專利名稱：超臨界流體輔助的噴霧和鼓泡干燥的制作方法
背景技術(shù)：
隨著基因治療和重組DNA技術(shù)的進(jìn)步，蛋白質(zhì)藥物已成為一類重要的治療藥物。例如，近年來(lái)用于治療呼吸道疾病以及作為全身性傳遞大分子注射的具有吸引力的替代方法，受到了很大的關(guān)注。然而，蛋白質(zhì)藥物的商業(yè)性生產(chǎn)嚴(yán)重的受到了蛋白質(zhì)化學(xué)和物理降解的限制，這種降解會(huì)導(dǎo)致生物性失活(Manning，M.C.等(1989)，“蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性”，Pharm.Res.6903-918；Lai，M.C.和Topp，E.M.(1999)，“蛋白質(zhì)和肽的固態(tài)化學(xué)穩(wěn)定性”，J.Pharm.Sci.88489-500)。許多這些降解過(guò)程是用水水解和/或通過(guò)其他降解過(guò)程的。因此，許多蛋白質(zhì)藥物制備成固態(tài)，如干粉，來(lái)延長(zhǎng)產(chǎn)品的使用壽命和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。干燥的固體中蛋白質(zhì)的解折可導(dǎo)致直接重新水合后不可逆的變性，并顯著降低長(zhǎng)期儲(chǔ)藏的穩(wěn)定性。
超臨界流體是溫度和壓力在臨界溫度和壓力以上的物質(zhì)，該物質(zhì)的密度、壓縮性和粘度是氣體和液體的中間值。近臨界的流體與超臨界流體相似，定義為其溫度和壓力與臨界溫度和臨界壓力之差在10％內(nèi)的流體。例如，由于CO2的臨界溫度是31.6℃(304.6K)，臨界壓力是1073psi，高于2℃(275K)和966psi的CO2是接近臨界的。已研究了超臨界流體在藥物細(xì)粉生產(chǎn)中的用途，然而，這些技術(shù)包括(超臨界流體的成核(Larson，K.A.和King，M.L.(1986)，“藥物工業(yè)中超臨界萃取的評(píng)價(jià)”，Biotechnol.Prog.273-82)，超臨界溶液的快速膨脹(Tom，J.W.和Debenedetti，P.G.(1991)“通過(guò)超臨界溶液快速膨脹沉淀生物可沖蝕的微球和微?！?，Biotechnol.Prog.7403-411)和氣相反溶劑技術(shù)(Randolph，T.W.等(1993)，“氣相反溶劑噴射沉淀法合成的聚(L-乳酸)亞微米粒徑的生物可降解顆?！保珺iotechnol.Prog.9429；Meyer，J.D.等(1998)，“適用于治療骨髓炎的慶大霉素浸潤(rùn)的生物可降解珠的制備和體內(nèi)特征”J.Pharm.Sci.871149；Winters，M.A.等(1996)，“超臨界二氧化碳中的蛋白質(zhì)沉淀”，J.Pharm.Sci.85586；Palakodaty，S.等(1998)，“超臨界流體處理來(lái)自水溶液的物質(zhì)SEDS對(duì)作為模型物質(zhì)的乳糖的應(yīng)用”，Pharm Res.151835)都需要藥物是在超臨界流體中可直接溶解的，或可被超臨界流體從非水溶劑(如二甲亞砜)中沉淀出來(lái)的。美國(guó)專利號(hào)5,639,441(Sieves，R.E.和Karst，U.，1997年6月17日提交)和分案申請(qǐng)08/847,310中公開(kāi)的噴霧器系統(tǒng)能使用超臨界流體和不互溶的液體(如水)來(lái)處理不溶于超臨界流體的物質(zhì)，形成蒸氣氣溶膠。因此，使用美國(guó)專利號(hào)5,639,441中公開(kāi)的方法和裝置，可形成水溶性蛋白質(zhì)、賦形劑、穩(wěn)定劑、填充劑和/或表面活性劑的顆粒，而不是僅形成在超臨界流體和/或有機(jī)溶劑中可溶的化合物的顆粒。美國(guó)專利號(hào)5,639,441參考結(jié)合于本申請(qǐng)公開(kāi)的內(nèi)容。不像其他沉淀方法，如上述的SEDS法和GAS法，在該新方法中不需要有機(jī)溶劑，只要藥物、水和超臨界或近臨界的流體(例如二氧化碳)。
即使能制備水溶性蛋白質(zhì)的顆粒和其他水相制劑，迄今為止還不存在形成這些蛋白質(zhì)和/或制劑的合適干粉的方法?，F(xiàn)存的產(chǎn)生干蛋白質(zhì)粉末的方法(如噴射干燥、冷凍干燥或超聲噴霧)存在著許多問(wèn)題?？偟恼f(shuō)，當(dāng)用現(xiàn)有技術(shù)的方法制備時(shí)，由于這些方法中涉及的處理步驟，用這些方法干燥蛋白質(zhì)所需的溫度和這些方法的脫水過(guò)程，會(huì)破壞蛋白質(zhì)的精致結(jié)構(gòu)，所以干蛋白質(zhì)粉末常常不可避免的被滅活。另外，為了用于直接吸入藥物，藥物粉末必需足夠細(xì)小，能有效肺部傳遞。通過(guò)肺部途徑的藥物傳遞比其他傳遞途徑(如注射)好，因?yàn)樘弁礈p輕，藥物傳遞到所需位置更快。如果干燥過(guò)程產(chǎn)生的顆粒比所需的大，它們必須經(jīng)過(guò)噴射研磨或機(jī)械研磨。這對(duì)分子會(huì)產(chǎn)生額外的物理應(yīng)力，可能使得蛋白質(zhì)活性進(jìn)一步損失。產(chǎn)生于正確粒徑范圍的干粉能直接用于肺部傳遞用的干粉吸入器中。
噴霧干燥是目前可行的產(chǎn)生干蛋白質(zhì)粉末的方法。在噴霧干燥技術(shù)中，用噴射噴霧器形成液滴噴流。在一類噴霧器中，用高壓氣流將液體樣品吸過(guò)小直徑管道。氣體將液體分解成微小液滴。氣體還能以直角橫向流過(guò)小直徑管道，以相似方式形成液滴。超聲噴霧器使用與樣品溶液偶合的超聲振動(dòng)，使溶液分解成細(xì)小液滴。噴霧干燥的一個(gè)缺點(diǎn)是逸出噴射噴霧器的分子噴流不是非常濃。導(dǎo)致產(chǎn)生所需量的蛋白質(zhì)過(guò)程緩慢。冷凍干燥是另一種目前使用產(chǎn)生干蛋白質(zhì)粉末的方法，對(duì)藥物水溶液進(jìn)行冷凍，并置于真空中，使水分升華。冷凍干燥方法的一個(gè)缺點(diǎn)是干燥過(guò)程非常緩慢。另外，產(chǎn)生的顆粒較大，需要額外的處理步驟，產(chǎn)生藥物學(xué)上理想的粒徑。
美國(guó)專利號(hào)6,063,138(Hanna等，2000年5月16日)和相關(guān)的EP 0767702描述了通過(guò)將超臨界流體、物質(zhì)在第一載體中的溶液或懸浮液、以及基本與第一載體可溶合，并在超臨界流體中基本能溶解的第二載體同時(shí)引入到形成顆粒的容器中(維持在超臨界壓力和溫度下)，形成物質(zhì)顆粒的方法。
PCT出版申請(qǐng)PCT/US99/19306(WO 010541)(Edwards等)描述了混合生物活性劑、磷脂和有機(jī)溶劑或有機(jī)-水相共溶劑，形成混合物，然后噴霧干燥形成顆粒的方法。
美國(guó)專利號(hào)5,695,741(Schutt等，1997年12月9日提交)和相關(guān)的美國(guó)專利5,639,443(Schutt等，1997年6月17日提交)和5,720,938(Schutt等，1998年2月24日提交)描述了用于磁共振成像和超聲成像的“微泡”。對(duì)液體制劑噴霧干燥，產(chǎn)生具有空隙的微球，然后用氟烴氣體滲透劑進(jìn)行滲透，制備“微泡”。
美國(guó)專利號(hào)5,928,469(Franks等，1999年7月27日)描述了將物質(zhì)與水溶性或水膨脹性載體物質(zhì)混合，噴霧干燥得到的混合物，形成含有物質(zhì)和載體物質(zhì)的顆粒，其中載體物質(zhì)是非晶體(玻璃狀或橡皮狀)狀態(tài)。Franks描述了100-300℃氣溫的噴霧干燥。
美國(guó)專利號(hào)6,001,336(Gordon等，1999年12月14日提交)描述了溶于水溶液的疏水成分和親水成分的懸浮液進(jìn)行噴射干燥。
美國(guó)專利5,851,453(Hanna等，1998年12月22日提交)和相關(guān)EP 0 706 421描述了通過(guò)將超臨界流體和物質(zhì)在能溶于超臨界流體中的載體中的溶液或懸浮液引入容器(維持在受控的溫度和壓力下)，形成顆粒狀產(chǎn)物的方法和裝置。WO95/01324(York等，1995年1月12日出版)描述了使用該方法制備的沙美特羅xinafoate顆粒。
WO 99/16419(Tarara等，1999年4月8日出版)描述了對(duì)液體霧化，并噴霧干燥所形成的液滴，制備“多孔微結(jié)構(gòu)”。WO 00/00215(Bot等，2000年1月6日出版)描述了含有“生物活性劑”的“多孔微結(jié)構(gòu)”的傳遞系統(tǒng)。
WO99/59710(Hanna等，1999年11月25日出版)描述了將一種物質(zhì)溶解或懸浮在第一載體(它是或含有第一種超臨界或近臨界的流體)中，將所得溶液或懸浮液通入一顆粒形成容器(含有第二種超臨界流體)中，形成物質(zhì)顆粒的方法和裝置。該裝置維持在一定的溫度和壓力下，使第二種流體是超臨界的。
WO 98/36825(Hanna等，1998年8月27日出版)描述了形成顆粒的方法和裝置，該方法是將兩種超臨界流體(其中一種含有要形成顆粒的物質(zhì))引入加熱和增壓的處理室中。
現(xiàn)在需要一種干粉形式的穩(wěn)定或藥物活性的蛋白質(zhì)，并需要一種產(chǎn)生干粉形式穩(wěn)定或藥物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的方法。而且還需要產(chǎn)生具有改善藥物活性更細(xì)小顆粒的方法。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了形成細(xì)小干燥顆粒的方法，包括(a)形成含有一種或多種物質(zhì)和超臨界或近臨界的流體的組合物；(b)快速降低所述組合物上的壓力，形成液滴；(c)將所述液滴通過(guò)加熱至2℃-300℃的氣流。
起泡干燥優(yōu)選應(yīng)在環(huán)境溫度以上和100℃以下的溫度下進(jìn)行，來(lái)縮小藥物的降解。給予充分的停留時(shí)間和稀釋，干燥氣流可不經(jīng)外部加熱干燥微小液滴。加熱提高了水蒸氣壓力而加速干燥。組合物還可含有水相溶劑。
還提供了形成細(xì)小干燥顆粒的方法，包括(a)混合含有感興趣物質(zhì)的和水溶液和超臨界或近臨界的流體，形成組合物；(b)快速降低所述組合物上的壓力，形成液滴；(c)所述液滴通過(guò)加熱至2℃-300℃的氣流。
還提供了形成細(xì)小干燥顆粒的方法，包括(a)用超臨界或近臨界的流體與感興趣的物質(zhì)的水溶液平衡，形成組合物；(b)快速降低所述組合物上的壓力，形成液滴；(c)將所述液滴通過(guò)加熱至2℃-300℃的氣流。
