專利名稱：卵內(nèi)提供抗火雞鼻氣管炎保護(hù)的方法和疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)禽類宿主如火雞和雞卵內(nèi)提供針對(duì)火雞鼻氣管炎(TRT)和/或“腫頭綜合征(Swollen Head Syndrome)”的保護(hù)的有用方法。更具體地說(shuō)，已經(jīng)證明抗TRT疫苗當(dāng)如本文所述合適地卵內(nèi)給予禽類宿主時(shí)安全有效。
背景技術(shù)：
TRT是由肺病毒引起的火雞上呼吸道感染。這是一種累及所有年齡火雞的高度傳染性急性疾病。TRT感染的臨床癥狀包括顯著頻繁的泡沫狀鼻排出物、水泡音、咔嗒聲、打噴嚏和搖頭。在受感染的火雞中也可以觀察到眼睛排出物或腫脹的眶下竇(infraorbitalsinus)。
已經(jīng)在一些患有腫頭綜合征(SHS)的雞群(肉用仔雞和肉用仔雞/種雞)中檢測(cè)到抗TRT病毒(TRTV)的抗體。人們推測(cè)TRTV在SHS和相關(guān)性呼吸窘迫中起作用。
針對(duì)TRT的商業(yè)化疫苗并不通過(guò)卵內(nèi)給予。而是在孵出后以各種形式給予它們。一般通過(guò)勞動(dòng)密集型的噴灑方法(如手工噴霧、背囊噴霧或自動(dòng)噴霧設(shè)備)或滴劑方法(眼或鼻)給予所述疫苗。
根據(jù)下文更完全的解釋，與目前使用的麻煩并且耗時(shí)的孵出后給予途徑相比，使用改良的卵內(nèi)應(yīng)用TRT疫苗的卵內(nèi)給予方法提供明顯的好處。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明利用商業(yè)化TRT疫苗改良用于本發(fā)明的卵內(nèi)給予方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了使用合適給藥參數(shù)卵內(nèi)給予火雞和雞這些疫苗的安全性和有效性。
可以利用本發(fā)明的方法，通過(guò)卵內(nèi)給予所述疫苗，保護(hù)禽類宿主對(duì)抗TRT和/或TRT或SHS相關(guān)性呼吸窘迫。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供保護(hù)禽類宿主對(duì)抗TRT和/或TRT或SHS相關(guān)性呼吸窘迫的方法，所述方法利用更簡(jiǎn)單并且更便宜地應(yīng)用于大群禽類的卵內(nèi)接種技術(shù)。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是使用疫苗以一定劑量提供所述卵內(nèi)接種，所述疫苗的劑量為孵出的禽類宿主提供合適的免疫反應(yīng)，而不對(duì)孵化率有不良影響。
本發(fā)明的再一個(gè)目標(biāo)是使用根據(jù)卵內(nèi)應(yīng)用改良的TRT疫苗，提供對(duì)抗SHS相關(guān)性呼吸窘迫的保護(hù)。
本發(fā)明的又一個(gè)目標(biāo)是提供接種禽類宿主以對(duì)抗TRT和/或TRT或SHS呼吸窘迫的方法，所述方法比常規(guī)接種的禽類提供更高的抗TRTV滴度，使用更少量的疫苗抗原，因此降低費(fèi)用。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供卵內(nèi)免疫禽類宿主對(duì)抗TRTV、因此提供對(duì)抗TRT和/或TRT和SHS呼吸窘迫的保護(hù)的方法?？梢杂欣貜纳虡I(yè)化TRT疫苗制備用于本發(fā)明方法的疫苗。尤其適用于本發(fā)明方法的疫苗是商業(yè)化Poulvac_TRT疫苗，所述疫苗可以從Fort Dodge Animal Health，F(xiàn)ort Dodge，Iowa or Weesp，The Netherlands獲得。Poulvac_TRT商業(yè)化制劑包含TRTV減毒K株每劑滴度不低于103.2TCID50，該制劑未批準(zhǔn)或指示用于卵內(nèi)給予。在本申請(qǐng)中，“TCID50”指50％組織培養(yǎng)感染劑量。
一般根據(jù)進(jìn)行免疫的禽類，將所述疫苗重懸浮于合適媒介物，以便提供約103.2到約104.5范圍內(nèi)的TCID50，并以每個(gè)蛋約0.05到0.1ml的量給予。可以手工進(jìn)行給予，但更典型經(jīng)濟(jì)的方法是使用商業(yè)化蛋注射設(shè)備給予，所述商業(yè)化蛋注射設(shè)備例如可以從Embrex，Inc.，North Carolina獲得。準(zhǔn)確的給予劑量將取決于所述疫苗所給予的禽類物種，如較小的禽需要較少的劑量。通常在孵化第24天或之前給予所述疫苗(如火雞)，但本發(fā)明的范圍也包括其它卵內(nèi)給予時(shí)間，例如孵化第18天或之前(如雞)。
本發(fā)明的疫苗和方法所應(yīng)用的禽類宿主包括雞、鴨、火雞、鵝、矮腳雞、鵪鶉和鴿。優(yōu)選禽類物種是重要的商業(yè)家禽，例如雞、鴨和火雞。
已經(jīng)驚人地發(fā)現(xiàn)不僅卵內(nèi)接種方法是安全而更簡(jiǎn)單的給予方法，而且在用該方法免疫的禽類宿主中存在更高的滴度。
此外，當(dāng)與基本相同的對(duì)照(未接種)組進(jìn)行比較時(shí)，所述疫苗和給予方法基本不降低卵內(nèi)接種后蛋的孵化率。優(yōu)選所述孵化率降低比對(duì)照組低約10％以下，更優(yōu)選約5％以下。甚至更優(yōu)選降低少于約1-2％。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗和方法可能實(shí)際上增加蛋的孵化百分率，有時(shí)增加約1-2％或更高。因此，所述疫苗對(duì)于給予禽類物種如雞和火雞是安全有效的。
下面實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明示例性的方法和技術(shù)。對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員，可以對(duì)材料和方法實(shí)施許多改變，而不偏離本公開內(nèi)容的目的和宗旨。
實(shí)施例實(shí)施例1-卵內(nèi)給予火雞的安全性研究從已知未感染TRTV并且此前未針對(duì)TRT接種疫苗的親代火雞群獲得用于孵化的可育火雞蛋。將這些蛋隨機(jī)分配到2個(gè)不同的組。
第一組76枚受精卵在孵化第24天卵內(nèi)給予所述疫苗。孵化的第一天視為第0天。蛋在孵化前放置約2-7天。使用Poulvac_TRT(批號(hào)TR015，有效期1997年6月24日，滴度107.5TCID50)制備所述卵內(nèi)疫苗。將三小管所述商業(yè)化產(chǎn)品各自重懸浮于10ml無(wú)菌鹽水中，獲得每0.1ml滴度為105.5TCID50的懸浮液。充分混合并匯集這些內(nèi)容物。將所述混合/匯集的內(nèi)容此后在實(shí)施例1中重命名為“IOV”。
所述卵內(nèi)給予為每個(gè)蛋使用滴度為105.5TCID50的0.1ml IOV，注射入所述76個(gè)受精卵中每一個(gè)蛋的羊膜液。然后，立即將這些蛋置于孵化器內(nèi)(不用旋轉(zhuǎn))，使它們?cè)诟髯苑胖玫母綦x欄內(nèi)孵化。這些蛋/孵化蛋稱為接種的火雞。
