專利名稱：乙酰乳香酸在制備抗腫瘤劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥乳香中提取的五環(huán)三萜類成分，乙酰乳香酸(BC-4)在制備抗腫瘤劑應(yīng)用中的新用途，即藥物的第二次使用。
中藥乳香(Boswellia carterii Birdw.)具活血止痛、解毒消腫等功效。乙酰乳香酸(BC-4)是從中藥乳香中提取的五環(huán)三萜類成分，分子量為498.3，無色針狀結(jié)晶，由化合物α-BC-4及β-BC-4按1∶1組成，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示 在以往的研究中注重于抗炎作用的探討，并認(rèn)為其非甾體抗炎活性與其抑制5-脂氧酶(5-LO)活性從而抑制白三烯的合成有關(guān)(Safayhi H，Mack T，Sabieraj J，et al.J Pharmacol Exp Ther，1992，2611143-1146.)。在對BC-4活性篩選中，發(fā)現(xiàn)其對HL-60白血病細(xì)胞具有較強(qiáng)的分化誘導(dǎo)作用(Jing YK，Xia LJ and Rui H.Chinese Medical Sciences J，1992，712.)，且當(dāng)大豆甙元與BC-4聯(lián)合應(yīng)用時，對細(xì)胞增殖的抑制作用和分化誘導(dǎo)作用明顯增強(qiáng)(景永奎，韓銳.藥學(xué)學(xué)報，1993，2811.)。早期的研究發(fā)現(xiàn)其亦是一個拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，這方面的作用已公開在美國專利5064823中，
公開日期為1991年11月12日；及中國專利CN1041204C中，公告日期為1998年12月16日。近年來，乳香酸抗腫瘤活性引起了廣泛注意。研究結(jié)果顯示，BC-4低濃度時對多種髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞有廣泛的誘導(dǎo)分化作用，高濃度時則能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡(Jing Y，Nakajo S，Xia L，et al.Leuk Res，1999，2343-50.)。
本發(fā)明的另一個目的是提供乙酰乳香酸(以下簡稱BC-4)在腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑中的應(yīng)用。
1.制備方法及化合物的結(jié)構(gòu)將生藥乳香珠用95％的乙醇滲漉，得浸滲漉；減壓回收溶劑，得乙醇浸膏。將得到的乙醇浸膏溶解于石油醚-乙酸乙酯混合溶劑中，加碳酸鈉溶液調(diào)至pH10，石油醚-乙酸乙酯混合溶劑萃取三次，水相再用4N鹽酸調(diào)至pH3，石油醚-乙酸乙酯混合溶劑萃取三次，有機(jī)相用水洗滌兩次，無水硫酸鈉脫水，過濾，濃縮至干，加甲醇濃縮發(fā)泡得到乳香總酸發(fā)泡物。然后將乳香總酸進(jìn)行硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，得到乙酰乳香酸α、β異構(gòu)體混合物粗品，再進(jìn)行重結(jié)晶，得到乙酰乳香酸α、β異構(gòu)體混合物(1∶1)結(jié)晶。其分子量為498.3，無色細(xì)針狀結(jié)晶，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示 HPLC檢測含BC-4-α及BC-4-β的保留時間分別為11.70分鐘及12.79分鐘(

圖1)。2.藥理作用1)現(xiàn)有技術(shù)中BC-4的作用現(xiàn)有技術(shù)中，BC-4是一拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑及細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，能抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I(圖2)及拓?fù)洚悩?gòu)酶II(圖3)活性，人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞經(jīng)BC-4誘導(dǎo)后，向成熟細(xì)胞分化(Lu.Y andHan R.Acta Academia Medica Sinica，1986，8(37)211-214)。以BC-4作用于HL-60細(xì)胞5天后細(xì)胞的NBT還原能力見表1。
