專利名稱：α－淀粉酶活性抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有多酚類物質(zhì)作為活性成分的α-淀粉酶活性抑制劑，所述多酚類物質(zhì)來自于番石榴(Psidium guajava Linn.)(此后也稱為番石榴多酚)。還涉及含有該抑制劑的食品和飲料。
番石榴是一種起源于中美洲的灌木，它的果實(shí)、根和葉子一直被民間用于治療糖尿病和腹瀉。依最近的研究，用水或者一種親水性溶劑提取番石榴葉子得到的一種提取物抑制α-淀粉酶活性。日本專利公告第60-36746號(hào)公開了該提取物可以作為健康飲料的成分，日本專利公開第7-59539號(hào)公開了該提取物可以作為減肥食品和飲料的成分。
但是傳統(tǒng)的番石榴提取物還含有倍半萜、單寧及其他成分，并且它們的淀粉酶抑制劑活性也達(dá)不到上述節(jié)食作用的要求。
因此，本發(fā)明的目的之一是從番石榴提取物中分離一種組分，該組分具有很強(qiáng)的α-淀粉酶抑制活性，因此可能產(chǎn)生一種更有效的節(jié)食效果。本發(fā)明的另一個(gè)內(nèi)容是含有此組分的食品和飲料。
因此，本發(fā)明提供了一種α-淀粉酶活性抑制劑，此抑制劑含有多酚類物質(zhì)作為活性成分，所述多酚類物質(zhì)是通過下面的工藝獲得用選自水和其他親水溶劑的溶劑對(duì)番石榴葉子和/或果實(shí)進(jìn)行提??；對(duì)所得提取物進(jìn)行超濾，由此去掉分子量小于5000的物質(zhì)；剩余級(jí)分上樣于丁基支持物疏水層析柱，用0.02mol/L磷酸二氫鈉水溶液與0.02mol/L磷酸鈉水溶液組成的水性溶液在兩溶液間的pH梯度下進(jìn)行洗脫(流速1ml/分鐘)；從洗脫的物質(zhì)中回收一個(gè)級(jí)分，該級(jí)分相應(yīng)于當(dāng)在260nm下檢測(cè)物質(zhì)的光吸收時(shí)洗脫曲線中的第三個(gè)單峰。
本發(fā)明還提供了一種α一淀粉酶活性抑制劑，其含有多酚類物質(zhì)作為活性成分，這些多酚類物質(zhì)具有以下物理化學(xué)特性(a)含有碳(49.6％)、氫(4.6％)和氮(0.6％)；(b)分子量在5000--100000；(c)在3，428cm-1，1705cm-1，1615cm-1和u1220cm-1處有強(qiáng)紅外吸收；(d)固態(tài)碳核磁共振光譜顯示與糖類信號(hào)(76ppm附近)、芳香族化合物信號(hào)(115.0ppm附近)、酚類化合物信號(hào)(144和156ppm附近)以及酯羰基信號(hào)(168ppm附近)相吻合；
(e)在下述條件下進(jìn)行液相色譜時(shí)10分鐘左右出現(xiàn)一單峰柱填充物為硬質(zhì)合成多聚反相分配膠，丁基以化學(xué)鍵與之結(jié)合(型號(hào)Shodex Asahipak C4P-50 4D，Showa Denko產(chǎn)品)，內(nèi)徑4.6mm，長(zhǎng)150mm，或類似于此柱的柱)。
流速1.5ml/分鐘；柱溫40℃左右；檢測(cè)紫外光吸收儀(波長(zhǎng)260nm)；流動(dòng)相溶液A含有磷酸二氫鈉(0.02mol/L)和水(15∶85，V/V)的乙氰溶液混合物，pH4.6；溶液B含有磷酸鈉(0.02mol/L)和水(15∶85，V/V)的乙氰溶液混合物，pH11.4；分析方法按下表所列數(shù)據(jù)進(jìn)行梯度分析。