還提供了形成細(xì)小干燥顆粒的裝置，主要包括(a)第一個(gè)壓力室，含有第一種非氣相超臨界或近臨界流體；(b)第二個(gè)室，含有第二種非氣相液體中物質(zhì)的溶液或懸浮液；(c)一個(gè)混合室，用于混合所述溶液或懸浮液與第一種液體，該室與所述第一和第二室通過(guò)管道連接；(d)第一個(gè)流量控制裝置，與第一室和混合室之間的管道連接，用于使所述第一種流體流入所述混合室；(e)第二個(gè)流量控制裝置，與第二室和混合室之間的管道連接，用于使所述第二種流體流入所述混合室；(f)與所述混合室連接的節(jié)流器，用于將組合物導(dǎo)出混合室，流入具有低于超臨界或近臨界流體的壓力的迅速膨脹區(qū)，在其中形成了所述物質(zhì)細(xì)小粒的分散體；(g)與節(jié)流器連接的干燥室；(h)與干燥室以一個(gè)或多個(gè)入口連接的氣體來(lái)源；(i)顆粒通過(guò)干燥室后的收集裝置。
混合室優(yōu)選采用死體積小的三通。
細(xì)小顆粒是那些直徑小于5微米左右的顆粒。用本發(fā)明的方法形成的顆粒，粒徑可在約0.1-5微米之間。產(chǎn)生的顆?？尚∮?.1微米，但現(xiàn)有的測(cè)量方法在很小的粒徑范圍內(nèi)受到限制，而且細(xì)小顆粒在質(zhì)量上僅占很微小的部分。顆粒的粒徑可以是任何分布。對(duì)于某些應(yīng)用，如吸入治療，為了傳遞到肺泡深部，大多數(shù)顆粒優(yōu)選在可吸入的粒徑范圍內(nèi)。對(duì)于吸入用途，顆粒范圍優(yōu)選在1-3微米之間。對(duì)于其他用途，顆粒粒徑可以具有較大分布，如本領(lǐng)域已知或無(wú)需太多實(shí)驗(yàn)易于測(cè)定的。對(duì)于吸入用途，顆粒粒徑對(duì)于平均粒徑的差異優(yōu)選較小。
本文所用的“干的”或“經(jīng)干燥的”是指顆粒含有達(dá)到水分，優(yōu)選不超過(guò)5％重量。干的顆粒包括含有0.0001％-1％水分、1％-3％水分、1％-5％水分、5％-10％水分及這些范圍組合的顆粒。
本發(fā)明形成的顆粒包括各種形狀的顆粒。例如，顆粒可以是空心的即“泡?！薄Ｅ萘Ｊ侵锌盏?，類似于網(wǎng)球或乒乓球，雖然它們可能不像網(wǎng)球或乒乓球那樣像個(gè)球。其粒徑通常是表面厚度的10-10,000倍。用本發(fā)明方法形成的其他顆粒不是空心的。較高的干燥溫度(～100℃)促使形成空心顆粒，而如果在較低的溫度以較緩慢的速度干燥，相同的物質(zhì)可能形成實(shí)心球體。
“組合物”不意味著所有物質(zhì)必定是互相可溶的。可用本發(fā)明方法制成顆粒的物質(zhì)包括在超臨界流體或近臨界流體或其混合物中可溶的任何物質(zhì)；或在水溶液中可溶或可懸浮的物質(zhì)。水溶液可以包括各種共溶劑，但避免有機(jī)溶劑的使用，這在環(huán)境和毒物學(xué)上都有好處。可制成顆粒的一些物質(zhì)包括生理學(xué)上具有活性的組合物，含有一種或多種物質(zhì)，它們選自表面活性劑、胰島素、氨基酸、酶、止痛藥、抗癌劑、抗微生物劑、病毒、抗病毒劑、抗真菌藥物、抗生素、核苷酸、DNA、反義cDNA、RNA、肽、蛋白質(zhì)、免疫抑制劑、溶血栓劑、抗凝血?jiǎng)?、中樞神?jīng)系統(tǒng)刺激劑、減充血?jiǎng)⒗蛐匝軘U(kuò)張劑、精神病治療劑、神經(jīng)遞質(zhì)、鎮(zhèn)靜劑、激素、麻醉劑、消炎藥、抗氧化劑、抗組胺藥、維生素、礦物質(zhì)和其他本領(lǐng)域已知的生理學(xué)上活性的物質(zhì)?？僧a(chǎn)生單克隆抗體顆粒和疫苗。還可產(chǎn)生物質(zhì)，如氯化鈉的顆粒。一些物質(zhì)可以是藥物學(xué)上活性的?！八幬飳W(xué)活性的蛋白質(zhì)”標(biāo)明該蛋白質(zhì)具有足夠活性，是藥物學(xué)上有用的。其他物質(zhì)可能不是生理學(xué)或藥物學(xué)活性的。
在本發(fā)明的方法和顆粒中可采用各種添加劑。這些添加劑可在過(guò)程中加到感興趣的物質(zhì)或任何溶劑中。還可直接在形成顆粒后加入添加劑。添加劑包括穩(wěn)定劑、賦形劑、填充劑和表面活性劑。在蛋白質(zhì)制劑中使用穩(wěn)定劑能防止蛋白質(zhì)活性在干燥后喪失。穩(wěn)定劑包括(但不限于)糖和親水聚合物，如聚乙二醇、羥乙基淀粉、葡聚糖等。穩(wěn)定劑優(yōu)選是糖或不同的糖的混合物?？捎玫奶前ǜ事短恰⒄崽?、乳糖和海藻糖，以及其他單-、二-和寡糖。在脫水之前在蛋白質(zhì)溶液中加入一種或多種穩(wěn)定劑，會(huì)顯著抑制蛋白質(zhì)中的構(gòu)型變化，據(jù)信這種構(gòu)型變化與酶活性的喪失有關(guān)。可加入一種或多種表面活性劑來(lái)減小液/氣之間的界面張力，并減少可能在干燥后發(fā)生的降解?？杉尤氡砻婊钚詣p少干燥后可能發(fā)生的結(jié)塊或聚團(tuán)現(xiàn)象。表面活性劑還可認(rèn)為有助于球形顆粒的形成?？捎玫谋砻婊钚詣┑睦影ň垩跻蚁?20)去水山梨糖醇表面活性劑(Tween)，如Tween 20、Tween 40、Tween 80和Tween 85；硬脂酸；在Beckman等(2000)Nature 405165中報(bào)道的類型的myrj(PEG硬脂酸酯)、Span 85(去水山梨糖醇三油酸酯)和聚乙醚-碳酸酯嵌段共聚物?？捎昧字柞ヵ８视王?。表面活性劑和其他試劑(如鹽酸胍)與壓力處理結(jié)合，可促進(jìn)蛋白質(zhì)的重新折疊(St.John，R.J.等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.9613029)。填充劑和賦形劑可以是惰性或活性的。
如果最終制劑的穩(wěn)定性需要，優(yōu)選首先加入緩沖劑。如果需要較強(qiáng)的穩(wěn)定性，可以加入糖。如果需要更強(qiáng)的穩(wěn)定性，可加入表面活性劑。pH緩沖物質(zhì)適用于抵抗在高壓下二氧化碳溶解形成碳酸導(dǎo)致的pH迅速下降。
對(duì)于低能力藥物，粉末中添加劑的組分應(yīng)最大程度的減少，對(duì)于高能力藥物，無(wú)活性的賦形劑(稀釋劑)有時(shí)可占重量的99％以上。在組合物中加入添加劑可為任何有用的含量。通常使用添加劑的濃度是含有感興趣蛋白質(zhì)的溶液重量的約0.001-0.5wt％(優(yōu)選約0.001-0.1wt％)的表面活性劑，約0.05-25％(優(yōu)選當(dāng)用糖時(shí)，約0.1-20％，受糖的溶解度限制)的穩(wěn)定劑。這些百分?jǐn)?shù)表示噴灑和干燥前的水溶液。在干燥粉末中糖的最終百分?jǐn)?shù)可高達(dá)～99.9％。
組合物可含有溶于超臨界或近臨界流體的物質(zhì)，如親脂性化合物?？捎贸R界或近臨界流體的混合物。組合物還可含有物質(zhì)的水溶液或懸浮液和超臨界或近臨界流體(或多種流體)。接著形成不溶于超臨界或近臨界流體的物質(zhì)(如親水性物質(zhì))的液滴。在本方法的一個(gè)實(shí)施例中，將含有溶解或懸浮的化合物的水溶液泵入死體積小的三通中，同時(shí)將超臨界或近臨界流體泵入三通的另一個(gè)支管中。對(duì)得到的乳液或增壓至接近或達(dá)到超臨界流體的臨界壓力以上(當(dāng)使用二氧化碳時(shí)，約70-100個(gè)大氣壓)的超臨界溶液，使其通過(guò)節(jié)流器膨脹到大氣壓力，形成含有溶解藥物的液滴或液泡。將該氣溶膠引到干燥室中，蒸發(fā)掉溶劑，形成顆粒。
本方法的第二個(gè)變化不用死體積小的三通就可形成氣溶膠。在該方法中，首先使前體水溶液與近臨界或超臨界流體在靜力罐或室中平衡，優(yōu)選同時(shí)攪拌或振蕩。然后使該組合物流經(jīng)節(jié)流器膨脹到大氣壓，形成細(xì)小液滴。這些液滴被引入干燥室，蒸發(fā)掉溶劑，形成顆粒。
在超臨界流體或水相溶劑(或溶劑混合物)中感興趣的物質(zhì)的起始濃度受到該物質(zhì)在溶劑或超臨界流體中溶解度即飽和點(diǎn)的限制。通常起始濃度是溶液或流體中總固體重量的約1％-25％。
超臨界流體最好是用二氧化碳，因?yàn)槎趸际莾?nèi)源的，相對(duì)無(wú)毒，還具有易于獲得的臨界壓力和溫度。也可使用其他超臨界或近臨界的流體，條件是臨界溫度和壓力可以達(dá)到并且適用。二氧化碳目前比任何有機(jī)溶劑都便宜，而且其使用避免了VOC的逸出。二氧化碳在水中的溶解度在環(huán)境溫度和100個(gè)大氣壓下約為2％。
與液滴流接觸的氣體優(yōu)選是惰性的，例如用氮?dú)?，但可選擇能與感興趣的分子在干燥過(guò)程中反應(yīng)的氣體。與樣品接觸的氣流優(yōu)選包覆著樣品流，但氣流可通過(guò)其他方式，如湍流混合方式與樣品流接觸。優(yōu)選加熱該氣體至足夠溫度，達(dá)到顆粒干燥的所需程度，而且基本不會(huì)影響顆粒的生物學(xué)活性?？蓪怏w加熱至約2℃-300℃，優(yōu)選為低于100℃，雖然根據(jù)干燥的物質(zhì)和組合物的成分，可以調(diào)節(jié)干燥溫度。干燥溫度的優(yōu)選范圍是約35℃-100℃之間。
優(yōu)選將干燥氣體裝在干燥室(如干燥管)中。干燥管的長(zhǎng)度應(yīng)是以產(chǎn)生在顆粒達(dá)到一端時(shí)具有所需水分含量的顆粒。干燥管優(yōu)選比迅速膨脹形成的液滴流直徑大。蒸發(fā)水分需要的大部分熱量?jī)?yōu)選是在進(jìn)入干燥室前對(duì)干燥氣體進(jìn)行加熱提供的。加熱干燥管可防止在管表面上的凝結(jié)?？捎脽?如紅外線燈)從外部加熱，或用本領(lǐng)域已知的方法(如嵌在管材料中的加熱導(dǎo)線)在內(nèi)部加熱干燥管?？捎萌魏魏线m的材料(能經(jīng)受它所處的溫度)制成干燥管。可制備干燥管的材料的例子是不銹鋼或硼硅酸鹽玻璃。可使用任何其他設(shè)計(jì)的干燥室，只要能獲得所需結(jié)果?？捎闷渌b置(例如微波爐)用來(lái)代替干燥管起到相同的作用。
快速降低組合物的壓力通常是使用限流式/減壓節(jié)流器。節(jié)流器可以是導(dǎo)熱材料(如不銹鋼)或陶瓷材料，或其他能經(jīng)受加諸其上的壓力和溫度的材料制成的中空的針。節(jié)流器還可以是熔凝二氧化硅節(jié)流器，或都是一束多通道陶瓷毛細(xì)管，如在本文別處將更詳細(xì)討論的。另外，可用高壓燒結(jié)不銹鋼濾器產(chǎn)生氣溶膠。節(jié)流器的長(zhǎng)度通常約2英寸；然而，長(zhǎng)度不能長(zhǎng)至?xí)鹆魉倬徛蚬虘B(tài)物質(zhì)在節(jié)流器中充分沉淀，導(dǎo)致結(jié)塊。節(jié)流器可具有如需要的大直徑，只要形成所需粒徑的顆粒，而且泵具有足夠能力維持壓力。通過(guò)節(jié)流器的溶液粘度確定了限流器直徑的下限。如果粘度太高，顆粒不會(huì)形成。
本發(fā)明還提供一種多通道節(jié)流器。這些開(kāi)口可彼此間隔相同的距離。結(jié)構(gòu)可以是圓柱形、六角形或其他形狀，使其與所用的其他部分連接。開(kāi)口可以是任何合適形狀，圓形或六角形。這種結(jié)構(gòu)的一個(gè)實(shí)施例在2毫米總直徑中具有約900個(gè)非同心平行通道。該多通道節(jié)流器可具有能形成所需顆粒的總直徑。各通道優(yōu)選具有約40微米-125微米之間的內(nèi)徑。可用其他多通道結(jié)構(gòu)，開(kāi)口不需要大小相似，雖然最好是各開(kāi)口大小相近。