表1BC-4對HL-60人白血病細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用濃度(μg/ml) NBT還原能力(％)1 2.5827.010 51.02)本發(fā)明的藥理新用途a.BC-4抗腫瘤細(xì)胞增殖作用將對數(shù)生長期細(xì)胞按1200個/孔接種于96孔板。次日棄培養(yǎng)基，換含不同濃度藥物及相應(yīng)溶劑對照的新鮮培養(yǎng)基，每組平行6孔，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)4天后，棄上清，每孔加100μl新鮮配制的含0.4mg/mlMTT的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4hrs，棄培養(yǎng)上清，加100μl DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振蕩器振蕩混勻，在Bio-Rad 550型酶標(biāo)儀上測定550nm處光密度值，按下式計算腫瘤細(xì)胞存活率，并計算IC50。 研究表明，BC-4能抑制不同組織來源的惡性腫瘤細(xì)胞的生長(包括KB人上皮癌細(xì)胞、A2780人卵巢癌細(xì)胞、MCF-7人乳腺癌細(xì)胞、SHG-44人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、HCT-8人結(jié)腸癌細(xì)胞及A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)，結(jié)果見表2，其IC50從5.73μM到16.44μM。
表2BC-4對惡性腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用細(xì)胞系 IC50μg/ml(μM)KB (人上皮細(xì)胞癌) 5.356(10.71)A2780(人卵巢癌) 6.159(12.32)MCF-7(人乳腺癌) 2.866(5.73)SHG-44(人神經(jīng)膠質(zhì)瘤) 8.219(16.44)HCT-8(人結(jié)腸癌) 6.695(13.39)A549(人非小細(xì)胞肺癌) 6.159(12.32)CHL(中國倉鼠肺細(xì)胞) ＞10(＞20)b.BC-4誘導(dǎo)惡性細(xì)胞凋亡通過如下多種技術(shù)檢測BC-4對惡性腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用在蓋玻片上均勻涂上多聚賴氨酸，置于六孔培養(yǎng)板中，干3-5min后，加入70％乙醇滅菌30min，吸去乙醇，用PBS洗2次。將5×104細(xì)胞接種于培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)過夜后，加入一定濃度的藥物及溶媒對照，作用一定時間后，PBS洗一次，取出蓋玻片，固定于細(xì)胞運(yùn)動觀察室(制備同上)，在小室中填充凋亡檢測液(1ml結(jié)合緩沖液中含1μlAnnexin V-EGFP及1μl碘化吡啶)，室溫下避光作用5min后，反置于激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS 4D型)下觀察細(xì)胞凋亡。
細(xì)胞經(jīng)消化后用PBS洗一次，取細(xì)胞沉淀涂片，迅速風(fēng)干，用染液Wright染色1min，再用染液Giemsa染10min，蒸餾水沖洗，風(fēng)干，置油鏡下觀察細(xì)胞凋亡。
細(xì)胞制備成1×107/ml細(xì)胞懸液，取95μl細(xì)胞懸液加入5μl吖啶橙溶液(0.1mg/ml PBS，pH 6.8)，混勻后點(diǎn)樣于載玻片上，覆蓋蓋玻片后置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡。
細(xì)胞以PBS洗滌后，用2.5％戊二醛固定1h以上，經(jīng)PBS洗2次后用1％鋨酸(四氧化鋨)再固定1h，離心棄固定液，用蒸餾水洗2次。用2％醋酸鈾預(yù)染1h，離心棄染液，用蒸餾水洗2次。依次用35％-50％-75％-90％酒精脫水，每次5min，用環(huán)氧樹脂812浸泡，包埋，聚合后，組織塊超薄切片，檸檬酸鉛染色，在Hitachi800型電鏡下觀察細(xì)胞凋亡。
用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，PBS洗一次，加入50μl細(xì)胞裂解液(50mMTris-HCl，pH8.0，10mM EDTA，0.5％SDS，0.5mg/ml蛋白酶K)，置冰中40min，取出，加入RNA酶0.15mg/ml，37℃溫育至少1h，再加入蛋白酶K 1mg/ml，37℃溫育至少1h，加入上樣緩沖液后，將樣品于24V，1.7％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外燈下拍照觀察細(xì)胞凋亡引起的DNA損傷。
