專利名稱：人gm-csf抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的制作方法
人GM-CSF抗原結(jié)合蛋白質(zhì)與相關(guān)申請的交叉參照本申請要求于2008年8月8日提交的美國臨時申請序列號61/087，551、和于2007年9月18日提交的美國臨時申請序列號60/994，343的利益，本文依賴所述申請的公開內(nèi) 容并且通過引用將所述申請的內(nèi)容并入本文。背景粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF ；CSF2)是充分研究的蛋白質(zhì)，長期以來已 認(rèn)識到其造血性質(zhì)(即刺激髓系(myeloid lineage)的祖細(xì)胞增殖和分化以及成熟細(xì)胞增 殖)(在 Blood 77 :1131，1991；Rev Infect Dis 12 :41，1990 ；Med.Oncol. 13 :141，1996 中 綜述)。GM-CSF通過肺上皮細(xì)胞和腸的Paneth細(xì)胞組成性產(chǎn)生(BBRC312 :897，2003)，但廣 泛多樣的細(xì)胞在活化后表達(dá)GM-CSF，其中占優(yōu)勢的表達(dá)來自T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞、 成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞(J Infect Dis 172 1573，1995 ；J Infect Dis 185 1490，2002 ;J Allergy CinImmunol 112:653,2003)。GM-CSF 受體(GM-CSFR ;CSFR2)由兩種蛋白質(zhì)的異 源復(fù)合物組成對于GM-CSF特異的高親和力α多肽，以及由GM-CSF、IL-3和IL-5共享的 低親和力共有 β 多肽(在 J AllergyCin Immunol 112 653,2003 ；Cytokine and Growth Factor Reviews 12 :19，2001中綜述)。GM-CSFR在髓系的所有細(xì)胞上表達(dá)。GM-CSF通過介導(dǎo)信號來增加先天性免疫系統(tǒng)的活性，所述信號引起或?qū)崿F(xiàn)髓系細(xì) 胞的分化、存活、增殖和活化，所述髓系細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DCs)、嗜 中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞(在 J Immun 143 1198,1989 ；Rev Infect Dis 12:41,1990; Blood77 1131,1991 ；Trends in Immun. 23 403,2002 ；Growth Factors22 :225，2004 中綜 述)。GM-CSF是用于體外產(chǎn)生單核細(xì)胞衍生的DCs和1型巨噬細(xì)胞的重要因子(PNAS 101 4560，2004)，并且已顯示在體內(nèi)誘導(dǎo)DCs的分化和活化(Blood 95 :2337，2000)。在GM-CSF 的存在下產(chǎn)生的人單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞(1型巨噬細(xì)胞)產(chǎn)生高水平的促炎細(xì)胞因子， 例如IL-23，而不是IL-12，而在M-CSF(CSFl)的存在下產(chǎn)生的2型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗炎細(xì)胞 因子，例如 IL-10,而不是 IL-23 (PNAS 101 :4560，2004)。用GM-CSF刺激的人單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞具有增加的功能，包括細(xì)胞毒性、其他促 炎細(xì)胞因子(IL-IiKTNFa和IL_6)的產(chǎn)生和吞噬作用?；谶@些作用，近期已付出許多 努力以開發(fā)作為有效佐劑用于在傳染病中使用或伴隨疫苗施用的GM-CSF(在Eur J Clin MicrobiolInfect Dis. 13: :S47,1994 ；Curr Opin Hematol. 7 168，2000 中綜述)。事實 上，在某些臨床環(huán)境中，rhGM-CSF的施用極大改善真菌感染的結(jié)果和清除(Eur J Clin Microbiol Infect Dis 13 :S18，1994 ;J Med Microbiol47 :1998)。小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS的駐留巨噬細(xì)胞，并且來自體外研究的數(shù)據(jù)指出GM-CSF是關(guān) 鍵細(xì)胞因子，其增強(qiáng)胎兒和成人小膠質(zhì)細(xì)胞的存活、活化、增殖且甚至分化(Glia 12:309， 1994 J Immunol Methods 300 :32，2005)。此外，存在來自小鼠MS模型研究的幾個報告，其 提供關(guān)于在CNS血管周間隙中的APCs(小膠質(zhì)細(xì)胞或DCs)對于疾病起始和持續(xù)的關(guān)鍵作 用的證據(jù)(Nat. Med. 11 146, ,2005 ；Nat. Med. 11 328,2005 ；Nat. Med. 11 :335，2005)。小膠 質(zhì)細(xì)胞的GM-CSF刺激上調(diào)MHCII且增強(qiáng)抗原呈遞。
僅最近確定GM-CSF在疾病中作為促炎細(xì)胞因子的作用，和作為造血生長因子的 可省略性(在 Trends in Immun. 23 403,2002 ；Growth Factors 22 225,2004 中綜述)及 其在引起或增強(qiáng)炎性/自身免疫疾病中的作用。在多發(fā)性硬化癥(MS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、哮喘、牛皮癬、特應(yīng)性皮炎和肉樣瘤 病中的炎癥局部部位處已觀察到升高水平的GM-CSF。GM-CSF的升高一般無法在血清中觀 察到，因此測定疾病關(guān)聯(lián)需要靶組織的分析。在MS中，執(zhí)行2項臨床研究，其中在來自伴隨 活動性疾病(在組織收集2周內(nèi)的新癥狀或現(xiàn)有癥狀的惡化)的復(fù)發(fā)-緩解(RR)MS患者的 腦脊髓液(CSF)和血清中，通過ELISA測量GM-CSF蛋白質(zhì)水平，并且與具有穩(wěn)定疾病(前 6個月無發(fā)作)或其他神經(jīng)疾病(OND)對照的RRMS患者比較(Eur Neurol 33 :152，1993 ； Immunopharmacol. Immunotoxicol. 20 :373，1998)。重要的是，OND 對照不包括阿爾茨海默 病或血管性癡呆患者，因為在此種患者的CSF和血清中報告高度增加水平的GM-CSF(Acta Neurol Scand 103:166,2001)。
GM-CSF水平在低Pg范圍中，但與穩(wěn)定性疾病CSF比較，在RRMS活動性疾病CSF中 明顯更高，并且與OND CSF比較，在MS活動性疾病CSF中明顯更高。此外，與穩(wěn)定性疾病比 較，在活動性疾病的CSF中存在更高水平的TNF-α，并且與穩(wěn)定性疾病比較，在活動性疾病 的CSF中存在更高水平的TGF-β和IL-10。研究包括就患者正在進(jìn)行的治療和活動性與穩(wěn) 定性疾病比較的臨床確診而言的非常謹(jǐn)慎的選擇標(biāo)準(zhǔn)，以及樣品收集的同步性。有趣的是， 在任何組之間的血清中不存在GM-CSF水平的顯著差異。此外，一項研究觀察到在MS病變的 星形細(xì)胞中而不是對照CNS白質(zhì)中GM-CSF的選擇性免疫組織化學(xué)檢測(η = 3個MS供體， Glia 12 :309，1994)。最后，活化T細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在炎癥應(yīng)答過程中在活化后 能夠產(chǎn)生大量GM-CSF。存在關(guān)于這些細(xì)胞類型在MS病變(Ann Neurol. 47 707, 2000)、和 關(guān)于T細(xì)胞在CSF中(在Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 1 :257，2001中綜述)存在的大量證 據(jù)。除GM-CSF表達(dá)與MS的關(guān)聯(lián)外，存在關(guān)于其他炎性/自身免疫疾病的大量疾病關(guān) 聯(lián)數(shù)據(jù)和甚至關(guān)于施用外源GM-CSF疾病加重的某些證據(jù)。在RA中，與OA比較(生物測定， Clin. Exp. Immunol. 72 :67，1988)以及與非 RA 對照比較(生物測定，Rheumatol Int. 14 177，1995)，已在RA或牛皮癬關(guān)節(jié)炎(PsA)患者的滑液(SF)中檢測出升高水平的GM-CSF。 此外，在關(guān)節(jié)中CD68+巨噬細(xì)胞的存在與RA患者中的疾病嚴(yán)重度之間存在強(qiáng)關(guān)聯(lián)(Arm Rheum Dis 64 :834，2005)。最后，已報告具有Felty綜合征(中性粒細(xì)胞減少癥)的RA患 者的GM-CSF治療可以加重疾病(Blood 74 :2769，1989)。在哮喘中，通過免疫組織化學(xué)已發(fā)現(xiàn)GM-CSF在來自哮喘患者的支氣管活檢物 中是升高的，并且觀察到在類固醇療法后GM-CSF水平的減少和FEVl的增加之間的關(guān)聯(lián) (Chest 105 687,1994 ；Am RevRespir Dis 147:1557,1993)。還報告 GM-CSF 在間歇性、輕 微哮喘患者的痰中是升高的(Ann Allergy Asthma Immunol 86:304,2001)。支持 GM-CSF 的拮抗性的數(shù)據(jù)包括其中通過抗GM-CSF mAb減弱來自有癥狀患者的BALF的嗜酸性粒細(xì)胞 促進(jìn)活性的研究(在體外，Eur. Respir. J. 12 :872，1998)。在牛皮癬中，在牛皮癬皮膚而不是對照皮膚樣品中檢測出GM-CSF表達(dá)(Arch Dermatol Res. 287 158,1995 ；Clin Exp Dermatol. 19 383,1994 ；Dermatologica. 181 16，1990)。還已報告牛皮癬的GM-CSF治療可以加重疾病(Br J Dermatol. 128 :468，1993)。
在特應(yīng)性皮炎(AD)中，通過原位雜交檢測出在慢性AD病變的活檢物中比在急性 AD或非病變皮膚中明顯更多數(shù)目的GM-CSFmRNA表達(dá)細(xì)胞(ρ < 0. 05 ;J Clin Invest. 95 211，1995)。在第二項研究中，通過病變AD皮膚(表皮和真皮區(qū)室)的免疫組織化學(xué)檢測出 更高水平的GM-CSF，并且與來自非特應(yīng)性對照的角化細(xì)胞比較，由AD患者的未受累皮膚建 立的角化細(xì)胞培養(yǎng)顯示GM-CSF增加的自發(fā)性和PMA刺激性產(chǎn)生(J Clin Invest. 99 :3009， 1997)。
通過多個研究組產(chǎn)生GM-CSF(Science 264 713,1994 ；PNAS91 5592,1994)禾口 GM-CSFRc (Immunity 2 211,1995 ；PNAS92 =9565,1995)缺陷的小鼠。該小鼠在造血的穩(wěn) 態(tài)水平中沒有明顯差異，但的確具有肺泡蛋白沉積癥的組織學(xué)證據(jù)，對感染更敏感，并且顯 示IgG產(chǎn)生的適度延遲和在KLH免疫后減少的抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答(PNAS 94:12557， 1997)。GM-CSF-/-小鼠對 M0G35-55 誘導(dǎo)的 EAE(J Exp Med. 194 :873，2001)、膠原誘導(dǎo)的關(guān) 節(jié)炎(CIA ;JI 161 :3639，1998)和 mBSA/IL-1 誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(Arthritis Rheum 44:111， 2001)有抗性。相比之下，GM-CSF轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠已在許多實驗室中產(chǎn)生，并且與炎性/ 自身免疫疾病的發(fā)展相關(guān)(Cell 51 =675,1987 JI 166 =2090,2001 ;J Clin Invest 97: 1102,1996 J Allergy Clin Immunol 1111076,2003 ；Lab Invest 77:615,1997)。因此，本領(lǐng)域存在對GM-CSF抑制劑的需要。概述提供了結(jié)合GM-CSF特別是人GM-CSF的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。人GM-CSF抗原結(jié)合蛋白 質(zhì)可以抑制、干擾、或調(diào)節(jié)與GM-CSF相關(guān)的至少一種生物應(yīng)答，并且因此，用于改善GM-CSF 相關(guān)疾病或病癥的作用。某些抗原結(jié)合蛋白質(zhì)與GM-CSF的結(jié)合因此可以抑制、干擾或阻 斷GM-CSF信號傳遞，減少單核細(xì)胞遷移到腫瘤內(nèi)，并且減少腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)的累 積。還提供了用于產(chǎn)生GM-CSF抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)，包括細(xì)胞系，以及用于診 斷且治療與人GM-CSF相關(guān)的疾病的方法。提供的某些經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)包括(A)選自下組的一個或多個重鏈互補(bǔ) 決定區(qū)(CDRHs) (i)選自 SEQ ID NO :10、22、7094 禾口 142 的 CDRHl ； (ii)選自 SEQ ID NO 11、23、28、35、47、59、71、95、106、119 和 143 的 CDRH2 ；(iii)選自 SEQ ID NO 12、24、36、48、 60、72、83、96、108、120、132和144的CDRH3 ；和(iv)包含一個或多個氨基酸取代、缺失或插 入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH，所述氨基酸取代、缺失或插入不超過4個氨基酸；(B)選自 下組的一個或多個輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDRLs) :(i)選自SEQ ID NO :4、16、30、40、52、64、88、
100、107、112、118、124、125和 136 的 CDRLl ； (ii)選自 SEQ ID NO :5、17、29、34、41、65、77、
101、113、130、131和 137 的 CDRL2 ； (iii)選自 SEQ ID NO :6、18、42、46、66、78、84、89、90、
102、114、126和138的⑶RL3；和(iv)包含一個或多個氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii) 和(iii)的CDRL，所述氨基酸取代、缺失或插入不超過4個氨基酸；或(C) (A)的一個或多 個重鏈⑶RHs和(B)的一個或多個輕鏈⑶RLs。在一個實施方案中，經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可以包括上述(A)中的至少一個或 兩個CDRH和上述(B)中的至少一個或兩個CDRL。在另外一個方面，經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白 質(zhì)包括 CDRHl、CDRH2、CDRH3、CDRLl、CDRL2 和 CDRL3。此外，上述(A)的CDRH 進(jìn)一步選自(i)選自 SEQ ID NO 10、22、7094 和 142 的CDRHl ； (ii)選自 SEQ ID NO :11、23、28、35、47、59、71、95、106、119 和143 的 CDRH2 ； (iii) 選自 SEQ IDNO :12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132 和 144 的 CDRH3 ；和(iv)包含一 個或多個氨基酸取代、缺失或插入的(i)、( )和(iii)的CDRH，所述氨基酸取代、缺失或 插入不超過兩個氨基酸；上述(B)的CDRH選自(i)選自SEQ ID NO :4、16、30、40、52、64、 88、100、107、112、118、124、125 和 136 的 CDRLl ； (ii)選自 SEQ IDNO :5、17、29、34、41、65、 77、101、113、130、131 和 137 的 CDRL2 ； (iii)選自 SEQ ID NO :6、18、42、46、66、78、84、89、 90、102、114、126和138的CDRL3 ；和(iv)包含一個或多個氨基酸取代、缺失或插入的⑴、
