專利名稱：降低非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物抗原性并滅菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物材料領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種對哺乳動物血液來源的凝血物質(zhì)復(fù)合物進行滅菌以及降低其抗原性的方法，以及經(jīng)該方法處理得到的非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物組合物。
背景技術(shù)：
凝血物質(zhì)復(fù)合物主要含有纖維蛋白原，第XIII因子，纖維連接蛋白等。該復(fù)合物在凝血酶和鈣離子的存在下，可轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白網(wǎng)，而發(fā)揮有效的止血和組織封閉作用，它可用于外科臨床。
普通的凝血物質(zhì)復(fù)合物從人血漿制得。其制備方法為提取分離人血漿后，利用各種化學(xué)試劑如聚乙二醇、乙醇、硫酸銨，借助低溫沉淀或沉淀而從人血漿中濃縮凝血物質(zhì)復(fù)合物。然而，上述制備方法的缺點是其整個制備過程必須在無菌條件下進行，否則難以用常規(guī)的方法(如過濾法、氣體滅菌法、化學(xué)消毒法)將復(fù)合物中的諸如細(xì)菌等微生物除去。采用從人血制備的凝血物質(zhì)復(fù)合物，由于其原料來源有限，因此其成本昂貴。而且，它易導(dǎo)致人類血源性疾病(如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病等)的傳播。因此難以在我國臨床上常規(guī)使用。
利用哺乳動物血液來源的凝血物質(zhì)復(fù)合物，可以有效地克服上述人血來源的凝血物質(zhì)復(fù)合物的不足。但是，哺乳動物血液來源的凝血物質(zhì)復(fù)合物是異種物質(zhì)，直接用于人體后，會產(chǎn)生免疫反應(yīng)；同時，由于該凝血物質(zhì)復(fù)合物的粘度很大，且屬于蛋白質(zhì)，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，難以用過濾除菌法和化學(xué)法進行除菌。
楊莉(中國專利申請?zhí)?5106859；公告號1138483)和Kent(美國專利號6171549)等人先后報道了用鈷60的電離輻射法進行上述復(fù)合物的滅菌，取得較好的效果。但該方法的問題是電離輻射滅菌法需要特殊的加工控制系統(tǒng)，輻射監(jiān)測和測量裝置，該裝置投資巨大；而且輻射劑量的誤差很難嚴(yán)格控制，一般誤差在預(yù)定的輻射劑量20-50％左右。在誤差小于額定輻射劑量時，產(chǎn)品的抗原性不能有效降低，免疫反應(yīng)嚴(yán)重，微生物不能有效去除；而誤差大于額定輻射劑量，常常會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變形，從而影響凝血復(fù)合物的功能。
Ritter于1801年發(fā)現(xiàn)，在可見光紫端外側(cè)，有一種不可見光線，稱為紫外線。進一步研究發(fā)現(xiàn)，紫外線可使氯化銀變黑，而且比可見光更有效，從而證明了紫外線的化學(xué)作用。1877年，英國人Downes和Blunt在用紫外線照射殺滅枯草桿菌的實驗中證明了紫外線的殺菌作用，從而建立了紫外線殺菌發(fā)展史上的第一個里程碑。至1929年，Gates在研究紫外線的殺菌作用時發(fā)現(xiàn)，不同波長的紫外線對微生物的殺滅作用不同，殺菌作用光譜平行于核酸堿基對紫外線的吸收光譜。這一發(fā)現(xiàn)被后人稱為紫外線滅菌研究發(fā)展史的第二個里程碑。
紫外線是一種電磁波，作為橫向波在空間傳播。其傳播速度是每秒鐘振動的頻率和波長的乘積。與可見光一樣，紫外線的傳播亦是直線傳播。不同物質(zhì)對紫外線的透過率不同。普通玻璃對于可見光是透明的，但卻不能透過紫外線。而石英玻璃可以透過80％以上的殺菌紫外線。有機玻璃幾乎不透過紫外線。紫外線分為A波，B波，C波和真空紫外線。其中C波紫外線為殺菌紫外線，其波長范圍是200-275nm。一般認(rèn)為，殺菌作用最強的波段是254nm左右，但不同作者用不同微生物試驗的結(jié)果不盡相同。Gates指出對金黃色葡萄球菌殺滅作用最強的波長是265.2nm。Duggar等證明對芽孢桿菌殺滅作用強的波段是265.2-280.4nm之間。Sygkes指出240-280nm是最強的殺菌波段。紫外線可以殺滅各種微生物，包括細(xì)菌、真菌、病毒、立克次體等。每種微生物都有其特定的紫外線死亡閾值。殺菌劑量(K)是照射強度(I)和照射時間(T)的乘積(即，K＝It)。
