專利名稱：一枝蒿總黃酮膠囊的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由中草藥制備一枝蒿總黃酮膠囊，用于主治病毒性肝炎和各類肝損傷病的藥。
背景技術(shù)：
病毒性肝炎、肝損傷是損害人類健康的疾病，其中病毒性肝炎是嚴(yán)重危害人類健康的全球性傳染病，病人預(yù)后差，大多數(shù)病人轉(zhuǎn)為慢性，可能發(fā)展成肝硬化等。病毒性肝炎引起的肝損傷主要由機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)所介導(dǎo)，當(dāng)病毒激活機(jī)體免疫系統(tǒng)后，產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞和特異性抗體，特別是病毒特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞。它們不但能與體內(nèi)病毒起反應(yīng)而加以殺滅，而且也因受病毒感染的肝細(xì)胞表面帶有病毒抗原而引起肝損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性腫脹和壞死。目前，對(duì)于這類病中西醫(yī)療效不十分令人滿意。例如，西藥干擾素對(duì)肝炎病毒消除有一定療效，但經(jīng)臨床效果不理想，不能殺滅病毒，而且用藥時(shí)間長，藥費(fèi)較高。中成藥類在治療病毒性肝炎和保肝方面各有所不同，有的中藥偏重于清熱解毒，有的著重于活血化淤，有的滋補(bǔ)肝腎等，這些藥物都各有其不足。臨床久服苦寒藥物，可傷脾腎，減少食欲、消化及吸收。另外，許多藥物必須在肝臟內(nèi)進(jìn)行氧化、分解、排泄，有的也可直接導(dǎo)致肝臟損害，反而對(duì)肝病痊愈不利。
本發(fā)明針對(duì)目前在藥物治療肝病中存在的不足，結(jié)合中醫(yī)藥和民族醫(yī)藥理論兩者之長，研制了一種用于治療病毒性肝炎和各類肝損傷的口服藥一枝蒿總黃酮膠囊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于，研制的口服藥一枝蒿總黃酮膠囊是以一枝蒿為原料，將一枝蒿全草粉碎、用乙醇提取、石油醚脫脂、乙酸乙酯萃取、濃縮制成浸膏，其中有效部位總黃酮和酮酸類含量為50％-80％；然后將浸膏經(jīng)真空干燥制成干膏，加入淀粉制成顆粒，經(jīng)低溫干燥，整理后裝入膠囊即得成品。該膠囊用于治療病毒性肝炎和各類肝損傷的口服藥，具有劑量小，療效高，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)及臨床觀察無毒副作用，治療總有效率為91.0％。
本發(fā)明所述的一枝蒿總黃酮膠囊是以一枝蒿為原料，將一枝蒿全草粉碎、用95％乙醇提取、石油醚脫脂、乙酸乙酯萃取、濃縮步驟制成相對(duì)密度為1.10-1.30的浸膏，其中有效部位總黃酮和酮酸類含量為50℃-80％；然后將浸膏經(jīng)真空干燥制成干膏，加入淀粉制成顆粒，經(jīng)低溫干燥，整理后裝入膠囊即得成品。
一枝蒿總黃酮膠囊的制備方法，按下例步驟進(jìn)行a、首先將一枝蒿全草粉碎成粉末，用95％的乙醇回流提取三次，回流溫度70℃-80℃，將提取后的醇提液用石油醚進(jìn)行脫脂，過濾，濾去石油醚層，保留其殘留物；b、將保留的殘留物用乙酸乙酯進(jìn)行萃取三次，萃取溫度為常溫，過濾，濾去乙酸乙酯不溶物，將其余的乙酸乙酯層用0.5％-1％活性炭進(jìn)行脫色，減壓濃縮成相對(duì)密度為1.10-1.30的浸膏，該浸膏的有效部位為總黃酮和酮酸類，其含量為50％-80％；c、然后將濃縮后的浸膏經(jīng)40℃-60℃真空干燥得干膏，將干膏加入淀粉調(diào)制成顆粒，經(jīng)40℃-60℃低溫干燥，整理，裝入膠囊即得成品。
本發(fā)明所述的一枝蒿總黃酮膠囊，其中一枝蒿的藥理性能為一枝蒿Artemisia rupestris L.的干燥全草。七、八月采割、曬干。本品全長10-50厘米。根和根莖圓柱形，土黃色至灰褐色，長帶少數(shù)短須根，斷面淺黃色。莖單一或數(shù)個(gè)，于根莖處彎曲，直徑1.5-3厘米，幼枝和花枝上部密被短絨毛，老枝或枝的下部光滑，又不顯著的細(xì)條紋，表面常為紫紅色，斷面白色，中空。功能與主治清熱解毒，健胃消食，祛風(fēng)活血。用于感冒、過敏、食積、蛇傷、瘡癤。
