專利名稱：作為腫瘤相關(guān)抗原的伸展1型鏈鞘糖脂的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及新型人腫瘤相關(guān)抗原。本發(fā)明尤其涉及伸展1型鏈鞘糖脂及其用途，例如，作為免疫原和腫瘤標(biāo)記物。
背景技術(shù)：
盡管已投入巨大的財力和人力資源，腫瘤仍然是主要死亡原因之一。當(dāng)前的腫瘤治療，只能治愈50％左右發(fā)展成惡性腫瘤的患者。在大部分惡性腫瘤中，轉(zhuǎn)移是主要致死原因。
轉(zhuǎn)移是繼發(fā)性瘤集落在遠(yuǎn)距離部位的形成。在大多數(shù)人惡性腫瘤中，遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移通常太小以至于在治療原發(fā)瘤時很難被發(fā)現(xiàn)。而且，轉(zhuǎn)移性集落的蔓延性發(fā)端，通常在轉(zhuǎn)移性疾病臨床癥狀明顯以前發(fā)生。次生瘤的大小、壽命、其散布的解剖學(xué)位置及其異質(zhì)性組成都是妨礙手術(shù)切除和限制抗癌藥物遞送至轉(zhuǎn)移性集落處的濃度的因素。因此，要提高當(dāng)前腫瘤治療的有效性，需要在腫瘤細(xì)胞從原發(fā)位置傳播前檢測出惡性腫瘤。
已觀察到異常糖基化作用是大多數(shù)類型腫瘤的普遍特征。用于人腫瘤診斷的大多數(shù)糖抗原帶有聚乳糖胺(polylactosamine)結(jié)構(gòu)，即其包含Galβ1→3/4GlcNAc。聚乳糖胺通常根據(jù)其聚乳糖胺單元結(jié)構(gòu)分為兩類。具有Galβ1→3GlcNAc結(jié)構(gòu)的聚乳糖胺稱為1型鏈，具有Galβ1→4GlcNAc結(jié)構(gòu)的聚乳糖胺為2型鏈。在大多數(shù)癌中發(fā)現(xiàn)的最常見的腫瘤相關(guān)抗原具有乳系(lacto-series)2型鏈結(jié)構(gòu)，通常被唾液酸化和/或巖藻糖基化。正常細(xì)胞和組織中富含1型鏈抗原，其也是癌相關(guān)抗原。例如2→3唾液酸化的Lea抗原(N19-9抗體確定的CA19-9抗原)就是一種癌相關(guān)的1型鏈抗原。然而，基于檢測這些已知抗原的癌診斷方法受到假陽性率高和/或假陰性率高的阻礙。
鑒于當(dāng)前癌診斷方法存在的困難，本領(lǐng)域需要對組合物和方法加以改進(jìn)。本發(fā)明滿足了這一需要，并進(jìn)一步提供了其它相關(guān)優(yōu)勢。
發(fā)明概述簡而言之，本發(fā)明提供了分離的化合物及通過檢測這些化合物來篩選腫瘤的方法。一方面，本發(fā)明提供了一種分離的化合物，有或沒有巖藻糖基和/或唾液酸殘基，具有通式Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→3GlcNAcβ1→(3Galβ1→3GlcNAcβ1→)n3Galβ1→4Glcβ1→1Cer其中n為0或1或以上的整數(shù)，至少有兩個巖藻糖基和/或一個或多個唾液酸殘基，Gal代表半乳糖，Glc代表葡萄糖，GlcNAc代表N-乙酰葡糖胺，Cer代表神經(jīng)酰胺，其中所述的至少兩個巖藻糖殘基以α1→4鍵與GlcNAc殘基連接，和/或以α1→2鍵與末端的Gal殘基連接，所述的一個或多個唾液酸殘基以α2→3鍵與末端的Gal殘基連接，和/或以α2→6鍵與一個或多個亞末端的GlcNAc殘基連接。
另一方面，本發(fā)明提供具有下列通式的上述化合物 其中Fuc代表巖藻糖，NeuAc代表N-乙酰神經(jīng)氨酸。
另一方面，本發(fā)明提供第一次描述的具有下列通式的化合物 其中Fuc代表巖藻糖，NeuAc代表N-乙酰神經(jīng)氨酸。
另一方面，本發(fā)明提供第一次描述的具有下列通式的化合物 其中Fuc代表巖藻糖，NeuAc代表N-乙酰神經(jīng)氨酸。
另一實施方案中，本發(fā)明還提供具有下列通式的分離的化合物 再一方面，本發(fā)明還提供包含具有下列通式的表位分離的化合物 在其它方面，本發(fā)明中任何化合物都可用作制備多克隆或單克隆抗體的免疫原。
本發(fā)明另外還提供了腫瘤篩選的方法。這些方法包括(a)自溫血動物分離生物標(biāo)本；和(b)測定樣品中化合物的存在或量。
附圖簡述

圖1為伸展的唾液酸Lea的1H-NMR(核磁共振)光譜，化學(xué)位移從4.20ppm到5.60ppm，包括糖I(Glc)、II(Gal)、III(GlcNAc)、IV(Gal)、V(GlcNAc)和VI(半乳糖和標(biāo)作FIII的與III GlcNAc連接的巖藻糖和標(biāo)作FIV的與V GlcNAc連接的巖藻糖)。在此光譜中，所有Fv和FIII異質(zhì)子光譜用Fy-1和FIII-1標(biāo)記。另外，巖藻糖的C5質(zhì)子光譜用FIII-5和Fv-5標(biāo)記的多偶合標(biāo)記。標(biāo)記為Cis的光譜是指鞘氨醇的Cis雙鍵，用R-5和R-4代表鞘氨醇光譜。
發(fā)明詳述本發(fā)明一般涉及與癌檢測相關(guān)的化合物與方法。更具體而言，本發(fā)明內(nèi)容顯示，癌組織中存在伸展形式的乳系1型鏈。
如上所述，已知正常細(xì)胞和組織中富含乳糖胺I型鏈(Galβ1→3GlcNAc)。雖然已檢測到具有伸展2型鏈(即Galβ1→4GlcNAc核心結(jié)構(gòu)的重復(fù)的)的聚乳糖胺抗原，但還未檢測到具有伸展1型鏈的聚乳糖胺抗原。因此一般認(rèn)為乳系1型鏈不存在伸展形式。
