專利名稱：測試抗細(xì)菌粘附組合物的方法
背景技術(shù)：
用清潔劑清洗人類皮膚與同時能夠除菌聯(lián)系在一起已經(jīng)有一百多年了。但是，皮膚清洗制劑在除菌方面，無論是其定性的還是定量的效果，都沒有展示給其消費(fèi)公眾一個可見的證明。用放射性標(biāo)記細(xì)菌，然后再在皮膚樣品上清點(diǎn)殘留放射性標(biāo)記的數(shù)量，這當(dāng)然不是一個可被接受的方法。
相似的，人們可能對如何防止細(xì)菌粘附到各種身體細(xì)胞上也存在不斷增長的興趣。文獻(xiàn)USP5,002,759指出了抑制一種鏈球菌的生膿原粘附到位于口腔內(nèi)的一種特殊細(xì)胞上。另一份文獻(xiàn)，USP5,683,991，特別指出了通過應(yīng)用特殊的半乳糖醛酸抑制大腸桿菌(E.coli)粘附到消化道上皮細(xì)胞和泌尿生殖道上皮細(xì)胞。EP806935A指出利用一種糖類或其衍生物作為抗粘附劑，用于抵抗包括細(xì)菌，寄生蟲和原生動物在內(nèi)的許多有害物粘附到細(xì)胞表面，譬如，皮膚，粘膜，體孔，傷口，眼睛和頭發(fā)。USP5,416,075公開了一種水包油乳狀劑的用途，這種乳狀劑包含一種在其親水部分頭部末端具有生物特殊部分的兩親性分子。這些組合物可應(yīng)用于皮膚。其頭部基團(tuán)抑制了細(xì)菌粘附到皮膚上。
然而，這一方法的效果并沒有迅速可見的證明。
這樣的方法現(xiàn)在已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)了。其速度快。能可見的證實(shí)任何這類確實(shí)的或者假設(shè)的有效組合物的效果。而且，它對許多可以傳播到皮膚上的細(xì)菌有效。
發(fā)明概述根據(jù)這項(xiàng)發(fā)明，有一種可以可見的證明抗菌粘附組合物有效性的方法，該方法包括a．用潛在的或者已知的抑制細(xì)菌粘附的組分處理皮膚；b．該皮膚接觸細(xì)菌，使細(xì)菌沾附到皮膚上；c．該皮膚接觸細(xì)菌生長支持培養(yǎng)基，可選擇地，事先在其中加入或者后來在其中加入一種有助于可見的檢測細(xì)菌菌落的化合物或者混合物。
應(yīng)當(dāng)指出，大多數(shù)人通常能夠檢測到生長在瓊脂平板或者其他支持培養(yǎng)基上的細(xì)菌菌落，并且能成功的比較有大量細(xì)菌生長的培養(yǎng)基與有輕度或者中度細(xì)菌生長的培養(yǎng)基。這樣的細(xì)菌作為有色的小團(tuán)是肉眼可見的，無需使用另外的用于可見檢測的培養(yǎng)基。這樣的細(xì)菌包括粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)，金黃色葡萄球菌(Straphylococcus aureus)，熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，綠膿桿菌(Pseudomonas aeroginosa),Bacteroidesasaccharolytics和產(chǎn)黑素?cái)M桿菌(bacteroidesmelaninogenicus)。
然而，細(xì)菌生長培養(yǎng)基中常常含有特定的組分，這些組分可以特異的支持某種細(xì)菌的生長，并使細(xì)菌出現(xiàn)可見的顏色。此外，培養(yǎng)基中還可以含有其他特定化合物，把這種特定的化合物加在生長培養(yǎng)基中，可以在有其他細(xì)菌存在的情況下選擇性的使特定細(xì)菌著色。
本發(fā)明更深層的方面是一種方法，該方法不僅可以可見地評估潛在的或者已知的抑制細(xì)菌吸附組合物的相對有效性，包括上述用于評價的每種細(xì)菌吸附組合物的a,b和c三步，還可以就每一所述的組合物，測試和比較皮膚上的可見菌落數(shù)量。