本發(fā)明所述的一枝蒿總黃酮膠囊的藥理學(xué)研究一枝蒿是維吾爾醫(yī)常用藥材，文獻(xiàn)報(bào)道一枝蒿全草含有黃酮類、酮酸類、氨基酸、甙類、多糖類、揮發(fā)油、多肽、生物堿等化合物。我們分析了一枝蒿有效成分，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了一枝蒿總黃酮膠囊的保肝作用、治療免疫性肝炎、抗氧化、抗過敏作用研究及誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡時(shí)p53與Bcl基因的表達(dá)等實(shí)驗(yàn)研究，并采用電子順磁共振方法檢測(cè)一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)O2-°、OH°的抑制作用，旨在闡明該藥防治疾病的科學(xué)內(nèi)涵。一、實(shí)驗(yàn)材料1.藥物一枝蒿總黃酮膠囊由本發(fā)明提供。
2.試劑磷酸組胺，中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所產(chǎn)品；凍干皮內(nèi)注射用卡介苗，蘭州生物制品研究所產(chǎn)品；天花粉，新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室提供；四氯化碳，北京市新光化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；D-氨基半乳糖氨鹽酸鹽，北京科技協(xié)作中心精細(xì)化學(xué)分部產(chǎn)品；脂多糖，SIGMA公司產(chǎn)品；5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氮化物(DMPO)購自美國Sigma公司。二甲基亞砜(DMSO)，化學(xué)純?cè)噭?，上海硫酸廠產(chǎn)品。氫氧化鈉，分析純?cè)噭?，上海試劑三廠產(chǎn)品。NaH2PO4，K2HPO4，H2O2，F(xiàn)eSO4.7H2O，EDTA，均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?。QGY-7701(人肝癌)細(xì)胞，由中科院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞庫提供；焦碳酸乙二脂(DEPC)、隨機(jī)引物(Oligo[dT]15Primer)、脫氧核糖核酸酶抑制劑(Rnasin)、脫氧核苷三磷酸(dNTP)均為Promega產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶(M-MuLV ReverseTranscriptase)，MBI Fermentas產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶(5u)、PCR擴(kuò)增緩沖液，上海生工(Sangon)產(chǎn)品；Marker(φχ174/Hinc IIdigest)為日本(TOYOBO)公司產(chǎn)品。
3.動(dòng)物Wistar大鼠、體重200±20g，二級(jí)；NIH小鼠，體重20±1.4g，二級(jí)，雌雄個(gè)半，均購自自治區(qū)衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
4.儀器721-型分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；Vital-200型全自動(dòng)生化測(cè)定儀，荷蘭威圖公司產(chǎn)品；ER200D-SRC型電子順磁共振儀及ER4111-VT變溫裝置，德國Bruker公司產(chǎn)品；PCR熱循環(huán)儀(Gene Amp PCR System 9700型)，Perkin-Elmer公司；紫外光度儀(Gene QuantTMII RNA/DNA Calculator型)，Amersham pharmaciabiotech公司。二、方法與結(jié)果(一)一枝蒿總黃酮膠囊抗過敏研究1.對(duì)同系大鼠被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)(PCA)的影響取健康雄性大鼠5只，各鼠每足跖注射0.1ml天花粉-氫氧化鋁凝膠混懸液(5mg/ml)，同時(shí)ip 0.1ml卡介苗強(qiáng)化，15天后心臟取血，離心得到抗血清。用前將抗血清用生理鹽水稀釋10倍。另取大鼠安表1隨機(jī)分組，在各鼠背部脫毛處皮下注射抗血清0.1ml致敏，共3點(diǎn)。48h后iv 5me(5mg)天花粉的0.5％伊文思藍(lán)溶液進(jìn)行攻擊。于致敏前1天開始給藥，連續(xù)給藥3天?？乖艉?.5h，斷頭處死大鼠，將皮膚藍(lán)斑消化，離心，取上清液用分光光度計(jì)測(cè)定吸收度(A)。結(jié)果見表1。