節(jié)流器結(jié)構(gòu)的出口尖端可以是平坦的或基本平坦的，或可具有其他形成。特別有用的一種形狀是通過(guò)從平端除去材料，形成與鉛筆相似的拉長(zhǎng)筆尖形狀。這種形狀可得到以大于180℃發(fā)射的更分散的液滴流，它可有助于防止顆粒在經(jīng)歷鼓泡干燥時(shí)的聚集。得到最佳結(jié)果的幾何形狀具體由所需的結(jié)果確定，可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)?？捎萌魏纹渌档徒M合物壓力的方法來(lái)加速干燥。
由于組合物可能通過(guò)許多開(kāi)口，通過(guò)系統(tǒng)的流量會(huì)提高，因此通過(guò)系統(tǒng)的產(chǎn)量可增大。總通過(guò)流量主要由節(jié)流器的總內(nèi)徑控制。還可用單通道節(jié)流器的各種內(nèi)徑，包括75微米、100微米、170微米、200-1000微米。多通道節(jié)流器比單通道的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是如果一個(gè)通道阻塞，剩余的通道仍起作用。
本發(fā)明的方法可用于需要比現(xiàn)在更快的干燥的過(guò)程。由于本發(fā)明的膨脹/爆裂法對(duì)干燥提供了更大的表面積，可發(fā)生快速干燥，雖然申請(qǐng)人不希望被該理論限制。
本發(fā)明的方法產(chǎn)生了各種無(wú)水形式的藥物學(xué)上活性的蛋白質(zhì)組合物顆粒，它們包括蛋白質(zhì)顆粒，或可含有一種或多種添加劑，這些添加劑選自賦形劑、穩(wěn)定劑、填充劑和表面活性劑，其中添加劑以約0.001％-99.9％的濃度(用干蛋白質(zhì)重量計(jì))存在，而且其中顆粒具有約0.1微米-10微米的粒徑。顆?？删哂胁煌谋碛^密度，視具體顆粒物質(zhì)以及顆粒形成和干燥的條件而定。例如，可形成表觀密度約0.1-1.5g/cm3的顆粒。表觀密度可以小于1g/cm3，小于0.5g/cm3，小于0.4g/cm3，或其他范圍。顆粒在重新水合后可具有各種活性。例如，本發(fā)明能制得在重新水合后具有至少90％原來(lái)活性，以及90-95％、90-100％、100-120％原來(lái)活性的顆粒。
可以采用任何便利方法儲(chǔ)藏形成和干燥后的顆粒，包括置于袋中或其他儲(chǔ)藏裝置中，在儲(chǔ)藏時(shí)還可用干燥劑如P4O10進(jìn)一步干燥。
本發(fā)明還提供了一種噴霧系統(tǒng)，它使用比現(xiàn)有系統(tǒng)需要樣品體積少的注入孔。當(dāng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的實(shí)驗(yàn)(例如對(duì)昂貴的樣品)時(shí)這是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。注入孔還能使噴霧和干燥系統(tǒng)只與溶劑平衡，在系統(tǒng)平衡后，引入含有感興趣的蛋白質(zhì)的溶液。這就減少了蛋白質(zhì)的浪費(fèi)。該噴霧系統(tǒng)可以與鼓泡干燥系統(tǒng)結(jié)合，或與常規(guī)噴射干燥所用的裝置結(jié)合，在較低的溫度下更快干燥。
提供了一種方法，使用將小體積樣品引入流體的裝置將一定體積的一種或多種物質(zhì)注射進(jìn)入溶液流(該溶液流含有水相或超臨界或近臨界的溶液)中，對(duì)得到的溶液進(jìn)行迅速降壓，形成液滴。引入裝置優(yōu)選是個(gè)注入孔，如HPLC所用的。引入體積最好是約0.01毫升-10毫升。
提供了一種傳遞蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)的方法，它包括用本發(fā)明的方法干燥蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)，用水或其他合適的物質(zhì)重建蛋白質(zhì)，并通過(guò)所需裝置進(jìn)行傳遞。
還提供了穩(wěn)定和/或藥物學(xué)上活性的顆粒?！胺€(wěn)定”意味著在儲(chǔ)藏。運(yùn)輸、重建和使用過(guò)程中能抵抗分解。
還提供了一種迅速膨脹組合物的裝置，該裝置具有死體積小的三通，所述組合物通過(guò)該三通和一種節(jié)流器，后者具有一條以上基本平行的非同心通道。死體積小的三通是體積約0.2-10微升的混合用三通?？捎萌魏魏线m方法，如環(huán)氧或合適的零件將三通連接在節(jié)流器上。
本發(fā)明的干燥技術(shù)優(yōu)于常規(guī)干燥技術(shù)。本發(fā)明的干燥技術(shù)是可以放大的，不會(huì)顯著改變顆粒粒徑或形貌。本方法還提供了比其他方法產(chǎn)生的表觀密度更小的顆粒。這就是空氣動(dòng)力學(xué)粒徑小，而絕對(duì)粒徑大的顆粒，因?yàn)樵谝粋€(gè)實(shí)施例中，形成了額外的氣相超臨界流體，生成呈多孔或空心結(jié)構(gòu)的顆粒。這使得在一種用途中具有較低的動(dòng)量的較大顆粒，能深入肺內(nèi)，而其他方法制成的顆粒難以做到這一點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是超臨界流體輔助的噴霧和鼓泡干燥系統(tǒng)的示意圖。
圖2是本發(fā)明所用干燥管的示意圖。
圖3是多通道限流式節(jié)流器的電子顯微照片；圖4是成型的多孔節(jié)流器的電子顯微照片。
圖5是用超臨界CO2噴霧后，磷酸一氫鉀/磷酸二氫鉀(◆，pH7)，Tris/TirsHCl(▲，pH7.2)，檸檬酸/檸檬酸鈉(■，pH5.5)和乙酸/乙酸鈉(●，pH5)的緩沖能力。
圖6A-6G是本發(fā)明方法產(chǎn)生的干燥蛋白粉的電子顯微照片。
圖7顯示了本發(fā)明的方法產(chǎn)生的含和不含賦形劑的溶菌酶粉末的電子顯微照片。
圖8顯示對(duì)4毫克/毫升溶菌酶，100mMpH7.0的磷酸緩沖液和10％甘露醇(A)和10％蔗糖(B)超臨界CO2輔助噴霧的樣品的X光衍射圖，鼓泡干燥的粉末中含有最終近似固體重量百分?jǐn)?shù)為4％蛋白質(zhì)、16％緩沖劑和80％糖。
圖9顯示了本發(fā)明的方法產(chǎn)生的含或不含賦形劑的溶菌酶粉末的FTIR圖譜。
圖10是重新水合的粉末的溶菌酶酶活性與原始制劑的活性比較圖，該粉末是用超臨界CO2輔助的噴霧和鼓泡干燥制備的。
圖11是用本發(fā)明的方法制備的乳酸脫氫酶(LDH)粉末在重新水合后的活性圖。
圖12是使用各種不同種類以及用量的賦形劑制備的顆粒在重新水合后溶菌酶活性恢復(fù)的圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明形成干燥蛋白質(zhì)的技術(shù)比常規(guī)所用的技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)包括能形成各種不同蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)的穩(wěn)定制劑，這些制劑目前用常規(guī)技術(shù)干燥是不合適的。本發(fā)明干燥過(guò)程對(duì)物質(zhì)產(chǎn)生的應(yīng)力和破壞小得多。另外，用該方法能直接制備含有蛋白質(zhì)的穩(wěn)定制劑在可吸入粒徑范圍內(nèi)的細(xì)粉，不再需要額外的機(jī)械粉碎，這種粉碎可能會(huì)對(duì)干燥制劑進(jìn)一步產(chǎn)生應(yīng)力，進(jìn)一步喪失其活性。本發(fā)明過(guò)程中優(yōu)選采用的溫度低于常規(guī)干燥法。這種降低的干燥溫度會(huì)使熱降解減小。本發(fā)明方法形成的粉末所含的水分比常規(guī)干燥方法的要少，所以不再需要進(jìn)一步的干燥步驟。本發(fā)明方法減少了物質(zhì)變性程度和常規(guī)噴霧法導(dǎo)致的聚集現(xiàn)象。
說(shuō)明本發(fā)明方法中液體、溶液和顆粒流動(dòng)的圖1是本發(fā)明的一個(gè)具體示范的實(shí)施例。裝有液態(tài)二氧化碳的二氧化碳儲(chǔ)器10(可以是氣瓶或其他儲(chǔ)器)與二氧化碳泵15(可以是注射泵或其它合適的泵)通過(guò)管道70連接。二氧化碳泵15通過(guò)管道71與混合三通20連接，當(dāng)?shù)竭_(dá)加熱的混合三通20時(shí)，二氧化碳在變成超臨界流體或近臨界流體的條件下泵送通過(guò)管道71。水性溶劑儲(chǔ)器40通過(guò)管道72與液體泵35(優(yōu)選高效液相層析(HPLC)泵，它通過(guò)管道73與注入孔30連接)連接。注入孔30用于加入蛋白質(zhì)或其他藥物、緩沖劑、填充劑、賦形劑、穩(wěn)定劑和/或表面活性劑的水溶液。來(lái)自儲(chǔ)器40的水相溶劑和通過(guò)注射孔30注入的蛋白質(zhì)溶液(含或不含添加劑)通過(guò)管道74通入混合三通20?；旌先?0優(yōu)選具有小的死體積(如小于約10微升)，因此可在其中形成超臨界二氧化碳和溶液的密切混合物?；旌先?0裝有減壓節(jié)流器25，以維持混合三通中的背壓力，并還可通過(guò)加熱線圈保持三通中的超臨界溫度。
所得的混合物從混合三通20通過(guò)細(xì)小直徑的減壓節(jié)流器25后，在減壓節(jié)流器25節(jié)流孔出口的壓力突然釋放，形成非常細(xì)小的溶液液滴的氣溶膠和/或泡沫(80)。節(jié)流器可具有單個(gè)出口，或可具有許多出口。然后氣溶膠80被引入干燥管45中央。干燥管45優(yōu)選短于1米，直徑小于10厘米。在干燥管45中經(jīng)過(guò)管道85，通過(guò)輸入孔35加入來(lái)自氮?dú)鈨?chǔ)器30的氮?dú)?。最好是圍繞干燥管45的中央安排等距離的多個(gè)輸入孔35?？捎脽?0加熱干燥管45。也可如圖2所示加熱氮?dú)狻Ｈ绻麤](méi)有爆炸危險(xiǎn)，可使用加熱的空氣或氣體混合物。加熱促進(jìn)著干燥過(guò)程，并避免水凝結(jié)在管內(nèi)壁上和濾紙上。如果水凝結(jié)在濾紙上，它會(huì)導(dǎo)致阻塞。干燥管45的出口裝有濾紙支架50，它與真空泵55通過(guò)一合適的接頭91連接。
在操作中，通過(guò)超臨界二氧化碳泵15，將液態(tài)二氧化碳從二氧化碳儲(chǔ)器10通過(guò)導(dǎo)管70，經(jīng)過(guò)泵15，通過(guò)導(dǎo)管71，泵送到低體積(0.2-10微升)混合三通20中，它在其中變成超臨界流體(如果還沒(méi)有變成的話)，或近臨界流體。泵35將通過(guò)導(dǎo)管72來(lái)自溶劑儲(chǔ)器40的水相溶劑通過(guò)導(dǎo)管73泵送到注射孔30，通過(guò)該注射孔以水溶液形式加入感興趣的蛋白質(zhì)。添加劑可通過(guò)注射孔30引入或加到儲(chǔ)器40的溶劑中?？稍诘鞍踪|(zhì)溶液或儲(chǔ)器40的水相溶劑中使用緩沖液，以減少蛋白質(zhì)變性的可能性，并減少由于在混合物中引入二氧化碳，未補(bǔ)償?shù)膒H改變引起的可能發(fā)生的聚集現(xiàn)象。可用加熱線圈對(duì)混合三通20加熱，也可和/或加熱節(jié)流器25維持溫度在二氧化碳的臨界溫度以上。用閥門(mén)裝置(圖1中未顯示)分別調(diào)節(jié)二氧化碳和水溶液的流量。流量也可通過(guò)改變泵的條件進(jìn)行控制?；旌先?0中的混合物在下游膨脹，形成含有溶于或懸浮于水溶液的物質(zhì)的細(xì)小顆粒氣溶膠80。顆粒被引入干燥管45中央，在其中干燥并收集在濾紙支架50的濾紙上。另外，如果粒徑分布合適的話，例如可用旋風(fēng)式收集器或級(jí)聯(lián)式?jīng)_擊取樣器收集顆粒。
