專利名稱：起催化作用的抗因子Ⅷ同種抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種測定能降解哺乳動物中因子VIII的起催化作用的抗因子VIII同種抗體的存在的方法，以及由所述起催化作用的抗因子VIII同種抗體使所述因子VIII分子中裂解部位特征化的方法。
本發(fā)明還涉及一種被抗因子VIII同種抗體催化的因子VIII降解抑制劑。
本發(fā)明進一步涉及一種藥物組合物，其中包含所述的能降解因子VIII并來源于所述測定方法的起催化作用的抗因子VIII同種抗體，還涉及一種藥物組合物，其中包含被所述抗因子VIII同種抗體催化的因子VIII降解抑制劑。
最后，本發(fā)明涉及以下這些物質(zhì)在治療上的應用，即所述抗因子VIII同種抗體催化的因子VIII降解抑制劑，包含所述能降解因子VIII以及起源于所述測定方法的起催化作用的抗因子VIII同種抗體的藥物組合物，以及包含所述抗因子VIII同種抗體催化的因子VIII降解抑制劑的藥物組合物。
給具有嚴重血友病A的病人注入同源的因子VIII導致25％的病案出現(xiàn)抗因子VIII同種抗體(Ehrenforth，S.，Kreuz，W.，Scharrer，I.，Linde，R.，F(xiàn)unk，M.，Güngr，T.，Krackhardt，B.和Komhuber，B.，《Incidence of development of factor VIII and factor IX inhibitors inhaemophiliacs》，Lancet，1992，339594-598)，該同種抗體通過因子VIII與穩(wěn)定化分子(Saenko，E.L.，Shima，M.，Rajalakshmi，K.J.和Scandella，D.，《Arole for the C2 domain of factor VIII in bindingto von Willebrand factor》，J.Biol.Chem.，1994，26911601-11605；和Saenko，E.L.，Shima，M.，Gilbert，G.E.，和Scandella，D.，《Slowed release of thrombin-cleaved factor VIII from von Willebrandfactor by a monoclonal and a human antibody is a novel mechanismfor factor VIII inhibition》，J.Biol.Chem.，1996，27127424--27431)，或與對其活性來說必要的分子(Arai，M.，Scandella，D.，和Hoyer，L.W.，《Molecular basis of factor VIII inhibition by humanantibodiesAntibodies that bind to the factor VIII light chainprevent the interaction of factor VIII with phospholipid》，J.Clin.Invest.，1989，831978-1984；和Zhong，D.，Saenko，E.L.，Shima，M.，F(xiàn)elch，M.和Scandella，D.，《Some human inhibitor antibodiesinterfere with factor VIII binding to Factor IX》.，Blood，1998，92136-142)，或與活化分子(Lubahn，B.C.，Ware，J.，Stafford，D.W.，和Reiser，H.M.，《IdentificatIon of a FVIII epitope recognized bya human hemophilic inhibitor》，Blood，1989，73497-499；和Neuenschwander，P.F.，and Jesty，J.，《Thrombin-activated andfactor Xa-activated human factor VIIIdifferences in cofactoractivity and decay rate》，Arc.Biochem.Biophys.，1992，296426-434)的相互作用的空間位阻來抑制因子VIII的促凝血活性。
