyP結(jié)合蛋白YAGYSEQ ID NO:58H2TmpyP結(jié)合蛋白MGYAGYSEQ ID NO:59H2TmpyP結(jié)合蛋白YAGFSEQ ID NO:60H2TmpyP結(jié)合蛋白MGYAGFSEQ ID NO:61原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白質(zhì)MG(HASYS)4SEQ ID NO:62原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白質(zhì)MG(HASYS)8SEQ ID NO:63原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白質(zhì)MG(RASSL)4SEQ ID NO:64原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白質(zhì)MG(RASSL)8
序列表&lt;110&gt;Hiroki NAKAJIMA等人；Sumitomo Chemical Company Limited&lt;120&gt;使植物產(chǎn)生對(duì)雜草控制化合物的耐受性的方法&lt;130&gt;&lt;150&gt;JP 10/120553&lt;151&gt;1998-04-30&lt;150&gt;JP 10/281127&lt;151&gt;1998-10-02&lt;150&gt;JP 10/330981&lt;151&gt;1998-11-20&lt;150&gt;JP 11/054730&lt;151&gt;1999-03-02&lt;160&gt;64&lt;210&gt;1&lt;211&gt;39&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為擴(kuò)增bchH基因設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物&lt;400&gt;1gacatctaga ggagacgacc atatgcacgg tgaagtctc 39&lt;210&gt;2&lt;211&gt;31&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為擴(kuò)增bchH基因設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物&lt;400&gt;2acggaagctt agatcttcac tcggcggcaa t 31&lt;210&gt;3&lt;211&gt;39&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為擴(kuò)增大豆PPO基因設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物&lt;400&gt;3tcgagctcca tggtttccgt cttcaacgag atcctattc 39&lt;210&gt;4&lt;211&gt;39&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為擴(kuò)增大豆PPO基因設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物&lt;400&gt;4ttgtcgacaa ctgctactat ttgtacactc tatttg 36&lt;210&gt;5&lt;211&gt;1632&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;甘氨酸最大變種Williams82&lt;220&gt;&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(1)…(1632)&lt;400&gt;5atg gtt tcc gtc ttc aac gag atc cta ttc ccg ccg aac caa acc ctt 48Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gln Thr Leu1 5 10 15ctt cgc ccc tcc ctc cat tcc cca acc tct ttc ttc acc tct ccc act 96Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr20 25 30cga aaa ttc cct cgc tct cgc cct aac cct att cta cgc tgc tcc att144Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile35 40 45gcg gag gaa tcc acc gcg tct ccg ccc aaa acc aga gac tcc gcc ccc192Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg Asp Ser Ala Pro50 55 60gtg gac tgc gtc gtc gtc ggc gga ggc gtc agc ggc ctc tgc atc gcc240Val Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser Gly Leu Cys Ile Ala65 70 75 80cag gcc ctc gcc acc aaa cac gcc aat gcc aac gtc gtc gtc acg gag288Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn Val Val Val Thr Glu85 90 95gcc cga gac cgc gtc ggc ggc aac atc acc acg atg gag agg gac gga336Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly100 105 110tac ctc tgg gaa gaa ggc ccc aac agc ttc cag cct tct gat cca atg384Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met
115 120 125ctc acc atg gtg gtg gac agt ggt tta aag gat gag ctt gtt ttg ggg432Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly130 135 140gat cct gat gca cct cgg ttt gtg ttg tgg aac agg aag ttg agg ccg480Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro145 150 155 160gtg ccc ggg aag ctg act gat ttg cct ttc ttt gac ttg atg agc att528Val Pro Gly Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile165 170 175ggt ggc aaa atc agg gct ggc ttt ggt gcg ctt gga att cgg cct cct576Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro180 185 190cct cca ggt cat gag gaa tcg gtt gaa gag ttt gtt cgt cgg aac ctt624Pro Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu195 200 205ggt gat gag gtt ttt gaa cgg ttg ata gag cct ttt tgt tca ggg gtc672Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val210 215 220tat gca ggc gat cct tca aaa tta agt atg aaa gca gca ttc ggg aaa720Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys225 230 235 240gtt tgg aag ctg gaa aaa aat ggt ggt agc att att