專利名稱：人腫瘤抗原－分枝桿菌熱休克蛋白瘤苗的組成與制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制品的組成與制備方法，尤其是用于人癌免疫治療的腫瘤疫苗。
熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)是廣泛存在于生物界的一組蛋白質(zhì)，作為分子伴侶，它們可與多種蛋白質(zhì)、多肽鏈結(jié)合形成熱休克蛋白-肽復(fù)合物(heat shock protein-peptide com-plexes,HSPPCs)，協(xié)助新生肽鏈的折疊、轉(zhuǎn)位、轉(zhuǎn)運，參與損傷蛋白質(zhì)的修復(fù)，在抗原加工、提呈方面起重要作用。在腫瘤細胞內(nèi)，HSP可與畸變蛋白質(zhì)、多肽結(jié)合，所形成的HSPPCs具有腫瘤排斥抗原的免疫學作用。從腫瘤細胞中提取HSPPCs免疫小鼠對實驗性腫瘤有明顯的免疫防治作用，是一種安全有效的新型瘤苗。但對于人癌治療來講，腫瘤細胞內(nèi)具有腫瘤排斥抗原作用的HSPPCs量極少，而手術(shù)切除的腫瘤組織量本來就少，從中提取的HSPPCs達不到治療腫瘤、防止復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移所需的劑量。HSP-PCs提取方法復(fù)雜，需高效液相色譜及其配套的層析柱等，成本高。因此從自身腫瘤中提取HSPPCs作為瘤苗在理論上充滿誘惑力，實際上難以進行，更談不上規(guī)模化生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的在于提供一種新型熱休克蛋白-腫瘤抗原(肽)疫苗，以解決從自體腫瘤細胞中提取HSPPCs存在的難以達到治療量、制備復(fù)雜、成本高等問題，使HSPPCs成為實用、安全有效、可規(guī)?；a(chǎn)的腫瘤疫苗，且價格低廉。
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種新的熱休克蛋白-腫瘤抗原(肽)瘤苗——人腫瘤抗原-分枝桿菌熱休克蛋白瘤苗的組成與制備方法。該瘤苗主要含兩類成分，一類是人腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原，在不同個體的不同腫瘤組織都有表達，決定該瘤苗的免疫特異性和免疫原性，其化學性質(zhì)可分為蛋白質(zhì)、多肽和DNA片段等。可以從手術(shù)切除的腫瘤組織、白血病病人外周血白血病細胞、培養(yǎng)的人腫瘤細胞系中提取，如P21ras]]>、P53、P210bcr-abl]]>、P185her-2/neu]]>、癌胚抗原、粘芯肽、甲胎蛋白、P15、gp100、β-角蛋白、HPV-E6、EBNA、CDK4；另一類為分枝桿菌HSP，具有抗原載體和佐劑效應(yīng)，也能刺激T細胞，從分枝桿菌屬細菌中提取。人腫瘤細胞系和分枝桿菌都可在體外大量擴增，使提取腫瘤抗原和HSP都有充足的原料。本發(fā)明采用膜分離技術(shù)提取人腫瘤抗原和分枝桿菌HSP，將兩類成分混合，建立細胞外反應(yīng)體系，向反應(yīng)體系中加入連接劑等，如酶、極性化合物、脂類、糖類及小分子連接劑，可加入巨噬細胞溶解物促進結(jié)合)，使兩類成分形成復(fù)合物。
人腫瘤抗原-分枝桿菌HSP瘤苗的制備分三個步驟1．分枝桿菌HSP的制備將分枝桿菌菌株加入到Lowen-stein-Jensen培養(yǎng)基中，置于水浴搖床等37℃培養(yǎng)48-72小時，500轉(zhuǎn)/分離心5分棄掉沉淀，3000-15000g離心10-20分，收集細菌沉淀，加入pH8.0磷酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液后加入溶菌酶2mg/10ml，超速離心機50000g-100000g離心1-5小時，收集含有可溶性蛋白的上清，用截留分子量為30KD的超濾膜濃縮，收集末透過部分；用截留分子量70KD的超濾膜分離，收集透過部分，提取分子量為30-70KD的蛋白質(zhì)，其中含HSP64等HSP，蛋白質(zhì)定量及western blot分析檢測HSP64等后，調(diào)HSP濃度，除菌備用。