注射孔30的使用能在引入蛋白質(zhì)和/或添加劑以前使系統(tǒng)平衡。當(dāng)用熱電偶測(cè)出干燥管的溫度是平衡的，而且水溶液和二氧化碳的流量達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)，系統(tǒng)就達(dá)到平衡。平衡后，通過(guò)注射孔30可在水相進(jìn)料管中注射已知體積的蛋白質(zhì)制劑。
六孔注射閥可用于噴霧系統(tǒng)，從而在加樣階段有兩個(gè)獨(dú)立的溶液回路。在一個(gè)回路中將溶劑從HPLC泵泵送通過(guò)混合三通，而樣品包含在樣品回路中，如3毫升的樣品回路，它在加樣階段不與溶劑回路連接。在注射階段，溶劑從HPLC泵泵送通過(guò)樣品回路，到混合三通。這種修改的優(yōu)點(diǎn)是蛋白質(zhì)或其他感興趣的物質(zhì)不泵送通過(guò)HPLC活塞，使得能夠注射非常少的樣品。每次運(yùn)行所需的蛋白質(zhì)數(shù)量和總運(yùn)行時(shí)間可很大下降。
當(dāng)使用樣品注射閥時(shí)，典型系統(tǒng)參數(shù)包括二氧化碳?jí)毫?00大氣壓，二氧化碳流量0.3毫升/分鐘；水相流量0.3毫升/分鐘，使用內(nèi)徑為50微米的5厘米長(zhǎng)的熔凝二氧化硅節(jié)流器。
圖2顯示更詳細(xì)的干燥管和干燥過(guò)程圖。來(lái)自混合三通20的溶液通過(guò)節(jié)流器尖70，通過(guò)入口100進(jìn)入干燥管45內(nèi)，在其中形成液滴。來(lái)自儲(chǔ)器30的氮?dú)?或其他氣體，惰性或含有需要與氣溶膠顆粒反應(yīng)的物質(zhì))通過(guò)管道85到達(dá)氣體干燥柱60。然后氣體通過(guò)管道95到加熱線圈65。在優(yōu)選例中，將氣體加熱到約70℃，流量約15升/分鐘。加熱的氣體通過(guò)管道100，經(jīng)過(guò)氣體入口35到達(dá)干燥管45。在優(yōu)選例中，干燥管45是玻璃管，具有5個(gè)輸入口，一個(gè)在中間加入氣溶膠，其他4個(gè)入口圍繞中央口排列。還用燈90在外部加熱干燥管45。在干燥管45的出口，用支架50上的濾紙收集顆粒。
干燥管45可使用其它外形。例如，可用多些或少些的入口35。還可將氣體加到管中央，顆粒加在氣體周?chē)?。還可在干燥管中混合氣體和顆粒。干燥氣體和顆粒在管內(nèi)的相互作用影響最終產(chǎn)物的特征。
優(yōu)選用不銹鋼制造全部的高壓部件?？墒褂闷渌栊圆牧虾屯繉印?yōu)選用不銹鋼制造濾紙支架50。節(jié)流器長(zhǎng)度優(yōu)選約為2英寸(5厘米)。上述裝置中水溶液的流量約0.5-3毫升/分鐘。如需要，可以大批量或小批量進(jìn)行該過(guò)程，只要調(diào)節(jié)尺寸和流量，同時(shí)維持相似的溫度和壓力。在一具體的代表性實(shí)施例中，當(dāng)使用50微米內(nèi)徑的限流式節(jié)流器時(shí)，二氧化碳和水相溶劑的流量大約是0.3毫升/分鐘。
注射孔30使得在沒(méi)有注射孔的系統(tǒng)中引入大體積(＞10毫升)制劑需要的相同時(shí)間內(nèi)，可引入幾個(gè)小體積蛋白質(zhì)制劑的等份(約0.1-10毫升)。這就可以使幾種具有不同成分和濃度的蛋白質(zhì)制劑快速干燥，而且每次運(yùn)行中蛋白質(zhì)用量很少。這比商品化的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模噴射干燥器(它每次實(shí)驗(yàn)需要100毫升的蛋白質(zhì)溶液)優(yōu)點(diǎn)大得多。然而，本發(fā)明的方法也可用于大體積的蛋白質(zhì)和大體積的任何物質(zhì)的干燥。
節(jié)流器可以是多通道節(jié)流器，它具有多根平行管子。一種這樣的多通道節(jié)流器可以用玻璃多通道柱(Alltech，Inc.Illinois)制造。該柱可以長(zhǎng)達(dá)1米的長(zhǎng)度購(gòu)得，具有大約900個(gè)等于柱長(zhǎng)的洞，各洞具有約40-50微米或更大的內(nèi)徑。可用一個(gè)這樣的柱作為多通道節(jié)流器。一種這種產(chǎn)品具有六角形截面(Alltech部件號(hào)17059)。其他產(chǎn)品具有圓形截面，其中六角形置于相同直徑的圓中。圖3顯示了這樣的節(jié)流器末端的電子顯微照片。圓形截面的節(jié)流器更容易與泵以及具有套環(huán)密封裝置和Swagelok零件的罐連接，它們也可與不銹鋼管道或三通通過(guò)涂有環(huán)氧前聚合物混合物的玻璃或陶瓷管連接，并將其滑入大一些的鋼管中。六角形截面的孔隙可用聚合物或環(huán)氧填充。這些多通道節(jié)流器可用于靜態(tài)過(guò)程，也可用于動(dòng)態(tài)過(guò)程。在動(dòng)態(tài)過(guò)程中，死體積小的三通用來(lái)對(duì)液體蒸汽(接近臨界狀態(tài))或要噴霧的超臨界流體如二氧化碳和水溶液或懸浮液進(jìn)行混合。在靜態(tài)過(guò)程中，超臨界或近臨界流體在接近其臨界溫度的溫度對(duì)感興趣的物質(zhì)的溶液進(jìn)行增壓。這使得一些超臨界或近臨界流體(如果用二氧化碳，達(dá)到大約1-2摩爾百分?jǐn)?shù))溶于水。當(dāng)溶液通過(guò)混合達(dá)到平衡時(shí)，如果水溶液和超臨界或近臨界的流體通過(guò)節(jié)流器射出，隨著增壓流體的壓力回到大氣壓或更低時(shí)，形成氣溶膠。還可在氣體反溶劑法中和其他需要顆粒的方法中使用多通道節(jié)流器。
節(jié)流器可具基本平坦的或制成一定形狀的末端。節(jié)流器的末端可以是機(jī)械成形的。例如，可用一種磨料除去其部分材料。一些合適的研磨料包括例如鉆石包埋的鎳合金板(3M制造的大理石雕刻家使用的類型)。用極細(xì)小(微米粒徑)的鉆石晶體磨去各通道周?chē)谋?。圖4顯示了用鉆石板造型后的圖3所示的節(jié)流器類型。另外，可用細(xì)碳化硅“干濕”砂紙?；覞{和瓦中的硅酸鹽可磨蝕和成形節(jié)流器。優(yōu)選采用鉆石。
節(jié)流器上的層也可化學(xué)蝕刻。例如，可用HF蝕刻玻璃節(jié)流器的所選層。可以使用的一種方法是將空氣緩慢通入節(jié)流器的尖端，并將其浸在氫氟酸(水溶液)中越來(lái)越深。這就使末端逐漸變成鉛筆樣的筆尖。也可使用其他合適的化學(xué)物質(zhì)。例如，如果節(jié)流器是金屬的，可使用鹽酸等酸來(lái)除去層。也可使用機(jī)械和化學(xué)蝕刻的組合。
錐形尖端的角度可從非常尖到很大的銳角(從節(jié)流器體平面約5度到從節(jié)流器體平面約89°)。錐體尖端的角度確定了液滴形成的體積。當(dāng)角度越小，會(huì)增加形成液滴的體積。當(dāng)角度越小時(shí)，通道出口顯得是長(zhǎng)橢圓形，而不是圓形。在半球區(qū)域上噴射(而不是單向噴射)使得液滴迅速的分散在干燥氣體中，聚集較少。
使用多通道節(jié)流器的好處包括相對(duì)于單通道節(jié)流器而言通量的增加，如果某些通道被阻擋或阻塞，仍能連續(xù)形成顆粒。用延長(zhǎng)的液體出口的好處包括1)更分散(軸向)的氣溶膠煙霧，它有助于避免顆粒在形成后聚集的問(wèn)題，2)混合得到更好的流體。
多通道節(jié)流器可用來(lái)形成各種物質(zhì)的顆粒，這些物質(zhì)包括液體、熔體、溶液、超臨界流體和超臨界流體的溶液或懸浮液、水性和/或有機(jī)溶劑、乳液、微乳液、膠團(tuán)、反相膠團(tuán)和其他物質(zhì)，形成的是含有細(xì)小顆粒固體(非晶態(tài)或晶態(tài))的氣溶膠?？捎帽疚乃龅姆椒ɑ蚱渌绢I(lǐng)域已知的方法干燥這些氣溶膠。還可在滅火器中使用這種多通道節(jié)流器，其中可用自由基清除劑聯(lián)合除去熱量來(lái)滅火。含有自由基清除劑的非常細(xì)小分散的水滴氣溶膠云比常規(guī)噴射噴嘴形成的不含CO2的大水滴具有更大的表面積和液滴懸浮時(shí)間，而不會(huì)沉積。
實(shí)施例材料從Sigma Chemical Co.以批號(hào)53H7145購(gòu)得微晶蛋清溶菌酶(結(jié)晶，經(jīng)水中透析和凍干)。作為銨鹽懸浮液，從Sigma Chmical Co.(從家兔肌肉中分離，M4同工酶，批號(hào)95H9550)和Boehringer-Mannheim(從豬心臟中分離，M4同工酶，批號(hào)84895527)購(gòu)得乳酸脫氫酶。從Pfanstiehl Laboratories購(gòu)得蔗糖和甘露醇，不經(jīng)進(jìn)一步純化使用。從Aldrich Chemical購(gòu)得聚氧乙烯去水山梨糖醇月桂酸酯(Tween20)和緩沖鹽，不經(jīng)進(jìn)一步純化使用。從Scott Specialty Gases購(gòu)得二氧化碳(SFE級(jí)，虹吸罐)。
方法酶的制備。在所需制劑中加入固態(tài)的、預(yù)先凍干的固體材料，制備溶菌酶溶液。溶菌酶是一種較強(qiáng)的蛋白質(zhì)，在凍干或常規(guī)噴射干燥后破壞不顯著。讓凍干粉末緩慢擴(kuò)散進(jìn)入2-8℃之間的溶液。將LDH硫酸銨懸浮液對(duì)100mM磷酸鉀(pH7.5)在2-8℃透析12-24小時(shí)。然后將得到的溶液稀釋到濃度為每毫升水100毫克蛋白質(zhì)。
噴霧和鼓泡干燥系統(tǒng)。本文已簡(jiǎn)要總結(jié)了用于超臨界CO2輔助噴霧的系統(tǒng)(如圖1所示)。各均以大約0.3毫升/分鐘的穩(wěn)定流量將水流和超臨界或近臨界的二氧化碳流(T＞32℃，P＝1500psi)分別傳送到死體積小的混合三通(Valco)的兩個(gè)支管中，水流用HPLC溶劑傳送泵(Water型M-6000A)，二氧化碳用注射泵(ISCO型260D，設(shè)定在1500psi的恒壓下傳送)。將最初室溫下的這兩股流用裝接于混合三通的熱電偶控制的加熱筒加熱到32℃以上。讓在混合三通中得到的乳液膨脹出三通的第三個(gè)口，它裝有一個(gè)50微米內(nèi)徑，5厘米長(zhǎng)的熔凝二氧化硅減壓節(jié)流器(Alltech)。當(dāng)乳液流出減壓節(jié)流器，此時(shí)水溶液中溶解的二氧化碳爆炸性釋放，超臨界流體迅速分解形成非常細(xì)小的含有一些剩余溶解二氧化碳的水相液滴。然后該氣溶膠進(jìn)入定制建造的干燥室，它包括一根30厘米×2厘米的硼硅酸鹽玻璃管(在管頂部裝有4個(gè)氣體入口)和一個(gè)粉末過(guò)濾裝置(不銹鋼Millipore濾膜支架，0.2微米孔徑的醋酸纖維素濾紙)，然后是在管底部的一個(gè)冷捕集器和真空泵。和氣溶膠進(jìn)入的同時(shí)，通過(guò)干燥管頂部的4個(gè)氣體入口加入流量約15升/分鐘的加熱干燥的氮?dú)?。另外，干燥管用一紅外燈從外面加熱，促進(jìn)干燥過(guò)程，并防止水凝聚在管的內(nèi)壁上。在噴霧過(guò)程中干燥室內(nèi)的溫度維持在70℃，這足夠引起迅速的鼓泡干燥。