ggt gga act ttc768Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe245 250 255aaa gca ata caa gag aga aat gga gct tca aaa cca cct cga gat ccg816Lys Ala Ile Gln Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro260 265 270cgt ctg cca aaa cca aaa ggt cag act gtt gga tct ttc cgg aag gga864Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly275 280 285ctt acc atg ttg cct gat gca att tct gcc aga cta ggc aac aaa gta912Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val290 295 300aag tta tct tgg aag ctt tca agt att agt aaa ctg gat agt gga gag960Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu305 310 315 320tac agt ttg aca tat gaa aca cca gaa gga gtg gtt tct ttg cag tgc 1008Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Leu Gln Cys325 330 335aaa act gtt gtc ctg acc att cct tcc tat gtt gct agt aca ttg ctg 1056Lys Thr Val Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Thr Leu Leu340 345 350cgt cct ctg tct gct gct gct gca gat gca ctt tca aag ttt tat tac 1104Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr355 360 365cct cca gtt gct gca gtt tcc ata tcc tat cca aaa gaa gct att aga 1152Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg370 375 380tca gaa tgc ttg ata gat ggt gag ttg aag ggg ttt ggt caa ttg cat 1200Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His385 390 395 400cca cgt agc caa gga gtg gaa aca tta gga act ata tac agc tca tca 1248Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser405 410 415cta ttc ccc aac cga gca cca cct gga agg gtt cta ctc ttg aat tac 1296Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr420 425 430att gga gga gca act aat act gga att tta tcg aag acg gac agt gaa 1344Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu435 440 445ctt gtg gaa aca gtt gat cga gat ttg agg aaa atc ctt ata aac cca 1392Leu Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Ile Leu Ile Asn Pro450 455 460aat gcc cag gat cca ttt gta gtg ggg gtg aga ctg tgg cct caa gct 1440Asn Ala Gln Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gln Ala465 470 475 480att cca cag ttc tta gtt ggc cat ctt gat ctt cta gat gtt gct aaa 1488Ile Pro Gln Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys485 490 495gct tct atc aga aat act ggg ttt gaa ggg ctc ttc ctt ggg ggt aat 1536Ala Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn500 505 510tat gtg tct ggt gtt gcc ttg gga cga tgc gtt gag gga gcc tat gag 1584Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu
515 520 525gta gca gct gaa gta aac gat ttt ctc aca aat aga gtg tac aaa tag 1632Val Ala Ala Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn Arg Val Tyr Lys530 535 540 543&lt;210&gt;6&lt;211&gt;543&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;甘氨酸最大變種Williams82&lt;400&gt;6Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gln Thr Leu1 5 10 15Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr20 25 30Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile35 40 45Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg Asp Ser Ala Pro50 55 60Val Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser Gly Leu Cys Ile Ala65 70 75 80Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn Val Val Val Thr Glu85 90 95Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly10 105 110Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met115 120 125Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly130 135 140Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro145 150 155 160Val Pro Gly Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile165 170 175Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro180 185 190Pro Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu195 200 205Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val210 215 220Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys225 230 235 240Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe245 250 