2．腫瘤抗原的制備首先要制備單個瘤細胞懸液；方法因標本來源而異，對手術(shù)切除的實體瘤，先將腫瘤組織制成1mm3小塊，洗滌后加0.14％胰酶，0.03％DNA酶消化，4℃10-16小時，37℃水浴搖床震蕩30分，用力吹打后濾血網(wǎng)過濾，1500轉(zhuǎn)/分離心5分，棄上清，加入三蒸水，混勻后加3.6％氯化鈉溶液，容積比為3∶1，1500轉(zhuǎn)/分離心5分，棄上清；白血病病人取抗凝靜脈血，用淋巴細胞分離液分離，洗滌吹打后收集細胞，培養(yǎng)的腫瘤細胞系離心棄上清。將腫瘤細胞制成細胞勻漿，3000轉(zhuǎn)/分5分鐘離心，棄掉細胞碎屑，上清部分于超速離心機50000g-100000g離心，收集上清，用截留分子量不同的超濾膜濃縮和分離，選擇膜的依據(jù)是目標分子的分子量。蛋白質(zhì)定量和westernblot檢測腫瘤抗原后，除菌備用。
3．人腫瘤抗原-分枝桿菌HSP瘤苗的構(gòu)建將分別提取的人腫瘤抗原和分枝桿菌HSP按一定比例混合建立細胞外反應(yīng)體系，向反應(yīng)體系中加入連接劑等，如，酶、極性化合物、脂類、糖類、小分子連接劑，加或不加巨噬細胞溶解物，使兩類成分相互作用形成HSP-腫瘤抗原(肽)復(fù)合物，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢查，western blot檢測腫瘤抗原-HSP復(fù)合物，除菌分裝。
本發(fā)明的效果是所提供的人腫瘤抗原-分枝桿菌HSP瘤苗設(shè)計合理，構(gòu)思新穎，該瘤苗中含有人源腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原，這些抗原可為不同病人的腫瘤所表達，如20％人癌表達的P21ras]]>，具有很強的交叉反應(yīng)性，同一種瘤苗可用于不同個體的不同腫瘤的免疫治療，并且可根據(jù)欲治療腫瘤的腫瘤抗原表達情況選擇合適的瘤苗，分枝桿菌HSP可與不同的腫瘤抗原配伍，能增強機體對腫瘤抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明采用膜分離技術(shù)分離人腫瘤抗原和分枝桿菌HSP，并建立細胞外反應(yīng)體系構(gòu)建復(fù)合物，方法簡單，不需昂貴的高效液相色譜和層析柱，成本低，價格便宜。本發(fā)明提供的瘤苗為非細胞性制劑，不含毒性物質(zhì)，無成瘤性和致癌性，安全，易于為患者接受。
以下舉例詳細說明本發(fā)明的具體實施方案實施例1人突變P21ras]]>-分枝桿菌HSP瘤苗ras瘤基因的點突變在人癌中十分常見，約20％人癌表達突變的ras蛋白，其分子量為21KD，稱P21ras]]>，是一種常見的腫瘤特異性共有抗原。取表達突變ras瘤基因的人腫瘤細胞系培養(yǎng)物，1500轉(zhuǎn)/分離心5分，棄上清，hanks’液洗3次后，收集沉淀，用組織勻漿器研磨制備細胞勻漿，2000轉(zhuǎn)/分離心棄掉細胞碎屑，收集上清置于離心管中，用超速離心機離心，100000g,2-8小時。收集上清加到裝有截留分子量15KD的超濾膜的特制離心管中1000-10000轉(zhuǎn)/分，離心5-15分，或用卷式膜分離儀分離，收集未透過組分，改用截留分子量30KD的超濾膜分離，方法同上步，反復(fù)2-10次，收集濾液，取樣測定蛋白質(zhì)濃度和P21ras]]>。該腫瘤抗原也可從表達突變ras的實體瘤中分離。取分枝桿菌菌株，接種于裝有Lowen-stein-Jensen培養(yǎng)基的大型旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中，置37℃溫箱中培養(yǎng)，或加入裝相同培養(yǎng)基的三角燒瓶中于水浴搖床搖動培養(yǎng)，48-72小時后，取細菌培養(yǎng)物將其加入到離心管中，500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄掉沉淀，3000-15000g離心10-20分，收集沉淀，加hanks’液洗2次，用pH8.0磷酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液稀釋，加入溶菌酶2mg/10ml,37℃1-2小時，超速離心機50000-100000g離心1-6小時，收集可溶性上清，用截留分子量30KD的超濾膜濃縮，收集未透過部分用截留分子量70KD的超濾膜分離，收集透過液，蛋白質(zhì)定量，western blot法檢測HSP64等。