一旦系統(tǒng)通過(guò)噴霧和干燥純凈水10-15分鐘平衡后，將水相蛋白質(zhì)制劑(含2-20％重量/重量總固體)通過(guò)HPLC-型注射孔注入水相進(jìn)料管線。這類注射孔能加入體積非常小的等份(約0.5-5毫升)水相蛋白質(zhì)制劑，以便進(jìn)行噴霧、干燥和收集，這對(duì)于使用的蛋白質(zhì)量有限的情況是很適宜的。該系統(tǒng)的設(shè)計(jì)能在溫?zé)岣稍锏獨(dú)獾姆€(wěn)定吹氣條件下收集干燥的粉末，該吹氣過(guò)程持續(xù)到實(shí)驗(yàn)完成，以從干燥室中除去過(guò)量水蒸氣。然后從系統(tǒng)中取下過(guò)濾裝置，轉(zhuǎn)移到充有干燥氮?dú)獾奶状?，在套袋中將粉末轉(zhuǎn)移到1.5毫升微量離心管中，加蓋儲(chǔ)藏在置有濃硫酸的干燥器中，供分析之用。在一些實(shí)驗(yàn)中，用真空泵通過(guò)濾膜以稍低于大氣壓(在Boulder，CO一英里海拔高的地方630毫米汞柱)的壓力將水蒸氣、二氧化碳和氮?dú)獬槌?。在其他?shí)驗(yàn)中，不用真空泵，在稍高于環(huán)境的壓力下進(jìn)行干燥，得到相同結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
靜態(tài)和動(dòng)態(tài)系統(tǒng)pH測(cè)量為了模擬可觀察靜態(tài)系統(tǒng)中死體積小的三通內(nèi)的情況，將與Fisher pH指示溶液混合的未緩沖或緩沖的溶液，裝入配有藍(lán)寶石窗、一個(gè)壓力轉(zhuǎn)換器、熱電偶繼電器控制的加熱筒和磁性攪拌裝置的高壓室中。在35℃一邊攪拌一邊平衡室中的內(nèi)含物，并用CO2增壓到1500psi。為了確定由于用二氧化碳增壓水相制劑導(dǎo)致酸性增加的程度，對(duì)于緩沖和未緩沖溶液都進(jìn)行了一系列pH測(cè)定。在第二個(gè)更定量的方法中，用超臨界CO2系統(tǒng)噴霧緩沖和未緩沖的溶液，作為液滴氣溶膠收集起來(lái)，直到收集容器中水溶液的液面允許用pH探針進(jìn)行測(cè)量。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用超臨界CO2輔助的噴霧和鼓泡干燥從下列水相溶菌酶制劑，制備了粉末表征用的樣品“僅含緩沖液”含有4毫克/毫升溶菌酶和100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)?！?0％甘露醇”含有4毫克/毫升溶菌酶、100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)和10％w/w甘露醇?！?0％蔗糖”含有4毫克/毫升溶菌酶、100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)和10％w/w蔗糖，“10％蔗糖w/Tween”含有4毫克/毫升溶菌酶、100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、10％w/w蔗糖和0.01％w/w Tween20(聚氧乙烯(20)去水山梨糖醇月桂酸酯)。在噴霧前，所有制劑均通過(guò)0.2微米Nylon注射過(guò)濾器，除去其中的顆粒。每次實(shí)驗(yàn)將約2毫升各制劑注射入噴霧系統(tǒng)，除了僅含緩沖液的制劑，它每次實(shí)驗(yàn)的注射體積是6毫升，(為了每次實(shí)驗(yàn)?zāi)苁占銐虻姆勰┯糜诜治?，因?yàn)樵撝苿┲械娜苜|(zhì)總含量低。每種制劑注射三次，分別收集每批粉末，來(lái)確定各次實(shí)驗(yàn)之間結(jié)果的一致性。另外，從含有0.1毫克/毫升LDH和100nM磷酸鉀(pH7.5)，并分別含有下列賦形劑的水相制劑中制備了含LDH的粉末10％w/w甘露醇；10％w/w蔗糖；和含有0.01％w/w Tween20的10％w/w蔗糖。這些濃度是指在鼓泡干燥前水溶液中的百分?jǐn)?shù)；干燥粉末中的濃度由于水被除去而成比例的增大。
尺寸排阻色譜在裝有AD20型UV探頭(定為280)、GP40梯度液體泵和Spectra Physics自動(dòng)采樣機(jī)的Dionex HPLC上，進(jìn)行尺寸排阻色譜，測(cè)定可溶性聚集物的存在與否。固定相是30毫米×7.8毫米(內(nèi)徑)的TosoHaas TSK-Gel 3000SWx1柱，其中有孔徑為250的5毫米二氧化硅珠。同等(isocratic)流動(dòng)相是100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)。在注射前，將粉末樣品用去離子水重新水合到脫水前的原來(lái)總固體重量與總?cè)芤褐亓恐?。將該重新水合的樣品進(jìn)行離心，在隔膜加蓋的HPLC小管中裝到自動(dòng)采樣機(jī)上。流量設(shè)定為0.5毫升/分子，每種樣品向柱中注射約10毫升。用辣根過(guò)氧化物酶、肌紅蛋白、BSA和卵清蛋白作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。每種樣品注射三次，確定各峰面積的平均值。
掃描電子顯微鏡分析用IS1-SX-30和Jeol JSM-6400掃描電子顯微鏡(SEM)在加速電壓30kV條件下觀察粉末。用碳絲膠帶將樣品粘附在鋁棒上，在分析前用金濺射機(jī)進(jìn)行涂覆。
熱分析在Perkin-Elmer DSC-7上進(jìn)行了差示掃描量熱計(jì)(DSC)分析。將粉末(5-10毫克)加到經(jīng)陽(yáng)極化的鋁盤(pán)上，在氮?dú)庀旅芊庠跐穸仁芸氐拇髿?＜2％相對(duì)濕度)中。樣品迅速冷卻到-20℃，在-20℃維持10分鐘，然后以10℃/分鐘的加熱速度加熱到200℃。Tg是玻璃轉(zhuǎn)變溫度(玻璃-液體)。Tm是固體-液體的熔化溫度。
X光粉末衍射在裝有CuKa光源(1＝1.54056)的Sintag PADV系統(tǒng)(在X光管負(fù)載為40kV和25毫安條件下操作)上進(jìn)行粉末X-光衍射。為了確定超臨界CO2輔助的噴霧和鼓泡干燥制備的粉末中是否存在結(jié)晶，在2θ為5°-50°范圍內(nèi)，以掃描速度為0.02°/分鐘對(duì)樣品進(jìn)行掃描。
水分分析在Mettler Karl Fisher自動(dòng)滴定器上進(jìn)行了Karl Fisher滴定。在氮?dú)獬錃獾氖痔资讲僮飨?維持在1％相對(duì)濕度以下)中制備分析樣品。在25毫克樣品粉末中加入約1毫升無(wú)水甲醇或甲酰胺。對(duì)得到的懸浮液超聲處理數(shù)分鐘。將100毫升該溶液注入庫(kù)侖計(jì)，在減去懸浮粉末的溶劑的背景水分含量后，獲得粉末的水分含量。每種粉末樣品進(jìn)行三次平行分析。
紅外光譜分析在Bomem PROTA紅外分光光度計(jì)上測(cè)出了紅外光譜。將凍干的粉末(約0.5毫克蛋白質(zhì))與300毫克無(wú)水KBr混合，用13毫米可抽空模具壓成小片。將小片直接置于氮?dú)獬錃獾姆止夤舛扔?jì)樣品室內(nèi)。天然蛋白質(zhì)的水溶液(20毫克/毫升)置于具有CaF2窗的樣品室內(nèi)，用6毫米Mylar定位片相隔。以4cm-1分辨率在4000-900cm-1范圍收集了128次掃描的平均值，進(jìn)行Fourier變換。根據(jù)先前建立的標(biāo)準(zhǔn)，從蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)光譜減去液態(tài)水和水蒸氣的光譜(Dong，A.等(1990)“二階導(dǎo)數(shù)酰胺紅外光譜得到的水中的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)”，Biochem293303-3308；Dong，A.和Caughey，W.S.(1994)，“研究血紅蛋白反應(yīng)和結(jié)構(gòu)的紅外方法”Methods Enzymol.232139-175；Dong，A.等(1995)，“凍干的紅外光譜研究-誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集”，J.Pharm.Sci 84415-424)。計(jì)算出Fourier變換光譜的二階導(dǎo)數(shù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Savizky-Golay修正，并用七點(diǎn)卷積窗口減少可能的白噪聲。
溶菌酶酶活性試驗(yàn)制備了溶壁微球菌的細(xì)菌懸浮液(Sigma批號(hào)38H8619)，其中有濃度為0.25毫克/毫升的67mM磷酸鹽緩沖液(pH6.6)。用磷酸鹽緩沖液將溶菌酶溶液稀釋到4毫克/毫升。反應(yīng)混合物含有2.5毫升細(xì)胞懸浮液和0.1毫升酶稀釋液。酶活性與細(xì)胞懸浮液濁度的下降速率成正比，濁度用分光光度計(jì)在450納米測(cè)量2分鐘，結(jié)果是線性下降的。
LDH酶活性試驗(yàn)25℃，在2毫升反應(yīng)混合物中測(cè)定了LDH活性，該混合物由25mM三(羥甲基)氨基甲烷/三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris/Tris HCl，pH7.5)、100mM KCl，2mM丙酮酸鹽(Sigma，批號(hào)126H10981)和0.15mM NADH(Sigma批號(hào)027H78191)組成。在反應(yīng)混合物中加入LDH制備物(10毫升)，比色杯倒轉(zhuǎn)3次，用分光光度計(jì)測(cè)量340納米處吸光度減少。在超臨界CO2輔助的噴霧之前和干燥粉末重新水合之后立即測(cè)量活性，報(bào)道為原始活性的百分?jǐn)?shù)。注意在圖11中對(duì)于某些組合物，LDH活性大于100％的原始水溶液的活性。
含或不含緩沖液的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)pH測(cè)量研究了當(dāng)CO2溶于水時(shí)，使用緩沖液能否發(fā)生酸化的問(wèn)題。在1500psi壓力下，CO2在水中的溶解度(在35℃約2摩爾％)會(huì)導(dǎo)致未緩沖溶液中酸度的增加。在不存在緩沖液情況下，酸性環(huán)境可能使蛋白質(zhì)變性。因此，用靜態(tài)系統(tǒng)模擬混合三通內(nèi)的條件，觀察無(wú)緩沖水溶液中酸度的增加程度。在用二氧化碳增壓前加入pH敏感的指示染料，來(lái)定量測(cè)量酸度的改變。如預(yù)期的，CO2增壓后pH迅速降到指示劑范圍(pH＜4)以下。用該靜態(tài)系統(tǒng)，對(duì)下列緩沖鹽估測(cè)了中和這種pH下降效應(yīng)的能力磷酸一氫鉀/磷酸二氫鉀(pH7)，Tris/Tris HCl(pH7.2)，檸檬酸/檸檬酸鈉(pH5.5)和乙酸/乙酸鈉(pH5)。所有測(cè)試的溶液的緩沖能力(測(cè)作緩沖系統(tǒng)阻止指示染料顏色改變的能力)在約100mM濃度顯示為pH穩(wěn)定(數(shù)據(jù)未示)。為了進(jìn)一步對(duì)這些觀察定量，用超臨界CO2系統(tǒng)對(duì)靜態(tài)系統(tǒng)中使用的相同緩沖液進(jìn)行噴霧，收集所得的液滴氣溶膠。各溶液的pH必須在收集后立即測(cè)定，因?yàn)樵撝涤捎诙趸嫉拿芭荻^續(xù)增加。圖5中表示了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，這與靜態(tài)觀測(cè)到的100mM的緩沖液會(huì)充分中和溶解CO2的效應(yīng)，并能避免對(duì)酸化引起的蛋白質(zhì)的破壞是一致的。