255Lys Ala Ile Gln Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro260 265 270Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly275 280 285Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val290 295 300Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu305 310 315 320Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Leu Gln Cys325 330 335Lys Thr Val Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Thr Leu Leu340 345 350Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr355 360 365Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg370 375 380Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His385 390 395 400Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser405 410 415Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr420 425 430Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu435 440 445Leu Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Ile Leu Ile Asn Pro450 455 460Asn Ala Gln Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gln Ala465 470 475 480Ile Pro Gln Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys485 490 495Ala Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn500 505 510Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu515 520 525Val Ala Ala Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn Arg Val Tyr Lys530 535 540 543&lt;210&gt;7&lt;211&gt;39&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;213&gt;為擴(kuò)增bchH基因設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物&lt;400&gt;7gacatctagt ctagacgacc atatgcacgg 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36&lt;210&gt;13&lt;211&gt;33&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為擴(kuò)增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物&lt;400&gt;13cacaggaaag gtaccatggt ctgcatcgcc cag 33&lt;210&gt;14&lt;211&gt;33&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為擴(kuò)增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物&lt;400&gt;14cctgcagctc gagagctcct actatttgta cac 33&lt;210&gt;15&lt;211&gt;28&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為擴(kuò)增衣藻屬PPO基因設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物&lt;400&gt;15aatgatgttg acccagactc ctgggacc28&lt;210&gt;16&lt;211&gt;27&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為擴(kuò)增衣藻屬PPO基因設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物&lt;400&gt;16tactacacat cccagcaagc gccaatg 27&lt;210&gt;17&lt;211&gt;1838&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;雷氏衣藻CC407&lt;220&gt;&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(2)…(1693)&lt;400&gt;17a atg atg ttg acc cag act cct ggg acc gcc acg gct tct agc cgg 46Met Met Leu Thr Gln Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ala Ser Ser Arg1 5 10 15cgg tcg cag atc cgc tcg gct gcg cac gtc tcc gcc aag gtc gcg cct 94Arg Ser Gln Ile 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180 185 190Ile Pro Gly Lys Ile Arg Ala Gly Leu Gly Ala Ile Gly Leu Ile Asn195 200 205Gly Ala Met Pro Ser Phe Glu Glu Ser Val Glu Gln Phe Ile Arg Arg210 215 220Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Phe Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser225 230 235Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe240 245 250 255Asn Arg Ile Trp Ile Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Leu Val Gly Gly260 265 270Ala Ile Lys Leu Phe Gln Glu Arg Gln Ser Asn Pro Ala Pro Pro Arg275 280 285Asp Pro Arg Leu Pro Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe290 295 300Arg Lys Gly Leu Lys Met Leu Pro Asp Ala Ile Glu Arg Asn Ile Pro305 310 315Asp Lys Ile Arg Val Asn Trp Lys Leu Val Ser Leu Gly Arg Glu Ala320 325 330 335Asp Gly Arg Tyr Gly Leu Val Tyr Asp Thr Pro Glu Gly Arg Val Lys340 345 350Val Phe Ala Arg Ala Val Ala Leu Thr Ala Pro Ser Tyr Val Val Ala355 360 365Asp Leu Val Lys Glu Gln Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ser370 375 380Phe Asp Tyr Pro