收集細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基洗一次，將細(xì)胞沉淀在暗處加入含0.5μlAnnexin V-EGFP的結(jié)合緩沖液500μl(10mM HEPES，pH7.4，140mMNaCl，2.5mM CaCl2)，室溫作用10min后，樣品管中加入等體積4％甲醛溶液，室溫固定15min后，12.0×103rpm離心1min，PBS洗一次，細(xì)胞沉淀中加入100μg/ml RNA酶A 100μl，37℃作用30min，加入含0.5μl碘化吡啶的結(jié)合緩沖液400μl，室溫作用10min后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。同時設(shè)立空白對照，樣品中僅加500μl結(jié)合緩沖液；Annexin V-EGFP對照，樣品中僅加含0.5μl Annexin V-EGFP的結(jié)合緩沖液500μl。流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson FACSCalibur型)檢測細(xì)胞凋亡信號，Annexin V-EGFP染色(Ex＝488nm，Em＝530nm)使用FITC信號檢測器(FL1)，碘化吡啶染色使用FL2信號檢測器。
以上檢測結(jié)果如下i.人膀胱癌細(xì)胞以BC-4 75μM作用于T24人膀胱癌細(xì)胞8小時，即可見細(xì)胞凋亡的發(fā)生，表現(xiàn)為磷脂酰絲氨酸由磷脂雙層膜的內(nèi)層翻轉(zhuǎn)到磷脂雙層膜的外層(圖4)，并出現(xiàn)DNA梯帶。流式細(xì)胞儀檢測表明，以BC-4 75μM作用于T24細(xì)胞24小時后，細(xì)胞凋亡百分率可達(dá)77.2％(圖5)。
ii.人乳腺癌細(xì)胞研究結(jié)果顯示，MDA-MB-468、轉(zhuǎn)染pCMV-HER2質(zhì)粒的MDA/HER-2及其導(dǎo)入空白質(zhì)粒的陰性對照細(xì)胞MDA/NEO對BC-4引起的凋亡均較敏感(圖6)。
iii.IFNγ對MV3人黑色素瘤細(xì)胞的凋亡增敏作用IFNγ500U/ml作用于MV3細(xì)胞72小時后，可下調(diào)HMW-MAA、αv、TAA等表面抗原的表達(dá)，經(jīng)IFNγ500U/ml作用72小時的MV3細(xì)胞對BC-4引起的凋亡信號卻較為敏感。以BC-4作用于IFNγ處理的MV3細(xì)胞，8小時后即可引起49.2％細(xì)胞凋亡(圖7)。
iv.人纖維肉瘤細(xì)胞BC-4在低濃度下，可劑量依賴性地抑制人纖維肉瘤細(xì)胞HT-1080細(xì)胞分泌金屬蛋白酶MMP-2及MMP-9(圖8)。用50μM以上濃度BC-4作用于HT-1080細(xì)胞24小時，能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)完整，但細(xì)胞染色質(zhì)固縮、細(xì)胞核裂解分成碎塊。Wright-Giemsa染色、吖啶橙熒光染色及電鏡觀察均在HT-1080細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體(圖9)，DNA分析檢測出DNA梯帶(圖10)。BC-4引起的HT-1080細(xì)胞凋亡具有劑量和時間依賴性，當(dāng)以BC-4 50μM作用36小時后，凋亡細(xì)胞百分率由對照組的0.42％增加至59.3％；當(dāng)以BC-4 75μM作用24小時后，凋亡細(xì)胞百分率則增加至76.5％(圖11)。
c.BC-4對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用利用[3H]-TdR摻入DNA、[3H]-UdR摻入RNA及[3H]-Leu摻入蛋白質(zhì)觀察BC-4對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化計數(shù)制成1×105/ml細(xì)胞懸液，按每孔200μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12hrs，棄去培養(yǎng)基，換含不同濃度藥液及溶劑對照的培養(yǎng)基，每組平行4孔，于37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24hrs。在終止作用前4hrs，每孔加放射性同位素標(biāo)記的前體物1μCi。棄去含同位素的培養(yǎng)基，每孔加200μl胰酶于37℃消化20min，用自動細(xì)胞收集器將每孔細(xì)胞分別收集于玻璃纖維膜上，蒸餾水反復(fù)沖洗20次，取出膜置于紅外烤箱中80℃干烤15min，對號剪下各膜片，置于裝有4ml閃爍劑(0.4％PPO，0.01％POPOP的二甲苯溶液)的液閃杯中，暗處放置15min后用Beckman LS-9800型液閃計數(shù)儀測定dpm值。