發(fā)明詳述被抑制而不能吸附到皮膚上的細(xì)菌樣品包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis),Corynebacterium minutissimum，大腸桿菌(Escherichia coli)，豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)，以及其他在這項(xiàng)申請中提到的細(xì)菌。
這項(xiàng)測試簡單易行，它為估算皮膚上細(xì)菌的可見數(shù)量提供了一個簡單的方法。把一塊皮膚接觸可能能抑制細(xì)菌吸附的被測試組合物，這種皮膚包括但不局限于來自機(jī)體的外植皮膚，或者來自動物和人體的其他來源的皮膚，合成皮膚等，例如手。在相似的部分皮膚上進(jìn)行對照試驗(yàn)，對照組合物中不含有被測試組合物中所含有的所謂的抑制細(xì)菌粘附的成分。例如，在一塊皮膚(一只手)上使用含有細(xì)菌粘附抑制劑的肥皂組合物。在另一只手上，使用不含有該細(xì)菌粘附抑制劑的肥皂組合物。每只手都接觸一種特定細(xì)菌或者多樣的細(xì)菌，抑制細(xì)菌粘附組合物被認(rèn)為對這種特定細(xì)菌或者多樣的細(xì)菌是有功效的。過一段時間，用手接觸可以支持細(xì)菌生長的細(xì)菌生長支持固體培養(yǎng)基，或者接觸可以容易地加入細(xì)菌生長所需養(yǎng)分的培養(yǎng)基。生長支持培養(yǎng)基的一個例子是瓊脂。在培養(yǎng)基中事先混合或者在適當(dāng)時間之后加入足夠量的生長營養(yǎng)成分，這可以使得從皮膚轉(zhuǎn)移過來的各種各樣的細(xì)菌生長起來。經(jīng)過一段細(xì)菌生長所需的適當(dāng)時間之后，時間長短至少部分地依賴于溫度，菌的種類等，帶菌的培養(yǎng)基就可以被可見的評定了。
如前所述，具有正常視力的人可以看到細(xì)菌菌落，并且可以區(qū)分生長的各種水平，比如大量生長，中度生長。這沒有使用任何附加的視覺效果，即細(xì)菌沒有任何天然顏色。前面提到，有些細(xì)菌確實(shí)具有天然的顏色。另外，因?yàn)樵S多細(xì)菌當(dāng)生長在含有特定養(yǎng)分的培養(yǎng)基中時，可以產(chǎn)生色素，所以可以根據(jù)營養(yǎng)生長物質(zhì)的特性使細(xì)菌菌落帶有顏色。這樣的培養(yǎng)基在性質(zhì)上是可以有選擇性和有差別的。例如，下述培養(yǎng)基可以使以下的細(xì)菌具有顏色色素·在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上，大腸桿菌(Escherichia coli)產(chǎn)生帶有特有的綠色金屬光澤的菌落。這種營養(yǎng)培養(yǎng)基含有這樣一些成分蛋白胨，乳糖，磷酸氫二鉀，曙紅Y(Eosin Y)，亞甲基藍(lán)(Methylene Blue)，瓊脂，pH值6.8。
·在甘露醇鹽瓊脂培養(yǎng)基上，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)產(chǎn)生帶有特有的黃色的菌落。這種營養(yǎng)培養(yǎng)基在每升純水中含有以下成分酪蛋白胰酶消化物 5.0g動物組織胃蛋白酶消化物5.0g牛肉提取物1.0g氯化鈉75.0g酚紅 0.025g瓊脂 15.0g·一種大腸桿菌感受態(tài)菌株E.coli HB101在含有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷酶)，IPTG(異丙基-β-硫代半乳糖-吡喃糖苷)的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生藍(lán)色菌落。LB培養(yǎng)基含有細(xì)菌用胰蛋白胨，酵母提取物，NaCl，瓊脂和水。