申請人發(fā)現(xiàn)的起催化作用的抗因子VIII同種抗體是就他所知在治療帶有因子VIII的病人時出現(xiàn)被誘導的催化抗體的第一次報告。迄今為止仍認為在因子VIII存在下形成抗體是令人非常驚訝的，甚至是荒謬或難以置信的，因為實際上這將通過催化水解使因子VIII分子失去活性(《蛋白質(zhì)水解(proteolysis)》)。但是至今已報道的在疾病過程中或在生理條件下發(fā)現(xiàn)的催化抗體都是自身抗體。因此，被誘發(fā)的抗體稱作同種抗體(ALLO-antibodies)，其起源與任何自身免疫疾病中的自身抗體(AUTO-antibodies)的起源明顯不同。
對于一個病人的抗因子VIII抗體的反應來說，算術平均值Km和表觀Vmax分別是9.46±5.62μM和85±60fmol.min-1。因子VIII水解動力參數(shù)表明在活體內(nèi)因子VIII鈍化作用中催化免疫應答的功能性作用。
由此抗因子VIII同種抗體作為位點特異蛋白酶的特性給具有抗因子VIII同種抗體的病人提供了新的疾病治療方法。
因此依據(jù)本發(fā)明第一方面，本發(fā)明提供了一種測定能夠降解哺乳動物中因子VIII的、起催化作用的抗因子VIII同種抗體是否存在的方法，其特征在于該方法包括i)從所述哺乳動物中取得的血樣分離出血漿；ii)從所述血漿中分離出抗因子VIII同種抗體；iii)放置所述抗因子VIII同種抗體，使之與因子VIII接觸一段時間，該時間足以使所述因子VIII被所述抗因子VIII同種抗體任意降解；以及iv)在所述的一段時間后，測定所述因子VIII是否被所述的抗因子VIII同種抗體有效地降解。
依據(jù)本發(fā)明方法步驟ii)的實施方式，所述抗因子VIII同種抗體通過與所述因子VIII組合而從所述血漿中分離出來，所述因子VIII優(yōu)選與一種基質(zhì)偶合。有利的是，在步驟ii)中，所述抗因子VIII同種抗體通過親合色譜法分離出來。優(yōu)選地在步驟ii)中，所述親合色譜法包括使用瓊脂糖凝膠(Sepharose)基質(zhì)，優(yōu)選用溴化氰活化。
依據(jù)本發(fā)明方法步驟iii)的實施方式，所述因子VIII用一種標記試劑所標記，優(yōu)選用放射性標記試劑，具體來說如125I。有利的是在步驟iii)中，在約15℃到約40℃，優(yōu)選為38℃的溫度下，所述因子VIII與所述抗因子VIII同種抗體接觸放置的時間在約0.5到約30小時之間，優(yōu)選約10小時。
依據(jù)本發(fā)明方法步驟iV)的實施方式，測定所述因子VIII是否被所述抗因子VIII同種抗體有效地降解的方法是通過包括分離技術的測定方法來完成的，例如凝膠電泳，具體來說例如SDS PAGE，或凝膠過濾，具體來說例如快速蛋白質(zhì)液相色譜凝膠過濾，以及造影術，具體來說例如放射自顯影術。
依據(jù)本發(fā)明方法進一步的實施方式，所述方法的特征在于其進一步包括V)使被所述抗因子VIII同種抗體裂解的所述因子VIII分子中一個(多個)部位特征化。
依據(jù)本發(fā)明方法的步驟V)的實施方式，所述的特征化是通過將所述因子VIII與能夠降解因子VIII的所述抗因子VIII同種抗體接觸放置，分離，然后對由此得到因子VIII片段測序來完成的。有利的是所述分離是用例如凝膠電泳，具體而言如SDS PAGE，或凝膠過濾的技術來實施的。所述測序方法有利地是用例如N-終端測序，具體而言如用自動蛋白質(zhì)微層序的技術來實施的。通過使用這種測序，將以下易裂開的價鍵定位Arg372-Ser373，定位于因子VIII分子A1和A2結(jié)構(gòu)域(domain)之間，Tyr1680-Asp1681，定位于因子VIII分子A3結(jié)構(gòu)域的N-終端上，Glu1794-Asp1795，定位在因子VIII分子的A3結(jié)構(gòu)域內(nèi)。
依據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種氨基酸序列Ser Val Ala Lys Lys His Pro；一種氨基酸序列Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser；和一種氨基酸序列Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu。
本發(fā)明還擴展到因子VIII的這種或任何其它序列的變異體(variant)或類似物(analogue)，這些序列能夠抑制因子VIII分子中任意容易被抗因子VIII同種抗體水解的位點。在本發(fā)明的上下文中，這種變異體可以是以上所述的如一種氨基酸序列的肽或非肽類似物，該氨基酸序列抑制因子VIII分子中任何容易被抗因子VIII同種抗體水解的位點。這種變異體可以是例如在N-端，C-端或兩端短幾個氨基酸或者長幾個氨基酸的該序列的變異體(通過化學合成或通過酶解天然分子可能得到這種變異體)，只要該變異體抑制因子VIII分子中任何易被抗因子VIII同種抗體水解的位點。