如本發(fā)明所公開的，伸展形式的乳系I型鏈(即Galβ1→3GlcNAcβ1→[3Galβ1→3GlcNAcβ→]n3Galβ1→R，有或沒有唾液酸和/或巖藻糖殘基)存在于腫瘤組織中。通過將糖脂組分(從腫瘤細(xì)胞中提取)過制備柱和薄層層析，分離到兩個代表性的伸展形式乳系1型鏈。
從結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Colo205的單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂(monosialylganglioside)組分中純化出同質(zhì)性的慢遷移唾液酸化-Lewis(sLea)活性鞘糖脂(GSL)。該化合物通過HPLC(高效液相層析)和在兩種不同溶劑中的制備性HPTLC(高效薄層層析)得以純化，用a-sLea單克隆抗體(MAb)NKH-1經(jīng)TLC免疫染色強(qiáng)染色。弱酸水解(1％乙酸，100℃ 1小時)產(chǎn)生與二聚Lea標(biāo)準(zhǔn)GSL共遷移，且α-二聚LeaMAb ST-421可使其強(qiáng)染色快遷移組分。通過1H-NMR光譜證實其結(jié)構(gòu)為唾液酸-二聚Lea(見以下結(jié)構(gòu))。 除上述的特殊糖脂外，Lea-Lea和Leb-Lea表位與可能以含有附加的[3Galβ1→3GlcNAcβ1→]n單元的伸展1型鏈存在。此外，Lea-Lea和Leb-Lea表位可能由糖蛋白如高分子量粘蛋白樣血清糖蛋白所攜帶。
考慮到此處提供的教導(dǎo)，其它伸展形式的乳系1型鏈化合物可從生物原料如腫瘤組織中分離，或在結(jié)構(gòu)鑒定后化學(xué)(和/或酶催化)合成，這對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。簡要地，與脂類或蛋白質(zhì)結(jié)合的糖的結(jié)構(gòu)可基于降解、質(zhì)譜分析，包括電子碰撞直接探針(electron-impact direct-probe)(EI)和快速原子轟擊(FAB)、甲基化分析(如下所述的方法和，例如Nudelman等人，J.Biol.Chem.2615487-5495，1986)進(jìn)行測定。降解分析可通過化學(xué)和/或酶催化完成，如通過糖苷酶降解。降解分析顯示的糖序列可通過甲基化分析(例如Hakomori，J.Biochem. 55205-208，1964)、再以過甲基化(permethylated)糖的化學(xué)電離質(zhì)譜分析(例如Stellner等人，Arch.Biochem.Biophys.155464-472，1974；Levery等人，Meth.Enzymol.13813-25，1987)來確定。或者，聯(lián)合使用這些方法，對過甲基化聚糖或適當(dāng)降解后的完整聚糖進(jìn)行EI質(zhì)譜分析(例如，kannagi等人，J.Biol.Chem.2598444-8451，1984；Nudelman等人，J.Biol.Chem.26313942-13951，1988)。糖序列的同質(zhì)性可根據(jù)多種化學(xué)和物理標(biāo)準(zhǔn)闡明，包括完整的或甲基化聚糖的質(zhì)子NMR及FAB質(zhì)譜分析。一旦確定了糖的結(jié)構(gòu)，可通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的技術(shù)合成糖或其衍生物或其非糖類功能等價物。
本發(fā)明的化合物可用作制備多克隆和單克隆抗體(MAb)的免疫原。多克隆抗體可按標(biāo)準(zhǔn)方法制備。例如簡言之，多克隆抗體可通過用本發(fā)明中的化合物免疫動物、然后采集其血清來制備。通常優(yōu)選在采集血清之前，在首次免疫后，再進(jìn)行一次或多次的加強(qiáng)免疫。MAb通?？刹捎肒ohler和Milstein的方法(Nature256495-497，1975；Eur.J.Immunol.6511-519，1976)制備。簡言之，取自經(jīng)本發(fā)明中化合物免疫的動物的淋巴結(jié)和/或脾，與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交細(xì)胞系(″雜交瘤″或″克隆″)。每一雜交瘤分泌單一的免疫球蛋白，并且象骨髓瘤細(xì)胞一樣，具有無限分裂的潛能。代替雜交瘤制備單克隆抗體的另一方法是用噬菌體和細(xì)菌建立MAb的表達(dá)文庫(例如Sastry等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865728，1989；Huse等人，Science 2461275，1989)?？梢杂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的多種方法來篩選具有目的特異性的抗體。
為了增強(qiáng)它們的免疫原性，可能想要將本發(fā)明中的化合物與載體聯(lián)合使用。適當(dāng)?shù)妮d體包括滅活的細(xì)菌、匙孔血藍(lán)蛋白、甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白和它們的衍生物。例如所有或部分的GSL Lea-Lea或Leb-Lea的糖殘基可與載體聯(lián)合。本發(fā)明中的化合物可通過多種方法與載體聯(lián)合，包括吸附和共價連接。
