一種c-Met特異性嵌合抗原受體及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種c?Met特異性嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體由人抗c?Met單鏈抗體，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成。本發(fā)明還公開(kāi)了上述c?Met特異性嵌合抗原受體的氨基酸序列和核酸序列。該嵌合抗原受體用于修飾T淋巴細(xì)胞，修飾后的淋巴細(xì)胞可用于c?Met基因表達(dá)相關(guān)腫瘤的治療。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種c-Met特異性嵌合抗原受體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞免疫技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種C-Met特異性嵌合抗原受體及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌是威脅人類(lèi)健康的的惡性腫瘤之一，其中大多數(shù)為肝細(xì)胞癌（hepatocelly Lar carcinoma，HCC)。由于缺乏有效的治療手段，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)。在中 國(guó)，由于存在嚴(yán)重的乙型肝炎病毒(HBV)感染，肝癌的發(fā)病率和死亡率態(tài)勢(shì)尤為嚴(yán)峻。如今 隨著分子生物學(xué)技術(shù)及基因工程技術(shù)的發(fā)展，肝癌的開(kāi)辟了新的領(lǐng)域。細(xì)胞治療成為繼手 術(shù)治療、放療、化療后的又一新型模式，并展示出良好的前景。其中靶向治療是針對(duì)明確的 靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)出相應(yīng)的藥物，藥物進(jìn)入體內(nèi)，與靶點(diǎn)結(jié)合而發(fā)揮特異性作用，因而具有毒副作 用低，效率高的優(yōu)點(diǎn)。
[0003] 肝癌一個(gè)有前途的候選革巴點(diǎn)是c-met(mesenchymal epithelial transition factorhc-met為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體，具有絡(luò)氨酸激酶活性，通常表達(dá)于多種組織的上皮 細(xì)胞。c-met在細(xì)胞的代謝、分化以及死亡細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起著重要的作用，當(dāng)c-met 和其高親和力的配體肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合，可活化其信號(hào)通路，參與胚胎發(fā)育、組織損傷修 復(fù)以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因而，以酪氨酸激酶受體c-met為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物已經(jīng)成為腫 瘤研究中非常火熱的領(lǐng)域，為人類(lèi)對(duì)抗腫瘤提供了新的路徑。
[0004] 嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR)主要由三部分構(gòu)成：胞外抗原 結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)。其中胞外抗原結(jié)合區(qū)通常是由針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原 (tumor associated antigen，TAA)的單克隆抗體的單鏈可變區(qū)序列（single chain fragment variable，scFv)構(gòu)成（輕和重鏈可變區(qū)通過(guò)鉸鏈區(qū)連接形成）。這部分功能是識(shí) 另IJ腫瘤相關(guān)抗原，把CAR-T細(xì)胞結(jié)合到腫瘤上去?？缒^(qū)通常由CD3、CD28、⑶8等二聚體蛋白 構(gòu)成。胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)主要為免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM，通常為0)3ζ或FceRI γ )。其主要功能是把信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)給T細(xì)胞，提 高抗腫瘤及細(xì)胞因子分泌能力。CAR通過(guò)不斷地改進(jìn)，目前已經(jīng)發(fā)展到了第四代。第一代CAR 主要由識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的scFv和ITAM(通常為CD3G)構(gòu)成，但是由于僅有CD3G活化信號(hào)，T 細(xì)胞不能充分增值，且活化的T細(xì)胞在體內(nèi)存活時(shí)間短。第二代CAR在一代CAR的基礎(chǔ)上加入 一個(gè)共刺激分子，如CD28、CD 134、CD137等等，增強(qiáng)了T細(xì)胞激活、增殖，體內(nèi)維持時(shí)間，從而 提高抗腫瘤的效應(yīng)。第三代CAR在二代CAR的基礎(chǔ)上再引入一個(gè)以上的共刺激分子。第四代 CAR(TRUCKS，T cells redirected for universal cytokine killing)主要通過(guò)引入IL-12，IL-23，IL-27等細(xì)胞因子，召集固有免疫細(xì)胞-巨嗜細(xì)胞等殺傷TAA陰性的腫瘤細(xì)胞。
[0005] CAR-T治療是利用嵌合抗原受體可以特異性地識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原（TAA，tumor associated antigen)祀點(diǎn)，結(jié)合后將信號(hào)傳到胞內(nèi)，引起T細(xì)胞的激活和增增，清除腫瘤細(xì) 胞。修飾后的T細(xì)胞不受腫瘤微環(huán)境的抑制，以非MHC (major histocompatibility complex，主要組織相容性復(fù)合體)限制方式抵御腫瘤細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于【背景技術(shù)】存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種c-Met特異性嵌合抗 原受體。
[0007] 本發(fā)明的目的還在于提供上述嵌合抗原受體的氨基酸序列和核酸序列。
[0008] 本發(fā)明的目的還在于提供上述嵌合抗原受體的應(yīng)用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出的一種c-Met特異性嵌合抗原受體，由人抗C-Met 單鏈抗體，⑶8TM，⑶137，及⑶3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成。