·胰胨豆胨瓊脂培養(yǎng)基組合物每升純水中的近似配方酪蛋白胰消化物 15.0g大豆粉胃酶消化物5.0g氯化鈉 5.0g瓊脂15.0g在這種培養(yǎng)基上，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)產(chǎn)生紅色菌落。
·下列腸細(xì)菌在特殊的培養(yǎng)溫度下也可以產(chǎn)生色素*生物體 菌落顏色 有色菌落(培養(yǎng)溫度℃) ％成團(tuán)腸桿菌 黃76-89(Enterobacter agglomerans)斯氏歐文氏菌 黃(27)90-100(Erwinia stewartii)赫氏埃希氏菌 黃90-100(Escherichia hermannii)發(fā)光致病桿菌 黃，橙或紅(25)90-100(Xenorhabdus luminescens)波氏致病桿菌 褐90-100(Xenorhabdus poinarii)*Manual of Clinical Microbiology，第六版，459頁還有更多的含有特殊化合物或者混合物的這種培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基可以與生長中細(xì)菌巧妙復(fù)雜的酶代謝物發(fā)生反應(yīng)或者相互作用，產(chǎn)生可用于鑒定細(xì)菌的可見顏色。WO9739103,FR2708286,FR2708285和WO9409152公開了這樣的化合物，這幾項(xiàng)專利的發(fā)明人都是Alain Rambach。一種含有這樣的色原體(chromogen)的典型的培養(yǎng)基例示如下，這種培養(yǎng)基可以以脫水粉末形式從CHROM agarCompany,Paris,France購得。
組合物·蛋白胨
·肉類提取物·酵母提取物·瓊脂·色原體(一種辛酸脂，特別是吲哚辛酸)40-200mg/l在這種培養(yǎng)基上，Salmonnella產(chǎn)生藍(lán)色菌落。
·在CHROMMagar指示培養(yǎng)基上，各種各樣的細(xì)菌菌落有不同的顏色。例如大腸桿菌(E.coli) 粉紅色肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae) 金屬藍(lán)色腸桿菌屬(Enterobacter species) 金屬藍(lán)色金黃色葡萄球菌(Staph.aureus) 白色至黃色弗氏檸檬酸細(xì)菌(Citrobacter freundii) 金屬藍(lán)色腸球菌屬(Enterococcus species) 青綠色(Ref.J.Clin.Microbiol.36(4):990-994,1998)。
根據(jù)培養(yǎng)基上肉眼可見的細(xì)菌數(shù)量評定結(jié)果培養(yǎng)基上肉眼可見的細(xì)菌菌落數(shù)量越少，抑制細(xì)菌粘附組合物越有效用，與之相反，培養(yǎng)基上肉眼可見的細(xì)菌菌落數(shù)量越多，抑制細(xì)菌粘附組合物越?jīng)]有效用。
這里所用到的皮膚這個詞是指，頂層皮膚(即角化層)和這層的所有成分，包括細(xì)胞的和非細(xì)胞的(即生物分子)，比如蛋白質(zhì)，糖類，脂類等。
任何一種潛在的或者已知的抑制細(xì)菌粘附到皮膚上的成分，都可以用這種方法來評估。前面所討論的組合物，除了能抑制細(xì)菌粘附到皮膚上之外，都在美國暫時申請60/087,533和60/087,532中有公布，在此引入作為參考文獻(xiàn)。這些組合物是一些組合物，這種組合物包括表面活性劑與能達(dá)到抑制細(xì)菌粘附效果含量的硅氧烷，例如聚二甲基硅氧烷(dimethicone)，或者表面活性劑與能達(dá)到抑制細(xì)菌粘附效果含量的烴類成分，例如礦脂，minerol oil，石蠟等，或者表面活性劑與能達(dá)到抑制細(xì)菌粘附效果含量的硅氧烷和烴類成分的混合物。一種陰離子聚合物可以與硅氧烷，或者烴類成分，或者這二者同時出現(xiàn)在其中。各種各樣的其他成分也可以出現(xiàn)在其中，比如香料；抗微生物材料，例如Triclosan或者trichlorocarbanilides等。但是，抗微生物材料，例如Triclosan或者triclocarban可以不必加入。