(ii)和(iii)的CDRL，所述氨基酸取代、缺失或插入不超過兩個氨基酸；或(C)(A)的一個 或多個重鏈⑶RHs和(B)的一個或多個輕鏈⑶RLs。在另外一個實施方案中，經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可以包括㈧選自下組的 CDRH ⑴選自 SEQ ID NO :10、22、70 94 禾口 142 的 CDRHl ； (ii)選自 SEQ ID NO :11、23、28、 35、47、59、71、95、106、119和 143 的 CDRH2 ； (iii)選自 SEQ ID NO 12、24、36、48、60、72、83、 96、108、120、132 和 144 的 CDRH3 ； (B)選自下組的 CDRL (i)選自 SEQ ID NO :4、16、30、40、 52、64、88、100、107、112、118、124、125 和 136 的 CDRLl ； (ii)選自 SEQ ID NO :5、17、29、34、 41、65、77、101、113、130、131 和 137 的 CDRL2 ； (iii)選自 SEQ ID NO :6、18、42、46、66、78、 84、89、90、102、114、126和 138 的 CDRL3 ；或(C) (A)的一個或多個重鏈 CDRHs 和(B)的一個 或多個輕鏈⑶RLs。在一個實施方案中，經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可以包括(A)選自SEQ ID N0:10、22、70 94 和 142 的 CDRHl ；選自 SEQ ID NO :11、23、28、35、47、59、71、95、106、119 和 143 的 CDRH2 ；選自 SEQ ID NO 12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132 和 144 的 CDRH3 ； 和(B)選自 SEQID NO :4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125 和 136 的 CDRLl ； 選自 SEQ ID NO :5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131 和 137 的 CDRL2 ；和選自 SEQ ID NO :6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126 和 138 的 CDRL3。在另一個實施方案中，可 變重鏈(VH)與選自 SEQ ID NO :9、21、33、45、57、69、81、93、105、117、129 和 141 的氨基酸序 列具有至少90%的序列同一性，和/或可變輕鏈(VL)與選自SEQ ID NO :3、15、27、39、51、 63、75、87、99、111、123和135的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。在一個進(jìn)一步的 實施方案中，VH 選自 SEQ IDNO :9、21、33、45、57、69、81、93、105、117、129 和 141，和 / 或 VL 選自 SEQ ID NO :3、15、27、39、51、63、75、87、99、111、123 和 135。在另一個方面，提供了與包含GM-CSF序列的表位特異性結(jié)合的經(jīng)分離的抗原結(jié) 合蛋白質(zhì)，其中與GM-CSF結(jié)合的抗體在包含GM-CSFR的細(xì)胞中拮抗GM-CSF介導(dǎo)信號的活 化。在另外一個方面，提供了結(jié)合GM-CSF的經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，其包括㈧選 自下組的一個或多個重鏈CDRs (CDRHs) :(i)與選自SEQ ID NO :10、22、7094和142的CDRHl 具有至少 80% 同一性的 CDRHl ;(ii)與選自 SEQ ID NO :11、23、28、35、47、59、71、95、106、 119 和 143 的 CDRH2 具有至少 80% 同一性的 CDRH2 ； (iii)與選自 SEQ ID NO 12、24、36、48、 60、72、83、96、108、120、132 和 144 的 CDRH3 具有至少 80 % 同一'性的 CDRH3 ； (B)選自下組 的一個或多個輕鏈 CDRs (CDRLs) (i)與選自 SEQ ID NO :4、16、30、40、52、64、88、100、107、 112、118、124、125 和 136 的 CDRLl 具有至少 80% 同一性的 CDRLl ； (ii)與選自 SEQ ID NO 5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131 和 137 的 CDRL2 具有至少 80 % 同一'性的 CDRL2 ；
(iii)與選自SEQ ID NO :6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126 和 138 的 CDRL3 具有至少80%同一性的⑶RL3 ；或(C) (A)的一個或多個重鏈⑶RHs和⑶的一個或多個輕 鏈⑶RLs。在一個實施方案中，經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)包括(A)選自下組的一個或多個 CDRHs (i)與選自 SEQ ID NO :10、22、7094 和 142 的 CDRHl 具有至少 90% 同一性的 CDRHl ； (ii)與選自 SEQ ID NO :11、23、28、35、47、59、71、95、106、119和 143 的CDRH2具有至少90% 同一性的 CDRH2 ;(iii)與選自 SEQ ID NO :12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132 和 144 的⑶RH3具有至少90%同一性的⑶RH3 ;(B)選自下組的一個或多個⑶RLs (i)與選自SEQ ID NO :4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125和 136 的 CDRLl 具有至少 90% 同 一性的 CDRLl ； (ii)與選自 SEQ ID NO :5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131 和 137 的 CDRL2 具有至少 90% 同一性的 CDRL2 ;(iii)與選自 SEQ ID NO :6、18、42、46、66、78、84、89、 90、102、114、126和138的CDRL3具有至少90%同一性的CDRL3 ；或(C) (A)的一個或多個 重鏈⑶RHs和(B)的一個或多個輕鏈⑶RLs。在一個進(jìn)一步的方面，提供了結(jié)合GM-CSF的經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，所述抗原結(jié)合蛋白質(zhì)包括A)選自下組的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(⑶RH) :(i)選自SEQ ID NOs 12, 24、36、48、60、72、83、96、108、120、132 和 144 的 CDRH3 ； (ii)通過不超過兩個氨基酸的 氨基酸添加、缺失或取代而與(i)的CDRH3在氨基酸序列中不同的CDRH3;(iii)選自 X1X2X3X4X5X6X7X8FDX9 (SEQ ID NO 83)的CDRH3氨基酸序列，其中X1選自E和無氨基酸，&選自 6和無氨基酸，&選自？、0和644選自￥、1、1 和1(，&選自S、W、F和T，X6選自Y和L，X7選自 D和G，X8選自Y、無氨基酸和A，并且X9選自Μ、T和V ；和/或B)選自下組的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū) (CDRL)⑴選自 SEQ ID NOs :6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126 和 138 的 CDRL3 ； (ii)通過不超過兩個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而與(i)的CDRL3在氨基酸序列中 不同的 CDRL3 ；和 iii)選自 X1QX2X3X4X5X6X7T (SEQ ID NO 84)和X1X2X3X4DSSNX5X6X7(SEQ ID NO 89)的CDRL3氨基酸序列，X1QX2X3X4X5X6X7T中Xl選自Q和L，X2選自Y和S，X3選自D、G 禾口 F，X4選自R、T和S，X5選自S和V，X6選自F和P,并且X7選自R和W ；X1X2X3X4DSSNX5X6X7 中X1選自S和A，X2選自S和A，X3選自W和F，X4選自D和T，X5選自G、W和無氨基酸，X6 選自V、L和P，并且X6選自V和無氨基酸。在另一個實施方案內(nèi)，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括:A)選自下組的⑶RH: (i)選自SEQ ID NOs :10、22、7094和142的CDRHl ;(ii)通過不超過兩個氨基酸的氨 基酸添加、缺失或取代而與⑴的CDRHl在氨基酸序列中不同的CDRHl ;(iii)選自 X1X2GX3X4XFX5X6YX7X8X9 (SEQ ID NO 94)的 CDRHl 氨基酸序列，其中 X1 選自 G 和無氨基酸，X2 選自G和無氨基酸，X3選自Y和F，X4選自T和S，X5選自T、S和G，X6選自G和S，X7選自 Y 和 G，X8選自 I 和M，并且 X9 選自 H 和 S，或(iv)選自 SEQ ID NOs :5、17、29、34、41、65、 77、101、113、130、131和137的CDRH2 ； (ν)通過不超過兩個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取 代而與(iv)的CDRH2在氨基酸序列中不同的CDRH2 ；或(vi)由X1X2X3X4X5X6GX7X8X9XltlX11X1 2X13X14X15G(SEQ ID NO 106)組成的CDRH2氨基酸序列，其中X1選自W和無氨基酸，X2選自 I禾口 Y，X3選自N、S禾口 I，X4選自P、A禾口 Y，X5選自N禾口 Y，X6選自S禾口 N，X7選自G禾口 N，X8 選自T和R，X9選自N和D，Xltl選自Y和S，X11選自A和N，X12選自Q和R，X13選自K和R， X14選自F和L，并且X15選自Q、K禾口 R ；或B)選自下組的CDRL ⑴選自SEQ IDNOs :4、16、 30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125 和 136 的 CDRLl ； (ii)通過不超過兩個氨基 酸的氨基酸添加、缺失或取代而與(i)的CDRLl在氨基酸序列中不同的CDRLl ； (iii)選自Kssqsx1XlyssX2NX3NX4LX5 (seq id no : 107)、rasx1x2x3x4x5x6yx7x8 (seq id no :ii8)或 x1x2x3x ^5x6yx7x8x9x10nx1 jx12(seq id no: 125)的cdrli氨基酸序列，kssqsx1xlyssx2nx3nx4lx5中x1 選自v和i，x2選自s和n，x3選自e和k，x4選自y和f，并且x5選自t和a ；rasx1x2x3x4x5x6yx7x8 中x1選自q和p，x2選自s和y，x3選自v、l和i，x4選自s和c，x5選自s和n，x6選自s、 i、t和無氨基酸，x7選自f和l，并且x8選自a和n ；x1x2x3x4x5x6yx7x8x9xltlnx11vx12中x1選自 i、s禾口 t，x2選自r禾口 g，x3選自t禾口 s，x4選自r禾口 s、x5選自g禾口 s，x6選自s、h禾口 d，x7 選自i和v，x8選自a和g，x9選自無氨基酸和g，xltl選自s和y，x11選自y和t， 并且x12選 自 q、N 和 s ；或(iv)選自 seq id NOs :5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131 和 137 的 cdrl2 ； (ν)通過不超過兩個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而與(iv)的cdrl2在氨基酸 序列中不同的 cdrl2 ；或(vi)選自 x1x2x3x4x5x6x7 (seq id no 130)或 x1x2x3x4rps (seq id no 131)的cdrl2氨基酸序列，x1x2x3x4x5x6x7中xl選自g、t和w，x2選自t和a，x3選自s 禾口 a, x4選自s禾口 τ，x5選自r禾口 l，x6選自a、e禾口 q，并且x7選自t禾口 s ；x1x2x3x4rps中xl 選自e禾口 s，x2選自d、v禾口 n，x3選自d、s禾口 n，并且x4選自q、g禾口 h。在一個方面，本文提供的經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可以是單克隆抗體、多克隆抗 體、重組抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體片段。在另一個實施 方案中，經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的抗體片段可以是Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2片段、 Fv片段、雙抗體(diabody)或單鏈抗體分子。在一個進(jìn)一步的實施方案中，經(jīng)分離的抗原結(jié) 合蛋白質(zhì)是人抗體，并且可以是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在另外一個方面，經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可以與標(biāo)記基團(tuán)偶聯(lián)，并且可以與所 提供的經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)之一的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)競爭與人GM-CSF的細(xì)胞外部分結(jié)
I=I O在另外一個方面，經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)與如本文所提供的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)競 爭與人GM-CSF的受體相互作用部分結(jié)合。在一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)是單克隆 抗體、多克隆抗體、重組抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體片段。 在相關(guān)實施方案中提供了人抗體和單克隆抗體以及抗原片段，包括Fab片段、Fab'片段、 F(ab' )2片段、Fv片段、雙抗體或單鏈抗體分子。在其他實施方案中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)是 IgGl型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。進(jìn)一步提供了與標(biāo)記基團(tuán)偶聯(lián)的經(jīng)分離的抗原結(jié)合 蛋白質(zhì)。在另外一個方面，本發(fā)明進(jìn)一步考慮了抑制GM-CSF活性，以限制引起或?qū)崿F(xiàn)髓系 細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DCs)、嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的分化、存 活、增殖和活化，和/或DCs的分化和/或活化的信號。此外，本發(fā)明考慮了抑制GM-CSF 活性，以限制單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞(1型巨噬細(xì)胞)產(chǎn)生高水平的促炎細(xì)胞因子例如 IL-23。在一個進(jìn)一步的方面，還提供了編碼與GM-CSF結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的經(jīng)分離 的多核苷酸，其中所述經(jīng)分離的多核苷酸與控制序列可操作地連接。在另一個方面，還提供了表達(dá)載體和用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，所述表 達(dá)載體包括編碼可以與GM-CSF結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的上述經(jīng)分離的多核苷酸。在另一個方面，還提供了制備抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的方法，其包括從分泌抗原結(jié)合蛋 白質(zhì)的宿主細(xì)胞制備抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的步驟。
在另外一個方面，提供了藥物組合物，其包括所提供的上述抗原結(jié)合蛋白質(zhì)中的 至少一種和藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一個實施方案中，藥物組合物可以包括另外的活性 齊U，其選自放射性同位素、放射性核素、毒素、或治療和化學(xué)治療基團(tuán)。