Pro Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Ser385 390 395Ala Val Arg Glu Glu 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gc22&lt;210&gt;32&lt;211&gt;29&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為合成可編碼肽RASSL的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸&lt;400&gt;32ggccgccaac gacgacgccc gggccagct 29&lt;210&gt;33&lt;211&gt;26&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為合成可編碼肽MGHASYS的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸&lt;400&gt;33catgggtcac gcttcttact cctaag 26&lt;210&gt;34&lt;211&gt;26&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為合成可編碼肽MGHASYS的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸&lt;400&gt;34aattcttagg agtaagaagc gtgacc 26&lt;210&gt;35&lt;211&gt;26&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為合成可編碼肽MGRASYS的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸&lt;400&gt;35catgggtcgt gcttcttccc tgtaag 26&lt;210&gt;36&lt;211&gt;26&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為合成可編碼肽MGRASSL的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸&lt;400&gt;36aattcttaca gggaagaagc acgacc 26&lt;210&gt;37&lt;211&gt;23&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為合成可編碼肽MGYAGY的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸&lt;400&gt;37catgggttac gctggctact 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37&lt;210&gt;44&lt;211&gt;35&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為合成可編碼肽MG(HASYS)4的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸&lt;400&gt;44aattcttagg agtaagatgc atgggagtaa gaagc 35&lt;210&gt;45&lt;211&gt;30&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為合成可編碼肽MG(HASYS)8的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸&lt;400&gt;45tcccacgctt cttactccca tgcatcttac 30&lt;210&gt;46&lt;211&gt;30&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為合成可編碼肽MG(HASYS)8的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸&lt;400&gt;46gtgggagtaa gatgcatggg agtaagaagc 30&lt;210&gt;47&lt;211&gt;34&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為合成可編碼肽MG(RASSL)4的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸&lt;400&gt;47catgggtcgt gcttcttccc tgcgcgcatc ttcc 34&lt;210&gt;48&lt;211&gt;36&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為合成可編碼肽MG(RASSL)4的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸&lt;400&gt;48acgcagggaa gatgcgcgca gggaagaagc acgacc 36&lt;210&gt;49&lt;211&gt;37&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為合成可編碼肽MG(RASSL)4的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸&lt;400&gt;49ctgcgtgctt cttccctgcg cgcatcttcc ctgtaag 37&lt;210&gt;50&lt;211&gt;35&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為合成可編碼肽MG(RASSL)4的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸&lt;400&gt;50aattcttaca gggaagatgc gcgcagggaa gaagc 35&lt;210&gt;51&lt;211&gt;30&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為合成可編碼肽MG(RASSL)8的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸&lt;400&gt;51ctgcgtgctt cttccctgcg cgcatcttcc 30&lt;210&gt;52&lt;211&gt;30&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;為合成可編碼肽MG(RASSL)8的基因而設(shè)計(jì)的寡核苷酸peptide MG(RASSL)8&lt;400&gt;52acgcagggaa gatgcgcgca gggaagaagc 30&lt;210&gt;53&lt;211&gt;5&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;原卟啉 Ⅸ結(jié)合蛋白 HASYS&lt;400&gt;53His Ala Ser Tyr Ser1 5&lt;210&gt;54&lt;211&gt;7&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;原卟啉 Ⅸ結(jié)合蛋白 MGHASYS&lt;400&gt;54Met Gly His Ala Ser Tyr Ser1 5&lt;210&gt;55&lt;211&gt;5&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;原卟啉phyrin Ⅸ結(jié)合蛋白 RASSL&lt;400&gt;55Arg Ala Ser Ser Leu1 5&lt;210&gt;56&lt;211&gt;7&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白MGRASSL&lt;400&gt;56Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu15&lt;210&gt;57&lt;211&gt;4&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;H2TMpyP 結(jié)合蛋白 YAGY.