第二組66個(gè)受精卵不接受接種，在第二個(gè)隔離欄內(nèi)于相似條件下孵化。這些蛋/孵化蛋稱為陰性對(duì)照火雞。
在孵化第27、28和29天記錄所述接種火雞和陰性對(duì)照火雞的孵化情況。表1顯示試驗(yàn)觀察到的孵化百分率。關(guān)于孵化率，本發(fā)明的卵內(nèi)接種產(chǎn)生極好的結(jié)果，有93.4％接種的蛋孵出，而有92.4％的陰性對(duì)照蛋孵出。
表1孵化百分率
孵出后，每組(即接種火雞和陰性對(duì)照火雞)各隨機(jī)選出25只幼禽，置于各自隔離欄內(nèi)地板上的刨花上。剔出每一組的剩余火雞。
每一組內(nèi)，在21天的時(shí)間內(nèi)每日檢查每只火雞的臨床表現(xiàn)。擠壓喙，檢查鼻溢泌物的存在。根據(jù)表2記錄臨床疾病的嚴(yán)重性。
表2臨床記錄系統(tǒng)
將一組火雞中每一只火雞在一天內(nèi)的個(gè)體分?jǐn)?shù)相加，得到該組火雞的日總分?jǐn)?shù)。表3顯示使用表2的相對(duì)計(jì)分系統(tǒng)得到的試驗(yàn)觀察到的臨床表現(xiàn)。
表3接種火雞的臨床檢查結(jié)果
同樣檢查陰性對(duì)照火雞的任何臨床表現(xiàn)，沒(méi)有觀察到異常，即所有陰性對(duì)照火雞都獲得分?jǐn)?shù)零。
上面觀察的結(jié)果證明本發(fā)明卵內(nèi)接種方法是安全的。6日齡火雞的最高平均分/火雞(即0.36)提供足夠安全限度，表示僅有輕微/輕度的TRT癥狀。
收到所述蛋61/2周后，收集從親代火雞群內(nèi)10只火雞獲取的血液，進(jìn)行血清學(xué)分析。還從下面4組火雞收集血液(a)1日齡，從20只陰性對(duì)照火雞；(b)21日齡，從21只陰性對(duì)照火雞；(c)1日齡，從20只接種的火雞；(d)21日齡，從20只接種的火雞。
各個(gè)血液樣品的血清學(xué)分析指示抗TRTV的抗體滴度。該分析使用其中應(yīng)用A型抗原的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)技術(shù)，結(jié)果表示為2log滴度。試驗(yàn)測(cè)定的2log滴度≥6.0定為陽(yáng)性。還計(jì)算試驗(yàn)測(cè)定滴度的幾何平均值(GM)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。所述滴度分析建立以下結(jié)果。親代火雞群未感染TRTV[見GM＝5.04，而陽(yáng)性判斷值≥6.0]。在所述10只火雞中，一只火雞的滴度高達(dá)7.7。此外，1日齡陰性對(duì)照火雞和接種火雞的GM滴度幾乎相同，即分別是4.05和4.06。然而，兩只接種火雞有陽(yáng)性滴度[見滴度值7.1和8.1，都≥6.0]。與此不同，沒(méi)有一只陰性對(duì)照火雞的滴度≥6.0。陰性對(duì)照火雞和接種火雞的SD分別是0.82和1.46。
所述21天血液取樣測(cè)試也顯示試驗(yàn)測(cè)定滴度明顯差異。陰性對(duì)照火雞的GM降低到3.53，SD降低到0.46。與此不同，接種火雞的GM增加到10.53，SD增加到0.85。因此，所述接種火雞具有極大提高的抗TRTV滴度。
在接種火雞中，21日齡的血清學(xué)反應(yīng)非常高。該反應(yīng)甚至高于對(duì)1日齡火雞使用同樣劑量(通過(guò)滴眼接種)通常出現(xiàn)的反應(yīng)。通常僅在用TRTV強(qiáng)毒株攻擊后才觀察到GM＝10.5的TRTV抗體滴度。與此相比，在使用105.5TCID50Poulvac_TRT通過(guò)滴眼接種易感火雞幼禽(1日齡)的兩個(gè)試驗(yàn)中，在21日齡收集的血液樣品分別顯示8.3和8.7的平均抗體滴度。
表4顯示對(duì)親代火雞群、陰性對(duì)照火雞和接種火雞的血清學(xué)測(cè)試的數(shù)據(jù)。
表4TRTV滴度
因此，將本發(fā)明的IOV以105.5TCID50卵內(nèi)給予(在孵化第24天)火雞受精卵在孵化率和臨床表現(xiàn)方面提供必要的安全性，并且與常規(guī)給予的疫苗相比增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
實(shí)施例2卵內(nèi)給予雞的安全性研究從商業(yè)途徑(Broekman Instituut BV，Someren，The Netherlands)獲得無(wú)特定病原體(下文稱為“SPF”)White Leghorn蛋。將120枚SPF蛋置于孵化器內(nèi)，孵化18天后，透光檢查這些蛋。剔出5枚未受精的蛋，115枚為合格受精蛋。在115枚合格蛋中，隨機(jī)選取100枚進(jìn)行卵內(nèi)接種。將這100枚蛋分為如下三組組1蛋/孵化蛋用有數(shù)字的橙色翅識(shí)別標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)注。組1包括30枚蛋，如下所述按每枚蛋滴度105.5TCID50的計(jì)算劑量接受卵內(nèi)疫苗。
組2蛋/孵化蛋用有數(shù)字的綠色翅識(shí)別標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記。組2包括40枚蛋，如下所述卵內(nèi)接受與組1蛋所注射疫苗同等體積的鹽水溶液。
組3蛋/孵化蛋不標(biāo)記。組3包括30枚蛋，不接受任何卵內(nèi)給予(不論是疫苗還是鹽水溶液)。
只有當(dāng)小雞表現(xiàn)TRT或SHS的臨床表現(xiàn)時(shí)才使用翅標(biāo)記上的數(shù)字。
組1和組2的小雞置于它們孵化的同一動(dòng)物房?jī)?nèi)。維持合適條件(如飼料、飲水、用作墊材的木刨花、溫度、相對(duì)濕度等)。
該試驗(yàn)的時(shí)間表如下組1、2和3孵化的第一天定義為孵化的第0天。分別卵內(nèi)給予組1和組2疫苗以及鹽水溶液的日期是孵化第18天。計(jì)算的孵化日期對(duì)應(yīng)于孵化第21天。該研究在等于孵化第46天的孵出后日期結(jié)束。
為制備用于卵內(nèi)給予的疫苗，使用商業(yè)化疫苗Poulvac_TRT，該疫苗每小管含2000劑量，可從Fort Dodge Animal Health in FortDodge，Iowa or Weesp，The Netherlands獲得。該疫苗每劑的滴度是104.2TCID50。將十二(12)小管該疫苗重懸浮于磷酸鹽緩沖溶液(下文稱為“PBS”)，每小管疫苗使用5mlPBS。充分混合并匯集得到的內(nèi)容物。所述重懸浮材料的計(jì)算滴度為105.5TCID50，總體積60ml。該疫苗下文稱為“IOV”。
孵化第18天，使用得自Embrex，Inc.，North Carolina的商業(yè)化Inovoject_蛋注射機(jī)器，通過(guò)注射卵內(nèi)給予組1的蛋所述IOV疫苗。按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行所述IOV的蛋注射給予。以相似方式，為組2的蛋給予得自Bieffle Medital SpA，Italy的商業(yè)化鹽水溶液CLEAR-FLEX_INFUSIEVLOESISTOF。