因此，依據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種被抗因子VIII同種抗體催化的因子VIII降解抑制劑。有利的是，這種抑制劑的特征在于其包括蛋白酶抑制劑。這種在本發(fā)明范圍內(nèi)的能用作抗因子VIII同種抗體催化的因子VIII降解抑制劑的蛋白酶抑制劑的例子是，但不限于，氟代磷酸酯型抑制劑，例如DFP，或磺酰氟化物型抑制劑，例如PMSF或AEBSF(4-(2-氨基乙基)苯基磺酰氟化物)氫氯化物(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國的著名商標，商標名稱是Pefabloc)。更具體而言，這種抑制劑的特征在于所述抑制劑抑制易斷裂價鍵的裂解Arg372-Ser373，位于因子VIII分子的A1結(jié)構(gòu)域之間，Tyr1680-Asp1681，位于因子VIII分子的A3結(jié)構(gòu)域的N-末端，和Glu1794-Asp1795，位于因子VIII分子的A3結(jié)構(gòu)域內(nèi)。更優(yōu)選的是，該抑制劑的特征在于其包括一種氨基酸序列的肽或非肽類似物Ser Val Ala Lys Lys His Pro；一種氨基酸序列的肽或非肽類似物Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser；或一種氨基酸序列的肽或非肽類似物Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu。
如上所述的因子VIII降解抑制劑，以及其加成鹽，尤其是其藥用可接受的加成鹽，具有非常有價值的藥理學性質(zhì)(pharmaceutical profile)，因為這些物質(zhì)對抗因子VIII同種抗體具有中和活性。
這些性能證明了它們在治療上的應用，且本發(fā)明通過藥劑的方式進一步涉及因子VIII降解抑制劑，及其加成鹽，尤其是它們的在藥理學上可接受的加成鹽。
因此，尤其是在血友病性質(zhì)的疾病，更具體地說涉及由于因子VIII缺乏造成的凝血缺陷的疾病的治療中將具體指明這些物質(zhì)。
可以提及到的這些物質(zhì)的應用的例子是具有如輕微或嚴重血友病A的高響應病人的治療，例如，一方面(當在這些病人中發(fā)現(xiàn)催化抗體的情況下)，和/或另一方面，遭受例如自身免疫疾病的病人(當在這些病人中發(fā)現(xiàn)催化抗體的情況下)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的第四主要方面，本發(fā)明通過一種藥物組合物解決一種長期需要，其特征在于該藥物組合物包含如上所述的，特別是可以從以上所述的方法得到的，藥用有效量的、能夠降解因子VIII的至少一種抗因子VIII同種抗體，或者至少一種加入到藥用可接受的賦形劑、媒介物或載體中的其加成鹽。
此外，依據(jù)本發(fā)明的第五主要方面，本發(fā)明提供一種藥物組成物，其特征在于其包含如上所述的，藥用有效量的至少一種因子VIII降解抑制劑，或者至少一種加入到藥用可接受的賦形劑、媒介物或載體中的其加成鹽。
這些組合物可通過如口腔、直腸、腸胃外、透皮膚的、眼的、鼻的、耳的途徑用藥。
這些組合物可以是固態(tài)或液態(tài)的，可以存在于人類藥品通常使用的藥用形式中，例如，簡單或涂布的片劑、膠囊、顆粒、栓劑、注射制劑、透皮體系、滴眼藥、氣霧劑、噴霧劑和滴耳劑。這些藥劑用傳統(tǒng)方法制備。其活性主要成分，包括由如上所述的，藥用有效量的至少一種因子VIII降解抑制劑或者一種藥用可接受的其加成鹽組成，可以將其與藥用組合物中通常使用的賦形劑摻雜在一起，例如滑石，阿拉伯膠，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，聚維酮，纖維素衍生物，可可脂，半合成的甘油酯，水性或非水性媒介物，從動物或植物得到的脂肪，乙二醇，各種濕潤劑，分散劑或乳化劑，硅酮膠，某些聚合物或共聚物，防腐劑，香料和顏料。優(yōu)選的藥劑形式是注射劑形式。
本發(fā)明還包括了一種具有中和活性的藥物組合物，該組合物可用作尤其是如產(chǎn)生抗因子VIII同種抗體的血友病A疾病的有利療法；尤其是帶有抗因子VIII同種抗體的自身免疫疾病(當在這些病人中發(fā)現(xiàn)催化抗體的情況下)，所述組合物的特征在于其包含如上所述的，藥用有效量的至少一種因子VIII降解抑制劑，或者至少一種加入到藥用可接受的賦形劑、媒介物或載體中的其藥用可接受的加成鹽。