&lt;400&gt;57Tyr Ala Gly Tyr 4&lt;210&gt;58&lt;211&gt;6&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;HzTMpyP 結(jié)合蛋白 MGYAGY&lt;400&gt;58Met Gly Tyr Ala Gly Tyr1 5&lt;210&gt;59&lt;211&gt;4&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;H2TMpyP結(jié)合蛋白YAGF&lt;400&gt;59Tyr Ala Gly Phe1&lt;210&gt;60&lt;211&gt;6&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;H2TMpyP結(jié)合蛋白MGYAGF&lt;400&gt;60Met Gly Tyr Ala Gly Phe1 5&lt;210&gt;61&lt;211&gt;22&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白MG(HASYS)4&lt;400&gt;61Met Gly His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr1 5 10 15Ser His Ala Ser Tyr Ser20&lt;210&gt;62&lt;211&gt;42&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白MG(HASYS)8&lt;400&gt;62Met Gly His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr1 5 10 15Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser20 25 30His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser35 40&lt;210&gt;63&lt;211&gt;22&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;原卟啉Ⅸ結(jié)合蛋白MG(RASSL)4&lt;400&gt;63Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser1 5 10 15Leu Arg Ala Ser Ser Leu20&lt;210&gt;64&lt;211&gt;42&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;原卟啉 Ⅸ結(jié)合蛋MG(RASSL)8.&lt;400&gt;64Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser1 5 10 15Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu20 25 30Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu35 40
權(quán)利要求
1．一種使植物產(chǎn)生雜草防治化合物耐受性的方法，包括下列步驟將一種可編碼一種蛋白質(zhì)的基因引入植物細(xì)胞并且表達(dá)該基因，所述的蛋白質(zhì)具有下列(a)至(c)特征(a)對(duì)可導(dǎo)致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質(zhì)具有特異性親和性；(b)對(duì)與所述蛋白質(zhì)有特異性親和性的物質(zhì)基本不具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白中可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中以這樣一種方式將基因引入植物細(xì)胞、即以可操作的方式將它與均可在植物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子和終止子進(jìn)行連接。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中可導(dǎo)致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質(zhì)是雜草防治化合物自身。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中可導(dǎo)致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質(zhì)是衍生于一種植物的內(nèi)源性物質(zhì)。
5．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中雜草防治化合物是可抑制植物卟啉的生物合成的物質(zhì)。
6．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中雜草防治化合物是原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物。
7．根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中可導(dǎo)致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質(zhì)是原卟啉Ⅸ。
8．根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中蛋白質(zhì)是鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結(jié)合亞單位蛋白、或?qū)υ策哂刑禺愋杂H和性的蛋白質(zhì)變體。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中蛋白質(zhì)是衍生于光合微生物的鎂螯合酶。
10．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中蛋白質(zhì)是衍生于一種植物的鎂螯合酶。
11．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中蛋白質(zhì)是衍生于煙草的鎂螯合酶。
12．根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
13．根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
14．根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
15．根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
16．根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
17．根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
18．根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
19．根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
20．根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中蛋白質(zhì)由4-100個(gè)氨基酸組成。
21．根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中可導(dǎo)致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質(zhì)是原卟啉原Ⅸ。
22．根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中蛋白質(zhì)是一種對(duì)原卟啉原Ⅸ沒有氧化能力、而對(duì)原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
23．根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中蛋白質(zhì)是一種對(duì)原卟啉原Ⅸ沒有氧化能力、而對(duì)原卟啉Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物具有特異性親和性的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