表5顯示組1、2和3蛋的處理。
表5蛋的處理
在試驗(yàn)中觀察并計(jì)算組1、2和3的蛋的孵化百分率。簡(jiǎn)要地說(shuō)，注意到下面例外。組1的兩只小雞由于脊柱裂骨骼畸形(不歸因于卵內(nèi)接種的任何副作用)，在孵出后、用鑒別翅標(biāo)簽標(biāo)記前直接從研究中去除。這兩只小雞不參與計(jì)算組1的孵化百分率。此外，在組1內(nèi)，一只小雞腳趾受傷，在標(biāo)記后從研究中去除。對(duì)這只小雞的尸體剖檢揭示沒(méi)有TRT或任何其它疾病或任何其它紊亂的征象。這只小雞同樣不參與計(jì)算組1的孵化百分率。至于組2的蛋/孵化蛋，一只小雞在孵出后、用鑒別翅標(biāo)簽標(biāo)記前死亡。相似地，這只小雞不參與計(jì)算組2的孵化百分率。
根據(jù)計(jì)劃，在25天觀察期內(nèi)研究和檢查組1和組2的孵化蛋。在此期間，沒(méi)有一只小雞顯示TRT或SHS的臨床表現(xiàn)。組3的所有30枚蛋都孵出。在它們孵出的那一天，所有30只小雞都去頭，取血樣，如下文所述進(jìn)行隨后的分析。
表6顯示試驗(yàn)觀察到的組1、2和3的孵化率和死亡率。這些結(jié)果證明本發(fā)明的卵內(nèi)接種在孵化率以及TRT和/或SHS的臨床表現(xiàn)方面是安全的。
表6孵化率/死亡率結(jié)果
在第25天測(cè)量組1(疫苗)和組2(鹽水)的小雞體重。組1雞的平均體重是209克，標(biāo)準(zhǔn)差22.1。組2雞的平均體重是217克，標(biāo)準(zhǔn)差24.8。根據(jù)兩側(cè)斯氏t檢驗(yàn)(P＝0.18)，組1和2的體重在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異并不顯著。這些結(jié)果證明本發(fā)明的卵內(nèi)接種與卵內(nèi)注射生理鹽水溶液相比，不影響第25天的體重(該數(shù)據(jù)在商業(yè)上是重要的)。
為證實(shí)在組1、2和3中使用的SPF蛋處于無(wú)TRT狀態(tài)，在組3的蛋孵出的那一天，去頭處死小雞，收集血液樣品進(jìn)行分析。ELISA測(cè)試未檢測(cè)到針對(duì)TRTV的任何抗體，這證實(shí)在本研究中使用的SPF蛋的無(wú)TRT狀態(tài)。
本研究證明對(duì)SPF雞蛋進(jìn)行卵內(nèi)接種對(duì)于孵化率、死亡率、TRT和/或SHS的臨床表現(xiàn)以及第25天的體重都是安全的。
實(shí)施例3卵內(nèi)SPF雞疫苗的效能研究本發(fā)明的目的是確定對(duì)18日齡雞胚的卵內(nèi)接種是否有效預(yù)防3周或6周齡毒力攻擊后的TRT和/或SHS疾病。下文證明用104.2TCID50卵內(nèi)接種易感18日齡SPF雞受精卵是安全的，而用103.2TCID50的劑量有效對(duì)抗臨床疾病。
從購(gòu)自Whickham Laboratories，United Kingdom的SPF WhiteLeghom親代群獲取用于孵化的受精卵。
獲得商業(yè)化TRT疫苗Poulvac_TRT，該疫苗可以從Fort Dodge，Iowa or Weesp，The Netherlands獲得。如下從所述Poulvac_TRT制備本發(fā)明的卵內(nèi)疫苗。分別用4ml無(wú)菌水重懸浮三(3)小管所述商業(yè)化疫苗(每小管的滴度為107.5TCID50)，充分混合并匯集。然后取出0.4ml，加入19.6ml無(wú)菌PBS，獲得等同于每小管200ml的最終稀釋液，最終懸浮液每0.1ml疫苗的滴度為104.2TCID50。取所述疫苗2ml加入18ml無(wú)菌PBS進(jìn)一步稀釋，得到最終懸浮液為每0.1ml疫苗103.2TCID50。
如下制備攻擊病毒。來(lái)自UK株BUT 8544(由Liverpool University(U.K.)的Dr.R.C.Jones分離)的TRTV在氣管器官培養(yǎng)物(下文稱為“TOC”)中傳代23次，在幼禽傳代一次，再分離，然后在TOC中再傳代一次。該攻擊病毒的滴度是每ml 104.5TCID50。
孵化18天后，用0.1ml上文所述包含103.2TCID50的重建TRT疫苗卵內(nèi)接種第一組70枚受精卵(下文稱為“組1”)。同樣用0.1ml上文所述包含104.2TCID50的重建TRT疫苗接種第二組70枚蛋(下文稱為“組2”)。所述蛋立即置于孵化器內(nèi)(不用旋轉(zhuǎn))，使它們?cè)诟髯苑胖玫母綦x欄內(nèi)孵化。組1和組2的蛋分別放在相似的隔離欄內(nèi)。第三組70枚受精卵不接受任何卵內(nèi)給予(下文稱為“組3”)。組3在下文稱為陰性對(duì)照雞。將這些蛋放置在第三個(gè)隔離欄內(nèi)。
在孵化后第20、21、22和23天(第零天是孵化的第一天)記錄孵出。孵出后，在一日齡每組選出五十只雞，淘汰多余的雞。試驗(yàn)記錄的組1、2和3的孵化百分率分別是91％、94％和92％。這證明用滴度103.2TCID50和104.2TCID50進(jìn)行卵內(nèi)接種在孵化率方面是安全的。
在三周齡，從每個(gè)接種組(即組1和2)以及陰性對(duì)照組(即組3)各取10只雞，標(biāo)記翅膀并轉(zhuǎn)移進(jìn)第四個(gè)隔離欄。隨后使用在0.1ml內(nèi)含103.5TCID50(強(qiáng)毒)TRTV劑量的滴眼劑，給予每只雞上文所述的攻擊病毒。在6周齡，另外10只雞同樣接受TRTV強(qiáng)毒株攻擊。然而，由于這些雞的年齡增加，攻擊劑量增加到每只雞0.2ml共103.8TCID50(強(qiáng)毒)TRTV。
受攻擊的雞試驗(yàn)監(jiān)測(cè)14天，然后取血并處死。使用表2臨床計(jì)分系統(tǒng)如實(shí)施例1所述記錄所觀察到的體征。將每組內(nèi)每只雞在一天內(nèi)各自的分?jǐn)?shù)相加，計(jì)算得到每組雞的日總分?jǐn)?shù)。累計(jì)分?jǐn)?shù)是第3-8天平均日分?jǐn)?shù)的加和。使用χ2檢驗(yàn)分析所述數(shù)據(jù)。將在2個(gè)接種組(組1和2)第3-8天觀察到的總臨床表現(xiàn)與(組3)陽(yáng)性對(duì)照在3周齡攻擊和6周齡攻擊中同樣天數(shù)觀察到的總臨床表現(xiàn)比較。該監(jiān)測(cè)建立下面結(jié)果。
當(dāng)用強(qiáng)毒TRTV株以滴度103.5TCID50進(jìn)行3周齡攻擊時(shí)，90％組3的未接種對(duì)照雞表現(xiàn)臨床表現(xiàn)。與此不同，組1和2接種雞顯示臨床表現(xiàn)的百分率較小。在組1(每蛋以滴度103.2TCID50接種)中，僅50％的雞顯示臨床表現(xiàn)。在組2(每蛋以滴度104.2TCID50接種)中，僅30％的雞顯示臨床表現(xiàn)。在組3中，只有一只雞保持完全沒(méi)有臨床表現(xiàn)。與此不同，組1的五只雞和組2的七只雞保持完全沒(méi)有臨床表現(xiàn)。
當(dāng)用強(qiáng)毒TRTV株以滴度103.8TCID50進(jìn)行6周齡攻擊時(shí)，80％組3的未接種雞顯示臨床表現(xiàn)。與此不同，組1和2接種雞顯示臨床表現(xiàn)的百分率較小。在組1(每蛋以滴度103.2TCID50接種)中，僅20％的雞顯示臨床表現(xiàn)。在組2(每蛋以滴度104.2TCID50接種)中，僅10％的雞顯示臨床表現(xiàn)。