這種方法可以用于已知的與未知的抑制細(xì)菌吸附組合物之間的相互比較或者對比，或者它們與對照組合物之間的相互比較或者對比。
可以通過任何形式的接觸把細(xì)菌轉(zhuǎn)移到皮膚，例如，皮膚接觸皮膚，或者皮膚接觸帶有這樣細(xì)菌的表面，比如，門把手，水龍頭，電話，桌面等。當(dāng)細(xì)菌有足夠大的濃度時，甚至能夠通過空氣形式傳播。
把細(xì)菌從皮膚轉(zhuǎn)移到生長支持培養(yǎng)基上，可以通過簡單地把帶菌的皮膚表面接觸培養(yǎng)基表面。把手按到瓊脂培養(yǎng)基的表面就是這種轉(zhuǎn)移的一個例子。
通過在細(xì)菌最適生長溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，并在事先沒加有養(yǎng)分的支持生長培養(yǎng)基中加入養(yǎng)分，細(xì)菌便可以生長成各種各樣的菌落。經(jīng)過這些細(xì)菌生長所必需的一段時間之后，這段時間的長短至少部分取決于溫度，pH值，細(xì)菌類型等，無需前面所述的包括培養(yǎng)基或者化合物在內(nèi)的顏色幫助，就可以直接看到細(xì)菌。然而，如果需要的話，這些有助于觀測的附加方法還是可以使用的。
以下是發(fā)明的一些實(shí)例。這些實(shí)例試圖闡明本發(fā)明具有廣泛的特性，并且沒有不適當(dāng)?shù)南拗菩浴?br> 實(shí)例1三十個被試者參與了這項(xiàng)研究。在開始研究之前，被試者經(jīng)過一周時間的清洗，在這期間以及在整個研究期間，他們避免用任何有抗細(xì)菌標(biāo)志的產(chǎn)品，例如抗細(xì)菌肥皂，碗盤清洗劑，洗液，面霜，滑石粉等，以及去頭屑洗發(fā)香波。
測試當(dāng)天，被試者的手經(jīng)過70％乙醇清洗以除去污染的細(xì)菌，并在空氣中干燥。技術(shù)員清洗被試者的每只手四次或者一次。清洗過程包括用肥皂洗15秒鐘，用帶有手套的手涂肥皂泡45秒鐘，流動的溫水水龍頭下清洗10秒鐘。對于多次清洗，在下一次清洗前，手要在空氣中干燥。
被試者把每只手輕輕地放在事先污染了200μl(約106)標(biāo)記細(xì)菌粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)(ATCC14756)的塑料盤表面。兩個總重約480克的物體放置于手上，以提供平均的壓力。手放在塑料盤表面5秒鐘。接著，被試者盡快輕輕地把他們的每只手放置于事先傾倒了Microbial Content Agar的印手板上以轉(zhuǎn)移細(xì)菌。技術(shù)員對被試者的手和手指施以輕壓10秒鐘。用作重物的相同物體被放在手上以提供平均的壓力，手放在瓊脂板上保持30秒鐘。被試者的手經(jīng)用70％異丙醇浸泡3分鐘凈化消毒。
瓊脂平板于35-37℃培養(yǎng)過夜。平板由三位鑒定人根據(jù)以下尺度估算0-沒有細(xì)菌生長1-非常少量細(xì)菌生長2-少量細(xì)菌生長3-中度細(xì)菌生長4-許多細(xì)菌生長5-非常多細(xì)菌生長6-極度細(xì)菌生長只有粉色菌落被估算。采用半分來描述整分之間的分?jǐn)?shù)。
把三位鑒定人給每塊平板的分?jǐn)?shù)取平均值。利用鑒定人的平均分?jǐn)?shù)，在5％的顯著性水平上采用成對t測驗(yàn)來判斷是否在產(chǎn)品之間存在顯著性references。