表1分析時(shí)間(分鐘) 溶液A(％) 溶液B(％)0(0到4) 10004(4到8) 65 358(8到12) 0 10012(12到20)1000本發(fā)明還提供了含有α-淀粉酶活性抑制劑的食品和飲料。
本發(fā)明還提供了多酚類物質(zhì)用于制備食品和飲料中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了包括攝入這類食品和飲料的節(jié)食方法。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方案本發(fā)明多酚類物質(zhì)可用下述步驟1-3生產(chǎn)。
1)步驟1用選自水和親水性溶劑的一種或多種溶劑提取番石榴的葉子和/或果實(shí)，以得到番石榴提取物。
本發(fā)明中使用的番石榴為Psidium guajava Linn.，對(duì)其種植地沒有特別限制。本發(fā)明中，番石榴是東南亞、南亞、南美或北美等熱帶或亞熱帶地區(qū)天然或人工栽培的。本發(fā)明中使用的是番石榴的葉子或果實(shí)。可以使用新鮮、半干或者干燥番石榴，但優(yōu)選干燥的番石榴葉子。使用番石榴果實(shí)時(shí)，優(yōu)選未成熟果實(shí)。這些番石榴葉子或者果實(shí)作為原料時(shí)在使用前優(yōu)選地經(jīng)粉碎。比如，當(dāng)使用番石榴葉時(shí)，番石榴葉子最好切成約3-5mm的小片。另外為了改進(jìn)味道，可以使用在干燥后再經(jīng)焙烤的干燥番石榴。
選自水和親水性溶劑的一種或多種溶劑用作提取溶劑。親水溶劑的例子包括甲醇、乙醇、正丙醇、丙酮和丙二醇。上述溶劑可以兩種或多種組合使用，也可以與水按任何比例組成含水溶劑使用。為了操作方便并提高安全性，優(yōu)選用水作為提取溶劑。
對(duì)所用溶劑的量沒有特別限制。當(dāng)使用番石榴葉子時(shí)，葉子和溶劑的重量比優(yōu)選1∶20；當(dāng)時(shí)用未成熟番石榴果實(shí)時(shí)，溶劑的重量?jī)?yōu)選約為果實(shí)的約10倍。
對(duì)番石榴葉進(jìn)行提取時(shí)，提取條件因使用的溶劑不同而不同。以水為溶劑時(shí)，提取在50-100℃進(jìn)行，優(yōu)選80-100℃；時(shí)間為5-60分鐘，優(yōu)選5-25分鐘。
當(dāng)使用未成熟番石榴果實(shí)時(shí)，提取優(yōu)選在60-100℃進(jìn)行10-60分鐘。
進(jìn)行提取時(shí)，可在提取溶劑中加入如碳酸鈉的堿以增加溶劑的pH值。也可以向提取溶劑中加入稀無機(jī)酸(如稀鹽酸)或者有機(jī)酸(如檸檬酸、琥珀酸、乳酸、蘋果酸或酒石酸)使溶劑變?yōu)槿跛嵝浴?br> 提取步驟完成后，優(yōu)選將所得提取物冷卻然后離心，除去雜質(zhì)。這樣得到的番石榴提取物可經(jīng)濃縮或者稀釋以達(dá)到合適濃度。
2)步驟2對(duì)步驟1得到的番石榴提取物進(jìn)行超濾，以此除去分子量小于5000的組分。
對(duì)于番石榴提取物的超濾，可以使用加壓過濾裝置、透析和離心等、也可以使用上述方法和技術(shù)的組合。
當(dāng)進(jìn)行透析時(shí)，將番石榴提取物裝入透析管。透析管由一種半透膜材料比如纖維素酯或者塞璐玢制成，其允許分子量小于5000的物質(zhì)通過。然后對(duì)水或者對(duì)稀緩沖液(此后稱透析液)透析1-7天，最好2-3天，期間定期更換新鮮透析液或水。通過上述步驟，從番石榴提取物中除去小分子量物質(zhì)。