使用本發(fā)明中化合物作為免疫原的典型實例是用Leb/Lea抗原免疫小鼠。簡言之，從Colo205細(xì)胞中分離的Leb/Lea與酸處理的明尼蘇打沙門氏菌(Salmonella minnesotae)懸浮液聯(lián)合，經(jīng)尾靜脈注射給BALB/c小鼠，間隔10天重復(fù)注射三次。最后一次注射后，采集免疫小鼠的脾細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞融合。建立雜交瘤IMH2(顯示對免疫原的選擇性反應(yīng)性)，并保藏在ATCC(American Type CultureCollection，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia20110 USA)，為ATCC NO.HB 11026。該雜交瘤產(chǎn)生具有IgG3同種型的MAb 1MH2。
用于檢測伸展形式的1型鏈抗原如Lea-Lea和/或Leb-Lea抗原的方法可用來篩選腫瘤。例如GSL Leb-Lea和GSL Lea-Lea，可分別用從多種腫瘤樣本制備的中性糖脂組分中的Mab 1MH2和Mab ST-421(根據(jù)Watanabe等人，Jpn.J.Cancer Res(Gann)7643-52，1985建立)進(jìn)行TLC免疫染色來檢測。這些樣本包括來自結(jié)腸癌、乳腺癌、何杰金氏病(Hodgkin’s disease)、膽囊癌和胚胎性橫紋肌肉瘤的組織。例如，GSL Lea-Lea在來自脾、肝、腎、胎盤和肺正常組織的糖脂組分中檢測不到。考慮到此處提供的教導(dǎo)，可采用本發(fā)明方法中的多種方法檢測腫瘤相關(guān)的伸展1型抗原(包括利用特異針對腫瘤相關(guān)伸展1型抗原的結(jié)合配偶體；例如GSL Lea-Lea和Leb-Lea)，這對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。例如，可按上述方法制備Lea-Lea或Leb-Lea表位的特異性抗體，在一定條件下令抗體與生物樣本接觸(例如溫育)，并持續(xù)一段時間，足以使免疫復(fù)合物形成后，測定免疫復(fù)合物的存在。
可通過多種已知方法檢測上述抗原和該抗原特異性抗體之間形成的免疫復(fù)合物的存在，例如放射免疫測定(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。適當(dāng)?shù)拿庖邷y定包括David等人(美國專利4,376,110)的雙單克隆抗體夾心免疫測定方法；單克隆-多克隆抗體夾心試驗(Wide等人，in Kirkham and Hunter，eds.，Radioimmunoassay Methods E.and S.Livingstone，Edinburgh，1970)；Gordon等人(美國專利4,452,901)的“western印跡”法；標(biāo)記配基的免疫沉淀法(Brown等人，J.Biol.Chem.2554980-4983，1980)；如Raines和Ross(J.Biol.Chem.2575154-5160，1982)描述的酶聯(lián)免疫吸附測定；免疫組化方法，包括使用熒光染料(Brooks等人，Clin.Exp.Immunol.39477，1980)；及活性抑制(Bowen-Pope等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 812396-2400，1984)。除上述免疫測定外，也可采用許多其它免疫測定方法，包括美國專利3,817,827；3,850,752；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876所描述的。
根據(jù)檢測目的，抗體可以標(biāo)記也可以不標(biāo)記。不標(biāo)記時，抗體可用于凝集試驗。此外，未標(biāo)記抗體也可同能與免疫復(fù)合物反應(yīng)的標(biāo)記分子聯(lián)合使用，或者同能與直接針對化合物的抗體反應(yīng)的標(biāo)記抗體(第二抗體)(如免疫球蛋白特異性抗體)聯(lián)合使用?；蛘?，可以直接標(biāo)記抗體。標(biāo)記時的報告基團(tuán)可包括放射性同位素、熒光團(tuán)、酶、發(fā)光物(luminescers)或染料顆粒。這些及其它標(biāo)記都是本領(lǐng)域眾所周知的，并描述于例如在下列美國專利3,766,162；3,791,932；3,817,837；3,996,345；和4,233,402中。
在免疫復(fù)合物檢測的一個優(yōu)選實施方案中，報告基團(tuán)與抗體結(jié)合。檢測免疫復(fù)合物的步驟包括基本上除去任何未結(jié)合的抗體，然后檢測報告基團(tuán)的存在。未結(jié)合抗體指那些沒有與抗原結(jié)合的抗體。
在另一個優(yōu)選實施方案中，報告基團(tuán)同能結(jié)合抗原特異性抗體的第二抗體結(jié)合。免疫復(fù)合物的檢測步驟包括(a)基本上除去任何未結(jié)合的抗體(即不與抗原結(jié)合的抗體)，(b)加入第二抗體，(C)基本上除去任何未結(jié)合的第二抗體，然后(d)檢測報告基團(tuán)的存在。例如，當(dāng)抗原特異性抗體來自小鼠時，第二抗體為抗-鼠抗體。
在免疫復(fù)合物檢測的第三個優(yōu)選實施方案中，報告基團(tuán)同能與免疫復(fù)合物結(jié)合的分子相結(jié)合。檢測步驟包括(a)加入該分子，(b)基本上除去任何未結(jié)合分子，然后(C)檢測報告基團(tuán)的存在。能與免疫復(fù)合物結(jié)合的分子實例是蛋白質(zhì)A。