紫外線殺菌的機理主要作用于微生物的核酸，由于DNA核苷酸的堿基受紫外線照射后被破壞，從而導(dǎo)致微生物死亡。紫外線可以被蛋白質(zhì)上的氨基酸所吸收，從而使這些化學(xué)基團破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變形，結(jié)構(gòu)改變，使其失去功能。目前還未曾見到有關(guān)用紫外線處理哺乳動物血液來源凝血物質(zhì)復(fù)合物的報道。
因此，本領(lǐng)域仍然迫切需要有對哺乳動物血液來源的凝血物質(zhì)復(fù)合物進行滅菌的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種對哺乳動物血液來源的凝血物質(zhì)復(fù)合物進行滅菌且同時降低其抗原性的新方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種無菌且抗原性降低的哺乳動物血液來源的凝血物質(zhì)復(fù)合物組合物。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一方面提供了一種降低非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物抗原性并同時滅菌的方法，該方法包括在所述復(fù)合物中加入濃度為0.1-5mM的路丁和0.1-20mM的甘氨酸，用劑量為50-1000萬μW·s/cm2的紫外線照射，在輻照時使所述復(fù)合物溶液的厚度為1-50毫米。
本發(fā)明另一方面提供了用上述方法得到的無菌且抗原性降低的非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物組合物，該組合物含有非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物以及0.1-5mM的路丁和0.1-20mM的甘氨酸。
本發(fā)明的意義在于通過采用本發(fā)明方法，可以簡便地、有效地降低非人哺乳動物來源的凝血物質(zhì)復(fù)合物中各種蛋白質(zhì)異種免疫原性，殺滅其中的微生物，同時保存促進凝血的功能，從而為哺乳動物血來源的凝血物質(zhì)復(fù)合物的臨床應(yīng)用，以發(fā)揮有效的止血和組織封閉功能奠定了堅實的基礎(chǔ)。本發(fā)明方法制得的無菌且抗原性降低的非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物組合物作為一種止血和組織封閉劑的組成部分之一，可以廣泛地用于普外科、神經(jīng)外科、心血管外科、泌尿外科、婦產(chǎn)科、整形外科、五官科、燒傷科等領(lǐng)域。另外，本發(fā)明所涉及的哺乳動物血液不僅原料來源廣泛，價格低廉，同時，所制備的凝血物質(zhì)復(fù)合物還可以有效地避免人類血源性疾病的傳播。
下面將進一步詳細(xì)描述本發(fā)明。
發(fā)明
具體實施例方式
首先，本發(fā)明提供了一種降低非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物抗原性并同時滅菌的方法，該方法包括在所述復(fù)合物中加入濃度為0.1-5mM的路丁和0.1-20mM的甘氨酸，用劑量為50-1000萬μW·s/cm2的紫外線照射，在輻照時使所述復(fù)合物溶液的厚度為1-50毫米。
所述“非人哺乳動物”例如可以是除人之外的靈長類動物、羊、牛、豬、熊、貓、狗、馬、嚙齒類動物等。但是，從血液的來源、成本和大批量制備等角度考慮，較佳的哺乳動物選自豬、牛、羊和馬。
非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物主要含有纖維蛋白原、第XIII因子、纖維連接蛋白等。它可以市售購得，或可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法從非人哺乳動物血液制得。上述購得或制得的非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物可直接用于本發(fā)明的方法中，也可用常規(guī)方法經(jīng)適當(dāng)?shù)叵♂尰蛟鰸夂笥糜诒景l(fā)明的方法中。在較佳的實施方案中，宜使非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物中的纖維蛋白原濃度為0.5-200毫克/毫升，更佳的為10-100毫克/毫升。