3)步驟3對(duì)步驟2獲得的分子量為5000或大于5000的級(jí)分進(jìn)行丁基支持物疏水層析。將樣品上柱，用磷酸二氫鈉(0.02mol/L)到磷酸鈉(0.02mol/L)pH梯度進(jìn)行洗脫(流速1.0ml/分鐘)。
對(duì)疏水層析中使用的固定相填料沒有特別限制，只要其含有作為功能基團(tuán)的丁基和具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度即可。填料的例子包括聚苯乙烯、羧化聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯以及纖維素衍生物。
以磷酸二氫鈉(0.02mol/L)水溶液和磷酸鈉(0.02mol/L)水溶液為流動(dòng)相，在二者之間的濃度梯度下進(jìn)行洗脫。
溶劑以1.0ml/分鐘的流速通過柱，檢測(cè)洗脫液在260nm處的光吸收值獲得被洗脫物質(zhì)的分離模式?；厥障鄳?yīng)于第3個(gè)單一峰的級(jí)分，將所得級(jí)分真空或者冷凍干燥，得到本發(fā)明中的多酚類物質(zhì)。
如此得到的水溶性級(jí)分的物理化學(xué)性質(zhì)將在下面給出。元素分析用通常方法進(jìn)行元素分析，結(jié)果如表2所示。
表2元素分析結(jié)果元素 合量(％)碳(C) 49.6氫(H) 4.6氮(N) 0.6鑒于氮含量極低，認(rèn)定此組分中不含蛋白質(zhì)。分子量用通常的GPC-HPLC方法用多角度光散射檢測(cè)儀測(cè)定該組分分子量，結(jié)果表明該級(jí)分的分子量在5000-100000范圍內(nèi)，平均分子量為70000。組成分析該級(jí)分的糖含量用下述方法測(cè)定將樣品在4mol/L三氟乙酸溶液中保持100℃2小時(shí)使之加熱并分解，依常規(guī)方式形成糠醛乙烯氰衍生物，然后用氣相色譜法計(jì)算糖含量。結(jié)果葡萄糖(2.1％)，阿拉伯糖(2.0％)，半乳糖(1.3％)，甘露糖(0.4％)，鼠李糖(0.3％)，木糖(0.3％)。沒食子酸含量、聯(lián)二沒食子酸含量和原花色素含量將樣品在含有硫酸鐵(III)銨的丁醇-鹽酸混合液(95∶5，V/V)中于100℃加熱24小時(shí)以使樣品分解，然后用HPLC方法分析分解的樣品中沒食子酸和聯(lián)二沒食子酸含量。沒食子酸和聯(lián)二沒食子酸的含量分別為0.6％和5.2％。用上述溶劑于95℃加熱樣品40分鐘分解樣品，根據(jù)分解溶液的光吸收值計(jì)算確定樣品中原花色素含量。原花色素以還原為花色素計(jì)含量為6.8％。紅外吸收光譜將樣品夾在兩層二氟化鋇晶體中間，加壓滾壓。用透射法測(cè)定光吸收。所獲得的紅外吸收光譜中，此組分的強(qiáng)吸收峰大約在3428cm-1，1705cm-1，1615cm-1和1220cm-1處。紅外吸收光譜見

圖1。固態(tài)碳核磁共振譜(固態(tài)13C-NMR)采用通常的正交極化幻角自旋(CP-MAS)方法。獲得的CP-MAS光譜中可見糖類、芳香族化合物類、酚類和酯羰基化合物的信號(hào)。光譜證明樣該級(jí)分由主要是含有一個(gè)鞣花單寧基團(tuán)的多酚。CP-MAS光譜見圖2。
從以下的實(shí)施例中將會(huì)看到，上述番石榴多酚具有很強(qiáng)的α-淀粉酶抑制劑活性，同時(shí)也有α-葡萄糖苷酶抑制劑活性。因此，當(dāng)攝入添加了這類多酚類物質(zhì)的食物時(shí)，淀粉降解為糊精和麥芽糖的過程將被抑制，同時(shí)二糖(麥芽糖、異麥芽糖和蔗糖等)降解成葡萄糖的過程也將被抑制。這樣，多酚類物質(zhì)的添加可賦予食物和飲料防止血糖升高和抵抗肥胖的作用。