24．根據(jù)權(quán)利要求22或23的方法，其中蛋白質(zhì)是一種衍生于植物的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
25．根據(jù)權(quán)利要求22或23的方法，其中蛋白質(zhì)是一種衍生于大豆的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
26．根據(jù)權(quán)利要求22或23的方法，其中蛋白質(zhì)是一種衍生于藻類的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
27．根據(jù)權(quán)利要求22或23的方法，其中蛋白質(zhì)是一種衍生于衣藻屬的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
28．一種使植物產(chǎn)生雜草控制化合物抗性的方法，包括下列步驟將一種可編碼一種蛋白質(zhì)的基因引入植物細(xì)胞并且表達(dá)該基因，所述的蛋白質(zhì)具有下列(a)至(c)特征(a)對(duì)原卟啉Ⅸ具有特異性親和性；(b)對(duì)原卟啉原Ⅸ基本不具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白中可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)。
29．根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中在植物細(xì)胞中以這樣一種方式將基因引入植物細(xì)胞、即以可操作的方式將該基因與均可在植物細(xì)胞內(nèi)起作用的啟動(dòng)子和終止子進(jìn)行連接。
30．根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中雜草防治化合物是可抑制植物卟啉的生物合成的物質(zhì)。
31．根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中雜草防治化合物是一種原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物。
32．根據(jù)權(quán)利要求30或31的方法，其中蛋白質(zhì)是鎂螯合酶或?qū)υ策哂刑禺愋杂H和性的所述蛋白質(zhì)的變體。
33．根據(jù)權(quán)利要求30或31的方法，其中蛋白質(zhì)是鐵螯合酶或?qū)υ策哂刑禺愋杂H和性的所述蛋白質(zhì)的變體。
34．根據(jù)權(quán)利要求30或31的方法，其中蛋白質(zhì)是衍生于一種植物鐵螯合酶。
35．根據(jù)權(quán)利要求30或31的方法，其中蛋白質(zhì)是衍生于大麥屬的鐵螯合酶。
36．根據(jù)權(quán)利要求30或31的方法，其中蛋白質(zhì)是來自黃瓜的鐵螯合酶。
37．根據(jù)權(quán)利要求30或31的方法，其中蛋白質(zhì)是一種由4-100個(gè)氨基酸組成的肽。
38．一種使植物產(chǎn)生雜草防治化合物耐受性的方法，包括下列步驟將一種可編碼一種蛋白質(zhì)的基因引入植物細(xì)胞并且表達(dá)該基因，所述的蛋白質(zhì)具有下列(a)至(c)特征(a)對(duì)原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性；(b)對(duì)糞卟啉原Ⅲ具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白中可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)。
39．根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中以這樣一種方式將基因引入植物細(xì)胞、即以可操作的方式將該基因與均可在植物細(xì)胞內(nèi)起作用的啟動(dòng)子和終止子進(jìn)行連接。
40．根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中蛋白質(zhì)是糞卟啉原Ⅲ或?qū)υ策哂刑禺愋杂H和性的所述蛋白質(zhì)的變體。
41．根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中蛋白質(zhì)是衍生于一種微生物的糞卟啉原Ⅲ氧化酶。
42．根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中蛋白質(zhì)是衍生于大腸桿菌的糞卟啉原Ⅲ氧化酶。
43．一種耐雜草防治化合物的植物，其耐受性按照權(quán)利要求1或28的方法而產(chǎn)生。
44．一種耐雜草防治化合物的植物，其耐受性按照權(quán)利要求38的方法而產(chǎn)生。
45．一種用于保護(hù)植物的方法，包括給所述權(quán)利要求43的植物的生長(zhǎng)區(qū)施用所述的雜草防治化合物。
46．一種用于保護(hù)植物的方法，包括給所述權(quán)利要求44的植物的生長(zhǎng)區(qū)施用所述的雜草防治化合物。
47．一種用于選擇植物的方法，包括給權(quán)利要求43的植物和其它植物的生長(zhǎng)區(qū)施用對(duì)權(quán)利要求43植物來說是耐受性的雜草防治化合物、并且根據(jù)植物間的生長(zhǎng)差異來選擇植物。
48．一種用于選擇植物的方法，包括給權(quán)利要求44的植物和其它植物的生長(zhǎng)區(qū)施用對(duì)權(quán)利要求44植物來說是耐受性的雜草防治化合物、并且根據(jù)植物間的生長(zhǎng)差異來選擇植物。
49．根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中植物是植物細(xì)胞。
50．根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中植物是植物細(xì)胞。
51．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中雜草防治化合物是選自下列(1)至(3)化合物的原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物；并且可導(dǎo)致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質(zhì)是原卟啉Ⅸ、原卟啉原Ⅸ或一種原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物(1)氯硝醚、治草醚、草枯醚、氟鎖草醚及其乙酯、氟鎖草醚鈉、氟硝草醚、惡草靈、2-[4-氯-2-氟-5-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,3,4,5,6,7-六氫化-1H-異吲哚-1,3-二酮、chlorphthalim、乙基TNPP、或N3-(1-苯乙基)-2,6-二甲基-5-丙炔基(propyonyl)煙酰胺；(2)由一般通式J-G(1)任意一個(gè)所代表的化合物，其中G是由通式G-1至G-9之任一，J是由通式J-1至J-30之任一代表的基團(tuán)