χ2統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)證明對(duì)于6周齡攻擊，在兩個(gè)接種組雞(組1和2)試驗(yàn)觀察到的臨床表現(xiàn)比在組3未接種陰性對(duì)照雞記錄到的臨床表現(xiàn)顯著更輕(P＜0.01)。
表7、8和9分別顯示上文討論的3周齡攻擊、6周齡攻擊和卡方統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果。
表73周齡攻擊的臨床表現(xiàn)
表86周齡攻擊的臨床表現(xiàn)
表9卡方分析
除監(jiān)測(cè)組1、2和3的雞的TRT臨床表現(xiàn)外，還對(duì)所述雞進(jìn)行血清學(xué)分析其中通過(guò)應(yīng)用A型抗原的ELISA測(cè)定各個(gè)血液樣品中的抗TRTV抗體，結(jié)果表示為2log滴度。2log滴度＞6.0的抗體滴度定為陽(yáng)性。使用用于非配對(duì)數(shù)據(jù)的斯氏t檢驗(yàn)對(duì)所述結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。表10和11顯示組1、2和3受攻擊的雞分別在3周齡攻擊和6周齡攻擊中獲得的血清學(xué)結(jié)果。在表10和11中，“PC”指攻擊后；“GM”指幾何平均值；“SD”指標(biāo)準(zhǔn)差。簡(jiǎn)要地說(shuō)，所有組(即組1、2和3)在攻擊后7天顯示抗體滴度顯著升高，在攻擊后14天抗體滴度進(jìn)一步升高。
表10TRTV抗體滴度(3周齡攻擊)
表11TRTV抗體滴度(6周齡攻擊)
對(duì)未用TRTV強(qiáng)毒株攻擊的所有三個(gè)組(即組1、2和3)也進(jìn)行相似的血清學(xué)分析。確定對(duì)照雞(組3)和2個(gè)接種雞組(組1和2)從一日齡到81/2周齡的平均抗體滴度。如預(yù)期的一樣，對(duì)照雞的抗體滴度在本研究中始終保持低水平。將對(duì)照雞的滴度與同樣年齡接種雞的滴度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。表12顯示卵內(nèi)接種后測(cè)定的平均抗體滴度。所獲得的各個(gè)結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)支持表12中顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在表12中，“n”指雞的數(shù)量，“SD”指標(biāo)準(zhǔn)差。
表12卵內(nèi)接種后平均抗體滴度
對(duì)實(shí)施例3的結(jié)果(包括試驗(yàn)獲得的測(cè)量、結(jié)果和相應(yīng)統(tǒng)計(jì)分析)分析指出更低疫苗劑量(將103.2TCID50TRTV卵內(nèi)傳遞到易感18日齡SPF雞受精卵)是有效的，因?yàn)樗鰟┝抠x予對(duì)抗用TRTV強(qiáng)毒株在6周齡攻擊的顯著保護(hù)。在3周齡也觀察到保護(hù)；然而，由于雞的數(shù)量，試驗(yàn)觀察到的在保護(hù)上的差異剛好在顯著水平以下。當(dāng)接種劑量增加到每枚蛋104.2TCID50TRTV(增加約1log10)，則在3周齡攻擊和6周齡攻擊中，都觀察到對(duì)暴露于TRTV強(qiáng)毒株的顯著保護(hù)。
卵內(nèi)給予從Poulvac_TRT制備的疫苗明顯與免疫/接種雞內(nèi)TRTV特異性抗體的產(chǎn)生有關(guān)。該相關(guān)看起來(lái)是依賴于劑量的。所述卵內(nèi)疫苗的更高劑量導(dǎo)致三周齡的平均抗體滴度增加到顯著高于陰性對(duì)照雞滴度的水平，稍低于判斷值6.0。用每蛋104.2TCID50更高劑量卵內(nèi)接種的循環(huán)抗體反應(yīng)看起來(lái)隨時(shí)間而增加；在六周齡觀察到最大值；此后，滴度保持穩(wěn)定直到81/2周齡。
與上述高接種劑量的結(jié)果不同，接受每蛋更低劑量103.2TCID50的雞看起來(lái)對(duì)接種的抗體反應(yīng)延遲。滴度在81/2周齡才開始增加-那時(shí)它們達(dá)到顯著高于對(duì)照雞滴度的水平。低劑量疫苗雞(組1)在此時(shí)(即81/2周)的滴度類似于高劑量疫苗雞(組2)在3周齡的滴度?？雌饋?lái)，可能隨著時(shí)間超過(guò)81/2周，所述抗體滴度將增加到高于6.0的水平。
在抗體滴度和TRT臨床表現(xiàn)減少之間有相關(guān)關(guān)系。在抗體滴度顯著高于對(duì)照雞的滴度但仍然低于6.0陽(yáng)性判斷值的每一組雞中，所觀察到的TRT臨床表現(xiàn)的降低在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的。
以至少每蛋103.2TCID50到至少每蛋104.2TCID50的大致范圍內(nèi)劑量(尤其是用每枚蛋約104.2TCID50的劑量)卵內(nèi)接種易感18日齡SPF雞受精卵對(duì)于對(duì)抗TRTV強(qiáng)毒株攻擊正常引起的臨床疾病是安全有效的。
實(shí)施例4卵內(nèi)商業(yè)化雞疫苗的效能研究本研究的目的是確認(rèn)卵內(nèi)接種18日齡孵化的雞受精卵是否在4或6周齡攻擊后有效預(yù)防TRT和/或SHS疾病，其中所述雞受精卵來(lái)自商業(yè)化肉用仔雞的親代群。按照下文討論，用來(lái)自Poulvac_TRT的疫苗，以每蛋103.2TCID50卵內(nèi)接種來(lái)自TRTV抗體陽(yáng)性親代的易感18日齡受精卵有效對(duì)抗臨床鼻氣管炎疾病。
從一群37周齡商業(yè)化肉用仔雞親代獲得用于孵化的受精卵，所述肉用仔雞親代先前在10周齡用活體TRT疫苗接種，然后在18周齡用滅活TRT疫苗接種。從Mossband種雞群，Marshall Agriculture，Whitburn，Scotland獲得這些蛋。
使用商業(yè)化TRT疫苗Poulvac_TRT制備本發(fā)明的卵內(nèi)疫苗，所述Poulvac_TRT可從Fort Dodge Animal Health，F(xiàn)ort Dodge，Iowa orWeesp，The Netherlands獲得。分別用5ml無(wú)菌水重懸浮三小管所述商業(yè)化疫苗(每小管的滴度為107.5 TCID50)，充分混合并匯集。所述疫苗隨后在無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中進(jìn)一步稀釋，得到最終懸浮液為每0.1ml疫苗含103.2TCID50。
如下制備攻擊病毒。來(lái)自UK株BUT 8544(見第12頁(yè))的TRTV在氣管器官培養(yǎng)物(下文稱為“TOC”)中傳代23次，在幼禽傳代一次，再分離，然后在TOC中再傳代一次。該攻擊病毒的滴度是每ml 104.5TCID50。
孵化18天后，用0.1ml上文所述包含103.2TCID50的重建TRT疫苗卵內(nèi)接種57枚受精卵。所述蛋立即置于孵化器內(nèi)(不用旋轉(zhuǎn))，使它們?cè)诟髯苑胖玫母綦x欄內(nèi)孵化。孵出后，從孵化器中取出40只雞，置于地板的刨花上。