表1 一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)大鼠PCA反應(yīng)的影響(X±SD)組別 動(dòng)物數(shù)劑(g/kg) 吸收度A 抑制率(％)空白對(duì)照組5 - 0.96±0.14 -地塞米松組5 0.01 0.04±0.02***95.8給藥組6 0.50 0.38±0.07***60.1給藥組6 1.00 0.11±0.02***88.5與空白對(duì)照組比較***p＜0.01。AR表示一枝蒿結(jié)果表明，一枝蒿總黃酮膠囊具有明顯的抑制同系大鼠PCA反應(yīng)的作用，而且濃度與抑制作用之間存在正比依賴性關(guān)系。2.對(duì)組胺所致毛細(xì)血管通透性增加的影響取大鼠26只，ig給藥，每日一次，共5天，于末次給藥后15h大鼠背部剪毛處皮內(nèi)注射磷酸組胺生理鹽水溶液0.1ml(750μg/ml)，每鼠2點(diǎn)，同時(shí)iv 1ml 0.5％伊文思藍(lán)溶液，0.5h后斷頭處死大鼠，按PCA方法測(cè)定皮膚各反應(yīng)點(diǎn)的吸收度(A)。結(jié)果見表2。表2 一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)磷酸組胺所致毛細(xì)血管通透性增加的影響(X±SD)組別動(dòng)物數(shù) 劑量(g/kg) 吸收度A 抑制率(％)空白對(duì)照組 7-0.92±0.29 -地塞米松組 60.01 0.38±0.11***58.7給藥組 70.50 0.73±0.16***20.6給藥組 61.00 0.70±0.22***23.6與空白對(duì)照組比較***p＜0.01。
結(jié)果表明，一枝蒿總黃酮膠囊具有明顯的抑制組胺所致毛細(xì)血管通透性增加的作用，而且濃度與抑制作用之間存在正比依賴性關(guān)系。3.對(duì)大鼠同種細(xì)胞抗體介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒的影響取大鼠5只，按PCA方法制備大鼠抗天花粉血清。另取大鼠5只，制備大鼠腸系膜標(biāo)本，每鼠10塊，每塊1cm2，放入臺(tái)氏營養(yǎng)液2ml，腸系膜標(biāo)本1塊及大鼠抗天花粉血清0.2ml，37℃水浴溫育0.5h后用37℃臺(tái)氏營養(yǎng)液沖洗標(biāo)本3次，再加臺(tái)氏營養(yǎng)液2ml，37℃水浴溫育10min，按表3劑量向管內(nèi)加藥，繼續(xù)溫育10min，加天花粉抗原0.1ml(1.1mg/ml)攻擊，37℃溫育20min后將標(biāo)本用甲醛固定，常規(guī)染色及封片，用顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)肥大細(xì)胞脫顆粒情況。結(jié)果見表3。
表3一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)大鼠同種細(xì)胞抗體介導(dǎo)的肥大細(xì)胞響
(X±SD)組別 動(dòng)物數(shù)(只) 劑量(μg/ml) 脫顆粒率(％) 抑制率(％)空白對(duì)照組10 - 71.7±8.2 -地塞米松組10 50 34.2±9.6***52.9給藥組10 50 30.1±8.7***30.1給藥組10 10035.8±7.6***50.1與空白對(duì)照組比較***p＜0.01。