在另外一個方面，提供了用于治療或預(yù)防患者中與GM-CSF相關(guān)的狀況的方法，其 包括給患者施用有效量的至少一種經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述狀 況選自風(fēng)濕性病癥、自身免疫病癥、血液系統(tǒng)病癥、腫瘤病癥、炎性病癥、神經(jīng)系統(tǒng)的變性狀 況、胃腸道、生殖泌尿系統(tǒng)(gastrourinary)病癥、內(nèi)分泌病癥等。在一個實施方案中，所 述狀況是選自下組的病癥或疾病多發(fā)性硬化癥(MS)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、哮喘、牛皮癬、 特應(yīng)性皮炎和肉樣瘤病。在另一個實施方案中，包括用單獨(dú)或作為聯(lián)合治療的經(jīng)分離的抗 原結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)行處理。在另外一個實施方案中，所述狀況選自乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸直 腸癌、子宮內(nèi)膜腺癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、胃癌、星形細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、膀胱 癌、腎癌和卵巢癌。在另一個方面，本發(fā)明提供了抑制患者中的GM-CSF與GM-CSFR的細(xì)胞外部分結(jié)合 的方法，其包括施用有效量的本文提供的至少一種抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。在另外一個方面，本發(fā)明提供了抑制患者中的人GM-CSFR磷酸化的方法，其包括 施用有效量的如本文所描述的至少一種抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。在另外一個方面，當(dāng)施用于患者時，經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)減少單核細(xì)胞趨化 性。在一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)抑制單核細(xì)胞遷移。在另外一個實施方案中，當(dāng)經(jīng) 分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)施用于患者時，抑制單核細(xì)胞遷移到腫瘤內(nèi)。作為另外一個方面，進(jìn)一步提供了治療多發(fā)性硬化癥的方法，其包括施用如本文 所描述的經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。還考慮了以下狀況，即其中多發(fā)性硬化癥是復(fù)發(fā)_緩解性多發(fā)性硬化癥、進(jìn)行 性_復(fù)發(fā)性多發(fā)性硬化癥、原發(fā)性_進(jìn)行性多發(fā)性硬化癥或繼發(fā)性進(jìn)行性多發(fā)性硬化癥。在一個方面，還提供了治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法，其包括施用如本文所描述的經(jīng) 分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。在另外的方面，提供了經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，如在GM-CSF依賴性測定中測量 的，其在人GM-CSF的1個對數(shù)內(nèi)與獼猴GM-CSF交叉反應(yīng)，并且以< InM的IC5tl結(jié)合GM-CSF。這些和其他方面將在本文中更詳細(xì)地描述。所提供的方面各自可以包括本文提供 的各種實施方案。因此預(yù)期涉及一種元件或元件組合的實施方案各自可以包括在所描述的 每個方面中。所公開的其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)在下述詳述中是顯而易見的。附圖簡述圖la-d :A)在活動性EAE中抗鼠類GM-CSF MAb的預(yù)防施用延遲了發(fā)作，并且減少 發(fā)病率。為了誘導(dǎo)活動性SJL/PLP139_151 EAE，給予11只小鼠皮下250 μ g PLP139_151+CFA，并 且實施3周評估。在免疫接種當(dāng)天時，給予11只小鼠/組500 μ g抗鼠GM-CSF mAb、同種 型對照mAb或PBS。獲得每日體重和評分。臨床評分0:無疾病；1:軟尾；2:翻正反射的輕 微損害或異常步態(tài)；3 嚴(yán)重后肢虛弱，部分后肢麻痹；4 完全后肢麻痹，使用前肢活動?？?GM-CSF mAb顯示與對照比較發(fā)作延遲，其中發(fā)生率為45%，而對照為91-100%。B和C)抗GM-CSF mAb的預(yù)防施用阻止體重減輕(B)且減少平均臨床得分(C)。D)來自在疾病發(fā)作當(dāng)天時單劑量抗mGM-CSF mAb、同種型對照mAb或PBS的結(jié)果，n= 14只小鼠。在活動性EAE中抗GM-CSF的治療施用減少平均臨床得分。與同種型對照 或 PBS 比較 P < 0. 05。圖2a_c :A)在活動性EAE中抗mGM-CSF MAb的治療施用加速恢復(fù)?；謴?fù)=≤1的 全部得分在連續(xù)> 2天中減少至得分< 1。B)與用抗mGM-CSF mAb、同種型對照mAb或PBS對照處理的小鼠比較，在疾病發(fā)作 當(dāng)天時(免疫接種后第13天)的治療性抗mGM-CSF mAb處理減少CNS炎癥。C和D)在過繼轉(zhuǎn)移EAE中抗mGM-CSF mAb的預(yù)防或治療施用改善疾病。在過繼轉(zhuǎn) 移EAE模型中，給予15只小鼠100 μ g PLP139_151+CFA，并且在免疫接種后第10天時收獲淋 巴結(jié)，用PLP肽在體外刺激4天，并且注射到接受小鼠內(nèi)。對小鼠實施體重和臨床得分的3 周評估。圖C顯示在細(xì)胞轉(zhuǎn)移當(dāng)天時的處理，圖D顯示在EAE發(fā)作當(dāng)天時的處理。圖 3 顯示抗 GM-CSF mAb 抑制或 0. 4ng/mlrhGM-CSF_Ile 的代表性 TF-1 Stat5 磷 酸化測定。圖4 顯示在來自大腸桿菌(E. coli)rhGM_CSF免疫接種小鼠的雜交瘤上清液的 TF-1STAT5磷酸化測定中的rhGM-CSF-Ile抑制分布的直方圖。圖 5 顯示 0. 15ng/ml rhGM-CSF-Ile 的抗 GM-CSF mAb 抑制的代表性 AML-5 增殖 測定。圖6a_f 在AML-5增殖測定中通過從雜交瘤上清液中純化的mAb抑制GM-CSF和 CSF-I。圖7a_b 在TF-I Stat5磷酸化測定中通過從雜交瘤上清液中純化的mAb抑制 GM-CSF 和 IL-3。圖8a-b 來自測量雜交瘤上清液抗GM-CSF mAb或重組抗GM-CSF mAb與來自各個 物種的GM-CSF的結(jié)合的ELISA的結(jié)果。圖9 在AML-5增殖測定中通過重組mAb (2nd TT和2nd SCL)抑制人和獼猴GM-CSF。

圖10 在TF-I Stat-5磷酸化測定中通過重組mAb (2nd TT和2ndSCL)抑制人和獼 猴 GM-CSF。圖11:在TF-I Stat-5磷酸化測定中通過重組mAb (1st TT)抑制天然人和獼猴肺 來源的GM-CSF。圖12 在TF-I Stat-5磷酸化測定中通過重組mAb (2nd SCL) IgGB抑制天然獼猴 PBMC 來源的 GM-CSF。圖13 在人單核細(xì)胞測定中通過重組mAb (2nd TT)抑制人GM-CSF。圖14 通過重組mAb (2nd SCL) IgG B抑制全血中GM-CSF誘導(dǎo)的ΜΙΡ-lb和ENA78產(chǎn)生。圖15a_b 在AML-5增殖測定(a)或單核細(xì)胞測定(b)中，從雜交瘤上清液中純化 的mAb不抑制酵母來源的rhGM-CSF(Leukine )。圖16 :mAb中和大腸桿菌來源的rhGM_CSF，但不中和酵母來源的 rhGM-CSF (Leukine )或未糖基化的、大腸桿菌來源的rhGM_CSF_R23L。詳述應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不限制于本文描述的具體方法、方案和試劑等，并且因此可以 改變。本文使用的術(shù)語僅用于描述具體實施方案的目的，并且不希望限制僅僅由權(quán)利要求限定的所公開的范圍。除非另有說明，一般根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法，并且如本說明書自始至終引用且討論的各種一般和更具體的參考文獻(xiàn)中描述的，執(zhí)行本申請的方法和技術(shù)。參見 例如，Sambrook 等人，MolecularCloning :A Laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)禾口 Ausubel 等人，Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992),and Harlowand Lane Antibodies :A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990)。術(shù)語“多核苷酸”包括單鏈和雙鏈核酸，并且包括基因組DNA、RNA、mRNA、cDNA或合 成來源或其某些組合，其不與自然界中通常發(fā)現(xiàn)的序列結(jié)合。除指定序列外，包括指定序列 的經(jīng)分離的多核苷酸還可以包括關(guān)于最多10種或甚至最多20種其他蛋白質(zhì)或其部分的編 碼序列，或可以包括可操作地連接的調(diào)節(jié)序列，其控制所述核酸序列編碼區(qū)的表達(dá)，和/或 可以包括載體序列。包括多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸，或經(jīng)修 飾形式的任意類型核苷酸。所述修飾包括堿基修飾例如溴尿苷和肌苷衍生物，核糖修飾例 如2’，3’ -雙脫氧核糖，和核苷酸間鍵修飾例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二 石西代 粦酸酉旨、phosphoroani Iothioate、phoshorani Iadate 禾口氛基 粦酸酉旨。術(shù)語“寡核苷酸”意指包括100個或更少核苷酸的多核苷酸。在某些實施方案中， 寡核苷酸長度是10至60個堿基。在其他實施方案中，寡核苷酸長度是12、13、14、15、16、 17、18、19或20至40個核苷酸。寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈的，例如用于構(gòu)建突變基因。 寡核苷酸可以是有義或反義寡核苷酸。寡核苷酸可以包括用于檢測測定的可檢測標(biāo)記，例 如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、半抗原或抗原標(biāo)記。寡核苷酸可以例如用作PCR引物、克隆引物 或雜交探針。術(shù)語“控制序列”指可以影響它與之連接的編碼序列表達(dá)和加工的多核苷酸序列。 此種控制序列的性質(zhì)可以依賴于宿主生物。在具體實施方案中，用于原核生物的控制序列 可以包括啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。例如，用于真核生物的控制序列可以包 括啟動子，其包括轉(zhuǎn)錄因子的一個或多個識別位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列和轉(zhuǎn)錄終止序列。“控 制序列”可以包括前導(dǎo)序列和/或融合配偶體序列。術(shù)語“載體”意指用于將蛋白質(zhì)編碼信息轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)的任何分子或?qū)嶓w (例如，核酸、質(zhì)粒、噬菌體或病毒)。術(shù)語“表達(dá)載體”或“表達(dá)構(gòu)建體”指適合于轉(zhuǎn)化宿主細(xì) 胞且包含核酸序列的載體，所述核酸序列指導(dǎo)和/或控制(與宿主細(xì)胞結(jié)合)與之可操作 地連接的一個或多個異源編碼區(qū)的表達(dá)。表達(dá)構(gòu)建體可以包括但不限于，影響或控制轉(zhuǎn)錄、 翻譯的序列，以及如果存在內(nèi)含子，影響與之可操作地連接的編碼區(qū)的RNA剪接的序列。如本文所使用的，“可操作地連接的”意指該術(shù)語所適用的組分處于允許其執(zhí)行其 固有功能的關(guān)系中。例如，在載體中與蛋白質(zhì)編碼序列“可操作地連接的”控制序列，例如 啟動子如此排列即，使得控制序列的正?；钚詫?dǎo)致蛋白質(zhì)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致所編 碼蛋白質(zhì)的重組表達(dá)。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”意指外來或外源DNA經(jīng)由細(xì)胞的攝取，并且當(dāng)外源DNA已引入細(xì)胞 膜內(nèi)時，細(xì)胞已進(jìn)行“轉(zhuǎn)染”。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在本文中公開。參 見例如，Graham 等人，1973，Virology52 456 ；Sambrook 等人，2001，Molecular Cloning A Laboratory Manual, supra ；Davis ^A 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier ;Chu等人，1981，Gene叢197。此種技術(shù)可以用于將一種或多種外源DNA部分引 入合適的宿主細(xì)胞內(nèi)。術(shù)語“多肽”或“蛋白質(zhì)”意指具有天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列的大分子，所述天然蛋白質(zhì)即由天然存在和非重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)；或它通過基因工程或重組細(xì)胞產(chǎn)生，并且 包括具有天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列的分子，或具有天然序列的一個或多個氨基酸缺失、添 加和/或取代的分子。該術(shù)語還包括其中一個或多個氨基酸是相應(yīng)天然存在的氨基酸和聚 合物的化學(xué)類似物的氨基酸聚合物。術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”包括GM-CSF抗原結(jié)合蛋白 質(zhì)，抗體，或具有抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的一個或多個氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。術(shù) 語“多肽片段”指與全長天然蛋白質(zhì)比較，具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或內(nèi)部缺 失的多肽。此種片段還可以包含與天然蛋白質(zhì)比較經(jīng)修飾的氨基酸。在某些實施方案中， 片段長度為約5至500個氨基酸。例如，片段長度可以為至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、 110、150、200、250、300、350、400或450個氨基酸。有用的多肽片段包括抗體的免疫學(xué)功能 片段，包括結(jié)合域。在GM-CSF-結(jié)合抗體的情況下，有用的片段包括但不限于CDR區(qū)、重或 輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域、抗體鏈的部分或僅其包括兩個CDRs的可變區(qū)等。術(shù)語“經(jīng)分離的蛋白質(zhì)”指純化掉將干擾其治療、診斷、預(yù)防、研究或其他用途的蛋 白質(zhì)或多肽或其他污染物的蛋白質(zhì)。多肽(例如，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)或抗體)的“變體”包括這樣的氨基酸序列相對于 另一種多肽序列，其中一個或多個氨基酸殘基插入氨基酸序列內(nèi)、從氨基酸序列中缺失和/ 或取代到氨基酸序列內(nèi)。變體包括融合蛋白。多肽的“衍生物”是這樣的多肽(例如，抗原 結(jié)合蛋白質(zhì)或抗體)其已經(jīng)通過與插入、缺失或取代變體不同的某一方式進(jìn)行化學(xué)修飾， 例如經(jīng)由與另一種化學(xué)部分綴合。如說明書自始至終結(jié)合生物材料使用的，術(shù)語“天然存在的”指在自然界中發(fā)現(xiàn)的 材料，所述生物材料例如多肽、核酸、宿主細(xì)胞等。如本文所使用的，“抗原結(jié)合蛋白質(zhì)”意指特異性結(jié)合指定靶抗原的蛋白質(zhì)；所提 供的抗原是GM-CSF或人GM-CSF。當(dāng)解離常數(shù)(Kd)是< ICT8M時，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)被說成“特異性結(jié)合”其靶抗原。 