以BC-4 75μM作用于原代培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞24小時，未引起細(xì)胞凋亡，表明BC-4對正常人體細(xì)胞的毒性較小(圖12)。不同濃度的BC-4作用于EC-304人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可不同程度地抑制[3H]-TdR、[3H]-UdR、[3H]-Leu摻入細(xì)胞，顯示對細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成有抑制作用(表3)。表3BC-4對EC-304人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成的影響[3H]-TdR摻入 [3H]-UdR摻入 [3H]-Leu摻入蛋白質(zhì)組別 DNA RNAdpmdpm dpm對照 19734.50±2431.745743.67±782.79 3586.33±684.36BC-4 15446.03±5290.444729.00±688.91 2949.67±360.155M9480.58±3220.91**4845.00±517.95 2436.67±991.0410M3513.33±887.52**2437.33±185.04**2340.67±497.4620M2466.33±1486.20**553.67±150.60**1827.67±78.64**40M與對照組比較**，p＜0.01d.BC-4對動物移植性腫瘤的抑制作用選擇腫瘤生長良好，全身狀態(tài)較好的荷瘤BDF1小鼠，頸椎脫臼處死。固定后碘酒酒精消毒，無菌條件下取出瘤塊，稱重、研磨、勻漿、過濾，勻漿后以生理鹽水1∶3稀釋，計數(shù)每毫升漿液中的瘤細(xì)胞數(shù)，給每只小鼠腋下接種0.2ml瘤液(2×106細(xì)胞)。次日將動物隨機(jī)分組并給藥。于接種24hrs后腹腔注射給藥，設(shè)25、50、100mg/kg三劑量組，同時設(shè)環(huán)磷酰胺陽性對照組及空白對照組，連續(xù)給藥10天后，頸椎脫臼處死，分別稱取體重、瘤重。計算腫瘤生長抑制率(％)，并將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。 動物移植性腫瘤模型研究表明BC-4以25、100mg/kg劑量腹腔注射給藥對S180小鼠肉瘤生長有一定抑制作用，其抑制率分別為40.9％和37.6％。研究結(jié)果還顯示，BC-4對小鼠毒性較低，未引起小鼠體重的明顯減輕(表4)。
表4BC-4對S180小鼠肉瘤生長的影響動物數(shù)體重 抑制率組別瘤重開始結(jié)束 開始 結(jié)束 (％)對照 10 10 18.2±1.23 27.5±1.5 3.40±1.361環(huán)磷酰胺100mg/kg×1 10 10 18.4±1.07 21.6±3.5 0.3±0.23**90.7天7BC-425mg/kg×10 10 10 18.9±0.74 24.6±3.1 2.00±0.70**40.9天050mg/kg×10 10 10 18.8±0.63 26.0±1.9 2.50±1.03 25.1天4100mg/kg×10 11 11 18.9±0.70 26.5±2.3 2.10±1.2*37.6天0與對照組比較*p＜0.05，**p＜0.01e.BC-4對B16BL6小鼠黑色素瘤自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)性治療收集對數(shù)生長期的B16BL6小鼠黑色素瘤細(xì)胞，重懸于滅菌生理鹽水中，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107/ml。于C57BL/6小鼠后肢爪墊皮下注射50μl瘤細(xì)胞液，次日將動物隨機(jī)分組并連續(xù)給藥3周。設(shè)BC-4 50、100mg/kg組、紫杉醇2.5、5mg/kg組、BC-4(50mg/kg)聯(lián)合紫杉醇(2.5mg/kg)組，同時設(shè)陰性對照組，每組15只小鼠。接種瘤液3周后，稱體重，用乙醚麻醉小鼠，結(jié)扎股動脈，截去荷瘤下肢，分離瘤塊，稱重，計算腫瘤生長抑制率(％)。停藥一天，連續(xù)給藥3周，手術(shù)后一周稱體重，于末次給藥24小時后，頸椎脫臼處死，稱體重，解剖取肺，用Bouin’s液固定肺組織并稱重，在Olympus解剖顯微鏡下(10倍)計數(shù)肺表面腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)并測量直徑，按轉(zhuǎn)移灶的大小分級I級，直徑＜0.5mm，II級，0.5mm≤直徑＜1mm，III級，1mm≤直徑≤2mm，IV級直徑＞2mm?？傓D(zhuǎn)移數(shù)＝I級(結(jié)節(jié)數(shù))×1+II級×2+III級×3+IV級×4。將結(jié)果進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗(yàn)，并對轉(zhuǎn)移發(fā)生例數(shù)與未轉(zhuǎn)移例數(shù)利用簡化直接概率法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)，對BC-4與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用后的療效采用Chou氏合并指數(shù)(CI)法計算CI值，當(dāng)CI＝1時為相加作用，當(dāng)CI＜1時為協(xié)同作用，當(dāng)CI＞1時為拮抗作用。