結(jié)果表明，一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)大鼠同種細(xì)胞抗體介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒有抑制作用，隨藥物濃度的增加，抑制作用也隨著增加。(二)一枝蒿總黃酮膠囊的保肝抗肝炎作用研究1.一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用取昆明種小鼠60只，按表1隨機(jī)分成6組，ig給藥，每日1次，共7天。末次給藥后1h，除空白對(duì)照組外其它各組小鼠ip0.1％四氯化碳花生油溶液10ml/kg。24h后眼球取血，常規(guī)分離血清，測(cè)定ALT含量，結(jié)果見表4。表4 一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)四氯化碳致肝損傷小鼠血清ALT的影響(X±SD)組別動(dòng)物數(shù)(只)劑量(g/kg)ALT(iμ/L)空白對(duì)照組 9 - 34.06±11.60肝損傷模型組9 - 128.80±57.36Δ干草甜素片組9 0.3 18.86±8.81***小劑量給藥組9 1.0 42.74±25.69***中劑量給藥組9 2.0 21.81±7.43***大劑量給藥組9 4.0 16.98±7.98***注與空白對(duì)照組比較Δp＜0.01，與肝損傷模型組比較***p＜0.01。
結(jié)果表明，一枝蒿總黃酮膠囊明顯降低CCl4致肝損傷小鼠的血清ALT含量(p＜0.01)，作用優(yōu)于干草甜素片。2.一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)四氯化碳致大鼠急性中毒性肝損傷的保護(hù)作用取Wistar大鼠42只，按表2隨機(jī)分成6組，ig給藥，每日1次，共7天。給藥后第3天、第7天除空白對(duì)照組外其它各組大鼠sc 25％四氯化碳0.5ml/100g。末次給藥12h后處死大鼠心臟取血，常規(guī)分離血清，測(cè)定ALT含量，結(jié)果見表5。表5 一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)四氯化碳致急性中毒性肝損傷大鼠血清ALT的影響(X±SD)組別動(dòng)物數(shù)(只)劑量(g/kg)ALT(iμ/L)空白對(duì)照組 7 - 20.50±12.82肝損傷模型組7 - 180.0710.40Δ干草甜素片組7 0.2 155.67±50.98*小劑量給藥組7 0.75 147.97±25.78**中劑量給藥組7 1.5 115.57±35.03***大劑量給藥組7 3.0 129.63±21.43***注與空白對(duì)照組比較Δp＜0.01，與肝損傷模型組比較*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01。
結(jié)果表明，不同劑量的一枝蒿總黃酮膠囊明顯降低CCl4致急性中毒性肝損傷大鼠的血清ALT含量(p＜0.01)，作用優(yōu)于干草甜素片3.一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)D-氨基半乳糖氨鹽酸鹽致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用取昆明種小鼠60只，按表3隨機(jī)分成6組，ig給藥，每日1次，共7天。末次給藥后1h，除空白對(duì)照組外其它各組小鼠ip D-氨基半乳糖800mg/kg，24h后眼球取血，常規(guī)分離血清，測(cè)定ALT含量，結(jié)果見表6。
結(jié)果表明，不同劑量的一枝蒿總黃酮膠囊明顯降低D-氨基半乳糖氨鹽酸鹽致急性肝損傷大鼠的血清ALT含量(p＜0.01)表6 一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)D-氨基半乳糖氨鹽酸鹽致急性肝損傷小鼠血清ALT的影響(X±SD)組別 動(dòng)物數(shù)(只) 劑量(g/kg) ALT(iμ/L)空白對(duì)照組 9-53.89±19.23肝損傷模型組 9-81.13±40.18Δ干草甜素片組 80.15 54.28±10.12**小劑量給藥組 81.0 57.38±15.53**中劑量給藥組 92.0 56.83±20.60**大劑量給藥組 84.0 50.50±17.78**注與空白對(duì)照組比較Δp＜0.01，與肝損傷模型組比較**p＜0.05。4.一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)小鼠免疫性肝炎的預(yù)防作用取昆明種小鼠51只，♀♂各半，按表4隨機(jī)分成5組，在iv LPS前5天給藥，每日1次，共5天。除空白對(duì)照組外其它各組小鼠尾靜脈iv BCG 5×106個(gè)菌/鼠，12d后再iv LPS 7.5μg/鼠，造成免疫性肝炎模型，10h后眼球取血，常規(guī)分離血清，測(cè)定ALT含量，結(jié)果見表7。結(jié)果，一枝蒿總黃酮膠囊在ivLPS前5天給藥，對(duì)小鼠免疫性肝炎沒有預(yù)防作用。