本發(fā)明涉及到的食品和飲料的類型包括固態(tài)食品、半液態(tài)食品、膠質(zhì)食品和各種飲料。具體的例子包括片劑、膠囊類產(chǎn)品和顆粒；糖果類食品如小甜餅、果凍和快餐食品；顆粒狀調(diào)味品、面包和面條；以及飲料類如提神飲料、果汁、以及由乳酸菌制備的飲料等。
除了本發(fā)明中的多酚類物質(zhì)外，還有很多常用的食品添加劑也可以添加到上述食品和飲料中。這類添加劑包括糖醇類(如葡萄糖、蔗糖、果糖、山梨糖醇、木糖醇、赤鮮糖醇、乳糖醇和palatinit)；乳化劑如蔗糖脂肪酸酯、多聚甘油脂肪酸酯和卵磷脂)；穩(wěn)定劑(如果膠、羧甲基纖維素、水性大豆多糖、古蘭糖膠、阿拉伯樹膠、黃原膠、角叉藻聚糖和瓜耳豆膠)。其他可摻入的物質(zhì)的例子包括維生素類(如維生素A、B族維生素、維生素C和維生素E)；礦物質(zhì)(如乳酸鈣、葡萄糖酸鈣、泛酸鈣、鎂化合物和鋅化合物)；和植物提取物。
當(dāng)將本發(fā)明中的多酚類物質(zhì)添加到食品和飲料中時(shí)，多酚的總量隨食品和飲料的形態(tài)而異，優(yōu)選在0.005-0.5％(重量百分比)。每日攝入這類食品和飲料的量折算成該多酚類物質(zhì)應(yīng)在5-500mg，優(yōu)先選擇5-100mg。
用上述檢測(cè)條件(e)中的條件對(duì)純化的番石榴多酚進(jìn)行層析分析，結(jié)果見圖4。從圖4可見，本發(fā)明純化的番石榴多酚在上述條件下用層析譜色層檢測(cè)表現(xiàn)為單一峰。實(shí)施例3α-淀粉酶抑制劑活性對(duì)實(shí)施例1和實(shí)施例2中得到的番石榴提取物和純化的番石榴多酚對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用進(jìn)行了研究。
α-淀粉酶抑制活性用常規(guī)方法測(cè)定。具體的，將來自豬胰液α-淀粉酶與0.02M磷酸鈉緩沖液(pH6.5)混合制備淀粉酶溶液。用8％的可溶性淀粉和0.08M的磷酸鈉緩沖液(pH6.5)制備底物溶液。將酶、底物溶液和測(cè)試溶劑混合物37℃反應(yīng)7分鐘，以酶、底物溶液和水的混合物為對(duì)照。加熱至100℃中止反應(yīng)。用HPLC方法檢測(cè)形成的麥芽糖，以阿拉伯糖為內(nèi)對(duì)照。用下面公式計(jì)算抑制劑活性。結(jié)果見表3。

表3測(cè)試樣品濃度(mg/ml)淀粉酶抑制程度(％)番石榴提取物 0.80 46純化的番石榴多酚 0.79 74如表3所示，本發(fā)明的純化番石榴多酚對(duì)淀粉酶的抑制作用比番石榴提取物高大約30％。實(shí)施例4α-葡萄糖苷酶抑制活性對(duì)實(shí)施例1和實(shí)施例2中得到的番石榴提取物和純化的番石榴多酚對(duì)麥芽糖酶(α-葡萄糖苷酶的一種)活性的抑制作用進(jìn)行了研究。
麥芽糖酶抑制活性測(cè)定用常規(guī)方法。將大鼠腸丙酮粉末(SIGMA)于56mM順丁烯二酸緩沖液(pH6.0)中勻漿，其中順丁烯二酸緩沖液約為丙酮粉末的9倍，收集離心上清液得到麥芽糖酶粗制液。用224mM順丁烯二酸緩沖液(pH6.0)制備底物溶液，使麥芽糖終濃度為1％。將酶、底物溶液和測(cè)試溶液的混合物37℃反應(yīng)5分鐘，以酶、底物溶液和水的混合物為對(duì)照。加熱至100℃中止反應(yīng)。用HPLC方法檢測(cè)形成的葡萄糖的量，以阿拉伯糖為內(nèi)對(duì)照。用下面公式計(jì)算抑制劑活性。結(jié)果見表4。 表4試驗(yàn)樣品濃度(mg/ml) 淀粉酶抑制程度(％)番石榴提取物 1.5 78.0純化的番石榴多酚 1.5 84.9