當(dāng)Kd是彡5xlO_9M時，抗體以“高親和力”特異性結(jié)合抗原，并且當(dāng)Kd是彡δχΙΟ,Μ時，以“極 高親和力”特異性結(jié)合抗原。在一個實施方案中，抗體具有彡ICT9M的Kd和約lxlO—4/秒的 解離速率(off-rate)。在一個實施方案中，解離速率是< lxlO—5。在其他實施方案中，抗體 將以約10_8M至ΙΟ,Μ的Kd與GM-CSF或人GM-CSF結(jié)合，并且在另外一個實施方案中，它將 以Kd彡2χ10_10結(jié)合?！翱乖Y(jié)合區(qū)”意指特異性結(jié)合指定抗原的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分。例如，包含 氨基酸殘基與抗原相互作用且對抗原結(jié)合蛋白質(zhì)賦予其對于抗原的特異性和親和力的 抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的部分稱為“抗原結(jié)合區(qū)”?？乖Y(jié)合區(qū)一般包括一個或多個“互補(bǔ)結(jié)合 區(qū)”(“⑶Rs”)。某些抗原結(jié)合區(qū)還包括一個或多個“構(gòu)架”區(qū)。“⑶R”是促成抗原結(jié)合特 異性和親和力的氨基酸序列。“構(gòu)架”區(qū)可以幫助維持CDRs的適當(dāng)構(gòu)象，以促進(jìn)抗原結(jié)合區(qū) 和抗原之間的結(jié)合。在某些方面，提供了結(jié)合GM-CSF蛋白質(zhì)或人GM-CSF的重組抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。在本文的上下文中，“重組蛋白質(zhì)”是使用重組技術(shù)即通過如本文所描述的重組核酸的表達(dá)制 備的蛋白質(zhì)。用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。術(shù)語“抗體”指任何同種型的完整免疫球蛋白，或其可以與完整抗體競爭與靶抗原特異性結(jié)合的片段，并且包括例如嵌合、人源化、全人和雙特異性抗體。“抗體”因此是抗原 結(jié)合蛋白質(zhì)的種類。完整抗體一般將包括至少兩條全長重鏈和兩條全長輕鏈，但在某些情 況下可以包括更少的鏈，例如在駱駝科動物(camelids)中可以僅包括重鏈的天然存在的 抗體。抗體可以單獨(dú)來自單一來源，或可以是“嵌合的”，即如下文進(jìn)一步描述的，抗體的不 同部分可以來自兩種不同抗體?？乖Y(jié)合蛋白質(zhì)、抗體或結(jié)合片段可以在雜交瘤中，通過重 組DNA技術(shù)，或通過完整抗體的酶促或化學(xué)切割產(chǎn)生。除非另有說明，除包括兩條全長重鏈 和兩條全長輕鏈的抗體外，術(shù)語“抗體”還包括其衍生物、變體、片段和突變蛋白質(zhì)，其例子 在下文描述。術(shù)語“輕鏈”包括全長輕鏈及其具有足夠序列以賦予結(jié)合特異性的片段。在一般 的哺乳動物抗體中，將發(fā)現(xiàn)包括可變區(qū)結(jié)構(gòu)域\和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域Q的全長輕鏈，其中輕鏈 的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域朝向多肽的氨基末端。一般的人抗體輕鏈包括κ鏈或λ鏈。術(shù)語“重鏈”包括全長重鏈及其具有足夠可變區(qū)序列以賦予結(jié)合特異性的片段。哺 乳動物全長重鏈抗體一般包括可變區(qū)結(jié)構(gòu)域Vh以及3個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。Vh 結(jié)構(gòu)域朝向多肽的氨基末端，并且Ch結(jié)構(gòu)域朝向羧基末端，其中Ch3與多肽的羧基末端最接 近。人重鏈一般可以是包括IgG (包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞型)、IgA (包括IgAl和 IgA2亞型)、IgM和IgE的同種型。如本文所使用的，術(shù)語抗體或免疫球蛋白鏈(重或輕鏈)的“功能性片段”(或簡 單地“片段”)是包括抗體的部分(不管那個部分是獲得還是合成的)的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)， 所述部分缺乏全長鏈中存在的至少某些氨基酸，但能夠與抗原特異性結(jié)合。此種片段是生 物學(xué)活性的，因為它們與靶抗原特異性結(jié)合，并且可以與其他抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，包括完整抗 體競爭與給定表位特異性結(jié)合。在一個方面，此種片段將保留全長輕或重鏈中存在的至少 一個CDR，并且在某些實施方案中，將包括單條重鏈和/或輕鏈或其部分。這些生物學(xué)活性 片段可以通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，或可以通過抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，包括完整抗體的酶促或化 學(xué)切割產(chǎn)生。免疫學(xué)功能性免疫球蛋白片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv、結(jié)構(gòu) 域抗體和單鏈抗體，并且可以來自任何哺乳動物來源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、駱駝科 動物或兔。進(jìn)一步考慮本文公開的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的功能性部分，例如一個或多個CDRs，可 以與第二種蛋白質(zhì)或小分子共價結(jié)合，以產(chǎn)生針對體內(nèi)特定靶的治療劑，其具有雙功能治 療性質(zhì)，或具有延長的血清半衰期。"Fab片段”包括1條輕鏈以及1條重鏈的ChI和可變區(qū)。Fab分子的重鏈無法與 另一種重鏈分子形成二硫鍵?！癋e”區(qū)包括兩個重鏈片段，所述片段包括抗體的C0I和Ch2結(jié)構(gòu)域。兩個重鏈片 段通過兩個或更多個二硫鍵并且通過Ch3結(jié)構(gòu)域的疏水相互作用保持在一起。"Fab'片段”包含1條輕鏈和1條重鏈的部分，所述部分包含VH結(jié)構(gòu)域和ChI結(jié) 構(gòu)域以及ChI和Ch2結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域，從而使得鏈間二硫鍵可以在兩個Fab'片段的兩條 重鏈之間形成，以形成F(ab' )2分子。"F(ab' )2片段”包含含有ChI和CH2結(jié)構(gòu)域之間的恒定區(qū)的部分的兩條輕鏈和兩條重鏈，從而使得鏈間二硫鍵在兩條重鏈之間形成。F(ab' )2片段因此由通過兩條重鏈之間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab'片段組成。"Fv區(qū)”包括來自重和輕鏈的可變區(qū)，但缺乏恒定區(qū)?！皢捂溈贵w”是其中重和輕鏈可變區(qū)已通過柔性接頭連接以形成單條多肽鏈的Fv 分子，其形成抗原結(jié)合區(qū)。單鏈抗體在PCT公開號W088/01649以及美國專利號4，946，778 和5，260，203中詳細(xì)討論?！敖Y(jié)構(gòu)域抗體”是僅包含重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的免疫學(xué)功能性免疫球蛋白片 段。在某些情況下，兩個或更多個Vh區(qū)與肽接頭共價連接，以產(chǎn)生二價結(jié)構(gòu)域抗體。二價 結(jié)構(gòu)域抗體的兩個Vh區(qū)可以靶定相同或不同抗原?！岸r抗原結(jié)合蛋白質(zhì)”或“二價抗體”包括兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。在某些情況下，兩 個結(jié)合位點(diǎn)具有相同抗原特異性。二價抗原結(jié)合蛋白質(zhì)和二價抗體可以是雙特異性的，參 見下文。多特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)”或“多特異性抗體”是靶定超過一個抗原或表位的抗原 結(jié)合蛋白質(zhì)或抗體?！半p特異性”、“雙重特異性”或“雙功能”抗原結(jié)合蛋白質(zhì)或抗體是分別具有兩個 不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的雜合抗原結(jié)合蛋白質(zhì)或抗體。雙特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)和抗體是多 特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)抗體的種類，并且可以通過各種方法產(chǎn)生，包括但不限于雜交瘤融 合或 Fab'片段連接。參見例如，Songsivilai 和 Lachmann，1990，Clin. Exp. Immunol. 79 315-321 ；Kostelny 等人，1992，J. Immunol. 148 1547-1553。雙特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)或抗 體的兩個結(jié)合位點(diǎn)將與可以存在于相同或不同蛋白質(zhì)靶上的兩個不同表位結(jié)合。術(shù)語“中和抗原結(jié)合蛋白質(zhì)”或“中和抗體”分別指這樣的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)或抗體 其與配體結(jié)合、阻止配體與其結(jié)合配偶體結(jié)合、并且中斷原本將由配體與其結(jié)合配偶體結(jié) 合引起的生物應(yīng)答。在評估抗原結(jié)合蛋白質(zhì)例如抗體或其免疫學(xué)功能性片段的結(jié)合和特異 性中，當(dāng)過量抗體使與配體結(jié)合的結(jié)合配偶體量減少至少約20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多時(如在體外競爭結(jié)合測定中測量的)，抗 體或片段將顯著抑制配體與其結(jié)合配偶體的結(jié)合。在GM-CSF抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的情況下，這 樣的中和分子將減少GM-CSF與GM-CSFR結(jié)合的能力。當(dāng)在競爭相同表位的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)(例如，中和抗原結(jié)合蛋白質(zhì)或中和抗體) 的上下文中使用時，術(shù)語“競爭”意指抗原結(jié)合蛋白質(zhì)之間的競爭通過這樣的測定進(jìn)行測 定其中測試的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)(例如，抗體或其免疫學(xué)功能性片段)阻止或抑制參照抗 原結(jié)合蛋白質(zhì)(例如，配體或參照抗體)與共同抗原(例如，GM-CSF或其片段)特異性結(jié) 合?？梢允褂帽姸囝愋偷母偁幗Y(jié)合測定，例如固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相 直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如，Stahli等人，1983，Methods in Enzymology9 =242-253)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如，Kirkland等人，1986， J. Immunol. U614-3619)、固相直接標(biāo)記測定、固相直接標(biāo)記夾心測定(參見例如， Harlow 禾口 Lane,1988, Antibodies, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)； 使用1-125標(biāo)記的固相直接標(biāo)記RIA(參見例如，Morel等人，1988，Molec. Immunol. 25 7-15)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如，Cheung，等人，1990，Virology 176 546-552)；和直接標(biāo)記 RIA (Moldenhauer 等人，1990，Scand. J. Immunol. 32 :77_82)。一般地，此種測定涉及使用與具有未標(biāo)記測試抗原結(jié)合蛋白質(zhì)和標(biāo)記的參照抗原結(jié)合蛋白質(zhì)中 任一種的固體表面或細(xì)胞結(jié)合的純化抗原。競爭性抑制通過測定在測試抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的存在下與固體表面或細(xì)胞結(jié)合的 標(biāo)記量進(jìn)行測量。通常測試抗原結(jié)合蛋白質(zhì)過量存在。通過競爭測定鑒定的抗原結(jié)合蛋白 質(zhì)(競爭抗原結(jié)合蛋白質(zhì))包括結(jié)合于與參照抗原結(jié)合蛋白質(zhì)相同的表位結(jié)合的抗原結(jié)合 蛋白質(zhì)，以及結(jié)合于與由參照抗原結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的表位足夠接近的鄰近表位以便發(fā)生空 間位阻的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。關(guān)于用于測定競爭性結(jié)合的方法的另外細(xì)節(jié)在本文實施例中提 供。通常，當(dāng)競爭抗原結(jié)合蛋白質(zhì)過量存在時，它將使參照抗原結(jié)合蛋白質(zhì)與共同抗原的特 異性結(jié)合抑制至少40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、70 %或75 %。在某些情況下，結(jié)合抑 制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。術(shù)語“抗原”指這樣的分子或分子部分其能夠由選擇性結(jié)合劑例如抗原結(jié)合蛋白 質(zhì)(包括例如，抗體或其免疫學(xué)功能片段)結(jié)合，并且另外能夠在動物中用于產(chǎn)生能夠與那 種抗原結(jié)合的抗體?？乖梢跃哂心軌蚺c不同抗原結(jié)合蛋白質(zhì)例如抗體相互作用的一個或 多個表位。術(shù)語“表位”包括能夠與抗原結(jié)合蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的任何決定簇。表位是由特異 性靶定抗原的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的抗原區(qū)域，并且當(dāng)抗原是蛋白質(zhì)時，包括接觸抗原結(jié) 合蛋白質(zhì)的特定氨基酸。最通常地，表位位于應(yīng)理解為包括非氨基酸翻譯后修飾的蛋白質(zhì) 上，但在某些情況下可以位于其他種類的分子例如核酸上。表位可以包括分子的化學(xué)活性 表面基團(tuán)，例如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；鶊F(tuán)，并且可以具有特異性三維結(jié)構(gòu)特征， 和/或特異性電荷特征。一般地，對于特定靶抗原特異的抗體將優(yōu)先識別在蛋白質(zhì)和/或 大分子的復(fù)雜混合物中的靶抗原上的表位。術(shù)語“同一性”指兩個或更多個多肽分子或兩個或更多個多核苷酸序列之間的關(guān) 系，如通過比對且比較序列測定的?！巴恍园俜直取币庵冈诒容^的分子中氨基酸或核苷酸 之間的相同殘基百分比，并且基于被比較的最小分子的大小進(jìn)行計算。對于這些計算，比對 中的空位(如果存在)必須通過特定數(shù)學(xué)模型或計算機(jī)程序(即，“算法”)來解決?？梢?用于計算所比對核酸或多肽的同一性的方法包括下述文獻(xiàn)中描述的那些Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M.,編輯)，1988, New York :Oxford University Press ； Biocomputing Informatics andGenome Projects, (Smith, D. W.,編輯)，1993, New York AcademicPress ；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M.禾口 Griffin, H. G.,編輯),1994, New Jersey Humana Press ；von Heinje, G. , 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology,New York:AcademicPress ；Sequence Analysis Primer, (Gribskov,M.和 Devereux，J.，編輯)，1991，New York :M. Stockton Press ；和 Carillo 等 人，1988，SIAM J. Applied Math. 48 1073 在計算同一性百分比中，被比較的序列以產(chǎn)生序列之間的最大匹配的方式進(jìn)行比 對。