其中通式J-5、J-6、J-12和J-24中的虛線代表含有單鍵的左旋環(huán)；或環(huán)中的一個(gè)鍵是碳原子間的雙鍵；X是氧原子或硫原子；Y是氧原子或硫原子；R1是氫原子或鹵原子；R2是氫原子、C1-C8烷基、C1-C8鹵代烷基、鹵原子、OH基、OR27基、SH基、S(O)pR27基、COR27基、CO2R27基、C(O)SR27基、C(O)NR29R30基、CHO基、CR27=NOR36基、CH=CR37CO2R27基、CH2CHR37CO2R27基、CO2N=CR31R32基、硝基、氰基、NHSO2R33基、NHSO2NHR33基、NR27R38基、NH2基或任意用一個(gè)或多個(gè)以及相同或不同的C1-C44烷基取代的苯基；P是0、1或2；R3是C1-C2烷基、C1-C2鹵代烷基、OCH3基、SCH3基、OCHF2基、鹵原子、氰基或硝基；R4氫原子、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基或鹵原子；R5是氫原子、C1-C3烷基、鹵原子、C1-C3鹵代烷基、環(huán)丙基、乙烯基、C2炔基、氰基、C(O)R38基、CO2R38基、C(O)NR38R39基、CR34R35CN基、CR34R35C(O)R38基、CR34R35CO2R38基、CR34R35C(O)NR38R39基、CHR34OH基、CHR34OC(O)R38基或OCHR34OC(O)NR38R39基；或當(dāng)G是G-2或G-6時(shí)，R4和R5可以與連接它們的碳原子一起形成C=O基；R6是C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C2-C6烷氧基烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；X1是單鍵、氧原子、硫原子、NH基、N(C1-C3烷基)基團(tuán)、N(C1-C3鹵代烷基)基團(tuán)或N(烯丙基)基團(tuán)；R7是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、鹵原子、S(O)2(C1-C6烷基)基團(tuán)或C(=O)R40基；R8是氫原子、C1-C8烷基、C3-C8環(huán)烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C1-C8鹵代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C3-C8烷氧基烷氧基烷基、C3-C8鹵代炔基、C3-C8鹵代鏈烯基、C1-C8烷磺?；?、C1-C8鹵代烷磺?；?、C3-C8烷氧基羰基烷基、S(O)2NH(C1-C8烷基)基團(tuán)、C(O)R41基或其苯環(huán)可以被R42取代的芐基；n和m獨(dú)立地為0、1、2或3且m+n為2或3；Z是CR9R10基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基團(tuán)；R9各自獨(dú)立地為氫原子、C1-C3烷基、鹵原子、羥基、C1-C6烷氧基、C1-C6鹵代烷基、C1-C6鹵代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6鹵代烷基羰基氧基；R10各自獨(dú)立地為氫原子、C1-C3烷基、和羥基或鹵原子；R11和R12獨(dú)立地為氫原子、鹵原子、C1-C6烷基、C3-C6鏈烯基或C1-C6鹵代烷基；R13是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6鹵代鏈烯基、C3-C6炔基、C3-C6鹵代炔基、HC(=O)基、(C1-C4烷基)C(=O)基團(tuán)或NH2基；R14是C1-C6烷基、C1-C6烷硫基、C1-C6鹵代烷基或N(CH3)2基；W是氮原子或CR15；R15是氫原子、C1-C6烷基、鹵原子、任意被C1-C6烷基或一個(gè)或多個(gè)鹵原子取代的苯基、C1-C6烷氧基或CF3基；Q各自獨(dú)立地為氧原子或硫原子；Q1是氧原子或硫原子；Z1是CR16R17基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基團(tuán)；R16各自獨(dú)立地為氫原子、鹵原子、羥基、C1-C6烷氧基、C1-C6鹵代烷基、C1-C6鹵代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6鹵代烷基羰基氧基；R17各自獨(dú)立地為氫原子、羥基或鹵原子；R18是C1-C6烷基、鹵原子或C1-C6鹵代烷基；R19和R20獨(dú)立地為氫原子、C1-C6烷基或C1-C6鹵代烷基；Z2是氧原子、硫原子、NR9基或CR9R10基；R21和R22獨(dú)立地為C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6鹵代鏈烯基、C3-C6炔基或C3-C6鹵代炔基；R23是氫原子、鹵原子或氰基；R24是C1-C6烷磺酰基、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6鹵代烷氧基或鹵原子；R25是C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；R26是C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基或任意被取代基取代的苯基，所述的取代基選自由1-2個(gè)鹵原子、1-2個(gè)硝基、C1-C6烷氧基和CF3基組成的組；W1是氮原子或CH基；T是由下列一般通式T-1、T-2和T-3所代表的任意基團(tuán)之一
(其中E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11和E12獨(dú)立地為氫原子或C1-C3烷基)；R27是C1-C8烷基、C3-C8環(huán)烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C1-C8鹵代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C2-C8烷硫基烷基、C2-C8烷亞磺酰基烷基、C2-C8烷磺?；榛?、C1-C8烷磺?；?、其苯環(huán)可以被至少一個(gè)選自由鹵原子和C1-C4烷基組成的組的取代基取代的苯磺?；?、C4-C8烷氧基烷氧基烷基、C4-C8環(huán)烷基烷基、C6-C8環(huán)烷氧基烷基、C4-C8鏈烯基氧基烷基、C4-C8炔基氧基烷基、C3-C8鹵代烷氧基烷基、C4-C8鹵代鏈烯基氧基烷基、C4-C8鹵代炔基氧基烷基、C6-C8環(huán)烷硫基烷基、C4-C8鏈烯基硫代烷基、C4-C8炔基硫代烷基、被苯氧基取代的C1-C4烷基；其中苯氧基的苯環(huán)被至少一個(gè)選自由鹵原子、C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基組成的組的取代基取代、被芐氧基取代的C1-C4烷基；其中芐氧基的環(huán)被至少一個(gè)選自由鹵原子、C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基組成的組的取代基取代、C4-C8三烷基甲硅烷基烷基、C3-C8氰基烷基、C3-C8鹵代環(huán)烷基、C3-C8鹵代鏈烯基、C5-C8烷氧基鏈烯基、C5-C8鹵代烷氧基鏈烯基、C5-C8烷基硫代鏈烯基、C3-C8鹵代炔基、C5-C8烷氧基鏈烯基、C5-C8鹵代烷氧基鏈烯基、C5-C8烷基硫代炔基、C2-C8烷基羰基、其苯環(huán)被至少一個(gè)選自由鹵原子、C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基組成的組的取代基取代的芐基、CHR34COR28基、CHR34COOR28基、CHR34P(O)(OR28)2基、CHR34P(S)(OR28)2基、CHR34C(O)NR29R30基或CHR34C(O)NH2基；R28是C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基或四氫呋喃基；R29和R31獨(dú)立地為氫原子或C1-C4烷基；R30和R32獨(dú)立地為C1-C4烷基或其環(huán)可以被至少一個(gè)取代基取代的苯基，所述的取代基選自由鹵原子、C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基組成的組；或R29和R30一起可以形成-(CH2)5-、-(CH2)4-或-CH2CH2OCH2CH2-，或由此形成的環(huán)可以被至少一個(gè)選自由C1-C3烷基、苯基和芐基組成的組的取代基取代；或R31和R32與連接它們的碳原子一起可以形成C3-C8環(huán)烷基；R33是C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基或C3-C6鏈烯基；R34和R35獨(dú)立地為氫原子或C1-C4烷基；R36是氫原子、C1-C6烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；R37是氫原子、C1-C4烷基或鹵原子；R38是氫原子、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6鹵代烷基、其環(huán)可以被選自由鹵原子、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基組成的組的取代基取代的苯基、-CH2CO2(C1-C4烷基)基團(tuán)或-CH(CH3)CO2(C1-C4烷基)基團(tuán)；R39是氫原子、C1-C2烷基或C(O)O(C1-C4烷基)基團(tuán)；R40是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或NH(C1-C4烷基)基團(tuán)；R41是C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C1-C6烷氧基、NH(C1-C4烷基)基團(tuán)、其環(huán)可以被選自由基團(tuán)R42、芐基和C2-C8二烷氨基組成的組的一個(gè)取代基取代的苯基；且R42是C1-C6烷氧基、一個(gè)或兩個(gè)鹵原子、C1-C6烷氧基或CF3基；(3)通式(Ⅱ)的化合物