重量份配方面粉 52精制糖 3煉乳 4無鹽黃油 3蛋 3精鹽 1鮮酵母 1.5水 31.5番石榴多酚 1烤制后，本面包具有草藥香氣和很好的味道，與市場(chǎng)上常見的面包產(chǎn)品的口味相當(dāng)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明α-淀粉酶抑制物與番石榴提取物相比具有較強(qiáng)的α-淀粉酶抑制活性，同時(shí)具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。因此，將此多酚類物質(zhì)加到食品和飲料中時(shí)，可賦予這些食品和飲料抑制血糖水平和抗肥胖癥的作用。具體來說，將此多酚類物質(zhì)加到富含淀粉的食物中，如調(diào)味粉(condiment flour)、面條、面包、甜點(diǎn)等食品中，可提供適合于高血糖和高血脂人群的減肥食品和飲料。
權(quán)利要求
1.一種α-淀粉酶活性抑制劑，其包含作為活性成分的多酚類物質(zhì)，所述多酚是通過以下工藝獲得的用一或多種溶劑對(duì)番石榴葉子和/或果實(shí)進(jìn)行提??；所用溶劑選自水和親水性溶劑；對(duì)所得提取物進(jìn)行超濾以除去分子量小于5000的物質(zhì)；將剩余級(jí)分上樣于丁基支持物疏水層析柱，用0.02mol/L磷酸二氫鈉水溶液和0.02mol/L磷酸鈉水溶液組成的水性溶液在pH梯度下以1.0ml/分鐘的流速洗脫；回收洗脫的物質(zhì)之級(jí)分，所述級(jí)分相應(yīng)于260nm下檢測(cè)物質(zhì)的光吸收時(shí)洗脫曲線的第三個(gè)單峰。
2.權(quán)利要求1中的α-淀粉酶活性抑制劑，其中多酚類物質(zhì)具有以下理化性質(zhì)(a)含有碳(49.6％)、氫(4.6％)和氮(0.6％)；(b)分子量在5000-100000；(c)在3,428cm-1，1,705cm-1，1,615cm-1和1,220cm-1處有強(qiáng)紅外吸收；(d)表現(xiàn)穩(wěn)定的固態(tài)碳核磁共振光譜，與糖信號(hào)(76ppm附近)、芳香族化合物信號(hào)(115.0ppm附近)、酚類化合物信號(hào)(144和156ppm附近)以及酯羰基信號(hào)(168ppm附近)相吻合；(e)在下述條件下進(jìn)行液相色譜約10分鐘后顯示單一峰柱填充物為硬質(zhì)合成多聚反相分配膠，丁基以化學(xué)鍵與之結(jié)合(型號(hào)Shodex Asahipak C4P-50 4D，Showa Denko產(chǎn)品)，內(nèi)徑4.6mm，長(zhǎng)150mm，或類似于此柱的柱)流速1.5ml/分鐘；柱溫40℃左右；檢測(cè)紫外光吸收儀(波長(zhǎng)260nm)；流動(dòng)相溶液A含有磷酸二氫鈉(0.02mol/L)和水(15∶85，V/V)的乙氰溶液混合物，pH4.6；溶液B含有磷酸鈉(0.02mol/L)和水(15∶85，V/V)的乙氰溶液混合物，pH11.4；分析方法按下表所列數(shù)據(jù)進(jìn)行梯度分析表1分析時(shí)間(分鐘) 溶液A(％) 溶液B(％)0(0到4) 100 04(4到8) 65 358(8到12) 0 10012(12到20)100 0