采用標(biāo)記抗原的免疫測定可代替通常的標(biāo)記抗體、標(biāo)記的第二抗體或標(biāo)記的與免疫復(fù)合物反應(yīng)的分子的使用。此類測定(″間接″或″競爭性″)中，樣品內(nèi)的抗原將與標(biāo)記的抗原競爭該抗體。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯然在本發(fā)明中可以采用多種檢測免疫復(fù)合物方法。適用于任一方法的報告基團(tuán)包括，放射性同位素、熒光團(tuán)、酶、發(fā)光物和染料顆粒。此外，應(yīng)意識到可使用本發(fā)明中腫瘤相關(guān)的伸展1型抗原的特異性結(jié)合配體(而不是抗體)來檢測該抗原，以及可通過類似上述免疫復(fù)合物的檢測方法來檢測該結(jié)合配體與抗原間形成的復(fù)合物。
提供以下實施例是為了說明而絕不構(gòu)成限制。
實施例實施例1 用從腫瘤和正常組織制備的中性糖脂的單克隆抗體NCC-ST-421進(jìn)行HPTLC免疫染色與免疫測定A.單克隆抗體與免疫測定Mab ST-421如前所述建立(watanabe等人，Jpn.J.CancerRes.(Gann)7643-52，1985)。識別1型鏈N-乙酰乳糖胺(Galβ1→3GlcNAcβ1→R)的MAb MNH-1，在發(fā)明人的實驗室制備；識別2型鏈N-乙酰乳糖胺(Galβ1→4GlcNAcβ1→R)的MAb 1B2，按以前所述建立(Young等人，J.Biol.Chem.25610967-10972，1981)?？?LeaMAb獲自Chembiomed Ltd(Edmonton，Alberta，Canada)?？?LeyMAb AH6按以前描述建立(Abe等人，J.Biol.Chem.258，11793-11797，1983)，不表現(xiàn)與Leb的任何交叉反應(yīng)性?？?LebMAb購自Chembiomed Ltd.(Edmonton，Alberta，Canada)，表現(xiàn)與1型H鏈的交叉反應(yīng)性。另一抗-LebMAb購自Monocarb(Lund，Sweden)，表現(xiàn)與Leb、1型H鏈和Ley的交叉反應(yīng)性。通過最初由Magnani等人(Magnani等人，Anal.Biochem.109399-402、1980)所描述方法的改進(jìn)方法(Kannagi等人，J.Biol.Chem.，2574438-4442，1982；Kannagi等人，J.Biol.Chem.25714865-14874，1982)，采用Whatman HPTLC板(HP-KF)進(jìn)行HPTLC免疫染色。
B.糖脂制劑所用糖脂樣品為分離的或由酶催化合成。VI3NeuAcnLc6、IV3NeuAcIII4FucLc4、VI2FucnLc6和IV2FucLc4分別從人胎盤、肝腺癌、人O型紅細(xì)胞和豬腸中分離，用IHW(55∶25∶20)抽提后，再進(jìn)行Folch分配、DEAE-Sephadex層析和Iatrobeads 6RS 8010柱的HPTLC(Magnani等人，J.Biol.Chem.25714365-14369，1982；Watanabe等人，J.Biol.Chem.2548223-8229，1979；Hakomori等人，J.Immunol.9831-38，1967；Stellner等人，Biochemistry 12656-661，1973)。nLc6和III4FucLc4通過在1％乙酸中加熱樣品100℃ 1小時而分別使VI3NeuAcnLc6和IV3NeuAcIII4FucLc4去唾液酸化制備。IV3GlcNAcnLc4、IV3Galβ1→3-GlcNAcnLc4、 IV3Galβ1→3[Fucl→4]GlcNAcnLc4和IV3Galβ1→3[Fucl→4]GlcNAcIII3FucnLc4(Lea-Lex)均通過酶促合成制備。IV3Galβ1→3GlcNAcIII3FucnLc4通過用巖藻糖苷酶處理IV3Galβ1→3[Fucl→4]GlcNAcIII3FucnLc4，即100μg糖脂與含0.05單位的牛腎a-L-巖藻糖苷酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)的0.2M檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.5)于37℃溫育2小時來制備。IV2III4Fuc2Lc4、V3III3Fuc2nLc6和VI2V3Fuc2nLc6采用生物合成制備，方法是以IV2FucLc4、nLc6和VI2FucnLc6為底物，用來自Colo205的a1→3/4巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(分別)使其a1→3巖藻糖化。通過在二倍體積的50 mMHepes緩沖液(pH 7.0)、0.5M蔗糖、1mM EDTA和1％Triton CF-54在Potter Elvehjem勻漿器中于4℃勻漿，從Colo2o5細(xì)胞中溶解得到a1→3/4巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。勻漿物以100,000xg離心1小時，上清液經(jīng)透析后濃縮至細(xì)胞原始體積。酶制劑于-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 酶促a1→3/4巖藻糖基化在總體積為1ml的含1mg鞘糖脂(GSL)底物、1mg脫氧牛磺膽酸、10μmol MnCl2、25μmol Hepes緩沖液(pH7.0)、5μmolCDP-膽堿、6μmol GDP-巖藻糖和500μl酶制劑的反應(yīng)混合物中進(jìn)行。該反應(yīng)混合物于37℃溫育16小時，然后凍干，用異丙醇-己烷-水(IHW)(55∶25∶20)超聲抽提，離心。上清液經(jīng)Iatrobeads 6RS-8010柱HPLC，用從55∶40∶5到55∶25∶20的IHW梯度洗脫200分鐘。按2毫升收集組分，根據(jù)在50∶40∶10的氯仿-甲醇-水中的HPTLC遷移，合并含有終產(chǎn)物的收集管。用苔黑酚噴劑顯色GSL帶。