細(xì)粉表征為了確定本發(fā)明的方法產(chǎn)生的分子的表面特征，用上述方法制備了舒喘寧硫酸酯、托布拉霉素硫酸酯、色甘酸鈉、rhDNase、乳糖和氯化鈉的細(xì)粉。液滴形成的條件是CO2壓力1500psi、流量0.3毫升/分鐘、CO2和H2O濃度約為10％(重量/體積)、管子入口約70℃，管子出口約50℃，50毫米和5厘米熔凝二氧化硅節(jié)流器、0.2毫米醋酸纖維素濾紙。
圖6顯示了用本發(fā)明方法制備的代表性干粉的電子顯微鏡照片。圖6A是本發(fā)明方法用20％氯化鈉水溶液樣品制備的干氯化鈉顆粒的透射電子顯微鏡(TEM)照片。圖6B是相同氯化鈉溶液用本發(fā)明方法干燥后的掃描電子顯微鏡(SEM)照片。圖6C是甘露醇的TEM照片。圖6D和6E顯示用本發(fā)明方法對(duì)10％(總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量/體積)的水溶液制備的托布拉霉素硫酸酯顆粒(6D)和1％托布拉霉素硫酸酯在乳糖中的顆粒(6E)。圖6F是本發(fā)明方法制備的舒喘寧硫酸酯顆粒。圖6G是本發(fā)明方法制備的色甘酸鈉顆粒。
最初對(duì)材料和方法兩節(jié)所述的水相溶菌酶制劑通過(guò)CO2輔助的噴霧和鼓泡干燥制備了干粉。肉眼可見(jiàn)所收集的樣品都是非常細(xì)小顆粒的白色粉末，粉末的質(zhì)量在各次實(shí)驗(yàn)之間差異非常小。所有的粉末在濕潤(rùn)空氣中是吸濕性的，但在低濕度環(huán)境中能自由流動(dòng)而且容易處理。圖7顯示了代表性干粉蛋白質(zhì)制劑的電子顯微照片，有“僅含緩沖液”粉末(A)，10％甘露醇粉末(B)，10％蔗糖粉末(C)，和含有0.01％Tween 20的10％蔗糖粉末(D)。注意當(dāng)用Tween時(shí)，(見(jiàn)圖7D)，形成了一種聚集顆粒較少，球形更明顯的分散顆粒。這可能是加入表面活性劑Tween 20的直接或間接效果。雖然不希望被任何具體理論所限，但可以相信在處理過(guò)程中去垢劑幫助脫水。產(chǎn)生的所有粉末中有很大一部分顆粒基本在1-3毫米直徑的可吸入粒徑范圍內(nèi)。從僅含緩沖液的制劑和含有10％甘露醇的制劑中制備的粉末的形狀比含有蔗糖的制劑制備的粉末，其顆粒球形度和光滑度差些。在蔗糖溶液中加入Tween 20具有進(jìn)一步光滑干燥顆粒表面的效果。其他顆粒研究者對(duì)于常規(guī)噴射干燥的顆粒已經(jīng)觀察到了這一點(diǎn)，并可以認(rèn)為在水相制劑中加入表面活性劑具有在脫水過(guò)程中減少表面湍流的作用。
10％甘露醇制劑的粉末顆粒顯微鏡照片(圖7B)表明是更為完善的結(jié)晶材料，表現(xiàn)為多面形狀的顆粒。
水分分析對(duì)本發(fā)明方法干燥的粉末進(jìn)行的Karl Fischer水分分析也表明了低水分含量4毫克/毫升溶菌酶和10％(原始水溶液中的百分?jǐn)?shù))甘露醇樣品的水分含量是0.6±0.05％，4毫克/毫升溶菌酶和10％蔗糖的粉末的水分含量是1.18±0.02％，4毫克/毫升溶菌酶和10％蔗糖和0.01％Tween的粉末的水分含量是1.25±0.07％。
用超臨界CO2輔助的噴霧和鼓泡干燥制備的各LDH粉末得到的Karl Fisher滴定結(jié)果表明，用該新方法能獲得非常低水分的顆粒從僅含緩沖液的水相制劑制備的粉末，水分含量是0.83±0.06％w/w，從10％甘露醇制劑得到的是1.3±0.01％，從10％蔗糖制劑得到的是1.4±0.08％，從含有10％蔗糖和0.01％Tween 20的制劑得到3.25±0.03％。收集的蔗糖粉末是非常吸濕性的，其操作必須在充有干燥氮?dú)鈺r(shí)手套式真空室內(nèi)進(jìn)行。其他糖粉末，如海藻糖粉末吸濕性較小。
XRD和DSC由于賦形劑的結(jié)晶會(huì)劇烈影響固態(tài)藥物制劑的溶解度和穩(wěn)定性，研究了超臨界CO2輔助噴霧形成結(jié)晶和/或無(wú)定形粉末的能力。甘露醇在凍干過(guò)程中會(huì)結(jié)晶和在噴射干燥后形成結(jié)晶粉末的強(qiáng)烈傾向是人們熟知的。因此，選擇甘露醇作為賦形劑來(lái)確定噴霧系統(tǒng)形成結(jié)晶粉末的能力，雖然該賦形劑對(duì)模型蛋白質(zhì)不能起顯著的穩(wěn)定作用。雖然結(jié)晶性是用作固態(tài)藥物填充劑的賦形劑的理想性質(zhì)，但是在過(guò)程中有結(jié)晶傾向的賦形劑對(duì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥物在脫水和隨后干燥狀態(tài)的儲(chǔ)藏過(guò)程中保護(hù)作用很小。對(duì)于超臨界CO2輔助的噴霧制備的樣品，在圖8中提供的是來(lái)自10％甘露醇制劑的溶菌酶樣品的粉末衍射數(shù)據(jù)。其水相制劑含有4毫克/毫升溶菌酶，100mM pH7.0的磷酸緩沖液，與10％甘露醇(A)或10％蔗糖(B)一起進(jìn)行噴霧。鼓泡干燥粉末中最終的大致重量百分?jǐn)?shù)4％蛋白質(zhì)、16％緩沖劑和80％糖。10％甘露醇溶液制備的粉末的衍射數(shù)據(jù)表明樣品有良好的結(jié)晶性，而且似乎是a和b多形甘露醇的混合物。該衍射圖譜與用廠商提供的純D-甘露醇獲得的粉末衍射圖譜(未顯示)一致。
收到狀態(tài)的甘露醇、與溶菌酶噴射干燥的甘露醇、與溶菌酶一起噴射干燥的蔗糖以及蔗糖和溶菌酶的DSC在本說(shuō)明書(shū)中并未圖示。接受狀態(tài)的甘露醇樣品的DSC表明有157.25-177.56℃的峰，從156.10℃開(kāi)始。Tm是159℃；300.47J/克。與4毫克/毫升溶菌酶一起噴灑干燥的甘露醇樣品的PSC顯示了從77.63℃開(kāi)始到146.48℃的峰。Tm＝154.7℃；134J/g未校正。含有4毫克/毫升溶菌酶的蔗糖樣品的DSC顯示21.93-47.12℃的Tg，從40.25℃開(kāi)始，Tg＝43.05℃，1.51J/g未校正。含有Tween和4毫克/毫升溶菌酶的蔗糖的DSC顯示28.57-56.99℃的Tg，從45.36℃開(kāi)始；1.00J/g deg；Tg＝50.95℃。
蔗糖制劑的X光粉末衍射數(shù)據(jù)(圖8B)表明其更為無(wú)定形的本性，并由DSC熱像圖中觀察到的玻璃轉(zhuǎn)變所證實(shí)。在玻璃轉(zhuǎn)變溫度以下形成無(wú)定形玻璃態(tài)粉末的能力是所揭示物的重要能力，因?yàn)榻鼇?lái)已發(fā)現(xiàn)聯(lián)系蛋白質(zhì)穩(wěn)定化與玻璃化(玻璃形成)的重要證據(jù)(Crowe，J.H.等(1998)，“脫水生活中玻璃化的作用”，Annu.REv.Physiol.6073)。樣品的差示掃描量熱計(jì)分析表明，在154.7℃有吸熱現(xiàn)象，它與結(jié)晶D-甘露醇的熔解溫度(169℃)一致。低Tm可能是由于在粉末中存在水(KarlFisher滴定測(cè)定約1％)。
重新水合的溶液的表征將濾紙上收集的粉末轉(zhuǎn)移到小的惰性試管中，用蒸餾的去離子水重新水合到原始的重量/重量百分?jǐn)?shù)(總?cè)苜|(zhì)質(zhì)量/總?cè)芤嘿|(zhì)量)濃度。與原來(lái)的溶液相比，重新水合的蛋白質(zhì)溶液的活性分析表明，全部噴灑的溶液保持(或恢復(fù))90％以上的活性。HPLC(尺寸排除Tosohaas柱TSK3000SWx1，100mM KPO4pH＝7.0洗脫緩沖液)表明單體蛋白質(zhì)與二聚體聚集物之比在干燥和重新水合后保持相同(聚集物形成二聚體、三聚體，最終形成不溶性的聚集物是常見(jiàn)的蛋白質(zhì)降解途徑)。HPLC數(shù)據(jù)在此處并未顯示。計(jì)算出聚集物單體之比對(duì)于最初的溶菌酶制劑以及所有重新水合的粉末大約是0.21％±0.02％。
研究者仍相信，一種重要的穩(wěn)定固態(tài)蛋白質(zhì)的方法是對(duì)蛋白質(zhì)提供一種基質(zhì)，脫水后至少在某種程度上它能保留天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(Chang，B.S.等，“影響凍干白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的因素玻璃轉(zhuǎn)變和蛋白質(zhì)構(gòu)型”，Arch.Biochem.Biophys.331249；Allison，D.S.等(1998)“干燥法和添加劑對(duì)肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響脫水引起的破壞及其抑制的機(jī)制”，Arch.Biochem.Biophys.358171)。已經(jīng)證明，在處理前在蛋白質(zhì)溶液中加入某些穩(wěn)定劑(如蔗糖)抑制了脫水誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變(Prestrelski，S.J.等(1993)，“蛋白質(zhì)中脫水誘導(dǎo)的構(gòu)型轉(zhuǎn)變及其被穩(wěn)定劑的抑制”，Biophys.J 65661)。用酰胺I區(qū)(1600-1700cm-1)中的二階導(dǎo)數(shù)傅里葉變換紅外光譜(Carpenter，J.F.等(1998)“用紅外光譜來(lái)開(kāi)發(fā)穩(wěn)定凍干的蛋白質(zhì)制劑”Eur.J.Pharm.Biopharm.45231)探測(cè)干燥的溶菌酶粉末的構(gòu)型結(jié)果。在圖9中顯示了代表性結(jié)果。70℃干燥的樣品(A)天然水相狀態(tài)的溶菌酶；(B)含有10％蔗糖和0.01％Tween 20的溶菌酶；(C)含有10％蔗糖的溶菌酶；(D)含有10％甘露醇的溶菌酶；和(E)僅含緩沖液的溶菌酶的樣品。酰胺I區(qū)顯示了不同類型二級(jí)結(jié)構(gòu)的特征性C＝O伸展頻率。有趣的是，雖然酶活性在所有粉末重新水合后幾乎完全保留，干燥的溶菌酶粉末在各制劑中都顯示了顯著不同的蛋白質(zhì)構(gòu)型。當(dāng)與天然溶菌酶液態(tài)紅外線譜比較時(shí)，不含賦形劑的制劑顯示了與天然構(gòu)型最大的偏差，10％甘露醇制劑與僅含緩沖液的制劑相比顯示較小的偏差，而10％蔗糖制劑顯示了與天然結(jié)構(gòu)甚至更小的偏差。10％蔗糖加上Tween20制劑顯示它是所有粉末中最像天然結(jié)構(gòu)的。這些結(jié)果表明，溶菌酶在我們的噴霧和干燥過(guò)程受到的破壞并非是不可逆的。然而在干粉中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)顯示與天然構(gòu)型顯著的偏差?；钚缘幕謴?fù)似乎表明溶菌酶在重新水合后恢復(fù)其天然構(gòu)型的能力?？赏ㄟ^(guò)加/入二糖穩(wěn)定劑(如蔗糖)抑制干燥過(guò)程中觀察到的構(gòu)型轉(zhuǎn)變。