用于測定同一性百分比的計算機(jī)程序是GCG程序包，其包括GAP (Devereux等人，1984， Nucl.Acid Res. 12 387 ；GeneticsComputer Group，University of Wisconsin, Madison， WI)o計算機(jī)算法GAP用于比對待測定序列同一性百分比的兩個多肽或多核苷酸。序列進(jìn) 行比對，以得到各自氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配的跨度”，如通過算法測定的)?？?位開放罰分(其計算為3x平均對角線，其中“平均對角線”是所使用的比較矩陣的對角線平均值；“對角線”是通過特定比較矩陣對每個完全氨基酸匹配指定的得分或數(shù)目)和空位延 伸罰分(其通常是空位開放罰分的1/10倍)，以及比較矩陣?yán)鏟AM 250或BL0SUM 62與 算法結(jié)合使用。在某些實施方案中，標(biāo)準(zhǔn)比較矩陣(關(guān)于PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff 等人，1978，Atlas of ProteinSequence and Structure 5 345-352 ；關(guān)于 BLOSUM 62 比較 矩陣，參見 Henikoff 等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 10915-10919)也由算法 使用。對于使用GAP程序測定關(guān)于多肽或核苷酸序列的同一性百分比推薦的參數(shù)是下 述算法Needleman等人，1970，J. Mol. Biol. 48 :443_453 ；比較矩陣來自Henikoff等人，同上的BL0SUM 62 ；空位罰分12(但對于末端空位無罰分)空位長度罰分4相似性閾值0用于比對兩個氨基酸序列的某些比對方案可以導(dǎo)致僅兩個序列的短區(qū)域的匹配， 并且盡管在兩個全長序列之間不存在顯著關(guān)系，這個小比對區(qū)可能具有極高的序列同一 性。因此，如果希望導(dǎo)致跨靶多肽的至少50個鄰接氨基酸的比對，那么可以調(diào)整所選擇的 比對法(GAP程序)。如本文所使用的，“基本上純的”意指所述分子種類是存在的占優(yōu)勢種類，即，在摩 爾基礎(chǔ)上，它比相同混合物中的任何其他單個種類更豐富。在某些實施方案中，基本上純 的分子是其中目標(biāo)種類包括存在的所有大分子種類的至少50% (在摩爾基礎(chǔ)上)的組合 物。在其他實施方案中，基本上純的組合物將包括組合物中存在的所有大分子種類的至少 80%、85%、90%、95% 或 99%。在某些實施方案中，基本上均質(zhì)的物質(zhì)已純化至此種程度即，使得污染種類通過 常規(guī)檢測法無法在組合物中檢測出，并且因此組合物由單個可檢測大分子種類組成。術(shù)語“治療有效量”指測定為在哺乳動物中產(chǎn)生任何治療反應(yīng)的GM-CSF抗原結(jié)合 蛋白質(zhì)的量。此種治療有效量通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地確定?！鞍被帷卑ㄆ湓诒绢I(lǐng)域中的通常含義。20種天然存在的氨基酸及其縮寫遵 循常規(guī)使用。參見 Immunology-A Synthesis，第 2 版，(E. S. Golub 和 D. R. Gren，編輯)， Sinauer Associates :Sunderland, Mass. (1991)。 20 種常規(guī)氛基酸，非天然氛基酸例如 [a ]-，[a ]-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸及其他非常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如，D-氨 基酸)也可以是多肽的合適組分。非常規(guī)氨基酸的例子包括4_羥脯氨酸、羧基谷 氨酸、[￡ ]_N，N, N-三甲基賴氨酸、[￡ ]-N_乙酰賴氨酸、0-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、 N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥賴氨酸、
-N-甲基精氨酸、及其他相似氨基酸和 亞氨基酸(例如，4-羥脯氨酸)。在本文使用的多肽標(biāo)記中，依照標(biāo)準(zhǔn)使用和常規(guī)，左手方 向是氨基末端方向，并且右手方向是羧基末端方向。A. 一般概述本文提供了結(jié)合GM-CSF蛋白質(zhì)特別是人GM-CSF(hGM-CSF)蛋白質(zhì)的抗原結(jié)合蛋 白質(zhì)。所提供的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)是如本文所描述的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)包埋和 /或連接到其內(nèi)的多肽。在某些抗原結(jié)合蛋白質(zhì)中，⑶Rs包埋到“構(gòu)架”區(qū)內(nèi)，其使一個或多個CDR定向，使得達(dá)到一個或多個CDR的適當(dāng)抗原結(jié)合性質(zhì)。一般而言，所提供的抗原結(jié) 合蛋白質(zhì)可以干擾、阻斷、減少或調(diào)節(jié)GM-CSFR和GM-CSF之間的相互作用。本文描述的某些抗原結(jié)合蛋白質(zhì)是抗體或衍生自抗體。在某些實施方案中，抗原 結(jié)合蛋白質(zhì)的多肽結(jié)構(gòu)基于抗體，分別包括但不限于，單克隆抗體、雙特異性抗體、微型抗 體(minibodies)、結(jié)構(gòu)域抗體、合成抗體(有時在本文中稱為“抗體模擬物”)、嵌合抗體、人 源化抗體、人抗體、抗體融合物(有時在本文中稱為“抗體綴合物”)及其片段。各種結(jié)構(gòu)在 本文中進(jìn)一步描述。已證實本文提供的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)與GM-CSF特別是人GM-CSF的某些表位結(jié)合。 因此，本文提供的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)能夠抑制GM-CSF活性。特別地，與這些表位結(jié)合的抗原 結(jié)合蛋白質(zhì)抑制GM-CSF信號傳遞的誘導(dǎo)、GM-CSF誘導(dǎo)的細(xì)胞生長或分化、和在與GM-CSFR 結(jié)合后由GM-CSF誘導(dǎo)的其他生理效應(yīng)，等等。本文公開的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)具有各種效用。某些抗原結(jié)合蛋白質(zhì)例如用于特異性 結(jié)合測定、GM-CSF特別是hGM-CSF或其配體的親和純化，以及鑒定GM-CSF活性的其他拮抗 劑的篩選測定中。某些抗原結(jié)合蛋白質(zhì)用于抑制GM-CSFR與GM-CSF的結(jié)合，或抑制GM-CSF 的自磷酸化。如本文說明的，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可以用于各種治療應(yīng)用中。例如，某些GM-CSF抗 原結(jié)合蛋白質(zhì)可用于治療與GM-CSF相關(guān)的狀況，例如減少患者中的單核細(xì)胞趨化性，抑制 單核細(xì)胞遷移到腫瘤內(nèi)，或抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤中的累積，如本文進(jìn)一步的描述。 抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的其他用途包括例如，GM-CSF相關(guān)疾病或狀況的診斷和用于測定GM-CSF 的存在或不存在的篩選測定。本文描述的某些抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可用于治療與GM-CSF活性 相關(guān)的后果、癥狀和/或病理狀態(tài)。這些包括但不限于各種類型的炎性疾病。B. GM-CSF抗原結(jié)合蛋白質(zhì)提供了可用于調(diào)節(jié)GM-CSF活性的各種選擇性結(jié)合劑。這些試劑包括例如抗原結(jié) 合蛋白質(zhì)，其包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，單鏈抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、免疫粘附素和具有抗原 結(jié)合區(qū)的多肽)，并且與GM-CSF多肽特別是人GM-CSF特異性結(jié)合。某些試劑例如可用于抑 制GM-CSFR與GM-CSF結(jié)合，并且因此可以用于抑制與GM-CSF信號傳遞相關(guān)的一種或多種 活性。一般而言，所提供的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)一般包括如本文所描述的一個或多個 ⑶Rs(例如，1、2、3、4、5或6個⑶Rs)。在某些情況下，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)包括(a)多肽結(jié)構(gòu)和 (b)插入多肽結(jié)構(gòu)內(nèi)和/或與多肽結(jié)構(gòu)連接的一個或多個CDRs。多肽結(jié)構(gòu)可以采取各種不 同形式。例如，它可以是或包括天然存在的抗體、或其片段或變體的構(gòu)架，或性質(zhì)上可以是 完全合成的。各種多肽結(jié)構(gòu)的例子在下文進(jìn)一步描述。在某些實施方案中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的多肽結(jié)構(gòu)是抗體或衍生自抗體，分別包括 但不限于，單克隆抗體、雙特異性抗體、微型抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、合成抗體(有時在本文中稱 為“抗體模擬物”)、嵌合抗體、人源化抗體、抗體融合物(有時稱為“抗體綴合物”)、和各 自的部分或片段。在某些情況下，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)是抗體的免疫學(xué)片段(例如Fab、Fab’、 F(ab' )2或scFv)。各種結(jié)構(gòu)在本文中進(jìn)一步描述且定義。如本文所提供的某些抗原結(jié)合蛋白質(zhì)與人GM-CSF特異性結(jié)合。如本文所使用的， “特異性結(jié)合”意指平衡解離常數(shù)是< 10_8至< 10-1QM，或者< 10_9至< IO-1qM。
在抗原結(jié)合蛋白質(zhì)用于治療應(yīng)用的實施方案中，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可以抑制、干擾 或調(diào)節(jié)GM-CSF的一種或多種生物活性。在這種情況下，當(dāng)過量抗體使與GM-CSFR結(jié)合的 人GM-CSF量減少(或反之亦然)至少約40%、60%、80%、85%或更多(例如通過在體外 競爭結(jié)合測定中測量結(jié)合)時，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)特異性結(jié)合和/或顯著抑制人GM-CSF與 GM-CSFR結(jié)合。GM-CSF具有許多獨(dú)特生物效應(yīng)，其可以在許多不同測定在不同細(xì)胞類型中 進(jìn)行測量，此種測定的例子在本文中提供。所提供的某些抗原結(jié)合蛋白質(zhì)具有一般與天然存在的抗體相關(guān)的結(jié)構(gòu)。這些抗 體的結(jié)構(gòu)單位一般包括一個或多個四聚體，各自包含兩個等同的多肽鏈偶聯(lián)體，盡管某些 哺乳動物物種也產(chǎn)生僅具有單條重鏈的抗體。在典型抗體中，每個對或偶聯(lián)體包括1條 全長“輕”鏈(在特定實施方案中，約25kDa)和1條全長“重”鏈(在特定實施方案中，約 50-70kDa)。每條單個免疫球蛋白鏈包含數(shù)個“免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域”，所述結(jié)構(gòu)域各自由約90 至110個氨基酸組成并且表達(dá)特征性折疊模式。這些結(jié)構(gòu)域是基本單位，其組成抗體多肽。 每條鏈的氨基末端部分一般包括負(fù)責(zé)抗原識別的可變結(jié)構(gòu)域。羧基末端部分在進(jìn)化上比鏈 的另一個末端更保守，并且稱為“恒定區(qū)”或“C區(qū)”。人輕鏈一般分類為k和\輕鏈，并且 這些鏈各自包含1個可變結(jié)構(gòu)域和1個恒定結(jié)構(gòu)域。重鏈一般分類為P、S、Y、a或e 鏈，并且這些使抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有數(shù)個亞型，包 括但不限于，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。IgM亞型包括IgM和IgM2。IgA亞型包括IgAl和 IgA2。在人中，IgA和IgD同種型包含4條重鏈和4條輕鏈；IgG和IgE同種型包含兩條重 鏈和兩條輕鏈；并且IgM同種型包含5條重鏈和5條輕鏈。重鏈C區(qū)一般包括可以負(fù)責(zé)效 應(yīng)物功能的一個或多個結(jié)構(gòu)域。重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的數(shù)目將依賴于同種型。IgG重鏈例如 各自包含3個C區(qū)結(jié)構(gòu)域，稱為CH1、Ch2和Ch3。所提供的抗體可以具有這些同種型和亞型 中的任何。在特定實施方案中，GM-CSF抗體是IgGl、IgG2或IgG4亞型。在全長輕和重鏈中，可變和恒定區(qū)通過約12個或更多個氨基酸的“J”區(qū)連接，其 中重鏈還包括約10個或更多個氨基酸的“D”區(qū)。參見例如，F(xiàn)undamental Immunology，第 2版，第7章(Paul, ff.，編輯)1989，New York Raven Press。每個輕/重鏈對的可變區(qū)一 般形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。1.抗體的可變結(jié)構(gòu)域本文提供的各種重鏈和輕鏈可變區(qū)在表1中描述。這些可變區(qū)各自可以與上述重 和輕鏈恒定區(qū)連接，以分別形成完整抗體重和輕鏈。進(jìn)一步地，如此產(chǎn)生的重和輕鏈序列各 自可以組合，以形成完整抗體結(jié)構(gòu)。提供了抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，其包含選自 VH1、VH2、Vh3、Vh4、Vh5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、 VH11 和 Vh12 的抗體重鏈可變區(qū)，和 / 或選自 VL1、Vl2、Vl3、Vl4、Vl5、Vl6、Vl7、Vl8、Vl9、Vl10、 VL11和的抗體輕鏈可變區(qū)，如下表1中所示。這個類型的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)一般可以通過式“VHx/\y”命名，其中“X”與重鏈可變 區(qū)數(shù)目對應(yīng)，并且“y”與輕鏈可變區(qū)數(shù)目對應(yīng)，如表1中所列出的表 1示例性VH和八鏈命名 氨基酸序列VH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHW
VRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNSAQKFRGRVTMT
RDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGGYSYGYFD
YWGQGTLVTVSS
[SEQ. ID. NO 9]
VH2QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKS SGYTFTGYYMH
WVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFKGRVT
MTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDKWLDGF
DYWGQGTLVTVSS
S[SEQ. ID. NO 21]
VH3QVQLVQSGAAVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHW
VRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMT
RDTSISTASMELSRLRSDDTAVYFCARDRWLDAFDIW
GQGTMVTVSS
[SEQ. ID. NO 33]
VH4QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMH
WVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQRFRGRVT
MTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARAPYDWTF
DYWGQGTLVTVSS
[SEQ. ID. NO 45]
VH5QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHW
VRQAPGQGLEWMGWINPNSGGRNYAQKFQGRVTMT
RDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRWLDAFEIW
GQGTMVTVSS
[SEQ. ID. NO 57]
命名氨基酸序列
Vh6QVQLVQSGAEVKQPGASVKVSCEASGYTFTSYGISff
VRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTDYAQKLQGRVTMT
TDTSTSAAYMELRSLRSDDTAVYYCARQRYYYSMDV
WGQGTTVTVSS
[SEQ. ID. NO 69]
VQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMH
WVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVT
MTRDTSISTAYMELSWLRSDDTAVYYCARDRWLDAF
DIWGQGTMVTVS
[SEQ. ID. NO 81]
Vh8QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSGYYMY
WVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYARKFQGRVT
MTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARRPWELPFD
YWGQGTLVTVSS[SEQ. ID. NO 93]
Vh9qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyymhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfkgrvtmtrdtsistahmelsrlrsddtavyycvrngdyvftyfdywgqgtlvtvss[seq. id. no 105]vh10 qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyymhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfrgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarfgyfgyyfdywgqgtlvtvss[seq. id. no : 117]vh11 qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyymhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfrgrvtmtrdtsistayvelsrlrsddtavyycardpytsgfdywgqgtlvtyss[seq. id. no : 129]命名 氨基酸序列vh12 qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsggsirsggyyffswirqhpgkglewigyiyysgstyynpslksrvtisvdtsknqfslklnsvtaadtavyycaredtamdyfdyffgqgtlvtvss[seq. id. no : 141]vl1divltqspdslavslgeratinckssqsilysssnenfltwyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedvavyycqqyfsvfrtfgqgtrveik[seq.id. no 3]vl2eivltqspgtlslspgdratlscrasqsvsssyfawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqydrsprtfgqgtkveik[seq. id. no : 15]vl3eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsssyfawyqqkpgqaprlliygtssratgipdrfsgsgsgtdftltvsrlepedfavyycqqydrsprtfgqgtkveik[seq. id. no : 27]vl4eivltqspgtlslspgeratlscrasqyisntylawfqqkpgqaprlliygaatratgipdrfsgsgsgtdftftis
rlepedfavyycqqygsspwtfgqgttveik[seq. id. no : 39]vl5evvltqspgtlslspgeratlscrasqsvcssylawyqqkpdqaprllisgassratgipdrfsgsgsgtdftlti
SSLEPEDFAVYYCQQYDRSPRTFGQGTKVEIK[SEQ. ID. NO 51]Vl6NFMLAQPHSVSESPGKTVTISCIRTSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSCDISNWFGGGTKLTVL [SEQ. ID. NO 63]命名 氨基酸序列Vl7EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQVPRLLIYGTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTVSRLEPEDFAVYYCLQYDRSPRTFGQGTKVEIK[SEQ. ID. NO : 75]Vl8EIVLTQSPGTLSLSLGERAILSCRASQSLSSIYLAWYQQKPGQAPGLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYATSPWTFGQGTKVEVK[SEQ. ID. NO 87]Vl9DIQMTQSPSSLSASVOTRVTITCRASQSISNYLNWYQ
QKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFSFPITFGPGTKVDIK[SEQ. ID. NO 99]VlIO QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSffYQQHPGKAPKLMIYEVSGRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSFTGSSTffLFGGGTKLTVL[SEQ. ID. NO 111]VlII EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASPSVSSSYFAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGWSPRTFGQGTKVEIK[SEQ. ID. NO : 123]VlI2 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSRSHIGSNTVNWYQHLPGTAPKLLIYSNNHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAffDDSLNGPVFGGGTKLTVL[SEQ. ID. NO : 135]表1中列出的重鏈可變區(qū)各自可以與表1中所示的任何輕鏈可變區(qū)組合，以形成 抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。此種組合的例子包括與八1、八2、八3、八4、八5、八6、VJ、八8、八9、八10、VL11 和 VL12 中任何一個組合的 VhI，或與、八2、VL3, VL4, VL5, VL6, \ 、VL8, VL9, VL10, VLll 和 VL12中任何一個組合的Vh2等。在某些情況下，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)包括來自表1中列出區(qū)域的至少1個重鏈可變區(qū) 和/或1個輕鏈可變區(qū)。在某些情況下，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)包括來自表1中列出區(qū)域的至少 兩個不同重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)。此種抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的例子包括(8)1個\1，和 (b) Vh2、Vh3、Vh4、Vh5、Vh6、Vh7、Vh8、Vh9、Vh10, VhII 或 VH12 之一。
另一個例子包括(a)l個 VH2，和(b) VhI、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VhI 1 或 Vh12 之一。另外一個例子包括(a) 1 個 VH3，和(b)VHl、VH2、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、 VH10、VH11 或 VH12 之一等。此種抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的另外一個例子包括(a) 1個V山和(b)八2、八3、VL4, VL5, \6、VJ、\8、八9、八10、VL11或VL12之一。此種抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的另外一個例子包括(a) 1 個 VL2，和(b) Vl 1、VL3、VL4、VL5、VL6、VJ、VL8、VL9、Vl 10、VL11 或 VL12 之一。此種抗原結(jié)合蛋 白質(zhì)的另外一個例子包括(a)l 個 Vl3，禾口 (b) VlI、VL2、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VLll 或VL12之一等。重鏈可變區(qū)的各種組合可以與輕鏈可變區(qū)的各種組合中任何一個組合。
在其他情況下，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)包含兩個等同的輕鏈可變區(qū)和/或兩個等同的重 鏈可變區(qū)。例如，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可以是抗體或免疫學(xué)功能性片段，其包括與表1中列出的 輕鏈可變區(qū)對和重鏈可變區(qū)對組合的兩個輕鏈可變區(qū)和兩個重鏈可變區(qū)。所提供的某些抗體包括重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域包含僅在1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14 或 15 個氨基酸殘基處與選自 VhI、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、 VH10, VhII和Vh12的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列不同的氨基酸序列，其中每個此種序列差異獨(dú)立 地是一個氨基酸的缺失、插入或取代。某些抗體中的重鏈可變區(qū)包括與VH1、Vh2、Vh3、Vh4、 VH5、Vh6、Vh7、Vh8、Vh9、VhIO, VhII和VH12的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列具有至少70%、75%、 80%、85%、90%、95%、97%或99%序列同一性的氨基酸序列。某些抗體包括輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域包含僅在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14 或 15 個氨基酸殘基處與選自 VL1、Vl2、Vl3、Vl4、Vl5、Vl6、\ 、VL8、VL9、VL10、VlII 和的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列不同的氨基酸序列，其中每個此種序列差異獨(dú)立地是一個氨 基酸的缺失、插入或取代。某些抗體中的輕鏈可變區(qū)包括與、Vl2,Vl3,Vl4,Vl5,Vl6,Vl7, Vl8、Vl9、VlIO, VlII和VL12的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列具有至少70%,75%,80%,85%, 90%、95%、97%或99%序列同一性的氨基酸序列。另外其他的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)例如抗體或免疫學(xué)功能性片段包括如剛才描述的各 種形式的可變重鏈和可變輕鏈。2. CDRs在常規(guī)抗體中，⑶Rs包埋在重和輕鏈可變區(qū)中的構(gòu)架內(nèi)，其中它們構(gòu)成負(fù)責(zé)抗原 結(jié)合和識別的區(qū)域。相同種類的免疫球蛋白鏈的可變結(jié)構(gòu)域一般顯示相似的總體結(jié)構(gòu)， 包括通過高變區(qū)連接的相對保守的構(gòu)架區(qū)(FR)，所述高變區(qū)更通常稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或 ⑶Rs?？勺儏^(qū)包括至少3個重或輕鏈⑶Rs。來自上文提及的每個重鏈/輕鏈對的兩條鏈 的⑶Rs —般通過構(gòu)架區(qū)比對，以形成與靶蛋白質(zhì)(例如，GM-CSF)上的特定表位特異性結(jié)合 的結(jié)構(gòu)。從N末端到C末端，天然存在的輕和重鏈可變區(qū)一般都符合這些元件的下述順序 FRl、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3和FR4。已設(shè)計編號系統(tǒng)用于對占據(jù)這些結(jié)構(gòu)域中每一個結(jié) 構(gòu)域的位置的氨基酸指定編號。給定抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)和構(gòu)架區(qū)(FR)可以使用這 種系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。這種編號系統(tǒng)在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，US Dept. of Health and Human Services，PHS，NIH，NIH公開號91-3242， 1991 或 Chothia&Lesk，1987，J. Mol. Biol. :901_917 ；Chothia 等人，1989，Nature 342 878-883中定義。如本文所描述的，本文提供的CDRs不僅可以用于定義常規(guī)抗體結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，還可以包埋在各種其他多肽結(jié)構(gòu)中。本文公開的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)是一個或多個CDRs移植、插入和/或連接到其內(nèi)的多肽。抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可以具有1、2、3、4、5或6個CDRs。然而，還考慮抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可以具 有超過6個⑶Rs?？乖Y(jié)合蛋白質(zhì)因此可以具有例如1個重鏈⑶Rl (“⑶RH1”)、和/或1個 重鏈 CDR2 ( “CDRH2”)、和 / 或 1 個重鏈 CDR3 ( “CDRH3”)、和 / 或 1 個輕鏈 CDRl ( “CDRLl，，)、 和/或1個輕鏈CDR2( “CDRL2”)、和/或1個輕鏈CDR3 ( “CDRL3，，)。某些抗原結(jié)合蛋白 質(zhì)包括CDRH3和CDRL3兩者。本文公開的某些抗原結(jié)合蛋白質(zhì)包括這樣的一個或多個氨基 酸序列其與表2(CDRHs)和表3(CDRLs)中呈現(xiàn)的一個或多個CDRs的氨基酸序列等同或具 有顯著序列同一性。表 2示例性CDRH序列SEQ ID NO 氨基酸序列10GYYIH11WINPNSGGTNSAQKFRG12EGGYSYGYFDY22GYYMH23WINPNSGGTNYAQKFKG24DKffLDGFDY35WINPNSGGTNYAQKFQG36DRffLDAFDI47WINPNSGGTNYAQRFRG48APYDffTFDY59WINPNSGGRNYAQKFQG60DRffLDAFEI70SYGIS71WISAYNGNTDYAQKLQG72QRYYYSMDV94GYYMY95WINPNSGGTNYARKFQG96RPffELPFDY108NGDYVFTYFDY119WINPNSGGTNYAQKFRG120FGYFGYYFDY132DPYTSGFDY142SGGYYffSSEQ ID NO 氨基酸序列143YIYYSGSTYYNPSLKS144EDTAMDYFDY表3