本發(fā)明還包括一種治療哺乳動物的治病方法，該哺乳動物遭受由其血液中因子VIII水平導致的病狀，該治病方法的特征在于將藥用有效量的至少一種如上所述的因子VIII降解抑制劑，或者一種其藥用可接受的加成鹽給所述的哺乳動物用藥。
這種方法特別提供了一種治療血友病特性，尤其是在血液中缺乏因子VIII造成的疾病的有利療法。
本發(fā)明還包括一種具有抗血栓活性的藥物組合物，其尤其可作為治療如血栓癥疾病的有利療法，所述組合物的特征在于其包括特別是可以從以上所述的方法得到的，藥用有效量的能夠降解因子VIII的至少一種抗因子VIII同種抗體，或者一種加入到藥用可接受的賦形劑、媒介物或載體中的其藥用可接受的加成鹽。
本發(fā)明還包括一種哺乳動物的治療方法，其特征在于將治療有效量的至少一種如上所述的抗因子VIII同種抗體，或者一種其藥用可接受的加成鹽給所述的哺乳動物用藥。
這種方法特別提供了一種治療血栓特性，尤其是在血液中存在過量因子VIII造成的所述病理的有利療法。
在人類和動物的療法中，如上所述的抗因子VIII同種抗體或因子VIII降解抑制劑可以任何形式，特別是膠囊或片劑的口服形式，或腸胃外使用的注射液形式，就其本身給藥，或與病理生理可接受的賦形劑一起給藥?？梢韵氲狡渌慕o藥形式，如栓劑，軟膏，膏狀物，凝膠體或氣溶膠制劑。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，使用以下術語《起催化作用的抗因子VIII同種抗體》的意義應當理解為這樣的抗體該抗體通過因子VIII治療制劑的輸血過程被導向因子VIII，在血友病A病人中引發(fā)并賦予因子VIII催化活性；《因子VIII》的意義應當理解為在凝血過程中在因子X酶切中的因子IX的一種輔酶；《因子VIII的降解》的意義應當理解為從因子VIII產(chǎn)生的片段，其出現(xiàn)不是由于自發(fā)水解，或由生理性裂解酶，即凝血酶、活化因子IX、活化因子X和活化蛋白質(zhì)C造成的水解。
《抗因子VIII同種抗體催化的因子VIII降解抑制劑》的意義應當理解為屬于或不屬于因子VIII序列的任何肽，或能特異地中和抗因子VIII催化抗體的水解活性的蛋白酶抑制劑。優(yōu)選實施方式的描述人類重組因子VIII被125I放射性標記。從瓊脂糖凝膠基質(zhì)(Sepharosematrix)上帶有抑制劑的三位血友病人的血漿中將抗因子VIII同種抗體親和純化，且瓊脂糖凝膠基質(zhì)已被免疫純化的人類因子VIII偶聯(lián)。親和純化的病人Bor，Che和Wal的抗因子VIII抗體抑制因子VIII促凝血活性的數(shù)值分另達到IgG 57.0，64.0和4 3.0 BU/mg。
在三人中有兩個病人出現(xiàn)以下情況被標記的因子VIII與抗因子VIII同種抗體共孵育導致分子蛋白水解。證實了IgG同型的抗因子VIII同種抗體的抗體結(jié)合部位上的水解特異性。在蛋白酶抑制劑-抑肽酶(0.15μM)，E-64(28μM)，EDTA(1.3μM)，亮肽素(10μM)和胃酶抑素(10μM)存在下，病人Bor和Wal的[125I]-因子VIII與親和純化的抗因子VIII IgG的共孵育不會導致蛋白水解活性的抑制。
申請人已經(jīng)使因子VIII分子中催化IgG的主要裂解部位特征化，如下所示Arg372-Ser373，位于因子VIII的A1和A2結(jié)構(gòu)域；Tyr1680-Asp1681，位于A3結(jié)構(gòu)域的N-端；Glu1794-Asp1795，位于A3結(jié)構(gòu)域內(nèi)。
已證實了因子VIII水解對抗因子VIII同種抗體的時間和劑量的依賴性。具體而言，在抗因子VIII IgG和因子VIII共孵育的摩爾比比預計存在于病人血漿中的摩爾比低80到9500倍的條件下觀察到水解，表明水解是因子VIII被病人體內(nèi)的同種抗體鈍化的機理。
申請人進一步研究了抗體介導的因子VIII的水解動力學，在固定濃度的[125I]-因子VIII的存在下，使增加濃度的未標記的因子VIII與病人Wal的抗因子VIII IgG一起孵育。將速度倒數(shù)作為基質(zhì)濃度倒數(shù)的函數(shù)所畫的曲線是線性的(r＝0.99)，表明該反應符合簡單的Michaelis-Menten動力學，正如已在多克隆催化自身抗體中觀察到的。該表觀催化效率，Vmax和抗因子VIII同種抗體的水解速率是以病人Wal的情況計算出來的。在體內(nèi)計算出的水解動力參數(shù)表明蛋白水解是病人體內(nèi)同種抗體造成因子VIII鈍化的機理。