若干(110)受精卵不免疫/接種，分別孵化。孵出后一天，取四十只雞置于第二個(gè)隔離欄內(nèi)作為陰性對(duì)照雞。受到攻擊的對(duì)照雞稱為陽(yáng)性對(duì)照雞。
在第20、21、22和23天(第零天是孵化的第一天)記錄孵出。孵出后，人道處死多余的雞或用于取血。未接種蛋和接種蛋的孵化百分率分別是89％和91％這證明用滴度103.2TCID50進(jìn)行卵內(nèi)接種在孵化率方面是安全的。
在4周齡，從接種組以及陰性對(duì)照組各取十只雞，標(biāo)記翅膀，轉(zhuǎn)移進(jìn)第三個(gè)隔離欄。隨后使用在0.1ml內(nèi)含103.5TCID50(強(qiáng)毒)TRTV劑量的滴眼劑，給予每只雞上文所述的攻擊病毒。在6周齡，另外14只雞同樣接受TRTV強(qiáng)毒株攻擊。然而，由于這些雞的年齡增加，攻擊劑量增加到每只雞0.2ml共103.8TCID50(強(qiáng)毒)TRTV。
受攻擊的雞試驗(yàn)監(jiān)測(cè)14天，然后取血并處死。使用表13修正的臨床計(jì)分系統(tǒng)記錄所觀察到的征象。所述表13系統(tǒng)與上文實(shí)施例1所述的表2系統(tǒng)相似但并不相同。
表13修正的臨床計(jì)分系統(tǒng)
將每組內(nèi)每只雞在一天內(nèi)各自的分?jǐn)?shù)相加，計(jì)算得到每組雞的日總分?jǐn)?shù)。累計(jì)分?jǐn)?shù)是平均日分?jǐn)?shù)的加和。使用χ2檢驗(yàn)分析所述數(shù)據(jù)。將在組1接種組觀察到的總臨床表現(xiàn)與組2陽(yáng)性對(duì)照在4周齡攻擊和6周齡攻擊同樣天數(shù)觀察到的總臨床表現(xiàn)進(jìn)行比較。該監(jiān)測(cè)得到下面結(jié)果。
在用強(qiáng)毒TRTV株以滴度103.5TCID50進(jìn)行的4周攻擊中，僅在第6和7天觀察到臨床表現(xiàn)，-兩組(組1和2)都在第6天觀察到最多征象。在接種組(組1)中，僅30％的雞在攻擊后顯示臨床表現(xiàn)，每只雞的累積平均分?jǐn)?shù)是0.6。在組1中，十只雞中有七只完全沒(méi)有臨床表現(xiàn)。將在接種雞中觀察到的總臨床表現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照雞的臨床表現(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。雖然接種雞顯示比陽(yáng)性對(duì)照雞更輕的臨床表現(xiàn)，但這些結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著(0.2＜P＜0.3)。
在用強(qiáng)毒TRTV株以滴度103.8TCID50進(jìn)行的6周齡攻擊中，觀察陽(yáng)性對(duì)照雞臨床表現(xiàn)的時(shí)間比4周齡更低劑量攻擊的后觀察的時(shí)間更長(zhǎng)。然而，在接種雞中，僅觀察臨床表現(xiàn)一天。在陽(yáng)性對(duì)照雞中，57％顯示臨床表現(xiàn)，每只雞的累積分?jǐn)?shù)是1.35。在該組的14只雞中，6只保持完全沒(méi)有臨床表現(xiàn)。一只雞在觀察期的第5和6天顯示嚴(yán)重臨床表現(xiàn)，隨后在攻擊后第九天死去。對(duì)該雞的尸體剖檢揭示右心室擴(kuò)大、心靜脈充血、肺充血、氣管內(nèi)過(guò)量粘液以及肝表面的纖維素性滲出物。可能死因是右心衰竭和可能的肝炎。與此不同，接種組僅14％的雞在攻擊后顯示臨床表現(xiàn)，每只雞的累積分?jǐn)?shù)是0.14。在該組的14只雞中，12只保持完全沒(méi)有臨床表現(xiàn)。使用χ2分析，對(duì)接種組(組1)中觀察到的總臨床表現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照雞(組2)內(nèi)觀察到的總臨床表現(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。該分析證明在接種組內(nèi)觀察到的臨床表現(xiàn)比在陽(yáng)性對(duì)照雞中觀察到的臨床表現(xiàn)顯著更輕(0.02＜P＜0.05)。
表14、15和16分別顯示上文討論的4周齡攻擊、6周齡攻擊和χ2統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果。
表144周攻擊的臨床表現(xiàn)
表156周齡攻擊的臨床表現(xiàn)
表9卡方分析臨床分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)
除監(jiān)測(cè)組1和2的雞的TRT臨床表現(xiàn)外，還對(duì)所述雞進(jìn)行血清學(xué)分析其中通過(guò)在Leahurst，Liverpool，(U.K.)發(fā)展的應(yīng)用A型抗原的ELISA技術(shù)測(cè)定各個(gè)血液樣品中的抗TRTV抗體，并表示為2log滴度。2log滴度＞6.0的抗體滴度定為陽(yáng)性。使用用于非配對(duì)數(shù)據(jù)的斯氏t檢驗(yàn)對(duì)所述結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。表17和18顯示組1和2受攻擊的雞分別在4周齡攻擊和6周齡攻擊中獲得的血清學(xué)結(jié)果。在表17和18中，“PC”指攻擊后。
表17TRTV抗體滴度(4周攻擊)
表18TRTV抗體滴度(6周齡攻擊)
另外對(duì)未用TRTV強(qiáng)毒株攻擊的那些雞進(jìn)行相似的血清學(xué)分析，其中使用Mossbank親代種雞群(Marshalls Agriculture)5個(gè)不同氣隙的雞在25周齡和41周齡取來(lái)的每個(gè)空間十個(gè)血清樣品。表19顯示來(lái)自親代種雞群的這些雞的平均抗體滴度。
表19親代種雞群的平均抗體滴度
對(duì)于未受攻擊的接種雞和未受攻擊的陰性對(duì)照雞，在1日齡和4、6和8周齡收集血液。表20顯示所述未受攻擊雞的平均抗體滴度。
表20未受攻擊雞的平均抗體滴度
對(duì)于受到攻擊的接種雞和受到攻擊的陽(yáng)性對(duì)照雞，在4周攻擊/組和6周齡攻擊/組中，在攻擊后14天收集血液。表21顯示在這2個(gè)組中受到攻擊雞的平均抗體滴度。
表21攻擊后14天受攻擊雞的滴度
各個(gè)結(jié)果支持上面表14-21顯示的數(shù)據(jù)。根據(jù)上述血清學(xué)分析，得出下面結(jié)論。對(duì)于接種雞和陰性對(duì)照雞，在1日齡，這些雞具有抗TRTV的母體抗體(MA)。在4周齡，陰性對(duì)照雞的抗體水平降到陰性范圍并在試驗(yàn)剩余時(shí)間保持低水平。在用從Poulvac_TRT制備的疫苗以滴度103.2TCID50卵內(nèi)給予后，平均抗體滴度保持在陰性范圍內(nèi)(即低于6.0的陽(yáng)性判斷值)，但隨著年齡增加而增加。在4、6和8周齡，接種雞的平均抗體滴度水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著高于陰性對(duì)照的所述水平。從4周齡開始，20％到22％的接種雞具有陽(yáng)性滴度。在受到攻擊的雞中，所有雞在攻擊后14天都表現(xiàn)血清轉(zhuǎn)變。在4周攻擊研究和6周齡攻擊研究中，接種組的平均滴度高于陽(yáng)性對(duì)照雞的平均滴度，并且這種差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(P＜0.05)。