在本發(fā)明方法中，對非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物進行滅菌是通過采用高劑量的紫外線輻照來實現(xiàn)的。在現(xiàn)有技術(shù)中，紫外線對清水進行滅菌的常用劑量在6-7萬μW·s/cm2范圍內(nèi)。而為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，需要采用劑量為高劑量，即50-1000萬μW·s/cm2的紫外線進行輻照滅菌。在一個較佳的實施方案中，紫外線照射劑量宜為100-600萬μW·s/cm2。本發(fā)明方法中所采用的紫外線的波長為200-300納米。在較佳的實施方案中，紫外線的波長為200-280納米，更佳的為240-280納米。
如上所述，不同物質(zhì)對紫外線的透過率不同。例如，石英玻璃可以透過80％以上的殺菌紫外線。因此，在本發(fā)明的一個較佳實施方案中，可將所述復(fù)合物溶液置于石英玻璃容器內(nèi)進行輻照。石英玻璃容器的厚度可以為1毫米-20毫米，較佳的厚度為5毫米-10毫米。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以在本說明書的基礎(chǔ)上采用任何其它能使殺菌紫外線透過的材料來制備盛放所述復(fù)合物溶液的容器。
另外，在本發(fā)明的方法中，受輻照的復(fù)合物溶液的厚度需在1毫米-50毫米之間。若厚度超過50毫米，則紫外線不能完全穿透溶液，因而不能起到很好的殺菌作用。若厚度小于1毫米，則處理量小，導(dǎo)致成本提高。在一個更佳的實施方案中，受輻照的復(fù)合物溶液的厚度為2毫米-10毫米。
本發(fā)明方法在滅菌的同時還導(dǎo)致非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物的抗原性降低。其主要原因是蛋白質(zhì)的抗原決定簇在高劑量的紫外線作用下發(fā)生改變。然而，與此同時，凝血物質(zhì)復(fù)合物中的凝血因子功能也因變性作用而大幅度降低。為此，本發(fā)明者設(shè)計了一個保護配方，即，在所述凝血物質(zhì)復(fù)合物內(nèi)加入0.1-5mM的路丁和0.1-20mM的甘氨酸。在該保護配方的作用下，可以有效地使凝血物質(zhì)中各凝血因子的抗原性降低，同時使凝血蛋白的功能得以有效保存。在一個較佳的實施方案中，路丁的濃度為0.2-3mM，甘氨酸的濃度為0.2-10mM。在一個更佳的實施方案中，路丁的濃度為0.2-1mM，甘氨酸的濃度為0.2-1mM。
本發(fā)明還提供了用上述方法得到的無菌且抗原性降低的非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物組合物，該組合物含有非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物以及0.1-5mM的路丁和0.1-20mM的甘氨酸。
該組合物可以制成各種臨床外科常規(guī)采用的劑型形式，例如粉劑或膜劑，也可粘附于如明膠海綿、膠原蛋白膜、聚四氟乙烯膜等高分子生物材料上。
下面將通過實施例和試驗來進一步對本發(fā)明的應(yīng)用作舉例說明。
采用等電點沉淀法制備豬血來源的凝血物質(zhì)復(fù)合物水溶液，使其纖維蛋白原濃度為70毫克/毫升。將該水溶液分為試驗組和對照組一，對照組二。在實驗組內(nèi)加入0.5mM路丁和0.5mM甘氨酸；對照組一不加保護劑路丁和甘氨酸，但經(jīng)過紫外線照射；對照組二不加保護劑，不經(jīng)紫外線照射。
將待紫外線處理的組置于在石英玻璃制成的裝置內(nèi)，使溶液厚度為2毫米。用波長為253nm的紫外燈照射，照射劑量分別為60萬、100萬、200萬、300萬、400萬、500萬μW·s/cm2。而后分別進行如下試驗。
試驗一用兔抗豬纖維蛋白原抗體、兔抗豬第XIII因子和兔抗豬纖維連接蛋白抗體分別與試驗組和兩對照組樣品進行抗原抗體反應(yīng)。放射免疫測定法結(jié)果顯示試驗組和對照組一的游離抗體滴度分別較對照組二提高3倍、5倍、6倍、7倍、10倍和13倍。