示例性CDRL序列SEQ ID NO 氨基酸序列4KSSQSILYSSSNENFLT5WASTRES6QQYFSVFRT16RASQSVSSSYFA17GASSRAT 18QQYDRSPRT40RASQYISNTYLA41GAATRAT42QQYGSSPffT52RASQSVCSSYLA64IRTSGSIASNYVQ65EDDQRPS66QSCDISNW77GTSSRAT78LQYDRSPRT88RASQSLSSIYLA90QQYATSPffT100RASQSISNYLN101TASSLQS102QQSFSFPIT112TGTSSDVGGYNYVS113EVSGRPS114SSFTGSSTffL124RASPSVSSSYFASEQ ID NO 氨基酸序列126QQYGffSPRT136SGSRSHIGSNTVN137SNNHRPS138AAffDDSLNGPV在一個方面，本文公開的⑶Rs包括來源于相關(guān)單克隆抗體組的共有序列。如本文 所描述的，“共有序列”指具有在許多序列中共有的保守氨基酸和在給定氨基酸序列內(nèi)不同 的可變氨基酸的氨基酸序列。所提供的⑶R共有序列包括與⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3、⑶RL1、 CDRL2和CDRL中的每一個對應(yīng)的CDRs。使用與抗GM-CSF抗體Vh和\對應(yīng)的⑶Rs的標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)發(fā)生分析來測定共有序列。 通過使⑶Rs在與Vh或\對應(yīng)的相同序列內(nèi)保持連續(xù)來測定共有序列。CDRHl共有序列包括由X1X2GX3X4FX5X6YX7X8X9(SEQ ID NO :94)組成的氨基酸序列， 其中X1選自G和無氨基酸，X2選自G和無氨基酸，X3選自Y和F，X4選自T和S，X5選自T、S和g，x6選自g和s，x7選自y和g，x8選自i和m，并且x9選自h和s。在一個方面，⑶rhl 共有序列是seq id no :94，即x1x2gx3x4xfx5x6yx7x8x9，其中x1選自g和無氨基酸，x2選自g 和無氨基酸，x3選自y和f，x4選自t和s，x5選自t、s和g，x6選自g和s，x7選自y和g， x8選自i和m，并且x9選自h和s。cdrh2 共有序列包括由 x1x2x3x4x5x6gx7x8x9xltlx11x12x13x14x15g (seq id no 106)組成 的氨基酸序列，其中x1選自w和無氨基酸，x2選自i和y，x3選自n、s和i、x4選自p、a和 y，x5選自n和y，x6選自s和n，x7選自g和n，x8選自t和r，x9選自n和d，xltl選自y禾口 six11選自a和n，x12選自q和r，x13選自k和r，x14選自f和l，并且x15選自q、k和r。在 一個方面，cdrh2共有序列是winpnsggtnx1ax2x3fx4g，其中xl是y或s，x2是q或r，x3是 k 或 r，并且 x4 是 r、k 或 q (seq id no 28)。cdrh3共有序列包括選自x1x2x3x4x5x6x7x8fdx9 (seq id no 83)的氨基酸序列，其中 x1選自e和無氨基酸，x2選自g和無氨基酸，x3選自p、d和g，x4選自y、w、r和k，x5選自 s、w、f和t，x6選自y和l，x7選自d和g，x8選自y、無氨基酸和a，并且x9選自μ、t和v。cdrll 共有序列包括選自 kssqsxilyssx2nx3nx4lx5 (seq idno 107)、 rasx1x2x3x4x5x6yx7x8 (seq id no 118)和 x1x2x3x4x5x6x7x8x9xltlnx11vx12 (seq id no 125)的氨 基酸序列，kssqsx1lyssx2nx3nx4lx5中x1選自ν和i，x2選自s和n，x3選自ε和k，x4選自 y和f，并且x5選自t和a ；rasx1x2x3x4x5x6yx7x8中x1選自q和p，x2選自s和y，x3選自v、 l和i，x4選自s和c，x5選自s和n，x6選自s、i、t和無氨基酸，x7選自f和l，并且x8選 自 a 禾口 n ；x1x2x3x4x5x6x7x8x9xltlnx1 jx12 中 x1 選自 i、s 和 t，x2 選自 r 和 g，x3 選自 t 和 s，x4 選自r和s，x5選自g和s，x6選自s、h和d，x7選自i和v，x8選自a和g，x9選自無氨基酸 禾口 g，xltl選自s和y，x11選自y和t，并且x12選自q、n禾口 s。在一個方面，cdrll共有序列 是 rasqx1x2x3x4x5yx6a，其中 xl 是 s 或 y，x2 是 v、i 或 l，x3 是 s 或 n、x4 是 s 或 c，x4 是 s、t、s 或 y，x5 是f或 l(seq id no :30)。cdrl2 共有序列包括選自 x1x2x3x4x5x6x7, (seq id no 130)和 x1x2x3x4rps (seq id no 131)的氨基酸序列，x1x2x3x4x5x6x7中x1選自g、t和w，x2選自t和a，x3選自s和a，x4 選自s和t，x5選自r和l，x6選自a、e和q，并且x7選自t和s a1x2x3x4rps中x1選自e禾口 s，x2選自d、v和n，x3選自d、s和n，并且x4選自q、g和h。在一個方面內(nèi)，cdrl2共有序 列是 gx1ssrat，其中 xl 是 a 或 t (seq id no 34)。cdrl3 共有序列包括選自 x1qx2x3x4x5x6x7t (seq id no 84)禾口 x1x2x3x4dssnx5x6x7 (seq id no 89)的氨基酸序列，x1qx2x3x4x5x6x7t 中 x1 選自 q 和 l，x2 選自 y和s，x3選自d、g和f，x4選自r、t和s，x5選自s和v，x6選自f和p，并且x7選自r和 w ；x1x2x3x4dssnx5x6x7中x1選自s和a，x2選自s和a，x3選自w和f，x4選自d和t，x5選自 g、w和無氨基酸，x6選自v、l和p，并且x6選自v和無氨基酸。在一個方面內(nèi)，⑶rl3共有 序列是 qqx1x2x3x4x5x6t，其中 xl 是 y 或 s，x2 是 f、g 或 a，x3 是 s、t 或 w，x4 是 v、s、f, x5 是 f 或 p，x6 是 r、w 或 i (seqid no 46)。在另一個方面，所提供的cdrs是(a)選自下組的cdrh (i)選自seq id no :10、 22、7094 和 142 的 cdrhl ； (ii)選自 seq idno :11、23、28、35、47、59、71、95、106、119 和 143 的 cdrh2 ； (iii)選自 seq id no 12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132和 144 的 cdrh3 ； 和(iv)包含一個或多個氨基酸取代、缺失或插入的(i)、( )和(iii)的cdrh，所述氨基酸取代、缺失或插入不超過5、4、3、2或1個氨基酸；(B)選自下組的⑶RL: (i)選自SEQ ID NO :4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125 和 136 的 CDRLl ； (ii)選自 SEQ ID NO :5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131 和 137 的 CDRL2 ； (iii)選自 SEQ ID NO :6、18、 42、46、66、78、84、89、90、102、114、126 和 138 的 CDRL3 ；和(iv)包含一個或多個氨基酸取 代、缺失或插入的(i)、( )和(iii)的CDRL，所述氨基酸取代、缺失或插入不超過5、4、3、 2或1個氨基酸。在另外一個方面，表2和3中列出的⑶Rs的變體形式與表2和3中列出的⑶R序 列具有至少80%、85%、90%或95%序列同一性。
根據(jù)一個方面，提供了結(jié)合GM-CSF的經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，其包括㈧選自 下組的一個或多個重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(⑶RHs) :(i)選自SEQ ID NO :10、22、7094和142的 CDRHl ； (ii)選自 SEQ IDNO :11、23、28、35、47、59、71、95、106、119 和 143 的 CDRH2 ； (iii)選 自 SEQ ID NO :12、24、36、48、60、72、83、96、108、120、132和 144 的 CDRH3 ；和(iv)包含一個 或多個氨基酸取代、缺失或插入的(i)、( )和(iii)的CDRH，所述氨基酸取代、缺失或插 入不超過5、4、3、2或1個氨基酸；(B)選自下組的一個或多個輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(⑶RLs) (i) 選自 SEQ ID NO :4、16、30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125 和 136 的 CDRLl ； (ii) 選自 SEQ ID NO :5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131 和 137 的 CDRL2 ； (iii)選自 SEQ ID NO :6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126 和 138 的 CDRL3 ；和(iv)包含一個或多 個氨基酸取代、缺失或插入的(i)、( )和(iii)的CDRL，所述氨基酸取代、缺失或插入不 超過5、4、3、2或1個氨基酸；或(C) (A)的一個或多個重鏈⑶RHs和(B)的一個或多個輕鏈 CDRLs。在另外一個實施方案中，經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可以包括㈧選自下組的 CDRH ⑴選自 SEQ ID NO 10、22、7094 禾Π 142 的 CDRHl ； (ii)選自 SEQ ID N0:ll、23、28、 35、47、59、71、95、106、119 和 143 的 CDRH2 ；和(iii)選自 SEQ ID NO 12、24、36、48、60、72、 83、96、108、120、132 和 144 的 CDRH3 ； (B)選自下組的 CDRL ⑴選自 SEQ ID NO :4、16、30、 40、52、64、88、100、107、112、118、124、125 和 136 的 CDRLl ； (ii)選自 SEQ IDNO :5、17、29、 34、41、65、77、101、113、130、131 和 137 的 CDRL2 ； (iii)選自 SEQ ID NO :6、18、42、46、66、 78、84、89、90、102、114、126 和 138 的 CDRL3 ；或(C) (A)的一個或多個重鏈 CDRHs 和(B)的 一個或多個輕鏈⑶RLs。在另一個實施方案中，可變重鏈(VH)與選自SEQ ID NO :9、21、33、45、57、69、81、 93、105、117、129和141的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%的序列同一性，和/ 或可變輕鏈(VL)與選自 SEQ ID NO :3、15、27、39、51、63、75、87、99、111、123 和 135 的氨基 酸序列具有至少80 %、85 %、90 %或95 %的序列同一性。在一個進(jìn)一步的方面，提供了結(jié)合GM-CSF的經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，所述抗 原結(jié)合蛋白質(zhì)包括A)選自下組的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(⑶RH) :(i)選自SEQ ID NOs 12, 24、36、48、60、72、83、96、108、120、132 和 144 的 CDRH3 ； (ii)通過不超過兩個氨基酸的 氨基酸添加、缺失或取代而與(i)的CDRH3在氨基酸序列中不同的CDRH3 ;(iii)選自 X1X2X3X4X5X6X7X8FDX9 (SEQ ID NO 83)的CDRH3氨基酸序列，其中X1選自E和無氨基酸，&選自 6和無氨基酸，&選自？、0和644選自￥、1、1 和1(，&選自S、W、F和T，X6選自Y和L，X7選自 D和G，X8選自Y、無氨基酸和A，并且X9選自Μ、T和V ；和/或B)選自下組的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDRL)⑴選自 SEQ ID NOs :6、18、42、46、66、78、84、89、90、102、114、126 和 138 的 CDRL3，
( )通過不超過兩個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而與(i)的CDRL3在氨基酸序列中 不同的 CDRL3 ；和 iii)選自 X1QX2X3X4X5X6X7T(SEQ ID NO 84)和 X1X2X3X4DSSNX5X6X7(SEQ ID NO 89)的CDRL3氨基酸序列，X1QX2X3X4X5X6X7T中X1選自Q和L，X2選自Y和S，X3選自D、G 禾口 F，X4選自R、T和S，X5選自S和V，X6選自F和P,并且X7選自R和W ；X1X2X3X4DSSNX5X6X7 中X1選自S和A，X2選自S和A，X3選自W和F，X4選自D和T，X5選自G、W和無氨基酸，X6 選自V、L和P，并且X6選自V和無氨基酸。在另一個實施方案內(nèi)，抗原結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括A)選自下組的⑶RH (i)選自SEQ ID NOs :10、22、7094和142的CDRHl ;(ii)通過不超過兩個氨基酸的氨 基酸添加、缺失或取代 而與⑴的CDRHl在氨基酸序列中不同的CDRHl ;(iii)選自 X1X2GX3X4XFX5X6YX7X8X9 (SEQ ID NO 94)的 CDRHl 氨基酸序列，其中 X1 選自 G 和無氨基酸，X2 選自G和無氨基酸，X3選自Y和F，X4選自T和S，X5選自T、S和G，X6選自G和S，X7選自 Y 和 G，X8選自 I 和M，并且 X9 選自 H 和 S，或(iv)選自 SEQ ID NOs :5、17、29、34、41、65、 77、101、113、130、131和137的CDRH2 ； (ν)通過不超過兩個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取 代而與(iv)的CDRH2在氨基酸序列中不同的CDRH2 ；或(vi)由X1X2X3X4X5X6GX7X8X9XltlX11X1 2X13X14X15G(SEQ ID NO 106)組成的CDRH2氨基酸序列，其中X1選自W和無氨基酸，X2選自 I禾口 Y，X3選自N、S禾口 I，X4選自P、A禾口 Y，X5選自N禾口 Y，X6選自S禾口 N，X7選自G禾口 N，X8 選自T和R，X9選自N和D，Xltl選自Y和S，X11選自A和N，X12選自Q和R，X13選自K和R， X14選自F和L，并且X15選自Q、K禾口 R ；或B)選自下組的CDRL ⑴選自SEQ IDNOs :4、16、 30、40、52、64、88、100、107、112、118、124、125 和 136 的 CDRLl ； (ii)通過不超過兩個氨基 酸的氨基酸添加、缺失或取代而與(i)的CDRLl在氨基酸序列中不同的CDRLl ； (iii)選自 Kssqsx1XlyssX2NX3NX4LX5 (seq id no 107)、rasx1x2x3x4x5x6yx7x8 (seq id no :ι 8)或 x1x2x3x ^5X6YX7X8X9X10NX1 Jx12(SEQ ID NO: 125)的CDRLi氨基酸序列，KSSQSX1XLYSSX2NX3NX4LX5中X1 選自v和i，x2選自s和N，x3選自e和K，x4選自y和f，并且x5選自t和a ；rasx1x2x3x4x5x6yx7x8 中X1選自Q和P，X2選自S和Y，X3選自V、L和I，X4選自S和C，X5選自S和N，X6選自S、 I、T和無氨基酸，X7選自F和L，并且X8選自A和N ；X1X2X3X4X5X6YX7X8X9XltlNX11VX12中X1選自 I、S禾口 T，X2選自R禾口 G，X3選自T禾口 S，X4選自R禾口 S、X5選自G禾口 S，X6選自S、H禾口 D，X7 選自I和V，X8選自A和G，X9選自無氨基酸和G，Xltl選自S和Y，X11選自Y和T，并且X12選 自 Q、N 和 S ；或(iv)選自 SEQ ID NOs :5、17、29、34、41、65、77、101、113、130、131 和 137 的 CDRL2 ； (ν)通過不超過兩個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代而與(iv)的CDRL2在氨基酸 序列中不同的 CDRL2 ；或(vi)選自 X1X2X3X4X5X6X7 (SEQ ID NO 130)或 X1X2X3X4RPS (SEQ ID NO 131)的CDRL2氨基酸序列，X1X2X3X4X5X6X7中Xl選自G、T和W，X2選自T和A，X3選自S 禾口 A, X4選自S禾口 Τ，X5選自R禾口 L，X6選自A、E禾口 Q，并且X7選自T禾口 S ；X1X2X3X4RPS中Xl 選自E禾口 S，X2選自D、V禾口 N，X3選自D、S禾口 N，并且X4選自Q、G禾口 H。在一個方面，本文提供的經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可以是單克隆抗體、多克隆抗 體、重組抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體片段。在另一個實施方案中，本文提供的經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的抗體片段可以是 Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2片段、Fv片段、雙抗體或單鏈抗體分子。