或nipilacrofen，其中R43是C1-C4烷基；R44是C1-C4烷基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4鹵代烷基、C1-C4鹵代烷硫基和C1-C4鹵代烷氧基；R43和R44一起可以形成-(CH2)3-或-(CH2)4-；R45是氫原子或鹵原子；R46是氫原子或C1-C4烷基；R47是氫原子、硝基、氰基、-COOR49、-C(=X)NR50R51基或-C(=X2)R52基；R48是氫原子、鹵原子、氰基、被至少一個(gè)選自由鹵原子和羥基組成的組的取代基任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、被至少一個(gè)選自由鹵原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和鹵代C1-C4烷基組成的組的取代基任意取代的苯基、吡咯基、C2-C8烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C3-C8烷氧基、選自由C2-C8烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基和C3-C8烷氧基組成的組的一個(gè)基團(tuán)，在該基團(tuán)中至少插入一個(gè)氧原子；或R48是由下列通式所代表的任意一個(gè)基團(tuán)-NR53R54
-OR58-S(O)fR59
-(CH2)a-A-(CH2)a-O-(CH2)b-R64-(CH2)a-O-R65-COR66其中R49、R50和R52相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R50和R51與連接它們的氯原子一起可以形成飽和的脂環(huán)5或6節(jié)環(huán)；R52是氫原子、C1-C4烷基或被至少一個(gè)鹵原子取代的C1-C4烷基；R53是氫原子、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C3-C6的炔基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的苯基、C3-C8環(huán)烷基、氰甲基、或R63CO-基；R54是氫原子、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C1-C6烷基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C3-C6炔基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的苯基、C3-C8環(huán)烷基、氰甲基、C1-C4烷氧基-C1-C6烷基、二-C1-C4烷氨基-C1-C4烷基、四氫糠基甲基、C3-C6炔基氧基-C1-C4烷基、其環(huán)可以被選自由鹵原子、硝基、氰基、C1-C4烷氧基和鹵代-C1-C4烷基組成的組的取代基取代的芐基、-C(=X2)R63基、-(CH2)a-(O)d-R70基、-(CH2)a-(O)b-R70基、-(CH2)a-X2-R76基；R53和R54與連接它們的碳原子一起可以形成飽和脂環(huán)3、5或6節(jié)環(huán)或芳香5或6節(jié)環(huán)，它的一個(gè)環(huán)碳原子可以被氧原子取代；R55是氫原子、C1-C4烷基、C2-C6鏈烯基或C3-C6炔基；或R55和R56一起可以形成-(CH2)e-；R56和R57獨(dú)立地為被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C3-C6炔基或被至少一個(gè)鹵原子任意取代的苯基、氫原子、C3-C6環(huán)烷基、XR60基或-NR61R62基；R58是氫原子、C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C1-C4烷基羰基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、二C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、芐基、C1-C4烷氧基--C1-C4炔基、-(CH2)a-R75基、-(CH2)a-X2-R72基、-(CH2)a-X2-(CH2)b-R72基或-(CH2)a-X2-(CH2)b-X2-(CH2)c-R72基；R59是氫原子、C1-C4烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷基羰基-C1-C3烷基或苯基；R60是被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C1-C4烷基；R61和R62相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R63是被至少一個(gè)鹵原子任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷基、C1-C4烷硫基-C1-C4烷基、C3-C6環(huán)烷基、其環(huán)可以被至少一個(gè)選自由鹵原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和鹵代--C1-C4烷基組成的組的取代基取代的苯基、-NR73R74基或-(CH2)a-(O)d-R75基；R64是C1-C4烷氧基羰基或羧基；R65是氯甲基、氰甲基、至少可以插入一個(gè)氧原子的C3-C6環(huán)烷基、或C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基；R66是羥基或-NR67R68基；A是-NR67R68基或-S(O)f-R69基；R67和R68相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R69是C1-C4烷基或C1-C4鹵代烷基；R70是氫原子、羥基、鹵原子、被至少一個(gè)C1-C4烷氧基任意取代的C1-C4烷基、至少可以插入一個(gè)氧原子的C3-C6環(huán)烷基、被一個(gè)或兩個(gè)甲基任意取代的C3-C6環(huán)烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；R71和R72相同或不同、為C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；R73和R74相同或不同、為C1-C4烷基或苯基；R75是可以插入至少一個(gè)氧原子的C3-C6環(huán)烷基、被一個(gè)或兩個(gè)甲基任意取代的C3-C6環(huán)烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；R76是C1-C4烷基；a、b和c獨(dú)立地為1、2或3；d是0或1；e是2或3；f是1或2；且X2是氧原子或硫原子。
全文摘要
通過將一種可編碼一種蛋白質(zhì)的基因引入植物細(xì)胞并且表達(dá)該基因而產(chǎn)生耐雜草防治化合物的植物,所述的蛋白質(zhì)具有至少下列(a)至(c)特征:(a)對(duì)可導(dǎo)致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質(zhì)具有特異性親和性;(b)對(duì)與所述蛋白質(zhì)有特異性親合性的物質(zhì)不具有修飾能力;(c)基本上不含免疫球蛋白中可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)。
文檔編號(hào)C12N9/00GK1236010SQ99105300
公開日1999年11月24日 申請(qǐng)日期1999年4月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月30日
發(fā)明者中島寬樹, 長(zhǎng)澤秋都 申請(qǐng)人:住友化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社