表7 一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)小鼠免疫性肝炎的預(yù)防作用(X±SD)組別動(dòng)物數(shù)(只) 劑量(g/kg)ALT(iμ/L)空白對(duì)照組 11 - 55.20±8.90肝炎模型組 11 - 79.10±22.80Δ干草甜素片組10 0.3 76.90±32.10*小劑量給藥組10 1.0 72.60±21.90*中劑量給藥組9 2.0 77.10±21.70*注與空白對(duì)照組比較Δp＜0.01，與肝炎模型組比較*p＞0.05。5.一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)小鼠免疫性肝炎的治療作用取昆明種小鼠51只，♀♂各半，按表5隨機(jī)分成5組。除空白對(duì)照組外其它各組小鼠尾靜脈iv BCG 5×106個(gè)菌/鼠，10d天后再ivLPS 7.5μg/鼠，造成免疫性肝炎模型。各組小鼠在iv BCG的當(dāng)天開始ig給藥(正常對(duì)照組和肝炎模型組小鼠ig等容量的生理鹽水)，每日1次，連續(xù)11d。在iv LPS 10h后眼球取血，常規(guī)分離血清，測(cè)定ALT含量，結(jié)果見表8。
結(jié)果，一枝蒿總黃酮膠囊在ivLPS后繼續(xù)給藥，對(duì)免疫性肝炎小鼠的血清ALT含量(p＜0.01)。
表8 一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)小鼠免疫性肝炎的治療作用(X±SD)組別動(dòng)物數(shù)(只)劑量(g/kg)ALT(iμ/L)空白對(duì)照組 11- 26.45±11.81肝炎模型組 11- 31.45±21.83Δ小劑量給藥組101.0 35.70±8.29中劑量給藥組102.0 39.00±8.10大劑量給藥組105.0 13.36±2.93***注與空白對(duì)照組比較Δp＜0.05，與肝炎模型組比較料***p＜0.01。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)CCl4或D-氨基半乳糖氨鹽酸鹽致急性肝損傷有保護(hù)作用并能治療免疫性肝炎。(三)一枝蒿總黃酮膠囊抗氧化作用研究1.對(duì)O2-°的抑制作用在室溫下，將含有飽和空氣的DMSO與H2O、NaOH溶液定量混勻。NaOH一經(jīng)加入即計(jì)時(shí)，反應(yīng)30min。測(cè)量前，定量吸取反應(yīng)液于直徑3mm的玻璃樣品管內(nèi)，在溫度130K時(shí)進(jìn)行ESR測(cè)定，此時(shí)可檢測(cè)到O2-°的特征信號(hào)，此作為空白對(duì)照管。當(dāng)檢測(cè)樣品與O2-°作用時(shí)，加入一定量的樣品藥液(5％100％)于產(chǎn)生O2-°的模型體系中，其它條件同前。
EPR操作參數(shù)測(cè)試溫度(TE)130K，微波頻率(SF)9.67GHz，微波功率(SP)20mW，調(diào)制頻率(MF)，調(diào)制幅度(MA)5.0G，時(shí)間常數(shù)(TC)500ms，掃場(chǎng)時(shí)間(TI)100s，中心磁場(chǎng)(CF)3360G，掃場(chǎng)寬度(SW)300G。2.對(duì)OH°的抑制作用利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生OH·自由基，反應(yīng)體系中DMPO終濃度100μM，PH7.4 NaH2PO4/K2HPO4緩沖液終濃度40mM，H2O2終濃度100mM，樣品藥液(注作為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)則加100μl H2O)5％-100％，F(xiàn)eSO4.7H2O+EDTA混和液終濃度300μM，操作時(shí)在塑料管依次加入DMPO，緩沖液，H2O2，藥液(或水)，最后加Fe2+引發(fā)反應(yīng)，5min后進(jìn)行EPR測(cè)量。