具有確定結(jié)構(gòu)的各種GSL的特征在于可與特異性MAb的反應(yīng)性，即Leb/Lea抗原與抗-LebMAb反應(yīng)而不與抗-LeyMAb AH6反應(yīng)；Ley/Lex與AH6反應(yīng)而不與抗-Leb或抗-LexMAb反應(yīng)；Lea/Lea和Lea/Lex與抗-LeaMAb和MAb ST-421反應(yīng)。
C.TLC免疫染色從多種腫瘤樣本制備的中性糖脂組分的TLC免疫染色顯示存在比-Lea-活性神經(jīng)酰胺五糖遷移慢、而與抗-LeaMAb交叉反應(yīng)的陽性帶。該帶可被MAb NCC-ST-421強(qiáng)染色，且見于迄今檢驗過的大多數(shù)腫瘤中。實例來自結(jié)腸癌、乳腺癌、何杰金氏病、膽囊癌和胚胎性橫紋肌肉瘤。
實施例2，二聚化Lea抗原和Leb-Lea抗原的分離A.腫瘤組織的制備Colo205細(xì)胞(ATCC)(semple等人，Cancer Res.381345-1355，1978)在含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。收集細(xì)胞，約每7天傳代一次。收集的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，離心，用磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.4)洗兩次，用細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)。經(jīng)皮下給6只無胸(裸)小鼠每只注射4×106細(xì)胞。2周后切除腫瘤(每個大約2ml)并保存于-80℃?zhèn)溆谩?br> B.從Colo205腫瘤中分離慢遷移Lea-活性組分(二聚化Lea)約200g腫瘤使用異丙醇-己烷-水(IHW)(55∶25∶20)抽提，再進(jìn)行Folch分配、DEAE-sephadex層析和在Iatrobeads 6RS-8010柱上進(jìn)行HPLC。以從55∶40∶5到55∶25∶20的IHW梯度洗脫上層相中性組分200分鐘。按2毫升收集組分，根據(jù)在氯仿-甲醇-水(50∶40∶10)中的HPTLC遷移來合并組分。慢遷移Lea-活性組分(通過TLC免疫染色顯示)進(jìn)一步通過在Merck HPTLC板(Silica Gel 60，Merck，Darmstadt，Germany)上的制備性TLC來純化，并用于結(jié)構(gòu)的性質(zhì)鑒定。
C.Leb-Lea抗原的分離遷移正好在二聚化Lea抗原之下的陽性帶(根據(jù)實施例1用MAbNCC-ST-421免疫染色)用上面B部分描述的方法純化。
實施例3二聚化Lea抗原和Leb-Lea抗原的性質(zhì)鑒定A.酶促降解依次用0.5單位的a-巖藻糖苷酶(牛腎)、0.5單位β-半乳糖苷酶(刀豆)和0.5單位β-N-乙酰葡萄糖胺酶(牛附睪)(SigmaChemical Co.，St.Louis，Mo)水解進(jìn)行1mg的二聚化Lea的酶促降解。所有反應(yīng)均在0.2M檸檬酸鈉(pH 4.5)中進(jìn)行，37℃震蕩水浴4小時。用制備性HPTLC純化每種降解產(chǎn)物。
B.IMH2的體外細(xì)胞毒性1.細(xì)胞系Colo205最初從美國典型培養(yǎng)物中心(American Type CultnreCollection)(ATCC)獲得，在補(bǔ)充有10％胎牛血清、mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和10μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。人表皮樣癌A431細(xì)胞系(Macleod等人，J.Cell.Physiol.127175-182，1986)最初由Dr.Carol MacLeod(GildredCancer Facility，UCSD School of Medicine，San Diego，CA)贈送。此細(xì)胞系表達(dá)表皮生長因子受體上的Lea、Leb、Lex、Ley和ALeb(Gooi.等人，Biosci.Reports 583-94，1985)。A431細(xì)胞在補(bǔ)充有5％胎牛血清、1mM谷氨酰胺、110mg/l丙酮酸鈉、100IU/ml青霉素和l0μg/ml鏈霉素的Dulbecco’s modified Eagle’smedium(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)中培養(yǎng)。接種細(xì)胞(約5×105/ml)，長滿后收集，先用EDTA處理，再用含Ca2+和Mg2+的PBS洗滌。這些細(xì)胞用作體外細(xì)胞毒性測定的靶細(xì)胞，或用于皮下接種5×106細(xì)胞于裸鼠來測定致瘤性。人紅白血病K562細(xì)胞(Lozzio等人；Blood 45321-334，1975)用作測定體系中淋巴細(xì)胞自然殺傷(NK)活性的對照。