對(duì)實(shí)施例4整體的分析(包括實(shí)驗(yàn)獲得的測(cè)量、結(jié)果以及相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析)指出在18天孵化用從Poulvac_TRT制備的疫苗以每蛋103.2TCID50劑量滴度卵內(nèi)接種母體抗體陽(yáng)性(MA+)的商業(yè)化肉雞蛋不對(duì)孵化率有副面影響，并且所述接種提供可靠、高效率和有效的疫苗給予方法。該疫苗還在用TRTV在6周齡攻擊時(shí)賦予顯著保護(hù)-此時(shí)所觀察到的臨床表現(xiàn)顯著減少。在4周齡有一定程度的保護(hù)-然而，這個(gè)時(shí)候甚至在未接種陽(yáng)性對(duì)照雞觀察到的臨床表現(xiàn)也不十分嚴(yán)重。因此，雖然存在對(duì)4周齡攻擊所賦予的保護(hù)，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。
本實(shí)施例4數(shù)據(jù)以及上文實(shí)施例1-3的數(shù)據(jù)結(jié)合證明雞對(duì)TRT疫苗的敏感性要低得多。卵內(nèi)接種后沒(méi)有觀察到陽(yáng)性的平均抗體滴度(高于6.0的判斷值)。然而，在接種組中的該水平顯著高于陰性對(duì)照中觀察到的水平。約五分之一的接種雞在4周齡后有陽(yáng)性滴度。因此，在攻擊時(shí)，總血清轉(zhuǎn)變達(dá)到ELISA水平高于6.0可能不是衡量卵內(nèi)接種所實(shí)際賦予的保護(hù)的好指標(biāo)。局部免疫可能在所誘導(dǎo)的保護(hù)和實(shí)驗(yàn)測(cè)定的滴度的相互作用間起作用。
在分析上文實(shí)驗(yàn)1-4前，已經(jīng)推定母體抗體的存在會(huì)副面影響疫苗的有效性。實(shí)施例4仍然并且令人吃驚地證明以每蛋滴度103.2TCID50卵內(nèi)給予TRT疫苗有效降低MA+雞的臨床TRT疾病。實(shí)施例4增強(qiáng)并延伸了在上面實(shí)施例3獲得的結(jié)論；即同樣接受卵內(nèi)接種的SPF(MA-)雞表現(xiàn)臨床疾病減少。
實(shí)施例5研究TRT疫苗聯(lián)合其它禽疫苗在本研究中使用下面縮寫AHSAnimal Health Service，Deventer，The Netherlands
BCBiochek，Gouda，The NetherlandsCVL Central Veterinary Laboratory，Weybridge，UKEID50 50％蛋感染劑量ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定FAT 熒光抗體測(cè)定HI血凝抑制IB傳染性氣管炎IBD 傳染性滑液囊病i.m. 肌內(nèi)MDMarek氏病ND新城病P 概率TCID5050％組織培養(yǎng)感染劑量TRT 火雞鼻氣管炎本研究使用下面疫苗材料Poulvac_TRT，批號(hào)TR02100和TR02200，每劑量分別含104.1和104.1TCID50 TRT病毒。
Poulvac_Ovoline ND，批號(hào)BB010，每小管含103.9 EID50 ND病毒(每小管5000劑量)。
Bursamune IN OVO，批號(hào)61640，每小管含5000劑量。
Poulvac_Marek HVT lyo，批號(hào)350129，含MD病毒FC126株(每小管1000劑量)。
Poulvac_NDW，批號(hào)BL03200和BL04302。
Poulvac_IB Primer，批號(hào)CX02301，每劑量含105.0 EID50 IB病毒血清型M41和D207(D274克隆)(每小管1000劑量)。
Poulvac_Bursa Plus，批號(hào)62481，每小管含103.2 EID50 IBD病毒V877株(每小管2000劑量)。
除Bursamune IN OVO外，所有疫苗都由Fort Dodge AnimalHealth Benelux，Weesp，The Netherlands提供。Bursamune IN OVO得自Fort Dodge Animal Health，Australia。
各批疫苗避光保存在0-8℃直到使用，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書使用。重建后，在兩小時(shí)內(nèi)使用疫苗。制備下面疫苗稀釋物。
用Poulvac_Marek稀釋劑(批號(hào)C8109)重建并進(jìn)一步稀釋卵內(nèi)接種組1 Poulvac_TRT(批號(hào)TR02100)、Poulvac_Ovoline ND和Bursamune IN OVO的疫苗稀釋物。每種疫苗最終稀釋物在0.05ml內(nèi)含一個(gè)商業(yè)化劑量。
用Poulvac_Marek稀釋劑(批號(hào)C8109)重建并進(jìn)一步稀釋肌內(nèi)接種組1和2抗MD Poulvac_Marek HVT lyo的疫苗稀釋物。所述稀釋物在0.5ml內(nèi)含一個(gè)商業(yè)化劑量。
用2.2升軟化水重建并進(jìn)一步稀釋粗噴霧(coarse spray)接種組1Poulvac_IB Primer的疫苗稀釋物。所述稀釋物在0.5ml內(nèi)含一個(gè)商業(yè)化劑量。
用3升軟化水重建并進(jìn)一步稀釋粗噴霧接種組2 Poulvac_NDW(批號(hào)BL04302)、Poulvac_IB Primer和Poulvac_TRT(批號(hào)TR02200)的疫苗稀釋物。最終稀釋物在0.5ml內(nèi)含一商業(yè)化劑量。
用自來(lái)水重建并進(jìn)一步稀釋抗飲用水IBD接種組2的三小管Poulvac_Bursa Plus的疫苗稀釋物。
用軟化水重建并進(jìn)一步稀釋用于抗ND接種組1和2的Atomistspray Poulvac_NDW(批號(hào)BL03200)的疫苗稀釋物，直到最終稀釋物在0.5ml內(nèi)含一商業(yè)化劑量。
14895枚用于生產(chǎn)肉雞的Cobb品種商業(yè)化蛋得自Pronk，Meppel，The Netherlands，將這些蛋置于Fort Dodge AHH，Muiden，TheNetherlands實(shí)驗(yàn)農(nóng)莊內(nèi)位于MUK-5/6的一個(gè)孵化器內(nèi)。所有蛋孵化17天后透光檢查。去除未受精的蛋或死胚蛋。
600l枚分配到組1的蛋接種每蛋0.05ml含1劑量Poulvac_TRT、Poulvac_Ovoline ND和Bursamune IN OVO的稀釋物，所述接種使用Embrex Inovoject蛋注射機(jī)按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)進(jìn)行。6028枚分配到組2的蛋不接種。