將因子VIII與von Willebrand因子(vWF)相連對于因子VIII來說增加了凝血酶的催化速率，在此其保護因子VIII不被活化的蛋白質(zhì)C(APC)水解。當用類似于普通血漿中存在的重量/重量比，即30μg/ml vWF對300 ng/ml因子VIII混合純化了的vWF和因子VIII時，將vWF加入到因子VIII中，將導致抗因子VIII IgG對因子VIII水解的部分抑制，即36.9％。
抗因子VIII同種抗體作為催化抗體的證實擴展了催化免疫應答的范圍，除了先前報道的在哮喘病人中作用于血管的腸內(nèi)肽(VIP)的水解抗體，還有SLE病人中的DNA水解抗體，以及自身免疫甲狀腺炎病人中的對甲狀腺球蛋白有特異性的催化抗體。這也是申請人就其所知人體內(nèi)對蛋白質(zhì)抗原的外部給藥應答，誘導催化抗體的第一次報道。因子VIII被抗因子VIII IgG水解的顯示催化特性的動力學參數(shù)，以及在血漿中的這些抗體的估計量表明在體內(nèi)使因子VIII鈍化的催化免疫應答的功能作用。對功能特性互相不同的抗因子VIII同種抗體多克隆混合物中，催化抗體能抑制因子VIII的促凝血活性，且抑制速度比非催化的抗因子VIII抗體的速度快。因此證實作為分解蛋白的抗因子VIII抗體的目標的肽抗原決定部位對于我們理解因子VIII抑制劑響應的病理生理學來說是至關重要的。此外，因子VIII抑制劑作為位點特異蛋白酶的特性將給具有抗因子VIII同種抗體的病人提供新的治療方法。


圖1帶抑制劑的血友病A病人的親和純化抗因子VIII IgG抗體對[125I]-因子VIII的水解。
圖1(A)在SDS-PAGE和反射自顯影之前，使[125I]標記的因子VIII與病人Bor(泳道Bor)，Che(泳道Che)和Wal(泳道Wal)的親和純化抗因子VIII IgG，或者與緩沖劑單獨(泳道1)在38℃下孵育10小時。在三位病人的兩位(Bor和Wal)中，因子VIII與親和純化的抗因子VIII IgG的孵育導致因子VIII分子的水解。相反，當[125I]標記的因子VIII與從病人Che(泳道Che)的血漿中純化的抗因子VIII IgG一起孵育時，因子VIII的遷移輪廓不變。當因子VIII與人類單克隆M061抗地高辛IgG(mAb)或與通常未分級的多克隆人類IgG(Sandoglobulin，IVIg)一起孵育時，因子VIII的遷移輪廓也不變。
圖1(B)由ELISA所測定的親和柱的流通物缺少抗因子VIII抗體，并且[125I]標記的因子VIII未水解。
圖1(C)從含有病人Wal和Bor的親和純化抗因子VIII抗體的酸洗脫液中，通過色譜法除去蛋白質(zhì)G上的IgG導致它們對因子VIII的水解活性喪失。
圖2抗因子VIII抗體的催化活性的尺寸排阻色譜法。
圖2(A)為進一步排除抗體蛋白水解活性造成的蛋白酶污染的可能性，用8M尿素處理病人Wal的親和純化的抗因子VIII抗體，并對其進行尺寸排阻色譜法。在餾分(fraction)25中分離出相應于ELISA指示的IgG的一個主峰。水解活性隨著IgG餾分一起共洗脫，而在IgG不存在的餾分(例如餾分35)中未檢測到該活性。
圖2(B)餾分25中分離出相應于IgG的主峰，其由餾分的SDS-PAGE放射性標記含量指示。
圖3[125I]-因子VIII蛋白質(zhì)水解作用對于帶抑制劑的血友病A病人的親和純化的抗因子VIII抗體的劑量和時間的依賴性。
研究因子VIII被病人Bor和Wal的抗因子VIII同種抗體水解的動力學。[125I]標記的因子VIII被病人Wal的抗因子VIII IgG水解的速率比被病人Bor的抗因子VIII IgG水解顯示出的速率快，這表明病人的催化抗體顯示出不同的動力學特性，或者病人之間抗因子VIII抗體中催化抗體的比例不同。
例4在增加量的冷卻因子VIII存在下，抗因子VIII IgG抗體對[125I]-因子VIII的水解。
在固定濃度的[125I]-因子VIII存在下，通過將病人Wal的抗因子VIII IgG與增加濃度的未標記因子VIII一起孵育，研究抗體介導的因子VIII的水解動力學。加入增加量的未標記因子VIII導致抗因子VIII IgG對[125I]-因子VIII水解的劑量依賴的抑制。在使用最大濃度(即1.7μM)的因子VIII時，因子VIII水解未達到飽和。將速度倒數(shù)作為基質(zhì)濃度倒數(shù)的函數(shù)畫出的曲線是線性的(r＝0.99)，表明該反應符合簡單的Michaelis-Menten動力學，如同已在多克隆催化自身抗體中觀察到的。
圖5病人Wal的抗因子VIII IgG的催化活性的抑制。