雖然不希望被理論所限，但可認(rèn)為糖與蛋白質(zhì)形成氫鍵，而取代了其與水分子形成的氫鍵，從而減少了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在水合后的構(gòu)型變化?？梢哉J(rèn)為表面活性劑由于與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)可占據(jù)的氣液界面區(qū)，減少了氣-液界面上蛋白質(zhì)經(jīng)受的應(yīng)力。據(jù)信加到蛋白質(zhì)制劑中的表面活性劑能預(yù)防蛋白質(zhì)分子的聚集。
溶菌酶活性試驗(yàn)在溶菌酶粉末重新水合至原來(lái)的總?cè)苜|(zhì)重量％濃度后，立即測(cè)定其酶活性。這些結(jié)果(圖10)報(bào)道成在超臨界CO2輔助噴霧和鼓泡干燥前立即測(cè)量的原始活性的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果是至少三次測(cè)量的平均值，誤差橫條表示一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤差。溶菌酶粉末的分析表明所有制劑都達(dá)到原來(lái)活性90％以上的恢復(fù)。觀察得到的活性恢復(fù)說(shuō)明了該蛋白質(zhì)在脫水和重新水合后結(jié)構(gòu)改變的可逆性。因此，雖然溶菌酶在超臨界CO2輔助的噴霧過(guò)程中，在不存在無(wú)定形穩(wěn)定劑的情況下，脫水后產(chǎn)生了嚴(yán)重的解折疊，但它可在重新水合后容易的重新折疊，從而恢復(fù)了大部分其原來(lái)的生物學(xué)活性。
LDH活性試驗(yàn)為了進(jìn)一步考察噴霧過(guò)程，用一種很不穩(wěn)定的酶，即乳酸脫氫酶(LDH，Sigma，5762)進(jìn)行了研究。圖10和11顯示了數(shù)據(jù)。已知LDH在常規(guī)干燥法中會(huì)受到破壞(Adler，M.和Lee，G.(1999)，“乳酸脫氫酶在噴射干燥海藻糖中的穩(wěn)定性和表面活性”J.Pharm.Sci.88199)。在室溫下，LDH對(duì)100mM磷酸鉀透析至少12小時(shí)到pH7.5。蛋白質(zhì)濃度維持在100微克/毫升。用鼓泡干燥溶菌酶制劑使用的相同條件對(duì)LDH制劑脫水。從LDH制備的粉末看來(lái)與溶菌酶的粉末相同(數(shù)據(jù)此處未顯示)。
從含有10％甘露醇、10％蔗糖和10％蔗糖加0.01％Tween 20，連同LDH(100微克/毫升)和磷酸鉀緩沖液(100mM，pH7.5)的制劑產(chǎn)生了含LDH的干粉。將重新水合的粉末的活性與噴霧和干燥前的原始制劑比較。
制備了4種不同制劑僅含緩沖液0.1毫克/毫升LDH100mM KPO4(pH7.5)10％甘露醇0.1毫克/毫升LDH100mM KPO4(pH7.5)100毫克/毫升甘露醇10％蔗糖0.1毫克/毫升LDH100mM KPO4(pH7.5)100毫克/毫升蔗糖10％蔗糖和Tween0.1毫克/毫升LDH100mM KPO4(pH7.5)100毫克/毫升蔗糖0.1毫克/毫升Tween 20圖11顯示了這些制劑的LDH催化活性恢復(fù)。未加入任何賦形劑噴霧和脫水的LDH在重新水合后僅恢復(fù)了15％的原來(lái)活性。有趣的是，作為液滴氣溶膠收集的相同溶液保留了其原來(lái)酶活性的87％。該結(jié)果表明蛋白質(zhì)受到的大部分破壞發(fā)生在干燥過(guò)程中，水溶液/CO2乳液從節(jié)流器尖射出以后。換言之，CO2輔助的噴霧干燥不像在70℃的氮?dú)庵形⒁旱魏臀⒁号莸母稍锬菢觿×?。加入甘露醇，或加入蔗糖可更大程度的部分預(yù)防脫水過(guò)程中經(jīng)歷的不可恢復(fù)的破壞。加入蔗糖和Tween20幾乎完全防止了活性喪失。由溶菌酶制劑的結(jié)構(gòu)分析這些結(jié)果是可以預(yù)期的，因?yàn)長(zhǎng)DH這種更不穩(wěn)定的四聚酶并不會(huì)被預(yù)料像溶菌酶一樣在重新水合后具有相同的重新折疊的能力。結(jié)果，當(dāng)在蔗糖存在下干燥L(fēng)DH時(shí)，活性更好的保留，因?yàn)楦锌赡鼙４娴鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)。
圖12比較了在不同百分?jǐn)?shù)的甘露醇、蔗糖和(蔗糖+Tween(0.01％))存在條件下重新水合后活性的恢復(fù)。注意最初活性的恢復(fù)百分?jǐn)?shù)顯示，當(dāng)制劑中使用Tween時(shí)，恢復(fù)程度隨糖濃度改變而劇烈改變。
這些結(jié)果一般表明，超臨界CO2輔助的噴霧和鼓泡干燥過(guò)程中LDH經(jīng)歷的破壞可通過(guò)加入糖穩(wěn)定劑來(lái)抑制，甚至通過(guò)組合使用10％蔗糖和0.01％表面活性劑Tween 20能進(jìn)一步抑制。配制的蛋白看來(lái)在超臨界CO2輔助的噴霧和鼓泡干燥的脫水過(guò)程中受到完全保護(hù)。
在超臨界CO2輔助的噴霧和鼓泡干燥過(guò)程中，在蔗糖存在下Tween20能提高保護(hù)的機(jī)制現(xiàn)在還不清楚。Tween20可能是飽和了氣-液界面的表面位點(diǎn)，從而防止表面變性來(lái)保護(hù)蛋白質(zhì)?？梢灶A(yù)料氣-液界面對(duì)于這個(gè)過(guò)程是重要的，因?yàn)槌R界CO2輔助的噴霧產(chǎn)生高表面積的許多微細(xì)液滴。另外，表面活性劑可通過(guò)飽和蛋白質(zhì)表面的疏水位點(diǎn)(它是聚集的可能位點(diǎn))來(lái)保護(hù)蛋白質(zhì)。另外，表面活性劑能促進(jìn)重新水合過(guò)程中的蛋白質(zhì)重新折疊。在噴霧和鼓泡干燥過(guò)程中，Tween 20是否通過(guò)這些機(jī)制中的一個(gè)或多個(gè)保護(hù)LDH現(xiàn)在尚不清楚。在含有Tween20的蔗糖制劑中這種蛋白質(zhì)保護(hù)作用，連同上述的改善顆粒分散度和光滑度的作用，清楚的表明了在用超臨界CO2輔助的噴霧和鼓泡干燥的制劑中加入這種表面活性劑的可能益處。還注意到，在某些實(shí)驗(yàn)中，用CO2增壓、降壓、鼓泡干燥后水相溶菌酶的酶活性明顯比2000psi增壓前的原始水溶液的大，如酶分析表明的(見(jiàn)圖12)。St.John Carpenter和Randolph已證明，蛋白質(zhì)重新折疊是通過(guò)對(duì)水溶液進(jìn)行20,000psi的增壓實(shí)現(xiàn)的(“高壓促使蛋白質(zhì)從高濃度聚集物中重新折疊”P(pán)roc.Natl.Acad.Sci.9613029，1999)。此時(shí)，活性改進(jìn)的原因尚不清楚。雖然申請(qǐng)人并不希望拘泥于理論解釋，但用CO2增壓和表面活性劑處理水溶液可產(chǎn)生由于表面活性劑、適當(dāng)?shù)膲毫σ约岸趸蓟蛱堑拇嬖诨蚱渌麢C(jī)制改善的活性。
雖然上述描述含有許多細(xì)節(jié)，但這些細(xì)節(jié)不應(yīng)該視為對(duì)本發(fā)明的限制，而僅是提供了本發(fā)明某些目前優(yōu)選的實(shí)施例。例如，可在本發(fā)明的方法中使用許多不同物質(zhì)的許多細(xì)小干粉除了特別限定的，還可使用其他超臨界或近臨界的流體；可使用除了特別限定的以外的添加劑。本發(fā)明的范圍可通過(guò)附加權(quán)利要求及其法律上等價(jià)內(nèi)容確定。
在本公開(kāi)中引用的各參考文獻(xiàn)在本文中引入以供參考，只要其與本文公開(kāi)的內(nèi)容一致。
權(quán)利要求
1.一種形成細(xì)小干顆粒的方法，其特征在于，該方法包括(a)形成一種組合物，該組合物含有一種或多種物質(zhì)和超臨界或近臨界的流體；(b)迅速降低所述組合物上的壓力，形成液滴；(c)讓所述液滴通過(guò)加熱至約2℃-300℃的氣流。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氣體溫度在所述液滴開(kāi)始通過(guò)所述氣體的位置低于約100℃。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述物質(zhì)可溶于所述超臨界或近臨界的流體。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述組合物還含有水相溶劑。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述物質(zhì)可溶于所述水相溶劑。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述組合物還含有一種或多種選自賦形劑、穩(wěn)定劑、填充劑和表面活性劑的添加劑。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述添加劑占干物質(zhì)的重量百分?jǐn)?shù)小于99.9％。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述組合物還含有pH緩沖物質(zhì)。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述超臨界或近臨界流體是二氧化碳。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氣體是氮?dú)狻?br> 11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氣流在干燥室內(nèi)。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述物質(zhì)是生理學(xué)活性組合物，該組合物選自表面活性劑、胰島素、氨基酸、酶、止痛藥、抗癌劑、抗微生物劑、病毒、抗病毒劑、抗真菌藥物、抗生素、核苷酸、DNA、反義cDNA、RNA、肽、蛋白質(zhì)、免疫抑制劑、溶血栓劑、抗凝血?jiǎng)?、中樞神?jīng)系統(tǒng)刺激劑、減充血?jiǎng)?、利尿性血管擴(kuò)張劑、精神病治療劑、神經(jīng)遞質(zhì)、鎮(zhèn)靜劑、激素、麻醉劑、消炎藥、抗氧化劑、抗組胺藥、維生素、礦物質(zhì)和其他本領(lǐng)域已知的生理學(xué)上活性的物質(zhì)。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括(d)收集所述細(xì)小的干顆粒。