已接種(組1)和未接種(組2)的蛋分別置于Fort Dodge AHH，Muiden，The Netherlands實(shí)驗(yàn)農(nóng)莊孵化器1和4內(nèi)，繼續(xù)孵化(不用旋轉(zhuǎn))直到孵出。孵出后，分別有4452只雞(接種，組1)和5248只雞(未接種，組2)進(jìn)入本研究。這些雞按組安置在Fort Dodge AHH，Muiden，The Netherlands實(shí)驗(yàn)農(nóng)莊同一平房?jī)?nèi)動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施的木刨花上。組1的雞安置在MUL-L，組2的雞安置在MUL-R。所有雞自由取食商業(yè)化肉用仔雞飼料(broiler pellet)，自由飲用漏斗飲水器內(nèi)的水。
接種計(jì)劃見表22。在一日齡，用Poulvac_IB Primer接種組1的雞。使用花園噴霧器(Gardena)通過(guò)粗噴霧按每只雞0.5ml給予一商業(yè)化劑量。在一日齡，用Poulvac_TRT、Poulvac_NDW和Poulvac_IB Primer接種組2的雞。與組1相同，通過(guò)粗噴霧按每只雞0.5ml給予一商業(yè)化劑量每種疫苗。在粗噴霧接種前，將雞置于雞盒(chickenbox)中，直到接種后3小時(shí)。
所有雞都在一日齡按每只雞一商業(yè)化劑量接種Poulvac_MarekHVT lyo。使用Pullet Injection Gun(Veterinary Supplies，Mijdrecht，TheNetherlands)，預(yù)設(shè)體積0.5ml，在大腿肌內(nèi)施用所述疫苗。
組2的雞在2周齡接種Poulvac_Bursa Plus，所述疫苗用飲用水給予，每只雞一商業(yè)化劑量。將所述疫苗分配在一定量的水中，在2小時(shí)內(nèi)喂食。給予所述疫苗前2小時(shí)內(nèi)，禁止雞飲水。
所有雞在4周齡接種Poulvac_NDW。通過(guò)霧化器按每只雞0.5ml共一商業(yè)化劑量應(yīng)用。
表22接種計(jì)劃
每組30只雞在一日齡斷頭后取血液樣品。每組取10只雞的血液樣品，在AHS進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)。每組取另外10只雞的樣品，在Central Veterinary Laboratory，Weybridge，UK(CVL)進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)。剩余的10個(gè)樣品在BC進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)。每組在2、3、4、5和6周齡從翅脈取血液樣品，直到最多24只雞。
使用HI檢驗(yàn)測(cè)定針對(duì)ND、IB M41和IB D274抗原的抗體滴度。HI檢驗(yàn)的檢測(cè)限對(duì)于ND抗原是2log HI滴度＝1.0，對(duì)于IB抗原是2log HI滴度＝3.0。計(jì)算HI滴度的幾何平均值。使用ELISA方法(IDEXX)，根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)測(cè)量針對(duì)TRT和IBD病毒的抗體滴度，計(jì)算平均滴度。這些檢驗(yàn)在AHS完成。
BC完成使用ELISA方法滴定針對(duì)ND、IB、TRT和IBD的抗體滴度。針對(duì)ND和IB病毒的ELISA抗體滴度分別在1159和834或以上時(shí)被認(rèn)為是陽(yáng)性。也使用IDEXX檢測(cè)試劑盒測(cè)定針對(duì)ND病毒的抗體滴度(在396或以上被認(rèn)為是陽(yáng)性)和針對(duì)IB病毒的抗體滴度。使用BC99軟件計(jì)算平均滴度。
對(duì)AHS和CVL獲得的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)斯氏雙側(cè)t檢驗(yàn)就抗體滴度比較這兩個(gè)組。針對(duì)IBD、TRT和MD的ELISA抗體滴度在分析前進(jìn)行l(wèi)og轉(zhuǎn)換(log[x+1])?！?600和陰性MD測(cè)量值在計(jì)算中分別用1600和25取代。概率P≤0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。
結(jié)果表23和24顯示AHS和BC測(cè)定的針對(duì)ND、IB、IBD和TRT抗原的平均滴度。
表23AHS測(cè)定的針對(duì)ND、IB M41、IB D274、IBD和TRT的平均抗體滴度。
*與組1在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(P≤0.05)。
表24BC測(cè)定的針對(duì)ND、IB、IBD和TRT的平均抗體滴度。
表25顯示對(duì)MD病毒的平均FAT滴度，該滴度代表呈現(xiàn)特異性熒光的平均血清稀釋度。組2在2、3和4周齡觀察到在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更高的FAT滴度，這顯示在所述禽的更年輕年齡有更高的免疫反應(yīng)。
表25對(duì)MD病毒的平均FAT滴度。
*與組1在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(P≤0.05)。
實(shí)施例5-討論兩組的雞都有抗ND、IB、IBD、TRT和MD病毒的MA。在一日齡接種后觀察到對(duì)ND和IB的血清反應(yīng)。兩組內(nèi)對(duì)這些抗原的滴度產(chǎn)生都在正常范圍內(nèi)。使用Poulvac_NDW的第二次接種在兩組中都誘導(dǎo)血清反應(yīng)。兩組都發(fā)展對(duì)IBD、TRT和MD病毒的抗體滴度。
在許多情況下，觀察到各組間抗體滴度上的某些差異。組1(從接種蛋孵出的雞)中對(duì)ND的抗體滴度在所有情況下都相對(duì)更高(6周齡除外)。組1中對(duì)TRT的抗體滴度在所有情況下都相對(duì)更高，除6周齡外，這些差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上都是顯著的。組1中對(duì)MD的血清反應(yīng)有點(diǎn)慢，但達(dá)到組2在5周齡的同樣水平。沒(méi)有觀察到各組間在對(duì)IB和IBD抗原的平均抗體滴度上有明顯差異。在大多數(shù)情況下，BC完成的滴定結(jié)果的模式與AHS所獲得的結(jié)果的模式相同，對(duì)IBD和TRT的ELISA滴度值更高。BC測(cè)試在3周齡顯示對(duì)IBD的血清反應(yīng)，這比在IDEXX測(cè)試中出現(xiàn)血清反應(yīng)早一周。BC ELISA測(cè)試對(duì)于測(cè)量針對(duì)ND的抗體滴度看起來(lái)比HI方法更敏感。BC ELISA測(cè)試從3周齡起顯示比HI方法更明顯的對(duì)IB病毒的反應(yīng)。