[0010]優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012] 優(yōu)選地，所述人抗c-Met單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013] 優(yōu)選地，所述人抗c-Met單鏈抗體的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0014] 優(yōu)選地，所述人抗c-Met單鏈抗體包括輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū) 的核酸序列如SEQ ID N0.10所示。
[0015] 優(yōu)選地，所述重鏈可變區(qū)的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0016] 優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體的氨基末端含有一個(gè)信號(hào)肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0017] 優(yōu)選地，所述人抗c-Met單鏈抗體的重鏈分子和輕鏈分子之間有一個(gè)連接肽，其氨 基酸序列為 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。
[0018] 優(yōu)選地，CD137的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0019] 優(yōu)選地，CD137的核酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0020] 優(yōu)選地，CD8TM，CD 137，及⑶3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域?yàn)門(mén)細(xì)胞共刺激 信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)，其氨基酸序列如SEQ ID Ν0.9所示。
[0021]本發(fā)明還提出的上述C-Met特異性嵌合抗原受體在制備治療C-Met相關(guān)腫瘤藥物 中的應(yīng)用。
[0022] c-Met相關(guān)的腫瘤包括肝癌、腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等。
[0023]本發(fā)明根據(jù)實(shí)驗(yàn)室從全人源抗體庫(kù)篩選出C-Met抗體Fab(可參見(jiàn)中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利 《抗Met人源Fab及其阿霉素偶聯(lián)物和其制法及應(yīng)用》，申請(qǐng)?zhí)枮?01110065209.2，【公開(kāi)日】為 2011年9月7日，公開(kāi)號(hào)為102174106A)，經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化，基因合成抗c-Met的ScFv序列，并 將合成ScFv克隆到pSFG-CD8TM-CD137-CD3G中，即構(gòu)建成c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3G嵌 合抗原受體，即獲得本發(fā)明的嵌合抗原受體c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3G。
[0024]利用嵌合抗原受體與逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝質(zhì)粒RD114在GP2-293T細(xì)胞包裝成逆轉(zhuǎn)錄病 毒，利用該病毒感染T淋巴細(xì)胞。利用El isa檢測(cè)CAR-T細(xì)胞在抗原刺激下IFN- γ的分泌及 CCK8法對(duì)c-Met陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞的殺傷作用。
[0025]本發(fā)明公布了c-Met特異性的嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)，體外感染T淋巴細(xì)胞。修飾后 的T淋巴細(xì)胞釋放IFN-γ等殺傷腫瘤細(xì)胞。c-Met特異性的嵌合抗原受體可以用于c-Met相 關(guān)腫瘤的靶向治療。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所得c-Met-scFv的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的電泳圖；其中 Μ為標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物，1為c-Met-scFv的重鏈可變區(qū)，2為c-Met-scFv的輕鏈可變區(qū)。
[0027]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1所得質(zhì)粒重組的電泳圖；其中Μ為標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物，1為c-Met CAR 載體，2為經(jīng)乂&&11，831111逆轉(zhuǎn)錄病毒載體〇)8了]\1-〇)137-〇)3(，3為(3-]^丨80卩￥。
[0028]圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中采用Western Blotting檢測(cè)本發(fā)明所得c-Met特異性嵌合 抗原受體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的表達(dá)，其中1為作為對(duì)照的未轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，2為轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病 毒CD19CAR質(zhì)粒的293T細(xì)胞，3為轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒c-Met CAR質(zhì)粒的293T細(xì)胞。
[0029] 圖4為Western Blot檢測(cè)不同的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞中c-Met的表達(dá)。
[0030]圖5為本發(fā)明所得c-Met特異性嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷檢 測(cè)。
[0031]圖6為本發(fā)明所得c-Met特異性嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞在受到c-Met抗原刺激 后IFN-γ的表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面，通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0033] 實(shí)施例1: c-Met特異性嵌合抗原受體慢病毒載體的構(gòu)建