BC-4與紫杉醇聯(lián)合用藥組對小鼠原發(fā)黑色素瘤的生長抑制率達(dá)43.9％，BC-4 50、100mg/kg組抑制率分別為26.3、33.3％，而紫杉醇對原發(fā)黑色素瘤無明顯抑制作用(表5)。BC-4 100mg/kg組小鼠黑色素瘤轉(zhuǎn)移肺重量顯著下降，抑制率達(dá)45.9％(表6)。與模型組比較，BC-4給藥組及紫杉醇給藥組小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目均顯著減少(表7)。
表5BC-4對B16BL6小鼠黑色素瘤原位生長的影響動物數(shù) 體重 抑制率組別 瘤重(g)開始 結(jié)束 開始 結(jié)束 (％)對照15 15 19.5±0.67 19.6±1.05 0.57±0.21BC-450mg/kg 15 15 19.7±0.82 19.8±1.05 0.42±0.10*26.3100mg/kg15 15 20.1±0.85 19.8±1.13 0.38±0.14*33.3Taxol2.5mg/kg15 15 19.2±1.01 19.0±1.05 0.51±0.13 10.55mg/kg 15 15 19.3±0.88 19.3±0.86 0.46±0.11 19.3BC-4 15 15 19.5±1.12 19.6±1.05 0.32±0.18**43.9(50mg/kg)+Taxol(2.5mg/kg)與對照組比較*p＜0.05，**p＜0.01
表6BC-4對B16BL6小鼠黑色素瘤自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移重量的影響動物數(shù)目 體重 抑制率組別肺重量(g)開始結(jié)束 開始結(jié)束 (％)對照14 1217.6±1.22 19.2±1.08 0.37±0.28BC-450mg/kg 15 1518.5±0.89 19.2±0.95 0.23±0.0637.8100mg/kg 10 1017.0±1.47 18.9±1.73 0.20±0.02*45.9Taxol2.5mg/kg 15 1517.4±1.33 18.9±1.10 0.23±0.11 37.85mg/kg 13 1318.0±1.08 19.3±1.11 0.33±0.16 10.8BC-412 1219.3±0.81 19.3±1.38 0.23±0.12 37.8(50mg/kg)+Taxol(2.5mg/kg)與對照組比較*p＜0.05，**p＜0.01表7BC-4對B16BL6小鼠黑色素瘤自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)的影響動物數(shù)組別 每鼠肺表面轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù)轉(zhuǎn)移 未轉(zhuǎn)移對照12/12 0/12157,66,114,112,60,76,30,11,12,8,27,29BC-450mg/kg 14/15 1/157,19,4,6,0,3,30,70,23,5,10,21,2,24,46(**)100mg/kg 8/102/10 0,8,3,5,34,0,44,3,29,3(**)Taxol2.5mg/kg 14/15 1/1531,1,6,26,0,1,9,69,16,17,4,13,15,4,34(**)5mg/kg 9/134/13 9,50,16,0,0,11,0,0,48,63,117,5,42(*)BC-4 7/12 5*/12 0,0,2,0,0,0,5,1,8,36,35,1(**)(50mg/kg)+Taxol(2.5mg/kg)與對照組比較*p＜0.05，**p＜0.01本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果是發(fā)現(xiàn)了BC-4的抗腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)惡性細(xì)胞凋亡、抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、抑制動物移植性腫瘤的生長、抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移等新作用。
根據(jù)本發(fā)明，所述藥物的給藥方法有例如口服、舌下、靜脈內(nèi)、皮下、透皮、肌內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜外、眼內(nèi)、顱內(nèi)、吸入、直腸、陰道給藥等。可以以霜劑、片劑、膠囊、丸劑、可分散粉劑、粒劑、栓劑、糖漿劑、酏劑、錠劑、注射溶液、非水溶液、懸浮液或乳液、等形式給藥?？蓪⒒钚越M分與無毒可藥用載體混合，這樣的載體包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯膠、明膠、甘露醇、淀粉粘、三硅酸鎂、滑石粉、玉米淀粉、角蛋白、膠態(tài)二氧化硅、土豆淀粉、尿素、葡聚糖等。