下面兩種接種在功效上是一致的一種是孵化18天后用一商業(yè)化劑量Poulvac_TRT、Poulvac_Ovoline ND和Bursamune IN OVO卵內(nèi)接種用于生產(chǎn)肉雞的商業(yè)化蛋，然后在一日齡接種Poulvac IBPrimer和Poulvac_HVT；第二種是孵出的雞在一日齡接種商業(yè)化劑量的Poulvac TRT、Poulvac_NDW、Poulvac_IB Primer和Poulvac_Marek HVT lyo，然后在2周齡接種Poulvac_Bursa Plus。
與HI檢測(cè)測(cè)量針對(duì)ND、IB M41和IB D274的抗體滴度水平或IDEXX檢測(cè)試劑盒測(cè)量針對(duì)IBD或TRT的抗體滴度水平相比，BCELISA檢測(cè)試劑盒看起來(lái)對(duì)于測(cè)量針對(duì)ND、IB、IBD和TRT病毒抗原的抗體滴度水平更有利。
表26到35提供其它抗體滴度結(jié)果。
表26.AHS測(cè)定的對(duì)ND病毒的HI抗體滴度。
表27.AHS測(cè)定的對(duì)IB M41抗原的HI抗體滴度。
表28.AHS測(cè)定的對(duì)IB D274抗原的HI抗體滴度。
表29.AHS測(cè)定的對(duì)IBD病毒的各個(gè)ELISA抗體滴度。
表30.AHS測(cè)定的對(duì)TRT病毒的各個(gè)ELISA抗體滴度。
表31.在CVL測(cè)定的對(duì)MD病毒的各個(gè)FAT滴度。
表32.BC測(cè)定的對(duì)ND病毒的各個(gè)ELISA抗體滴度。
表33.BC測(cè)定的對(duì)IB病毒的各個(gè)ELISA抗體滴度。
表34.BC測(cè)定的對(duì)IBD病毒的各個(gè)ELISA抗體滴度。
表35.BC測(cè)定的對(duì)TRT病毒的各個(gè)ELISA抗體滴度。
雖然已經(jīng)在上文相當(dāng)詳細(xì)地描述本發(fā)明，但申請(qǐng)人要求在參考上面教導(dǎo)但不限于任何具體公開的實(shí)施例的情況下，專利保護(hù)下述權(quán)利要求定義和確定的專利保護(hù)范圍，并且在所有情況下，所述專利保護(hù)范圍與符合本申請(qǐng)精神和范圍的權(quán)利要求的最大可能范圍一致。
權(quán)利要求
1.一種保護(hù)禽類宿主避免TRT和/或TRT或SHS相關(guān)性呼吸窘迫的方法，所述方法包括將疫苗卵內(nèi)給予包含所述禽類宿主胚的受精卵，所述疫苗包含免疫原性有效量的火雞鼻氣管炎病毒活體減毒株，所述免疫原性有效量大致范圍為每枚蛋約103.2TCID50到每枚蛋約104.5TCID50，其中在孵化第24天或之前給予所述疫苗。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫原性有效量使用每枚蛋約0.05到0.1ml的合適媒介物給予。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述免疫原性有效量是每枚蛋約103.2TCID50。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述免疫原性有效量是每枚蛋約104.2TCID50。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述禽類宿主是火雞或雞胚。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述給予在孵化約18天(雞)或孵化約24天(火雞)進(jìn)行。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述禽類宿主或者是火雞或者是雞胚。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述禽類宿主是火雞胚。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述禽類宿主是雞胚。
10.一種保護(hù)火雞和雞免不受火雞鼻氣管炎病毒強(qiáng)毒株影響的方法，所述方法包括卵內(nèi)給予受精卵疫苗，該疫苗以每枚蛋計(jì)包含免疫原性有效量的火雞鼻氣管炎病毒活體減毒株，其中所述疫苗的應(yīng)用使蛋孵出率降低約2％以下。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述免疫原性有效量在每枚蛋約103.2TCID50到每枚蛋約104.2TCID50的大致范圍內(nèi)。
12.一種保護(hù)火雞和/或雞不受強(qiáng)毒火雞鼻氣管炎病毒影響的卵內(nèi)疫苗，所述疫苗以每枚蛋計(jì)在緩沖溶液中包含免疫原性有效量的火雞鼻氣管炎病毒活體減毒株，所述免疫原性有效量為約103.2TCID50到約104.2TCID50。
13.權(quán)利要求11的疫苗，其中所述免疫原性有效量疫苗有效保護(hù)火雞和/或雞孵出后不受強(qiáng)毒火雞鼻氣管炎病毒的影響；而且不會(huì)使孵化期結(jié)束后卵內(nèi)接種火雞蛋和/或雞蛋的孵出率明顯降低。
14.權(quán)利要求13的疫苗，其中所述免疫原性有效量是約104.2TCID50。
15.一種接種家禽使其免患火雞鼻氣管炎疾病的方法，所述方法包括卵內(nèi)給予在藥學(xué)可接受載體內(nèi)的免疫原性有效量的TRT病毒活體減毒株，所述免疫原性有效量在至少每枚蛋約103.2TCID50到每枚蛋約104.2TCID50的范圍內(nèi)。
16.權(quán)利要求15的方法，所述方法還包括與所述TRT一起給予至少一種選自以下的其它疫苗新城病疫苗和傳染性滑液囊病疫苗。
17.權(quán)利要求16的方法，所述方法還包括給予至少一種選自以下的疫苗傳染性支氣管炎疫苗和Marek氏病疫苗，其中所述疫苗在卵內(nèi)給予后給予。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述在卵內(nèi)給予后給予的疫苗在約1日齡給予。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述方法不會(huì)使孵出蛋的數(shù)量明顯降低。
20.權(quán)利要求15的方法，其中所述方法使蛋的孵出率降低約5％以下。
21.權(quán)利要求21的方法，其中所述方法使蛋的孵出率降低約1％以下。
22.一種提高TRTV滴度的方法，所述方法包括配制減毒TRTV抗原的卵內(nèi)疫苗，然后給予所述疫苗，從而可以給予在每枚蛋約0.05到0.1ml媒介物內(nèi)含每枚蛋約103.2到約104.5范圍內(nèi)的TCID50。
全文摘要
保護(hù)禽類宿主(如火雞和/或雞)免受火雞鼻氣管炎病毒和/或TRT或SHS呼吸窘迫的方法和組合物，卵內(nèi)給予每蛋合適劑量水平的TRTV活體減毒株，以提供具有可接受安全性和功效特征的有效高效免疫，并且還在接種的禽中提供比常規(guī)給予的疫苗更高的滴度。
文檔編號(hào)A61P31/14GK1486206SQ01822109
公開日2004年3月31日 申請(qǐng)日期2001年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月21日
發(fā)明者F·G·達(dá)維拉爾, F G 達(dá)維拉爾 申請(qǐng)人:惠氏公司