在Pefabloc(由Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國銷售)存在下，當抗體和因子VIII共孵育時，病人Wal的放射性標記的抗因子VIII同種抗體對因子VIII的蛋白質(zhì)水解抑制到約62％，表明了某些絲氨酸蛋白酶抑制劑中和一些催化抗體的催化活性的效力。
實施例例I抗因子VIII抗體的親和純化通過硫酸銨沉淀(法)從血漿中分離出抗體?？贵w與因子VIII反應，然后在CNBr活化的Sepharose 4B matrix上親和純化，在該Sepharose 4Bmatrix上已經(jīng)偶聯(lián)了免疫純化的從市售人類血漿得到的因子VIII(25000U/3g凝膠)。收集柱流通物。用pH為7.4的PBS進行大量沖洗，用pH為2.8的0.2M甘氨酸洗脫抗因子VIII抗體，對PBS進行滲析，并用Centriperep濃縮。將流通物和洗脫液等分并在-20℃下保存直至使用?？挂蜃覸III抗體的F(ab’)2片斷用先前所述的方法制備。
在病人Bor，Che和Wal中，施加到柱子上的抗因子VIII IgG的濃度分別為每10mg IgG含130、20和280μg(即，143±130μg/mI的未分級的血漿)，這與以前觀察到的一致。例II因子VIII的中和活性用Kasper等人的方法測定抗因子VIII抗體的因子VIII中和活性，并用Bethesda單位(BU)(ref)表示。BU的定義是使得因子VIII促凝血活性被抑制50％的IgG濃度的倒數(shù)。殘留的因子VIII活性用一步測定法測定，用缺乏因子VIII(Behring)的人類血漿作為基質(zhì)，將人類胎盤pathromtin(Behring)作為活化劑，測定被活化的部分促凝血酶原激酶的時間。被測試的加熱了的血漿或免疫純化的抗因子VIII IgG與貯存的含枸櫞酸鹽人類血漿在37℃下孵育2小時。將參比血漿池(免疫AG，Wien)的四種順次的稀釋物的凝結(jié)時間與要測試的各試樣的三種稀釋物的凝結(jié)時間對比。在Owren-Koller緩沖器中(Diagnostica Stago)進行稀釋。中間測試變化范圍在1和2.5％之間。
病人Bor，Che和Wal的親和純化的抗因子VIII抗體抑制因子VIII促凝血活性分別達到57.0，64.0和43.0 BU/mg IgG。例III因子VIII的水解測試用生碘方法用125I對市售人類重組體因子VIII標記，使其具有特定活性11.6nCi/μg。[125I]-因子VIII(1.5到150ng)單獨或與17到1667nM的免疫純化的抗因子VIII IgG在50μl的50mM的tris-HCI pH7.7、100mM的甘氨酸、0.025％的土溫-20和0.02％NaN3中，在38℃下孵育5分鐘到10小時。人類單克隆抗地高辛IgG M061(mAb)和通常未分級的人類多克隆IgG(IVIg，Sand-oglobulin)用作陰性對照。將試樣與不帶有巰基乙醇的Laemmli’緩沖液以1∶1混合，在每個泳道中裝載20μl各試樣后，不煮沸對其進行SDS電泳。在各泳道裝載了20μl各試樣之后，在不減速的條件下，使試樣在7.5％和15％SDS-PAGE平行跑(電泳)。用微型PROTEAN II體系以25m A/gel在室溫下進行遷移，直至染料前部到達凝膠底部。然后將凝膠干燥，用X-OMAT AR顯示蛋白質(zhì)帶。在放射自顯影之后，因子VIII帶的表觀分子量200和300kDa與其被抗因子VIII IgG水解的一致，掃描因子VIII帶，以計算被標記的因子VIII的水解速率。例IV快速蛋白質(zhì)液相色譜凝膠過濾用8M尿素處理病人Wal(740μg)的一百μl等分的抗因子VIII IgG，以0.2ml/min的流動速率在用PBS-0.01％疊氮化物平衡了的superose-12柱子上進行凝膠過濾。收集500μl的餾分，用夾心ELISA測試IgG的存在，并在稀釋10倍后測試因子VIII分解蛋白的活性。在餾分25中的蛋白質(zhì)被125I放射標記，并在不減速的情況下與通常的多克隆人類IgG平行地進行SDS-PAGE。凝膠用Comassie Blue染色，并進行放射自顯影；然后將兩個影像重疊。在相應于ELISA指示的IgG以及餾分的放射性標記含量SDS-PAGE的餾分25中分離出一個主峰。與IgG餾分共洗脫出水解活性，而在不存在IgG的餾分(例如餾分35)中未檢測到該活性。例VNH2端序列的分析未標記的人類重組體因子VIII蔗糖制劑(rDNA-BHK)(300μg，八齒蘆葦草，Bayer Corporation，Berkeley，CA)在38℃下被在1500μl的50mM tris-HCI pH7.7、100mM的甘氨酸、0.025％吐溫-20和0.02％NaN3中的病人Wal(74μg)的抗因子VIII IgG處理24小時。