為了口服給藥，可使用含有各種賦形劑例如碳酸鈣、乳糖、磷酸鈣、磷酸鈉等以及各種制粒劑和崩解劑例如玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸等和粘合劑例如西黃耆膠、玉米淀粉、明膠、阿拉伯膠等的片劑、膠囊、糖錠劑、油懸浮液、可分散粉劑或粒劑、乳液、硬或軟膠囊、或糖漿劑、酏劑和錠劑。還可以加入潤滑劑例如三乙胺硬脂酸鎂、三乙胺硬脂酸、滑石等?？诜┯玫闹苿┛梢罁?jù)本領(lǐng)域已知的制備藥物制劑的任何方法制得，并且這樣的制劑可含有一種或多種選自下述的輔助劑以提供適口的藥物制劑甜味劑例如蔗糖、乳糖、糖精等，矯味劑例如薄荷、冬青油等，著色劑和防腐劑?？诜┯玫闹苿┻€可以含有合適的載體，包括乳液、溶液、懸浮液、糖漿等，并任選含有添加劑例如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香料等。片劑可以是未包衣的，或者可通過已知技術(shù)將其包衣以延遲其在胃腸道中的崩解和吸收，并由此提供在較長時間內(nèi)的持續(xù)作用。
對于口服液體制劑，合適的載體包括溶液、懸浮液、糖漿等，并任選含有添加劑例如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香料等。
對于非胃腸道給藥液體制劑，合適的載體包括非水溶液、懸浮液、或乳液。對于非胃腸道給藥，實(shí)施本發(fā)明所用化合物的溶液還可包含非水溶液、懸浮液、乳液等。非水溶劑或載體的實(shí)例有丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油和玉米油、明膠、和可注射有機(jī)酯例如油酸乙酯等。這樣的劑型還可以含有輔料例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑?？蓪⑺鼈儨缇缤ㄟ^經(jīng)由細(xì)菌保留濾器過濾、通過向組合物中加入滅菌劑、通過將組合物放射處理、或通過將組合物加熱來滅菌。還可以在臨用前將它們制成無菌注射介質(zhì)。
可以適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)注射。所用的無菌介質(zhì)都易于通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制得。可將它們滅菌，例如通過經(jīng)由細(xì)菌保留濾器過濾、通過向組合物中加入滅菌劑、通過將組合物放射處理、或通過將組合物加熱來滅菌。還可以在臨用前將它們制成無菌可注射介質(zhì)。
優(yōu)選的給藥劑量隨臨床適應(yīng)癥的不同而不同。根據(jù)所治療患者的病癥，可能必須對劑量作出某些改變，并且在任何情況下，都由醫(yī)師決定個體患者的合適劑量。每單位劑量中化合物的有效量取決于體重、生理狀況和所選的給藥方案等。單位劑量的化合物是指不包括載體重量在內(nèi)(當(dāng)使用載體時)的化合物的重量。
用于實(shí)施本發(fā)明的化合物的給藥途徑取決于疾病和需要治療的部位。因?yàn)楸景l(fā)明化合物的藥動學(xué)和藥效學(xué)特征會有某種程度的不同，因此在組織中獲得治療濃度的最優(yōu)選方法是逐漸增加劑量并監(jiān)測臨床效果。對于這樣的逐漸增加治療劑量，初始劑量將取決于給藥途徑。
對于任何特定患者，具體治療有效劑量水平將取決于多種因素，包括所治療的疾病、疾病嚴(yán)重程度、所用具體化合物的活性、給藥途徑、該具體化合物的清除速度、治療持續(xù)時間、與該具體化合物聯(lián)合或同時使用的具體藥物、患者的年齡、體重、性別、飲食和一般健康狀況等醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域眾所周知的因素。劑量水平通常為約10-200mg/kg/天，優(yōu)選為約50-200mg/kg/天。
DNA梯帶分析圖譜。
其中←為對照細(xì)胞；↑為溶媒對照細(xì)胞；→為BC-4 25μM作用24小時的細(xì)胞；↓為BC-4 50μM作用24小時的細(xì)胞；°為BC-475μM作用24小時的細(xì)胞；±為DNA梯帶分析圖譜，其中1為對照細(xì)胞，2-4分別為BC-4 25，50，75μM作用24小時的細(xì)胞。圖6BC-4對MDA/HER-2人乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的形態(tài)學(xué)觀察圖7BC-4對IFNγ處理的MV3細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果(A)及形態(tài)學(xué)觀察(B)圖8BC-4對HT-1080人纖維肉瘤細(xì)胞分泌金屬蛋白酶的抑制作用，其中1為對照細(xì)胞；2為溶媒對照細(xì)胞；3-6為BC-4 3.125，6.25，12.5，25μM作用24小時的細(xì)胞。