表1細(xì)菌挑取評估(Bacteria Pick-up Ecaluation)測試樣品/安慰劑鑒定人分?jǐn)?shù)的平均值+-標(biāo)準(zhǔn)差(每次研究n=15)洗4次 洗1次安慰劑a 3.8±1.03.5±1.0測試樣品b2.8±1.02.0±1.8p值 ≤0.05 ≤0.05a重量百分比肥皂77.5％，游離脂肪酸9.5％，水8.4％。
b重量百分比肥皂74.3％，游離脂肪酸9.2％,polyquat60.12％,triclocarban0.25％，礦脂3.5％,dimethicone0.1％，水8.3％。
根據(jù)數(shù)據(jù)所示，測試樣品顯著地抑制了細(xì)菌粘附到皮膚上。
問題登記P5/25,L25 Straphylococcus aureus拼寫錯誤，應(yīng)為Staphylococcus aureus，未修改，現(xiàn)譯作金黃色葡萄球菌。
P5/25,L26 Pseudomonas aeroginosa拼寫錯誤，應(yīng)為Pseudomonas aeruginosa，未修改，現(xiàn)譯作綠膿桿菌。
P8/25,L24 metabolities拼寫錯誤，應(yīng)為metabolites(代謝物)，未修改。
P9/25,L33 minerol oil拼寫錯誤，應(yīng)為mineral oil(礦物油)，未修改。
P10/25,L9 or skin surface，應(yīng)為or surface，未修改。
P11/25,L32 references拼寫錯誤，應(yīng)為differences，未修改。
P12/25,L9 polyquat60.12％，是否應(yīng)為polyquat 0.12％？未修改。
權(quán)利要求
1．一種可見的證明抗細(xì)菌粘附組合物有效性的方法，包括a．用潛在的或者已知的抗細(xì)菌粘附組合物處理皮膚；b．該皮膚接觸細(xì)菌，使細(xì)菌沾附到皮膚上；c．該皮膚接觸細(xì)菌生長支持培養(yǎng)基，可選擇事先在其中加入或者后來在其中加入一種有助于可見的檢測細(xì)菌菌落的化合物或者混合物。
2．如權(quán)利要求1中所述的方法，其中潛在的或者已知的抗細(xì)菌粘附組合物的效果是可以可見的評估的。
3．如權(quán)利要求2中所述的方法，其中未知抗細(xì)菌粘附效果的組合物與已知抗細(xì)菌粘附效果的組合物進(jìn)行了比較。
4．如權(quán)利要求2中所述的方法，其中至少對兩種不同的未知組合物的抗菌粘附效果作了比較性的評價。
5．如權(quán)利要求1中所述的方法，其中所說的包含一種表面活性劑和一種抑制細(xì)菌粘附有效量的物質(zhì)，該物質(zhì)選自包含一種硅氧烷，一種烴類化合物及其混合物的分組。
6．與權(quán)利要求1一致的方法，其中所說的組合物也含有有效量的抗微生物化合物。
7．與權(quán)利要求6一致的方法，其中化合物是Triclosan或者是一種trichlorocarbanilide。
8．與權(quán)利要求5一致的方法，其中存在一種陰離子聚合物。
全文摘要
一種可以可見的證明抗菌粘附組合物有效性的方法,該方法包括a.用潛在的或者已知的抑制細(xì)菌粘附的組分處理皮膚;b.該皮膚接觸細(xì)菌,使細(xì)菌沾附到皮膚上;c.該皮膚接觸細(xì)菌生長支持培養(yǎng)基,可選擇地,事先在其中加入或者后來在其中加入一種有助于可見的檢測細(xì)菌菌落的化合物或者混合物。
文檔編號C12Q1/04GK1316014SQ99810472
公開日2001年10月3日 申請日期1999年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月28日
發(fā)明者S·A·安薩里, D·K·基奧茲佩奧普羅－格里納, T·G·波萊夫卡 申請人:高露潔-棕欖公司