2.抗體-依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體-依賴的細(xì)胞毒性(CDC)用于ADCC測定的人外周血白細(xì)胞(HPBL)(用作效應(yīng)細(xì)胞)從健康志愿供者血液的白細(xì)胞(buffy coat)組分中獲得。簡言之，用Ficoll-Hypaque梯度溶液，以2000rpm離心20分鐘，分離單核細(xì)胞(Mishell等人，in Mishell，B.B and Shiigi，S.M.(eds.)，Selected Methods in Cellular Immunology，pp.3-27，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，CA，1980)。小鼠脾細(xì)胞和小鼠腹膜巨噬細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)按Mishell等人以前的描述制備，但做如下一些修改。靶細(xì)胞(5×106)通過與100μl的51Cr于37C溫育90分鐘進(jìn)行標(biāo)記。洗滌(3x)并溫育(37℃，1小時)后，細(xì)胞(1×106/ml)懸浮于補(bǔ)充有25mM HEPES緩沖液和3％牛血清白蛋白的RPMI-1640中。20μl的標(biāo)記細(xì)胞、100μl的IMH2或ST-421，和100μl的效應(yīng)細(xì)胞懸浮液在U型底的微量滴定板(Corning，NY)中混合。用非特異性小鼠免疫球蛋白(Sigma，St.Louis，MO)作陰性對照。溫育4小時后，用裝有懸掛平板固定器(hanging plate-holder)的離心機(jī)中離心滴定板(500xg，2分鐘)，每孔中取100μl上清液，用γ計數(shù)器測量放射性。每實驗組測定三次。根據(jù)公式([A-B]×100)/C計算特異性裂解百分?jǐn)?shù)，其中A＝裂解實驗細(xì)胞的cpm，B＝未裂解靶細(xì)胞的cpm；C＝全部靶細(xì)胞的cpm。自發(fā)性釋放不超過最大能釋放的標(biāo)記放射活性的15％。
對于CDC，51Cr-釋放測定使用與ADCC相似的方法進(jìn)行，除了加入100μl稀釋的人血清代替效應(yīng)細(xì)胞作為補(bǔ)體來源。血清在56℃滅活30分鐘，用作對照。特異性裂解百分?jǐn)?shù)按如上所述方法計算。
因為Colo205細(xì)胞已經(jīng)鑒定為表達(dá)伸展1型鏈Lea/Lea和Leb/Lea抗原，其分別與MAb ST-421和MAb IMH2強(qiáng)反應(yīng)，所以評價了IMH2對Colo205的細(xì)胞毒效應(yīng)，并與ST-421的進(jìn)行了比較。兩個單克隆抗體對Colo205細(xì)胞均表現(xiàn)出顯著的ADCC殺傷。這種殺傷與效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例(E∶T)及單克隆抗體的濃度有關(guān)。細(xì)胞毒效應(yīng)在E∶T比例為100∶1-200∶1，單克隆抗體濃度為35-70μg/ml時最大。無論E∶T比例或單克隆抗體濃度如何，對照小鼠IgG和其他非特異性單克隆抗體都沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒效應(yīng)。用小鼠脾細(xì)胞施行同樣的細(xì)胞毒性試驗時，相應(yīng)的值僅為7％和17％裂解(E∶T比例200∶1，單克隆抗體濃度30μg/ml)。單克隆抗體對A431細(xì)胞表現(xiàn)出弱細(xì)胞毒效應(yīng)(表)。表中比較了Colo205、A431和K562細(xì)胞的IMH2-依賴的最大裂解。高裂解值(例如，IMH2和ST-421對Colo205分別為65％和94％的裂解)只在HPBL存在時顯著；用小鼠脾細(xì)胞時，裂解值小得多，如以前用ST-421時所觀察到的那樣(Watanabe等人，Cancer Res.512199-2204，1991)。由IMH2和ST-421介導(dǎo)的CDC與補(bǔ)體濃度和所用單克隆抗體濃度近似地相關(guān)。
表MAb ST-421和IMH2對Colo205、A431和K562細(xì)胞的MAb-依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)裂解百分?jǐn)?shù)靶細(xì)胞 抗體/反應(yīng)性b效應(yīng)細(xì)胞+MAb+ 效應(yīng)細(xì)胞+MAb- 效應(yīng)細(xì)胞-MAb+Colo205ST-421+ 94.52.70.8IMH2+ 65.02.70.7A431 ST-421± 14.410.9 1.1IMH2± 7.6 9.20.6K562cST-421-48.236.2 0.5IMH2- 44.836.2 0.3a.在E∶T(效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞)比例為100∶1時IMH2(35μg/ml)和ST-421(100倍稀釋的腹水)的裂解百分?jǐn)?shù)。
b.用流式細(xì)胞木測定，+、陽性；±、弱陽性；-陰性。
c.在沒有MAb存在的情況下也可觀察到對K562細(xì)胞的高細(xì)胞毒素效應(yīng)，這被認(rèn)為是反映自然殺傷細(xì)胞活性。