圖9BC-4對HT-1080人纖維肉瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用的形態(tài)學(xué)觀察，其中A為Wright-Giemsa染色光鏡觀察圖(左側(cè)為對照細(xì)胞，右側(cè)為凋亡細(xì)胞)；B為吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察圖(左側(cè)為對照細(xì)胞，右側(cè)為凋亡細(xì)胞)；C為電鏡觀察圖(左側(cè)為對照細(xì)胞，右側(cè)為凋亡細(xì)胞)。圖10BC-4對HT-1080人纖維肉瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的DNA梯帶分析圖譜，其中1為對照細(xì)胞，2-4為BC-4 25，50，75μM作用24小時的細(xì)胞；5為100bp DNA分子量標(biāo)記。圖11BC-4對HT-1080人纖維肉瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，其中A為對照細(xì)胞，凋亡細(xì)胞百分率為0.42％；B為BC-4 25μM作用24小時的細(xì)胞，凋亡細(xì)胞百分率為1.85％；C-D為BC-4 50μM作用24，36小時的細(xì)胞，凋亡細(xì)胞百分率分別為9.00％，59.3％；E-G為BC-4 75μM作用8，12，24小時的細(xì)胞，凋亡細(xì)胞百分率分別為13.5％，18.7％，76.5％。圖12BC-4對原代培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的流式細(xì)胞儀檢測圖譜，BC-4未引起細(xì)胞凋亡。
其中←為對照細(xì)胞；↑為溶媒對照細(xì)胞；→為BC-4 25μM作用24小時的細(xì)胞；↓為BC-4 50μM作用24小時的細(xì)胞；°為BC-4
75μM作用24小時的細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.乙酰乳香酸在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其中所述腫瘤不包括白血病。
2.乙酰乳香酸在制備腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑中的應(yīng)用，其中所述腫瘤不包括白血病。
3.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤包括膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤和纖維肉瘤。
4.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤包括膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤和纖維肉瘤。
5.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物可以制備成霜劑、片劑、膠囊、丸劑、可分散粉劑、粒劑、栓劑、糖漿劑、酏劑、錠劑、注射溶液、非水溶液、懸浮液或乳液的形式。
6.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物可以制備成霜劑、片劑、膠囊、丸劑、可分散粉劑、粒劑、栓劑、糖漿劑、酏劑、錠劑、注射溶液、非水溶液、懸浮液或乳液的形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及從中藥乳香(Boswellia carterii Birdw.)中提取的乙酰乳香酸(BC－4)作為抗腫瘤藥物的新用途，即藥物的第二次使用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)BC－4具抗腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)惡性細(xì)胞凋亡、抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、抑制動物移植性腫瘤的生長、抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移等新作用，體內(nèi)、外的研究表明BC－4毒性很低，是一個極好的抗腫瘤藥物和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑。
文檔編號A61K31/56GK1436533SQ02103178
公開日2003年8月20日 申請日期2002年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月4日
發(fā)明者韓銳, 趙萬洲, 付招娣, 劉紅巖, 方起程, 周金云, 崔銳 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所