EPR操作參數(shù)SW＝100G，SF＝9.82GHz，MF＝100kHz，MA＝0.8G，TE＝297K。結(jié)果根據(jù)所測(cè)得EPR波譜信號(hào)，計(jì)算樣品與自由基之間的相互作用因子E。根據(jù)E的變化情況，判斷樣品各濃度對(duì)自由基的增抑作用。結(jié)果見表9、圖1。表9 一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)O2-°、OH°自由基的增抑作用(濃度與相互作用因子E的關(guān)系)相互作用因子E樣品濃度(g/ml)超氧陰離子自由基 羥自由基0.10 -0.9999 -0.98890.08 -0.9999 -0.98850.06 -0.4858 -0.95770.04 -0.3053 -0.90200.02 0.9655 -0.73270.01 0.8963 -0.66590.0050.4825 -0.4855由表9、圖1可見，一枝蒿總黃酮膠囊對(duì)O2-°的作用表現(xiàn)為高濃度抑制、低濃度增加的作用。但對(duì)OH°自由基表現(xiàn)為濃度依賴性地抑制作用，濃度(M)與相互作用因子(E)之間的回歸關(guān)系為E＝-1.4199-0.1709 lnM(r＝0.9887)，IC50＝0.00460g/ml。(四)一枝蒿總黃酮膠囊調(diào)節(jié)人肝癌細(xì)胞凋亡基因p53、Fas和Bcl-2的表達(dá)1.引物序列 按文獻(xiàn)及Gen Bank庫中p53基因序列設(shè)計(jì)了兩條引物，p15′-GGTCGACTGACACGCTTCCCTGGATTGG-3′，p25′-GGATCCTGCTTCTGACGCACACCTATTG-3′(295bp fragment)。按文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì)了Bcl-2及Fas基因序列Bcl-2為5′-GCGTCAACCGGGAGATGTCGCCC，3′-TTTCTTAAACAGCCTGCAGCTTTG(348bp fragment)；Fas為5′-GTACAGAAAACATGCAGAAAGCAC，3′-CTCTGCAAGAGTACAAAGATTGGC(342bp fragment)。
2.mRNA提取并反轉(zhuǎn)錄收集的細(xì)胞用PBS溶液洗2次，200ul RNA提取緩沖液離心棄去未裂解細(xì)胞和細(xì)胞核組成的沉淀，上清用50μg/ml的蛋白酶K，37℃消化30min。然后，加1體積的水飽和酚和0.2體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)。離心后用異丙醇沉淀RNA并在-20℃下至少放1h，離心沉淀RNA，用70％的乙醇洗一遍，真空干燥并用DEPC水重溶RNA。向20μl的反轉(zhuǎn)錄緩沖液中加2μl單鏈[dT]15引物，2.5μl dNTP(各10mmol/L)，0.5μlRNasin(1000u/ml)，然后，70℃加熱5min，冰上冷卻。簡短離心后加1.2μl Moloney MuLV病毒反轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO公司)并37℃下保溫1h，90℃變性5min，得到的cDNA樣品保存于-70℃。
3.PCR擴(kuò)增0.2ml的基因擴(kuò)增體系含2.5μl cDNA，50mmol/L KCL，10mmol/L Tris-HCl，2.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，0.5mmol/L 5′→3′寡核苷酸引物及2.5u Taq酶(Sangon)。PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，并在94℃變性30s，在每個(gè)引物相應(yīng)的退火溫度上退火并在72℃中延伸2min。PCR產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用去離子水設(shè)陰性對(duì)照組。照象系統(tǒng)用正/反665底片，DNA帶用溴化乙錠染色后在紫外燈下顯像。
5.結(jié)果本研究以肝癌細(xì)胞為模型應(yīng)用高度敏感的RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法研究凋亡基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示5μg/ml、10μg/ml的一枝蒿總黃酮膠囊處理肝癌細(xì)胞24h、36h及72h時(shí)有大量的p53(圖14、7號(hào)泳道，圖22、3、4、5號(hào)泳道)基因表達(dá)，而bcl-2與Fas基因未見表達(dá)(圖12、3、5、6號(hào)泳道，圖26、7、8、9、10、11、12、13號(hào)泳道)，同樣藥物處理前上述三種基因均未見表達(dá)(圖214、15、16號(hào)泳道)。