14.一種形成細(xì)小干顆粒的方法，其特征在于(a)混合含有一種或多種感興趣的物質(zhì)的水溶液和一種超臨界或近臨界的流體，形成組合物；(b)迅速降低所述組合物上的壓力，形成液滴；(c)使所述液滴通過(guò)加熱至2℃-300℃的氣流。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述氣體溫度在所述液滴開(kāi)始通過(guò)所述氣體的位置低于約100℃。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述組合物還含有一種或多種選自賦形劑、穩(wěn)定劑、填充劑和表面活性劑的添加劑。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述添加劑占干物質(zhì)的重量百分?jǐn)?shù)小于99.9％。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，如果存在的話，表面活性劑濃度約為0.001-0.5％重量；如果存在的話，穩(wěn)定劑濃度約為0.05％-25％重量。
19.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，在死體積小的三通中進(jìn)行混合。
20.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述物質(zhì)是生理學(xué)活性組合物，該組合物選自表面活性劑、胰島素、氨基酸、酶、止痛藥、抗癌劑、抗微生物劑、病毒、抗病毒劑、抗真菌藥物、抗生素、核苷酸、DNA、反義cDNA、RNA、肽、蛋白質(zhì)、免疫抑制劑、溶血栓劑、抗凝血?jiǎng)?、中樞神?jīng)系統(tǒng)刺激劑、減充血?jiǎng)⒗蛐匝軘U(kuò)張劑、精神病治療劑、神經(jīng)遞質(zhì)、鎮(zhèn)靜劑、激素、麻醉劑、消炎藥、抗氧化劑、抗組胺藥、維生素、礦物質(zhì)和其他本領(lǐng)域已知的生理學(xué)上活性的物質(zhì)。
21.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述氣流在干燥室內(nèi)。
22.一種形成細(xì)小干顆粒的方法，其特征在于，該方法包括(a)使感興趣的物質(zhì)的水溶液和超臨界或近臨界的流體達(dá)到平衡，形成一種組合物；(b)迅速降低所述組合物上的壓力，形成液滴；(c)使所述液滴通過(guò)加熱至約2℃-300℃的氣流。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述氣體溫度在所述液滴開(kāi)始通過(guò)所述氣體的位置低于約100℃。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述組合物還含有一種或多種選自賦形劑、穩(wěn)定劑、填充劑和表面活性劑的添加劑。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述添加劑占干物質(zhì)的重量百分?jǐn)?shù)小于99.9％。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，如果存在的話，表面活性劑濃度約為0.001-0.5％重量；如果存在的話，穩(wěn)定劑濃度約為0.05％-25％重量。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述物質(zhì)是生理學(xué)活性組合物，該組合物選自表面活性劑、胰島素、氨基酸、酶、止痛藥、抗癌劑、抗微生物劑、病毒、抗病毒劑、抗真菌藥物、抗生素、核苷酸、DNA、反義cDNA、RNA、肽、蛋白質(zhì)、免疫抑制劑、溶血栓劑、抗凝血?jiǎng)⒅袠猩窠?jīng)系統(tǒng)刺激劑、減充血?jiǎng)?、利尿性血管擴(kuò)張劑、精神病治療劑、神經(jīng)遞質(zhì)、鎮(zhèn)靜劑、激素、麻醉劑、消炎藥、抗氧化劑、抗組胺藥、維生素、礦物質(zhì)和其他本領(lǐng)域已知的生理學(xué)上活性的物質(zhì)。
28.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述氣流在干燥室內(nèi)。
29.一種形成細(xì)小干粉顆粒的裝置，其特征在于，該裝置主要包括(a)一個(gè)裝有物質(zhì)在第一種非氣相超臨界或近臨界的流體的增壓室；(b)一個(gè)裝有第二種非氣相流體中的溶液或懸浮液的室；(c)用于混合所述溶液或懸浮液與第一種流體的混合室，該室與所述第一室和第二室通過(guò)管道連接；(d)第一個(gè)流量控制裝置，與第一室和混合室之間的管道連接，用于使所述第一種流體流入所述混合室；(e)第二個(gè)流量控制裝置，與第二室和混合室之間的管道連接，用于使所述第二種流體流入所述混合室；(f)與所述混合室連接的節(jié)流器，用于將組合物引出混合室，進(jìn)入壓力低于超臨界或近臨界流體壓力的迅速膨脹區(qū)域，在該區(qū)域中形成了所述物質(zhì)細(xì)小顆粒的分散體；(g)與節(jié)流器連接的干燥室；(h)與干燥室在一個(gè)或多個(gè)入口連接的氣體源；(i)在顆粒通過(guò)干燥室后的收集顆粒的裝置。
30.如權(quán)利要求29所述的裝置，其特征在于，所述混合室是死體積小的室。
31.如權(quán)利要求29所述的裝置，其特征在于，所述第一種流體是超臨界二氧化碳。
32.如權(quán)利要求29所述的裝置，其特征在于，所述第一種流體是近臨界的流體。
33.如權(quán)利要求29所述的裝置，其特征在于，所述第二種液體是水。
34.如權(quán)利要求29所述的裝置，其特征在于，所述物質(zhì)是生理學(xué)活性組合物，該組合物選自表面活性劑、胰島素、氨基酸、酶、止痛藥、抗癌劑、抗微生物劑、病毒、抗病毒劑、抗真菌藥物、抗生素、核苷酸、DNA、反義cDNA、RNA、肽、蛋白質(zhì)、免疫抑制劑、溶血栓劑、抗凝血?jiǎng)?、中樞神?jīng)系統(tǒng)刺激劑、減充血?jiǎng)?、利尿性血管擴(kuò)張劑、精神病治療劑、神經(jīng)遞質(zhì)、鎮(zhèn)靜劑、激素、麻醉劑、消炎藥、抗氧化劑、抗組胺藥、維生素、礦物質(zhì)和其他本領(lǐng)域已知的生理學(xué)上活性的物質(zhì)。
35.權(quán)利要求1的方法形成的細(xì)小干顆粒。
36.一種藥物活性的物質(zhì)的顆粒，它具有至少90％的該物質(zhì)的原來(lái)藥物活性，具有約0.1-10微米的粒徑，約0.1％-10％的水含量，約0.1-1.5克/立方厘米的表觀密度。
37.如權(quán)利要求36所述的顆粒，其特征在于，所述顆粒還含有一種或多種選自賦形劑、穩(wěn)定劑、填充劑和表面活性劑的成分，它們按干粉末重量計(jì)的濃度約為0.001％-75％。
38.如權(quán)利要求36所述的顆粒，其特征在于，所述物質(zhì)是生理學(xué)活性組合物，該組合物選自表面活性劑、胰島素、氨基酸、酶、止痛藥、抗癌劑、抗微生物劑、病毒、抗病毒劑、抗真菌藥物、抗生素、核苷酸、DNA、反義cDNA、RNA、肽、蛋白質(zhì)、免疫抑制劑、溶血栓劑、抗凝血?jiǎng)?、中樞神?jīng)系統(tǒng)刺激劑、減充血?jiǎng)?、利尿性血管擴(kuò)張劑、精神病治療劑、神經(jīng)遞質(zhì)、鎮(zhèn)靜劑、激素、麻醉劑、消炎藥、抗氧化劑、抗組胺藥、維生素、礦物質(zhì)和其他本領(lǐng)域已知的生理學(xué)上活性的物質(zhì)。
39.具有約0.1-10微米粒徑，表面厚度約為粒徑1/10-1/10,000的空心顆粒。
40.如權(quán)利要求39所述的顆粒，其特征在于，所述物質(zhì)是生理學(xué)活性組合物，該組合物選自表面活性劑、胰島素、氨基酸、酶、止痛藥、抗癌劑、抗微生物劑、病毒、抗病毒劑、抗真菌藥物、抗生素、核苷酸、DNA、反義cDNA、RNA、肽、蛋白質(zhì)、免疫抑制劑、溶血栓劑、抗凝血?jiǎng)⒅袠猩窠?jīng)系統(tǒng)刺激劑、減充血?jiǎng)⒗蛐匝軘U(kuò)張劑、精神病治療劑、神經(jīng)遞質(zhì)、鎮(zhèn)靜劑、激素、麻醉劑、消炎藥、抗氧化劑、抗組胺藥、維生素、礦物質(zhì)和其他本領(lǐng)域已知的生理學(xué)上活性的物質(zhì)。
41.一種多通道流式/減壓節(jié)流器，用于從組合物形成一種物質(zhì)的顆粒，該組合物含有超臨界或近臨界的流體、物質(zhì)和可能還有的水相或有機(jī)相溶劑或這些溶劑組合，其特征在于，該節(jié)流器包括(a)引入組合物的入口端；(b)具有多個(gè)開(kāi)口的出口端；和(c)獨(dú)立的基本平行的許多非同心通道。
42.如權(quán)利要求41所述的多通道節(jié)流器，其特征在于，所述出口呈錐形。
43.如權(quán)利要求41所述的多通道節(jié)流器，其特征在于，所述通道由內(nèi)徑約40-50微米的蜂窩狀陶瓷通道構(gòu)成。
44.如權(quán)利要求41所述的多通道節(jié)流器，其特征在于，所述節(jié)流器與混合三通用環(huán)氧樹(shù)脂粘合。
45.一種制造權(quán)利要求42所述的多通道節(jié)流器的方法，其特征在于，該方法包括對(duì)出口端進(jìn)行機(jī)械或化學(xué)成形。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，機(jī)械成形是用一種磨具對(duì)出口端施加沖擊壓力。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，化學(xué)成形是用酸蝕刻出口端。
48.一種制備在重新水合后活性比未干燥的LDH水溶液有改善的LDH細(xì)小的干顆粒的方法，其特征在于，該方法包括(a)形成一種組合物，它含有1毫克/毫升以下的LDH、5％重量以上的糖、0.5％重量以下的表面活性劑、水、緩沖劑和超臨界或近臨界的流體，所示百分?jǐn)?shù)是在干燥前水溶液中存在的百分?jǐn)?shù)。(b)迅速降低所述組合物上的壓力，形成液滴；(c)使所述液滴通過(guò)加熱到約70℃的氣流。
49.一種制備在重新水合后生物學(xué)活性比未干燥的LDH水溶液有改善的LDH細(xì)小干燥顆粒的方法，其特征在于，該方法包括(a)形成一種組合物，它含有1毫克/毫升以下的LDH、5％重量以上的糖、0.5％重量以下的表面活性劑、水、緩沖劑和超臨界或近臨界的流體，所述百分?jǐn)?shù)是在干燥前水溶液中存在的百分?jǐn)?shù)。(b)迅速降低所述組合物上的壓力，形成液滴；(c)將所述液滴通過(guò)氣流。
50.一種迅速膨脹組合物的裝置，它包括(a)所述組合物通過(guò)其中的死體積小的三通；(b)具有一條以上基本平行的非同心通道的節(jié)流器，所述節(jié)流器連接于所述三通。
全文摘要
提供了一種制備物質(zhì)細(xì)小干顆粒的方法,包括形成含有感興趣的物質(zhì)和超臨界或近臨界流體的組合物;迅速降低所述組合物上的壓力,形成液滴;讓所述液滴通過(guò)加熱的氣流。該過(guò)程不需用有機(jī)溶劑。
文檔編號(hào)A61K9/00GK1368875SQ00811293
公開(kāi)日2002年9月11日 申請(qǐng)日期2000年6月9日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月9日
發(fā)明者羅伯特·E·希弗斯, S·P·塞勒斯, J·F·卡彭特 申請(qǐng)人:羅伯特·E·希弗斯