[0034] 1.本實(shí)驗(yàn)室利用基因工程抗體技術(shù)，從全人源抗體庫(kù)篩選出多株具有生物學(xué)活性 的c-met抗體Fab，并證實(shí)具有較高的親和力和明顯的中和作用，可作為CAR-T細(xì)胞治療的候 選革巴分子和候選ScFv。
[0035]利用本實(shí)驗(yàn)室篩選的抗c-Met的Fab序列，選出其中VH和VL的序列，用于設(shè)計(jì)CAR載 體中的scFv序列，采用金斯瑞生物技術(shù)公司OptimumGeneTM基因設(shè)計(jì)軟件對(duì)密碼子進(jìn)行進(jìn) 一步優(yōu)化，在優(yōu)化的序列兩端分別加上NcoI，SphI酶切位點(diǎn)，優(yōu)化后的序列由南京金斯瑞生 物技術(shù)公司完成基因合成，合成后的序列克隆在PUC57載體，質(zhì)粒命名為c-Met-scFv-pUC57〇
[0036] 2.c-Met-scFv-pUC57質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶Xball和Ban^酶切，酶切體系如下。2yg c-Met-scFv-pUC57、lyLXbal、lyLBamHI、2yL 10 X 酶切緩沖液，用水補(bǔ)到20yL，37°C水浴中 過(guò)夜，酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外下切取目的條帶，采用DNA凝膠回收試劑盒 (AXYGEN公司）回收目的片段;其結(jié)果如圖1所示，pUC57-c-Met-ScFv載體經(jīng)Xbal和BamHI酶 切釋放目的條帶。
[0037]用同樣的方法Xbal和BamM酶切pSFG-CD8TM-CD137-CD3G載體，用瓊脂糖凝膠電 泳，回收目的片段。其結(jié)果如圖2所示，pSFG-⑶8TM-⑶137-⑶3ζ載體經(jīng)Xbal和BamHI酶切釋 放目的條帶。
[0038] 將回收后的c-Met-ScFv與酶切載體通過(guò)T4DNA連接酶連接，反應(yīng)體系如下：2yL c- Met-ScFv、2yL載體酶切產(chǎn)物、lyL 10 X連接緩沖液、lyL連接酶，用水補(bǔ)到10yL，16 °C水浴中 過(guò)夜。取連接產(chǎn)物加入到DH5a感受態(tài)中[參考《分子克隆》第三版中大腸桿菌感受態(tài)制備 (CaCl2法）]，放置37°C細(xì)菌培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆的 質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測(cè)序，將正確的載體命名為c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3G。
[0039] 實(shí)施例2: c-Met特異性嵌合抗原受體表達(dá)鑒定
[0040] 參照無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒內(nèi)（天根生物）的操作說(shuō)明書(shū)提取逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3G，提取的質(zhì)粒，用PI轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到人胚腎細(xì)胞293T中，48h 后，用PBS洗一遍，用細(xì)胞蛋白提取試劑(RIPA)裂解細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞的蛋白經(jīng) 10 %的SDS-PAGE進(jìn)行分離后，恒流(300mA，lh)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用抗0)3ζ (1:1000)抗體孵 育，4°C孵育過(guò)夜。用TOST洗滌3遍后，用HRP羊抗小鼠的二抗（1:5000)室溫孵育lh。加入ECL 顯色后，用Bio-Rad公司的ChemiDoc XRS System進(jìn)行成像，其結(jié)果如圖3所示。
[0041]由圖3可知：本發(fā)明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠檢測(cè)到目的條帶的表達(dá)，大小與陽(yáng)參 ⑶19 一致，而未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞沒(méi)有條帶。
[0042]實(shí)施例3: c-Met特異性嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞的制備 [0043] 1.含抗c-Met嵌合抗原受體逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝
[0044]用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒內(nèi)（天根生物）的操作說(shuō)明書(shū)提取逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝載 體RD114和c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3G逆轉(zhuǎn)錄病毒載體共轉(zhuǎn)染到GP2-293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染 后48h收集細(xì)胞上清，4000rpm離心10min，去除上清中的細(xì)胞及細(xì)胞碎片。用0.45μπι的濾膜 過(guò)濾，分裝凍存，備用。
[0045] 2. Τ淋巴細(xì)胞的制備
[0046]采取20mL健康志愿者的新鮮抗凝血，用淋巴分離液(GE公司）分立外周血單核細(xì)胞 (PBMC)。分離后的細(xì)胞用CD3和CD28平板刺激48h，用T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551(TAKARA公 司）加3%自身血漿進(jìn)行誘導(dǎo)，得到T淋巴細(xì)胞。
[0047] 3.CAR-T細(xì)胞的制備
[0048] 用50yg/mL的RetroNectin(TAKARA公司）包被非組織培養(yǎng)板24孔板，每孔加入500μ L，4°C過(guò)夜。每孔再加入500yL病毒上清，37°C孵育30min。去除病毒上清，再加入500yL病毒 上清，37°C孵育30min，除病毒上清，每孔加入1.5mL病毒上清，再加入0.5mL稀釋后的T淋巴 細(xì)胞。從而獲得c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3GT細(xì)胞即c-Met特異性CAR-Τ細(xì)胞。
[0049]實(shí)施例4: c-Met特異性CAR-Τ細(xì)胞對(duì)c-Met相關(guān)腫瘤的殺傷作用 [0050] 1 .Western Blotting檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中c-Met的表達(dá)