6.研究發(fā)現(xiàn)，一枝蒿總黃酮膠囊作用于肝癌細(xì)胞后，F(xiàn)as基因與Bcl-2基因沒有表達(dá)，而野生型p53基因表達(dá)增強(qiáng)。與細(xì)胞調(diào)亡密切相關(guān)的野生型p53基因的表達(dá)增加，與細(xì)胞分化和增殖有關(guān)的Bcl-2基因未表達(dá)，說明AR有效部位可能激活肝癌細(xì)胞凋亡基因而使細(xì)胞發(fā)生凋亡。
(五)研究表明，一枝蒿總黃酮膠囊具有保肝作用、治療免疫性肝炎、抗過敏，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增值及DNA的合成有明顯的抑制作用，同時(shí)對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基具有不同程度的抑制作用，藥物濃度與抑制作用之間存在正比依賴性關(guān)系。
一枝蒿總黃酮膠囊的急性毒性試驗(yàn)取8只昆明種小鼠，隨機(jī)分4組，每組2只小鼠，按30％、32％、36％、40％濃度，以0.2ml/10g劑量1次給藥，連續(xù)觀察3天。結(jié)果無一死亡。
根據(jù)其結(jié)果增加給藥劑量，計(jì)每10克0.4ml，1.5小時(shí)內(nèi)分兩次口服，連續(xù)觀察3天。結(jié)果最大全不致死量(D分鐘)為13g/kg，最小全致死量(Dmax)為17g/kg。
取昆明種小鼠60只，體重20±1.8g，雌雄兼用，隨機(jī)分組，每組10只。組件劑量比為1∶1.7，藥業(yè)按等比(1∶1.07)稀釋，按40ml/10g，1.5小時(shí)內(nèi)分兩次灌胃給藥，每日觀察，連續(xù)7天。記錄動(dòng)物毒性反應(yīng)情況和死亡動(dòng)物分布。結(jié)果如下

用CASIO fx-180p計(jì)算器，程序按Bliss法計(jì)算LD50等有關(guān)參數(shù)。

|Yr-Y|＞0.2，以Yr代替Y進(jìn)行第二輪計(jì)算

|Yr-Y|＜0.2，回歸結(jié)果滿意，計(jì)算結(jié)果為LD50＝15673.75mg/kgS50＝0.0052895％可信區(qū)間PL＝15304.75-16051.65mg/kg結(jié)論本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，一枝蒿總黃酮膠囊的LD50為15674±0.0103mg/kg。
本發(fā)明所述的一枝蒿總黃酮膠囊經(jīng)過對(duì)123例患者用藥臨床觀察，其中男80例，女43例；年齡最大的67歲，最小的14歲；病史最長10年，最短1年；對(duì)照組60例，其中男34例，女26例；年齡最大63歲，最小15歲；病史最長11年，最短的9個(gè)月。全部病例均符合乙型病毒性肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過用藥治療，其中實(shí)驗(yàn)組使用一枝蒿總黃酮膠囊，每日3次，每次3粒，3個(gè)月為一療程。對(duì)照組服用肝脾康膠囊，每日3次，每次5粒，3個(gè)月為一療程。治療結(jié)果用藥兩個(gè)療程，治療組123例中顯效86例，好轉(zhuǎn)26例，無效4例；對(duì)照組60例中顯效31例，好轉(zhuǎn)20例，無效9例。治療組總有效率91.0％；對(duì)照組總有效率為85.0％。


參見附1為本發(fā)明抗氧化作用實(shí)驗(yàn)中樣品濃度與相互作用因子E之間的關(guān)系2為本發(fā)明調(diào)節(jié)人肝癌細(xì)胞調(diào)亡基因p53、Fas和Bcl-2的表達(dá)圖(24小時(shí))圖3為本發(fā)明調(diào)節(jié)人肝癌細(xì)胞調(diào)亡基因p53、Fas和Bcl-2的表達(dá)圖(36小時(shí)和72小時(shí))具體實(shí)施方式
實(shí)施例1a、首先將一枝蒿全草10kg粉碎成粉末，用5倍95％的乙醇回流提取三次，回流溫度70℃，將提取后的醇提液用400ml石油醚進(jìn)行脫脂，過濾，濾去石油醚層，保留其殘留物；b、將保留的殘留物用400ml乙酸乙酯進(jìn)行萃取三次，萃取溫度為常溫，過濾，濾去乙酸乙酯不溶物，將其余的乙酸乙酯層用0.5％活性炭進(jìn)行脫色，減壓濃縮成相對(duì)密度為1.10的浸膏，該浸膏的有效部位為總黃酮和酮酸類，其含量為50％；c、然后將濃縮后的浸膏經(jīng)45℃真空干燥得干膏，將干膏加入淀粉調(diào)制成顆粒，經(jīng)45℃低溫干燥，整理，裝入膠囊即得成品。