在一個進(jìn)一步的實施方案中，本文提供的經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)是人抗體，并且可以是IgGl型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。在另外一個方面，本文提供的經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)可以與標(biāo)記基團(tuán)偶聯(lián)，并且可以與本文提供的經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)之一的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)競爭與人GM-CSF的 細(xì)胞外部分結(jié)合。在一個實施方案中，當(dāng)施用于患者時，本文提供的經(jīng)分離的抗原結(jié)合蛋白 質(zhì)可以減少單核細(xì)胞趨化性，抑制單核細(xì)胞遷移到腫瘤內(nèi)，或抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫 瘤中的累積。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，對于具有來自所述序列的超過一個CDR的任何抗 原結(jié)合蛋白質(zhì)，獨(dú)立地選自所述序列的CDRs的任何組合都是有用的。因此，可以產(chǎn)生具有 1、2、3、4、5或6個獨(dú)立地選擇的⑶Rs的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理 解的，具體實施方案一般利用非重復(fù)CDRs的組合，例如一般用兩個CDRH2區(qū)制備抗原結(jié)合 蛋白質(zhì)，等等。所提供的某些抗原結(jié)合蛋白質(zhì)在下文中更詳細(xì)地討論?？乖Y(jié)合蛋白質(zhì)和結(jié)合表位當(dāng)抗原結(jié)合蛋白質(zhì)被說成結(jié)合特定殘基例如GM-CSF或GM-CSF的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域內(nèi) 的表位時，例如，這意指抗原結(jié)合蛋白質(zhì)與由特定殘基(例如，GM-CSF的特定區(qū)段)組成的 多肽特異性結(jié)合。此種抗原結(jié)合蛋白質(zhì)一般不接觸GM-CSF或GM-CSF的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域內(nèi)的 每一個殘基。GM-CSF或GM-CSF的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域內(nèi)的每一個單個氨基酸取代或缺失也不一 定顯著影響結(jié)合親和力。抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的表位特異性可以以各種方式進(jìn)行測定。例如，一 種方法涉及測試約15個氨基酸的重疊肽集合，所述氨基酸跨越抗原序列且在少量氨基酸 (例如3個氨基酸)增量中不同。肽固定在微量滴定皿的孔內(nèi)。固定可以通過使肽的一個末 端生物素化來實現(xiàn)。任選地，相同肽的不同樣品可以在氨基和羧基末端處進(jìn)行生物素化，并 且固定在分開孔內(nèi)用于比較目的。這對于鑒定末端特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)是有用的。任選 地，可以包括在特定目的氨基酸終止的另外的肽。這種方法可用于鑒定GM-CSF (或GM-CSF 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)的內(nèi)部片段的末端特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。篩選抗原結(jié)合蛋白質(zhì)或免疫 學(xué)功能性片段與多種肽的每一個的特異性結(jié)合。表位定義為伴隨氨基酸區(qū)段存在，所述氨 基酸區(qū)段是抗原結(jié)合蛋白質(zhì)對其顯示特異性結(jié)合的所有肽共有的。關(guān)于用于限定表位的具 體方法的細(xì)節(jié)在實施例13中闡述。競爭性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)在另一個方面，提供了抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，其與例示抗體或功能片段之一競爭結(jié)合 用于特異性結(jié)合GM-CSF的上述表位。此種抗原結(jié)合蛋白質(zhì)也可以與本文例示的抗原結(jié)合 蛋白質(zhì)之一相同的表位或重疊表位結(jié)合。與例示抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的相同表位競爭或結(jié)合的 抗原結(jié)合蛋白質(zhì)和片段預(yù)期顯示相似的功能性質(zhì)。例示的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)和片段包括上文 描述的那些，包括具有表1、2和3中包括的重和輕鏈、可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和⑶Rs的那些。1.單克隆抗體提供的抗原結(jié)合蛋白質(zhì)包括與GM-CSF結(jié)合的單克隆抗體。單克隆抗體可以使 用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)來產(chǎn)生，例如在免疫接種方案完成后，通過使從轉(zhuǎn)基因動物中收 獲的脾細(xì)胞永生化。脾細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)進(jìn)行永生化，例如通過使其與 骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤。在雜交瘤產(chǎn)生融合操作中使用的骨髓瘤細(xì)胞優(yōu)選是不產(chǎn) 生抗體的，具有高融合效率和使其無法在僅支持所需融合細(xì)胞(雜交瘤)生長的特定選擇性培養(yǎng)基中生長的酶缺陷。在小鼠融合中使用的合適細(xì)胞系例子包括Sp-20、P3-X63/ Ag8、P3-X63-Ag8. 653、NS1/1. Ag41、Sp210_Agl4、FO、NSO/U、MPC-IU MPC11-X45-GTG 1. 7 和S194/5XX0 Bul ；在大鼠融合中使用的細(xì)胞系例子包括R210. RCY3、Y3_Ag 1.2. 3、IR983F 和4B210。對于細(xì)胞融合有用的其他細(xì)胞系是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和 UC729-6。在某些情況下，雜交瘤細(xì)胞系通過下述方法產(chǎn)生用GM-CSF免疫原免疫動物(例 如，具有人免疫球蛋白序列的轉(zhuǎn)基因動物)；從已免疫的動物中收獲脾細(xì)胞；使所收獲的脾 細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合，從而產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞；從雜交瘤細(xì)胞建立雜交瘤細(xì)胞系，并且 鑒定產(chǎn)生結(jié)合 GM-CSF多肽的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。此種雜交瘤細(xì)胞系和由其產(chǎn)生的抗 GM-CSF單克隆抗體是本發(fā)明的方面。由雜交瘤細(xì)胞系分泌的單克隆抗體可以使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)進(jìn)行純化?？?以進(jìn)一步篩選雜交瘤或mAbs，以鑒定具有特定性質(zhì)的mAbs，例如阻斷Wnt誘導(dǎo)的活性的能 力。此種篩選的例子在下文實施例中提供。2.嵌合和人源化抗體還提供了基于前述序列的嵌合和人源化抗體。用作治療劑的單克隆抗體可以在 使用前以各種方式進(jìn)行修飾。一個例子是嵌合抗體，其是由來自不同抗體的蛋白質(zhì)區(qū)段組 成的抗體，所述蛋白質(zhì)區(qū)段共價連接以產(chǎn)生功能性免疫球蛋白輕或重鏈或其免疫學(xué)功能性 部分。一般地，重鏈和/或輕鏈的部分與來自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體 中的相應(yīng)序列等同或同源，而鏈的其余部分與來自另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體類或亞 類的抗體中的相應(yīng)序列等同或同源。對于與嵌合抗體相關(guān)的方法，參見例如，美國專利號 4, 816, 567 ；和 Morrison 等人，1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851_6855。CDR 移植例 如在美國專利號 6，180，370，、5，693，762，、5，693，761，、5，585，089 和 5，530，101 中描述。一般地，制備嵌合抗體的目的是制備其中來自預(yù)期患者物種的氨基酸數(shù)目達(dá)到最 大的嵌合體。一個例子是“CDR移植”抗體，其中抗體包括來自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類或 亞類的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，而抗體鏈的其余部分與來自另一個物種或?qū)儆诹硪?個抗體類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列等同或同源。對于在人中的使用，來自嚙齒類動物抗 體的可變區(qū)或所選擇的CDRs通常移植到人抗體內(nèi)，替換人抗體天然存在的可變區(qū)或CDRs。一個有用類型的嵌合抗體是“人源化”抗體。一般地，人源化抗體由最初在非人 動物中產(chǎn)生的單克隆抗體產(chǎn)生。這種單克隆抗體中一般來自抗體的非抗原識別部分的特 定氨基酸殘基進(jìn)行修飾，以與相應(yīng)同種型的人抗體中的相應(yīng)殘基同源。人源化可以例如 使用各種方法來執(zhí)行，所述方法是通過用至少部分嚙齒類動物可變區(qū)取代人抗體的相應(yīng) 區(qū)域(參見例如，美國專利號5，585，089和5, 693, 762 Jones等人，1986，Nature 321 522-525 ；Riechmann 等人，1988，Nature 332 323~27 ；Verhoeyen 等人，1988，Science 239 1534-1536)。在一個方面，將本文提供的抗體的輕和重鏈可變區(qū)的CDRs (參見表2)移植給來自 相同或不同系統(tǒng)發(fā)生物種的抗體的構(gòu)架區(qū)(FRs)。例如，重和輕鏈可變區(qū)Vh1、Vh2、Vh3、Vh4、 Vh5、VH6、Vh7、Vh8、VH9、VhIO, VhII 和 VH12，和 / 或 VL1、\2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、 VL10, VLll和VL12的CDRs可以移植給共有人FRs。為了制備共有人FRs，可以比對來自數(shù) 個人重鏈或輕鏈氨基酸序列的FRs，以鑒定共有氨基酸序列。在其他實施方案中，本文公開的重鏈或輕鏈的FRs由來自不同重鏈或輕鏈的FRs替換。在一個方面，不替換抗GM-CSF抗 體的重和輕鏈的RFs中的罕見氨基酸，而替換H 氨基酸的其余部分?！昂币姲被帷笔翘幱?一種位置中的特定氨基酸，在FR中，該特定氨基酸通常不存在于該位置中?？商娲兀瑏碜?一條重或輕鏈的經(jīng)移植的可變區(qū)可以連同恒定區(qū)使用，所述恒定區(qū)與如本文公開的那種特 定重或輕鏈的恒定區(qū)不同。在其他實施方案中，移植的可變區(qū)是單鏈Fv抗體的部分。在特定實施方案中，來自除人外的物種的恒定區(qū)可以連同人可變區(qū)一起使用，以 產(chǎn)生雜合抗體。3.全人抗體 還提供了全人抗體。無需使人類暴露于抗原而制備對于給定抗原特異的全人抗體 的方法是可獲得的(“全人抗體”)。提供用于實現(xiàn)全人抗體產(chǎn)生的一種具體方法是小鼠體 液免疫系統(tǒng)的“人源化”。將人免疫球蛋白(Ig)基因座引入內(nèi)源Ig基因已滅活的小鼠內(nèi)是 在小鼠中產(chǎn)生全人單克隆抗體(mAbs)的一種方法，所述小鼠是可以用任何所需抗原免疫 接種的動物。使用全人抗體可以使免疫原性和過敏反應(yīng)降到最低，所述免疫原性和過敏反 應(yīng)有時可以通過將小鼠或小鼠來源的mAbs作為治療劑施用于人而引起。全人抗體可以通過免疫接種轉(zhuǎn)基因動物(通常是小鼠)而產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因動 物在不存在內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下能夠產(chǎn)生人抗體所有組成成分。用于這個目的 的抗原一般具有6個或更多個鄰接氨基酸，并且任選與載體例如半抗原綴合。參見例如， Jakobovits 等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :2551_2555 Jakobovits 等人，1993， Nature 362 255-258 ；和 Bruggermann 等人，1993，Year in Immunol. Z :33。在此種方法的 一個例子中，轉(zhuǎn)基因動物通過下述方法產(chǎn)生使編碼小鼠重和輕免疫球蛋白鏈的內(nèi)源小鼠 免疫球蛋白基因座喪失能力，并且將包含編碼人重和輕鏈蛋白質(zhì)的基因座的人基因組DNA 的大片段插入小鼠基因組內(nèi)。隨后使具有少于人免疫球蛋白基因座的完全互補(bǔ)序列的部 分修飾的動物雜交，以獲得具有全部所需免疫系統(tǒng)修飾的動物。當(dāng)施用免疫原時，這些轉(zhuǎn) 基因動物產(chǎn)生這樣的抗體其對于免疫原是免疫特異性的，但具有人而不是鼠氨基酸序列， 包括可變區(qū)。關(guān)于此種方法的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，參見例如，W096/33735和W094/02602。關(guān)于用 于制備人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的另外方法在美國專利號5，545，807 ；6, 713，610 ；6, 673，986 ； 6，162，963 ；5，545，807 ；6，300，129 ；6，255，458 ；5，877，397 ；5，874，299 和 5，545，806 ；PCT 公開 W091/10741、W090/04036，以及 EP 546073B1 和 EP 546073A1 中描述。上文描述的轉(zhuǎn)基因小鼠在本文中稱為“HuMab”小鼠，包含編碼未重排的人重 ([μ]和[Y])和[κ]輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微基因座(minilocus)， 連同滅活內(nèi)源[μ ]和[κ ]鏈基因座的被靶定的突變(Lonberg等人，1994，Nature 368 856-859)。因此，小鼠顯示減少的小鼠IgM或[κ]表達(dá)并且反應(yīng)于免疫接種，并且所引 入的人重和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變，以產(chǎn)生高親和力人IgG[ κ ]單克隆抗 體(Lonberg 等人，同上.；Lonberg 禾口 Huszar，1995，Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93 ； Harding 和 Lonberg，1995，Ann. N. Y Acad. Sci. 764 536~546)。HuMab 小鼠的制備在下述 文獻(xiàn)中詳細(xì)描述Taylor 等人，1992，Nucleic Acids Research 巡6287_6295 ;Chen 等 人，1993，International Immunology 5 :647_656 ；Tuaillon 等人，1994，J. Immunol. 152 2912-2920 ；Lonberg 等人，1994，Nature 368 856~859 ；Lonberg,1994, Handbook of Exp. Pharmacologyjj_3 49-101 ；Taylor 等 人，1994，International Immunology 6 579-591 ；Lonberg 禾口 Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93 ；Harding 禾口 Lonberg, 1995, Ann. N. Y Acad. Sci. 7M 536-546 ；Fishwild 等人，1996, NatureBiotechnology 14 :845-85。進(jìn)一步參見美國專利號 5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ； 5，789，650 ；5，877，397 ；5，661，016 ；5，814，318 ；5，874，299 ；和 5，770，429 ；以及美國專利 號 5，545，807 ;PCT
發(fā)明者D·巴羅恩, J·A·柯奇納, J·C·埃斯科巴, K·A·布拉塞爾, K·奧爾森 申請人:安姆根有限公司