C.體內(nèi)的腫瘤抑制用作體內(nèi)實驗的Colo205和A431細(xì)胞體外培養(yǎng)，用培養(yǎng)基洗滌二次，以PBS重新達(dá)到要求的細(xì)胞密度。細(xì)胞(5×106/100μl)皮下注射入5-到7-周齡的無胸腺BALB/c小鼠背部，注射后立即開始單克隆抗體腹腔給藥。純化的IMH2(1.1mg/ml)或在腹水中相應(yīng)IgG濃度(1.1-1.2ng/ml)的ST-421，每天以0.2ml/動物劑量腹腔注射一次，注射2周。由同一觀測者每周3次測量腫瘤的寬度和長度。腫瘤重量估計為(寬度2×長度)/2。對照動物接受由小鼠骨髓瘤細(xì)胞系NS1在BALB/c小鼠中產(chǎn)生的腹水蛋白。每次實驗每組用7只小鼠，實驗重復(fù)兩次。以兩次實驗的腫瘤重量的平均值繪圖。
MAb IMH2和ST-421都顯著抑制Colo205腫瘤在裸鼠中的生長。相反，兩種MAb抗體都表現(xiàn)出對A431腫瘤生長的最小抑制效應(yīng)。因此，識別抗原的高表達(dá)似乎對抗體-依賴的體內(nèi)腫瘤生長抑制的易感性是必需的。
D.IMH2與多種腫瘤和正常組織的反應(yīng)性多種腫瘤及鄰近正常組織取自用福爾馬林固定并用石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本。此外，從事故遇難者新鮮尸體剖檢獲得腦、胸腺、肺、肝、胃、結(jié)腸、腎、腎上腺、脾、胰、子宮(帶有子宮內(nèi)膜)和皮膚正常組織和一些腫瘤組織。手術(shù)和尸體剖檢標(biāo)本均為Department ofPathology，Swedish Medical Center，Seattle，WA，和Biomembrane Institute的Ms.Debbie Bennett惠供。樣本切片(3μM厚)，用zylene脫蠟，乙醇脫水，用第一MAb處理，然后用生物素化第二MAb和過氧化物酶綴合的抗生物素蛋白處理，用3′，3′-二氨基聯(lián)苯胺染色。用0.3％H2O2處理切片20分鐘以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。一些切片與小鼠IgG一起溫育作為陰性對照。生物素化羊抗鼠IgM、抗生物素蛋白和生物素購自Vectastain(Burlingame，CA)。
MAb IMH2與結(jié)腸、直腸、肝、胰和子宮內(nèi)膜腫瘤的反應(yīng)強(qiáng)且發(fā)生率高(表I)。相反，其不表現(xiàn)與包括隱窩區(qū)和杯形細(xì)胞在內(nèi)的末端結(jié)腸和直腸正常粘膜的反應(yīng)性。其與肺腺癌反應(yīng)而不與大或小細(xì)胞癌反應(yīng)。5例鱗細(xì)胞癌中的一例表現(xiàn)出強(qiáng)陽性反應(yīng)性。MAb IMH2不與正常腦、肺、脾、皮膚組織或包括粒細(xì)胞在內(nèi)各種血細(xì)胞反應(yīng)。
觀察到的具有強(qiáng)染色的正常組織位置如下胸腺小體和胸腺上皮性網(wǎng)狀細(xì)胞(胸腺細(xì)胞呈陰性)；粘膜上皮和胃粘膜分泌腺(固有層、漿膜和肌肉層呈陰性)；腎上腺髓質(zhì)和皮層。強(qiáng)度中等到弱陽性染色的正常組織位置為腎近端和遠(yuǎn)端卷曲的上皮細(xì)胞(其它部分呈陰性)；胰島(Langerhan’s islets)細(xì)胞(胰其它部分呈陰性)；盲腸粘膜；尿道上皮。在肝細(xì)胞中觀察到非常弱的染色(肝的其它部分、小葉下結(jié)締組織、中央靜脈、膽管和肝巨噬細(xì)胞(Kupffer’scell)呈陰性)。這些結(jié)果概括于表I。
表I.用MAb IMH2對正常組織和癌的免疫組織學(xué)染色。組織染色 位置/注釋正常腦 -肺 - 包括支氣管(broncheolar)上皮脾 -直腸- 包括隱窩區(qū)結(jié)腸- -11/12，±1/12盲腸+皮膚-粒細(xì)胞 -淋巴細(xì)胞-胰 + 胰島+，其余-肝 ± 肝細(xì)胞弱+/±，其余--胸腺++胸腺小體、上皮和網(wǎng)狀細(xì)胞++，胸腺細(xì)胞-胃 +++ 粘膜、腺細(xì)胞(見正文)腎 + 管狀上皮弱+(見正文)腎上腺 +++子宮/子宮內(nèi)膜 -/+ 子宮內(nèi)膜- 或 弱+；-9/15，±2/15，+4/15(總陽性率4/15＝27％)癌結(jié)腸/直腸 +/+++ ++++4，++6，+4，±1，-1(總陽性率14/16＝88％)肝(原發(fā))++2/3胰腺+++ 2/2肺腺癌 ++2/4鱗狀的 + 1/5大細(xì)胞 - 0/3小細(xì)胞 - 0/5子宮內(nèi)膜-/+++ +++4，++11，+6/24，±/-3(總陽性率21/24＝88％)E.IMH2與來自Lewis和分泌腺狀態(tài)已知患者的正常和惡性的結(jié)腸和膀胱組織的反應(yīng)性Leb和Ley決定簇的表達(dá)與個體分泌腺狀態(tài)有關(guān)(Sakamoto等人，Molec.Immun.211093-1098，1984； 等人，J.Urol.138171-176，1987)，而Lewis抗原在某些腫瘤中的表達(dá)與宿主Lewis狀態(tài)無關(guān)( 等人，Lab.Invest.58576-583、1988； 等人，Blood 771389-1396，1991)。因此，研究了MAb IMH2與來自Lewis和分泌腺狀態(tài)已知患者的正常和惡性的結(jié)腸和膀胱組織的反應(yīng)性。結(jié)果概括于表II和III。IMH2與直腸腫瘤而不與正常的直腸組織反應(yīng)，該反應(yīng)性與分泌腺狀態(tài)無關(guān)。相反，IMH2與正常盲腸反應(yīng)，而與所研究的單一盲腸腫瘤樣品反應(yīng)較弱。該結(jié)果表明IMH2表位在正常和惡性結(jié)腸組織中的表達(dá)趨勢與大家公認(rèn)的ABH抗原表達(dá)模式相似。真正的Lewis-陰性(Lea-b-)個體( 等人，Lab.invest.58576-583，1988)，在正常和惡性的結(jié)腸組織均表達(dá)IMH2表位(表II和III)。