3.一種α-淀粉酶活性抑制劑，其含有多酚為活性成分，所述多酚類物質(zhì)具有以下理化性質(zhì)(a)含有碳(49.6％)、氫(4.6％)和氮(0.6％)；(b)分子量在5000——100000；(c)在3,428cm-1，1705cm-1，1615cm-1和1220cm-1處有強(qiáng)紅外吸收；(d)固態(tài)碳核磁共振光譜顯示與糖類信號(hào)(76ppm附近)、芳香族化合物信號(hào)(115.0ppm附近)、酚類化合物信號(hào)(144和156ppm附近)以及酯羰基信號(hào)(168ppm附近)相吻合；(e)在下述條件下進(jìn)行液相色譜時(shí)10分鐘左右出現(xiàn)一單峰柱填充物為硬質(zhì)合成多聚反相分配膠，丁基以化學(xué)鍵與之結(jié)合(型號(hào)Shodex Asahipak C4P-50 4D，Showa Denko產(chǎn)品)，內(nèi)徑4.6mm，長(zhǎng)150mm，或類似于此柱的柱)流速1.5ml/分鐘；柱溫40℃左右；檢測(cè)紫外光吸收儀(波長(zhǎng)260nm)；流動(dòng)相溶液A含有磷酸二氫鈉(0.02mol/L)和水(15∶85，V/V)的乙氰溶液混合物，pH4.6；溶液B含有磷酸鈉(0.02mol/L)和水(15∶85，V/V)的乙氰溶液混合物，pH11.4；分析方法按下表所列數(shù)據(jù)進(jìn)行梯度分析表1分析時(shí)間(分鐘) 溶液A(％) 溶液B(％)0(0到4)100 04(4到8)65 358(8到12) 0 10012(12到20) 100 0
4.權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的α-淀粉酶活性抑制劑，其還具有α-葡萄糖苷酶抑制劑活性。
5.含有權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的α-淀粉酶活性抑制劑的食品和飲料。
6.權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的多酚類物質(zhì)在制備減肥食品和飲料中的應(yīng)用。
7.一種減肥方法，包括攝入權(quán)利要求5中所述的食品和飲料。
全文摘要
一種含有多酚類物質(zhì)作為活性成分的α－淀粉酶活性抑制劑，所述多酚類物質(zhì)通過提取番石榴葉和/或果實(shí)獲得，以一種或多種選自水和親水性溶劑的溶劑提取，用超濾方法除去分子量小于5000組分，用疏水層析法對(duì)剩余組分進(jìn)行純化，層析柱中結(jié)合有丁基的裝柱材料作為固相，用0.02M磷酸二氫鈉水溶液和0.02M磷酸鈉水溶液組成的步進(jìn)濃度梯度以1.0M/分鐘的流速洗脫，260nm下檢測(cè)光吸收，回收洗脫曲線第三個(gè)單峰的組分；一種以具有特定理化性質(zhì)的多酚類物質(zhì)作為活性成分的α－淀粉酶活性抑制劑；含有此多酚類物質(zhì)的食品和飲料等。
文檔編號(hào)A61P3/10GK1416464SQ01806328
公開日2003年5月7日 申請(qǐng)日期2001年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月10日
發(fā)明者牧野孝, 相山律男, 出口順子, 綿貫雅章, 中澤真子, 水越晴美, 長(zhǎng)岡正人, 原田勝壽, 長(zhǎng)田邦子 申請(qǐng)人:株式會(huì)社益力多本社