在不減速的條件下，以50mA在10％的SDS-PAGE上跑(電泳)所得的因子VIII片斷，并在pH為11.0時，在10mM CAPS，10％乙醇中的Hybond-P PVDF薄膜(Amersham，Little Chalfont，England)上以100mA交換2小時。用考馬斯藍染色后，切斷可見帶，并用自動蛋白質(zhì)微序列器Prosize 492 cLC(PE-AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)進行N末端測序。被測序的蛋白質(zhì)的量的范圍是0.5到2pmol，這取決于片斷。
主要的易斷裂鍵如下Arg372-Ser373(R372-S373)，位于因子VIII的A1和A2結(jié)構(gòu)域之間；Tyr1680-Asp1681(Y1680-D1681)，位于A3結(jié)構(gòu)域的N-端上，Glu1794-Asp1795(E1794-D1795)位于A3結(jié)構(gòu)域之內(nèi)?？挂蜃覸III抗體對因子VIII多個部位的裂解可能是從帶有多特征催化活性的單個抗體或多克隆抗體群產(chǎn)生的，均顯示出獨特的裂解部位特異性。
例VI用Pefabloc，一種絲氨酸蛋白酶種屬抑制劑進行抑制劑研究在Pefabloc存在下，用帶抑制劑的血友病A病人的親和純化的抗因子VIII IgG抗體進行[125I]-因子VIII的水解。在38℃下，[125I]-因子VIII(150ng)與病人Wal的50μg/ml的免疫純化的抗因子VIII IgG單獨共孵育，或在抗因子VIII IgG和4mM絲氨酸蛋白酶抑制劑Pefabloc(Boehringer)同時存在下孵育5小時。然后在不減速的情況下，用7.5％SDS-PAGE分析因子VIII。在放射自顯影之后，掃描與抗因子VIII IgG造成的水解一致的表觀分子量為200和300kDa的因子VIII帶，以計算被標記的因子VIII的水解％。
當在Pefabloc存在下，抗體和因子VIII共孵育時，放射性標記的因子VIII被病人Wal的抗因子VIII同種抗體的蛋白質(zhì)水解的抑制為約62％，表明某些絲氨酸蛋白酶抑制劑中和一些催化抗體的催化活性的效力。進一步觀察使用125I放射性標記的因子VIII作為目標分子，對帶有血友病A的十位高響應病人的純化IgG進行篩選，在六位病人中觀察到因子VIII遷移輪廓的變化。這些結(jié)果證實了申請人前面的觀察，并表明在約60％的病人中發(fā)現(xiàn)起催化作用的抗因子VIII抗體。
權利要求
1.一種測定能夠降解哺乳動物中因子VIII的抗因子VIII同種抗體存在的方法，其特征在于該方法包括i)從所述哺乳動物中取得的血樣分離出血漿；ii)從所述血漿中分離出抗因子VIII同種抗體；iii)放置所述抗因子VIII同種抗體，使之與因子VIII接觸一段時間，該時間足以使所述因子VIII被所述抗因子VIII同種抗體任意降解；以及iV)在所述的一段時間后，測定所述因子VIII是否被所述的抗因子VIII同種抗體有效地降解。
2.如權利要求1的方法，其特征在于在步驟ii)中，所述抗因子VIII同種抗體通過與所述因子VIII結(jié)合而從所述血漿中分離出來，所述因子VIII優(yōu)選與一種基質(zhì)偶合。
3.如權利要求1或2的方法，其特征在于在步驟ii)中，所述抗因子VIII同種抗體通過親和色譜法分離。
4.如權利要求3的方法，其特征在于在步驟ii)中，所述親合色譜法包括使用與瓊脂糖凝膠基質(zhì)共價鍵合的因子VIII，優(yōu)選用溴化氰活化。
5.如權利要求1-4任何一項的方法，其特征在于在步驟iii)中，所述因子VIII用一種標記試劑標記，優(yōu)選用放射性標記試劑，具體來說例如125I。
6.如權利要求1-5任何一項的方法，其特征在于在步驟iii)中，在約15℃到約40℃，優(yōu)選為38℃的溫度下，所述因子VIII與抗因子VIII同種抗體接觸放置的時間在約0.5到約30小時之間，優(yōu)選約10小時。
7.如權利要求1-6任何一項的方法，其特征在于步驟iV)是通過包括分離技術的測定方法來完成的，例如凝膠電泳，具體來說例如SDSPAGE，或凝膠過濾，具體來說例如快速蛋白質(zhì)液相色譜凝膠過濾，和造影術，具體來說例如放射自顯影術。
8.如權利要求1-7任何一項的方法，其特征在于其進一步包括V)使所述因子VIII分子被所述抗因子VIII同種抗體裂解的一個(多個)部位特征化。
9.如權利要求8的方法，其特征在于所述的特征化是通過將所述因子VIII與能夠降解因子VIII的抗因子VIII同種抗體接觸放置，然后分離，并對由此得到因子VIII片段測序來完成的。