IMH2表位在正常尿道上皮中表達(dá)，但在膀胱癌中其表達(dá)減弱至不同程度。似乎有非典型程度的相關(guān)性，即IMH2表位在高度侵襲性腫瘤中的表達(dá)量最低。這種趨勢也與ABH抗原在正常和惡性的膀胱組織的表達(dá)相似。但與結(jié)腸組織相反，IMH2表位在A型血個體膀胱組織中的表達(dá)與分泌腺狀態(tài)相關(guān)。真正的Lewis-陰性(Lea-b-)個體在正常的和惡性的膀胱組織中均表達(dá)IMH2表位。表II.用MAb IMH2對正常和惡性的結(jié)腸組織免疫組織學(xué)染色與宿主Lewis狀態(tài)的關(guān)系正常 惡性直腸 盲腸 直腸盲腸A Lea-b+0/5 1/1 3/4 1/1A Lea+b-0/4 ND 2/2 ND0 Lea-b+0/2 ND 2/3 ND0 Lea+b-0/2 ND 1/1 ND真正的Lea-b-0/1 1/1a1/1 0/1非真正的Lea-b-0/2 ND 1/1 0/1a非分泌腺數(shù)字表示陽性標(biāo)本除以調(diào)查標(biāo)本總數(shù)。ND＝未確定的。Lea-b-個體(真正的和非真正的)的表型狀態(tài)，通過唾液al→4巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性，及紅細(xì)胞與抗-Lea和抗-LebMAb的反應(yīng)性來確定。表型定義可參見Holmes等人，Arch.Biochem.Biophys.27414-25，1989，以及 等人，Lab.Invest.58576-583，1988。表III.用MAb IMH2對正常和惡性的膀胱組織免疫組織學(xué)染色與宿主Lewis狀態(tài)的關(guān)系。
膀胱癌正常 非侵襲性 侵襲性ALea-b+4/41/11/2ALea+b-0/21/21/3OLea-b+1/11/11/2OLea+b-2/21/10/1真正的Lea-b-2/2ND 0/1非真正的Lea-b-ND ND ND主要腳注同表IIF.伸展的唾液酸化Lea(或SLea-Lea)的分離用高效薄層色譜技術(shù)檢驗Colo205細(xì)胞單唾液酰-神經(jīng)節(jié)苷脂組分導(dǎo)致或致使一種主要的神經(jīng)節(jié)苷脂的分離。抽提這一主帶并進(jìn)行性質(zhì)鑒定。其結(jié)構(gòu)鑒定為 該結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR光譜證實。
SLea-Lea上的伸展唾液酸-Lea結(jié)構(gòu)通過用唾液酸酶的酶促降解產(chǎn)生與Lea-Lea相同的化合物(其通過薄層色譜分析以及單克隆抗體ST-421免疫染色確證)來確定。初始的唾液酸Lea-Lea或伸展的Lea沒有表現(xiàn)出與MAb ST-421的任何反應(yīng)性。但這一化合物表現(xiàn)出與針對唾液酸-Lea的MAb如N-19-9、NKH-1和NKH-2的反應(yīng)性。
權(quán)利要求
1.一種分離的化合物，有或沒有巖藻糖基和/或唾液酸殘基，具有通式Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→3GlcNAcβ1→(3Galβ1→3GlcNAcβ1→)n3Galβ1→4Glcβ1→1Cer其中n為0或1或以上的整數(shù)，并且當(dāng)n＝1時，至少有兩個巖藻糖基和/或一個或多個唾液酸殘基，Gal代表半乳糖，GlcNAc代表N-乙酰葡糖胺，Glc代表葡萄糖，Cer代表神經(jīng)酰胺，其中所述的至少兩個巖藻糖殘基以a1→4鍵與GlcNAc殘基相連和/或以a1→2鍵與末端Gal殘基連接，所述的一個或多個唾液酸殘基以a2→3鍵與末端的Gal殘基相連，和/或以a2→6鍵與一個或多個亞末端的GlcNAc殘基連接。
2.權(quán)利要求1中分離的化合物，其中至少有兩個唾液酸殘基。
3.權(quán)利要求1中分離的化合物，具有通式 其中Fuc代表巖藻糖，NeuAc代表N-乙酰神經(jīng)氨酸。
4.權(quán)利要求1中分離的化合物，具有通式 其中Fuc代表巖藻糖，NeuAc代表N-乙酰神經(jīng)氨酸。
5.權(quán)利要求1中分離的化合物，具有通式 其中Fuc代表巖藻糖，NeuAc代表N-乙酰神經(jīng)氨酸。
6.權(quán)利要求1中分離的化合物，具有通式 其中Fuc代表巖藻糖。
7.權(quán)利要求1中分離的化合物，具有通式 其中Fuc代表巖藻糖。
8.權(quán)利要求1中分離的化合物，具有通式 其中NeuAc代表N-乙酰神經(jīng)氨酸，F(xiàn)uc代表巖藻糖。
全文摘要
本發(fā)明提供了多種可用作免疫原和腫瘤標(biāo)記物的化合物。本發(fā)明公開了與腫瘤檢測相關(guān)的方法。顯示伸展形式的乳系1型鏈存在于多種癌組織中。本發(fā)明還提供了細(xì)胞系及由其產(chǎn)生的單克隆抗體。該抗體有許多用途，包括在診斷或治療方法中的用途。
文檔編號A61K31/715GK1460022SQ00819788
公開日2003年12月3日 申請日期2000年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月3日
發(fā)明者S·萊弗里, S－I·哈克莫利, M·斯特勞德 申請人:生物膜研究所