調(diào)蛋白質(zhì)濃度。用pH值為7.0-7.4的含0.01-10mmol/L Ca2+、Mg磷酸緩沖液稀釋分離得到的人P21ras]]>和分枝桿菌HSP，按比例為1∶0.1-10比例混合，建立細胞外反應(yīng)體系，向反應(yīng)體系中加入0.1％-5％的甘油，加或不加巨噬細胞溶解物，其作用是促進兩類成分結(jié)合。4℃-37℃ 30分-6小時，收集反應(yīng)產(chǎn)物將其加入到裝有截留分子量50-70KD超濾膜的試管中，離心1000-100000轉(zhuǎn)/分15分-6小時，收集未透過組分，反復(fù)2-6次。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測分子量大于64KD的蛋白質(zhì)，或用west-ern blot檢測含有P21ras]]>蛋白質(zhì)和/或多肽的HSP64，以檢查連接效果。收集反應(yīng)產(chǎn)物，除菌、凍干、分裝、備用。
實施例2人P185her-2/neu]]>-分枝桿菌HSP瘤苗，取手術(shù)切除的人乳腺癌或腎癌或培養(yǎng)的腫瘤細胞系，經(jīng)免疫組化證明有P185ber-2/neu]]>蛋白表達，先按例1方法制備單個細胞懸液和100000g離心后所得的可溶性上清，將可溶性上清加入到裝有截留分子量200KD的超濾膜的離心管中，1000-10000轉(zhuǎn)/分離心，30分-2小時，收集透過部分，再用包被有抗P185her-2/neu]]>抗體、截留分子量150KD的超濾膜分離，收集未透過組分，按例1方法分離分枝桿菌HSP，將兩類成分按1∶0.1-10比例混合，加入連接酶促進二者聯(lián)合，檢測腫瘤抗原-HSP復(fù)合物，除菌、凍干、分裝。
實施例3多價腫瘤疫苗的制備，按例1方法制備單個細胞懸液和腫瘤細胞可溶性上清、分枝桿菌HSP，將腫瘤細胞可溶性上清與分枝桿菌HSP混合，比例為1∶0.1-10，向反應(yīng)體系中加入小分子連接劑乙酰巰基琥珀酸酐(S-Acetylmecaptosuccinicanhydride)，37℃反應(yīng)1-5小時，用抗HSP64包被的超濾膜分離HSP-肽復(fù)合物。方法是將抗HSP64加至超濾膜上，4℃12-16小時，洗去游離的抗體制成親和超濾膜，用截留不同分子量的超濾膜分離，根據(jù)western blot檢測結(jié)果和淋巴細胞增殖反應(yīng)結(jié)果選擇有免疫刺激活性的組分。
權(quán)利要求
1．人腫瘤抗原-分枝桿菌熱休克蛋白瘤苗的組成與制備方法，涉及一種生物制品的組成與制備方法，尤其是用于人癌免疫治療的腫瘤疫苗，其特征是主要由人源腫瘤抗原和分枝桿菌源熱休克蛋白組成，并在非細胞體系中相互作用形成復(fù)合物，所用腫瘤抗原如P53、 癌胚抗原、粘芯肽、甲胎蛋白、P15、gp100、β-角蛋白、HPV-E6、EBNA、CDK4及相應(yīng)的多肽、DNA片段，分枝桿菌熱休克蛋白主要有HSP64；采用膜分離技術(shù)提取腫瘤抗原和分枝桿菌HSP，將兩類成分混合建立細胞外反應(yīng)體系，向反應(yīng)體系中加入連接劑，如連接酶、極性化合物、脂類、糖類、小分子連接劑等。
全文摘要
人腫瘤抗原－分枝桿菌熱休克蛋白瘤苗的組成與制備方法,涉及一種生物制品的組成與制備方法,尤其是用于人癌免疫治療的腫瘤疫苗。該瘤苗采用膜分離技術(shù)分別從人腫瘤手術(shù)切除標本、白血病病人外周血白血病細胞和體外培養(yǎng)的人腫瘤細胞系中提取腫瘤抗原(蛋白質(zhì)、多肽、DNA片段),從分枝桿菌中提取熱休克蛋白,將兩類成分按一定比例混合,加入連接劑,如酶、極性化合物、脂類、糖類、小分子連接劑等。
文檔編號A61P37/00GK1306860SQ0010201
公開日2001年8月8日 申請日期2000年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月31日
發(fā)明者施廣霞, 錢振超 申請人:大連醫(yī)科大學