使用一枝蒿總黃酮膠囊，每日3次，每次3粒，3個(gè)月為一療程，總有效率為91.0％，其中對(duì)乙型肝炎的總有效率為88.0％，酒精性肝損傷的總有效率為94.0％。
實(shí)施例2a、首先將一枝蒿全草10kg粉碎成粉末，用6倍75％的乙醇回流提取三次，回流溫度75℃，將提取后的醇提液用500ml石油醚進(jìn)行脫脂，過濾，濾去石油醚層，保留其殘留物；b、將保留的殘留物用500ml乙酸乙酯進(jìn)行萃取三次，萃取溫度為常溫，過濾，濾去乙酸乙酯不溶物，將其余的乙酸乙酯層用0.8％活性炭進(jìn)行脫色，減壓濃縮成相對(duì)密度為1.25的浸膏，該浸膏的有效部位為總黃酮和酮酸類，其含量為70％；c、然后將濃縮后的浸膏經(jīng)60℃真空干燥得干膏，將干膏加入淀粉調(diào)制成顆粒，經(jīng)50℃低溫干燥，整理，裝入膠囊即得成品。
使用一枝蒿總黃酮膠囊，每日3次，每次3粒，飯前半小時(shí)口服，3個(gè)月為一療程，總有效率為89.0％，其中對(duì)乙型肝炎的總有效率為87.0％，酒精性肝損傷的總有效率為91.0％。
實(shí)施例3a、首先將一枝蒿全草10kg粉碎成粉末，用6倍85％的乙醇回流提取三次，回流溫度80℃，將提取后的醇提液用600ml石油醚進(jìn)行脫脂，過濾，濾去石油醚層，保留其殘留物；b、將保留的殘留物用600ml乙酸乙酯進(jìn)行萃取三次，萃取溫度為常溫，過濾，濾去乙酸乙酯不溶物，將其余的乙酸乙酯層用1％活性炭進(jìn)行脫色，減壓濃縮成相對(duì)密度為1.30的浸膏，該浸膏的有效部位為總黃酮和酮酸類，其含量為80％；c、然后將濃縮后的浸膏經(jīng)50℃真空干燥得干膏，將干膏加入淀粉調(diào)制成顆粒，經(jīng)60℃低溫干燥，整理，裝入膠囊即得成品。
使用一枝蒿總黃酮膠囊，每日3次，每次3粒，飯前半小時(shí)口服，3個(gè)月為一療程，總有效率為87.0％，其中對(duì)乙型肝炎的總有效率為85.0％，酒精性肝損傷的總有效率為89.0％。
權(quán)利要求
1.一種一枝蒿總黃酮膠囊，其特征在于以一枝蒿為原料，將一枝蒿全草粉碎、用95％乙醇提取、石油醚脫脂、乙酸乙酯萃取、濃縮步驟制成相對(duì)密度為1.10-1.30的浸膏，其中有效部位總黃酮和酮酸類含量為50％-80％；然后將浸膏經(jīng)真空干燥制成干膏，加入淀粉制成顆粒，經(jīng)低溫干燥，整理后裝入膠囊即得成品。
2.一種一枝蒿總黃酮膠囊的制備方法，其特征在于按下例步驟進(jìn)行a、首先將一枝蒿全草粉碎成粉末，用95％的乙醇回流提取三次，回流溫度70℃-80℃，將提取后的醇提液用石油醚進(jìn)行脫脂，過濾，濾去石油醚層，保留其殘留物；b、將保留的殘留物用乙酸乙酯進(jìn)行萃取三次，萃取溫度為常溫，過濾，濾去乙酸乙酯不溶物，將其余的乙酸乙酯層用0.5％-1％活性炭進(jìn)行脫色，減壓濃縮成相對(duì)密度1.10-1.30的浸膏，該浸膏的有效部位為總黃酮和酮酸類，其含量為50％-80％；c、然后將濃縮后的浸膏經(jīng)40℃-60℃真空干燥得干膏，將干膏加入淀粉調(diào)制成顆粒，經(jīng)40℃-60℃低溫干燥，整理，裝入膠囊即得成品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種一枝蒿總黃酮膠囊,是以一枝蒿為原料,將一枝蒿全草粉碎、用乙醇提取、石油醚脫脂、乙酸乙酯萃取、濃縮制成浸膏,其中有效部位總黃酮和酮酸類含量為50－80%;然后將浸膏經(jīng)真空干燥制成干膏,加入淀粉制成顆粒,經(jīng)低溫干燥,整理后裝入膠囊即得成品。該膠囊用于治療病毒性肝炎和各類肝損傷的口服藥,具有劑量小,療效高,經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)及臨床觀察無毒副作用,治療總有效率為91.0%。
文檔編號(hào)A61P1/00GK1380094SQ0211825
公開日2002年11月20日 申請(qǐng)日期2002年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月29日
發(fā)明者斯拉甫·艾白, 哈木拉提·吾甫爾, 阿吉艾克拜爾, 阿不都熱衣木·玉蘇甫, 古力娜·達(dá)吾提 申請(qǐng)人:斯拉甫·艾白, 哈木拉提·吾甫爾