10.如權利要求8或9的方法，其特征在于所述分離是用例如凝膠電泳，具體而言例如SDS PAGE的技術來完成的。
11.如權利要求8-10任何一項的方法，其特征在于所述測序方法是用例如N末端測序，具體而言如用自動蛋白質(zhì)微層序的技術來完成的。
12.如權利要求8-11任何一項的方法，其特征在于所述測序位于以下易裂開的價鍵處Arg372-Ser373，位于因子VIII分子A1和A2結(jié)構(gòu)域之間，Tyr1680-Asp1681，位于因子VIII分子A3結(jié)構(gòu)域的N末端上，Glu1794-Asp1795位于因子VIII分子的A3結(jié)構(gòu)域之內(nèi)。
13.一種氨基酸序列Ser Val Ala Lys Lys His Pro。
14.一種氨基酸序列Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser。
15.一種氨基酸序列Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu。
16.一種如權利要求13-15任何一項的氨基酸序列的肽或非肽類似物，其特征在于其能抑制因子VIII分子中任何容易被抗因子VIII同種抗體水解的部位。
17.一種抗因子VIII同種抗體催化的因子VIII降解抑制劑。
18.如權利要求17的抑制劑，其特征在于其包括蛋白酶抑制劑，具體來說如4-(2-氨基乙基)苯基磺酰氟化物)氫氯化物。
19.如權利要求17或18的抑制劑，其特征在于所述抑制劑抑制如下易裂開的價鍵的裂解Arg372-Ser373，位于因子VIII分子Al結(jié)構(gòu)域之間，Tyr1680-Asp1681，位于因子VIII分子A3結(jié)構(gòu)域的N末端，和Glu1794-Asp1795，位于因子VIII分子的A3結(jié)構(gòu)域之內(nèi)。
20.如權利要求17-19任何一項的抑制劑，其特征在于其包括如下氨基酸序列的肽或非肽類似物Ser Val Ala Lys Lys His Pro。
21.如權利要求17-19任何一項的抑制劑，其特征在于其包括如下氨基酸序列的肽或非肽類似物Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser。
22.如權利要求17-19任何一項的抑制劑，其特征在于其包括如下氨基酸序列的肽或非肽類似物Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu。
23.一種藥物組合物，其特征在于其包括特別是從權利要求1-6任何一項的方法得到的、藥用有效量的能夠降解因子VIII的一種抗因子VIII同種抗體。
24.能降解因子VIII的抗因子VIII同種抗體的用途，用于制備一種治療由于血液中因子VIII的量不正常而導致的疾病的哺乳動物的藥物組合物。
25.如權利要求24的用途，其特征在于所述疾病是由于血液中存在過量的因子VIII造成的。
26.一種藥物組合物，其特征在于其包括如權利要求17-22任何一項的藥用有效量的因子VIII降解抑制劑。
27.因子VIII降解抑制劑的用途，用于制備一種尤其用于治療受到血液中因子VIII的負生理級別導致的疾病的哺乳動物的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定能降解哺乳動物中因子VIII的起催化作用的抗因子VIII同種抗體的存在的方法,以及由所述催化作用的抗因子VIII同種抗體使所述因子VIII分子中裂解位點特征化的方法。本發(fā)明還涉及一種抗因子VIII同種抗體催化的因子VIII降解抑制劑;以及包含所述能降解哺乳動物中因子VIII并從所述測定方法中獲得的起催化作用的抗因子VIII同種抗體的藥物組合物;本發(fā)明還涉及一種包含抗因子VIII同種抗體催化的因子VIII降解抑制劑的藥物組合物。最后本發(fā)明涉及所述抗因子VIII同種抗體催化的因子VIII降解抑制劑,包含所述能降解因子VIII以及起源于所述測定方法的起催化作用的抗因子VIII同種抗體的藥物組合物,以及包含所述抗因子VIII同種抗體催化的因子VIII降解抑制劑的藥物組合物在治療中的應用。
文檔編號A61P7/04GK1361865SQ00810633
公開日2002年7月31日 申請日期2000年7月18日 優(yōu)先權日1999年7月21日
發(fā)明者斯里尼瓦斯·凱維利, 塞巴斯蒂安·拉克魯瓦－得斯馬塞斯, 米夏爾·卡扎切基尼 申請人:國家醫(yī)療保健研究所, 拜爾藥品有限公司