[00511 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人黑色素瘤細(xì)胞A375、肝癌細(xì)胞Hep-G2、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231，用細(xì)胞蛋白提取試劑(RIPA)裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western Blotting檢測(cè)，其 結(jié)果如圖4所示:人黑色素瘤細(xì)胞A375，肝癌細(xì)胞Hep-G2檢測(cè)到c-Met的表達(dá)，MDA-MB-231而 檢測(cè)不到c_Me t的表達(dá)。
[0052] 2.CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷力檢測(cè)
[0053] 將腫瘤細(xì)胞用培養(yǎng)基調(diào)整到5X106/mL，每孔50yL，按E:T(效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比） 為16:1、8:1、4:1、2:1，分別加入腫瘤細(xì)胞2.5\10 6個(gè)、1.25\106個(gè)、6.25\105個(gè)、3.125\ 1〇5個(gè);待細(xì)胞完全貼壁后，收集T細(xì)胞和CAR-Τ細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X 106/mL，每孔50yL， 培養(yǎng)12h。棄上清加入100yL稀釋的CCK8,孵育4~6小時(shí)，酶標(biāo)儀檢測(cè)0D450的吸光值。
[0054] 上述腫瘤細(xì)胞為人黑色素瘤細(xì)胞A375、肝癌細(xì)胞Hep-G2、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231〇
[0055] 檢測(cè)結(jié)果如圖5所示:CAR-Τ細(xì)胞對(duì)c-Met表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞的殺傷率 高于c-Met不表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231; c-Met特異性CAR-Τ細(xì)胞對(duì)表達(dá)c-Met的腫瘤細(xì) 胞殺傷作用高于T細(xì)胞，高于⑶19CAR-T細(xì)胞。
[0056] 3.ELISP0T檢測(cè)CAR-Τ細(xì)胞在受到c-Met抗原刺激后IFN- γ的表達(dá)
[0057] 用無(wú)菌包被液稀釋IFN- γ 抗體后加入ELISP0T(Mi 11 ipore，Cat · No · MAIPS4510)平 板中，每孔100yL，4°C放置過(guò)夜。第二天用無(wú)菌的包被液將平板洗滌2遍。每孔加入200yL完 全培養(yǎng)基，室溫封閉lh。洗去含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640,用roS洗三遍。準(zhǔn)備c-Met胞外 區(qū)多肽，稀釋在含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640,調(diào)至終濃度lyg/mL。每孔100yL。調(diào)整待檢 測(cè)CAR-T細(xì)胞濃度為1 X 106/mL，每孔加入100yL，37°C，5 %C02放置24h，棄去細(xì)胞及培養(yǎng)基， 用ELI SPOT洗滌液洗滌3遍。每孔加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，100μL7孔，4 °C放置過(guò)夜。再用 ELISP0T洗滌液洗滌4遍。每孔加入HRP標(biāo)記的親和素，100μL7孔，室溫放置45min。用ELISP0T 洗滌液洗滌3遍后，用roS洗滌2遍。每孔加入100yL ACE顯色底物，室溫顯色20-60min。待出 現(xiàn)明顯集落點(diǎn)后，用無(wú)菌水洗滌3遍終止反應(yīng)。空氣中晾干平板，用ELISP0T讀板機(jī)計(jì)算形成 的斑點(diǎn)數(shù)，其結(jié)果如圖6所示。由圖6可知:CAR-T細(xì)胞在特異性c-Met抗原刺激下能夠分泌 IFN- γ 〇
[0058] 以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其 發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種C-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體由人抗C-Met單鏈 抗體，⑶8TM，⑶137，及⑶3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體 的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述人抗c-Met單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示;優(yōu)選地，所述人抗c-Met單鏈抗體的核酸序 列如SEQ ID NO.5所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述人抗c-Met單鏈抗體包括輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)的核酸序列如SEQ ID NO. 10 所示;優(yōu)選地，所述重鏈可變區(qū)的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗 原受體的氨基末端含有一個(gè)信號(hào)肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述人抗c-Met單鏈抗體的重鏈分子和輕鏈分子之間有一個(gè)連接肽，其氨基酸序列為Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser_Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 〇8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，CD137的氨基 酸序列如SEQIDN0.7所示 ;優(yōu)選地，CD137的核酸序列如SEQIDN0.8所示。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，CD8TM， CD137,及CD3G的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域?yàn)門(mén)細(xì)胞共刺激信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)，其氨基酸 序列如SEQ ID NO.9所示。10. 如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述c-Met特異性嵌合抗原受體在制備治療c-Met相關(guān)腫瘤 藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK106008721SQ201610483181
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年8月9日
【發(fā)明人】馮振卿, 朱進(jìn), 許國(guó)貞, 劉振云, 唐奇, 唐小軍, 周熒
【申請(qǐng)人】安徽未名細(xì)胞治療有限公司