試驗二按照中國藥典規(guī)定的方法進行無菌試驗和熱原試驗。分別將試驗組、對照組一、對照組二樣本加入需氧和厭氧菌培養(yǎng)體系內(nèi)。試驗組和對照組一樣品內(nèi)無細(xì)菌生長。同時無熱原反應(yīng)。
試驗三將上述試驗組，對照組一和對照組二的樣品3毫升，分別與等量含凝血酶500U/毫升的40毫摩爾氯化鈣溶液混和后，觀察纖維蛋白凝膠形成時間。試驗組和對照組一的凝膠形成時間見下表一。
表一 纖維蛋白凝膠形成時間(秒) *紫外線照射劑量單位萬μW·s/cm2**對照組二的平均纖維蛋白凝膠形成時間為4-8秒試驗四取Waster大鼠180只，隨機等量分為三組。在乙醚麻醉下，制備肝臟滲血模型。將上述試驗組，對照組一和對照組二的樣品3毫升，分別與等量含凝血酶500U/毫升的40毫摩爾氯化鈣溶液裝入雙聯(lián)注射器內(nèi)，進行肝臟滲血模型止血試驗。以確定一分鐘內(nèi)止血率和五分鐘止血率。結(jié)果如表二所示
表二 肝臟滲血模型一分鐘止血率試驗(％) *紫外線照射劑量單位萬μW·s/cm2**括號外數(shù)字為一分鐘止血率。單位％；括號內(nèi)數(shù)字為五分鐘止血率。單位％。
***對照組二的平均一分鐘止血率為85％；五分鐘止血率為95％。
從上述試驗可以得出結(jié)論，經(jīng)本發(fā)明方法處理得到的凝血物質(zhì)復(fù)合物是無菌的，其抗原性降低但卻仍然保留了促進凝血的功能。
盡管本發(fā)明參照具體例子作了詳細(xì)的描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然能在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下對本發(fā)明作各種變化和改動。因此，這些變化和改動均包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種降低非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物抗原性并同時滅菌的方法，其特征在于，在所述復(fù)合物溶液中加入濃度為0.1-5mM的路丁和0.1-20mM的甘氨酸，用劑量為50-1000萬μW·s/cm2的紫外線照射，在輻照時使所述復(fù)合物溶液厚度為1-50毫米。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，路丁的濃度為0.2-1mM，甘氨酸的濃度為0.2-1mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，紫外線照射劑量為100-600萬μW·s/cm2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所采用的紫外線的波長為200-300nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述復(fù)合物溶液中的纖維蛋白原濃度為0.5-200毫克/毫升。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物選自豬、牛、羊、馬。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述復(fù)合物溶液的厚度為2-10毫米。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述復(fù)合物溶液置于石英玻璃容器內(nèi)進行輻照。
9.一種用權(quán)利要求1所述的方法得到的無菌且抗原性降低的非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物組合物，其特征在于，它含有非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物以及0.1-5mM的路丁和0.1-20mM的甘氨酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物組合物，其特征在于，所述組合物可制成粉劑或膜劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種降低非人哺乳動物來源凝血物質(zhì)復(fù)合物抗原性并同時滅菌的方法，其特征在于，在所述復(fù)合物溶液中加入濃度為0.1－5mM的路丁和0.1－20mM的甘氨酸，用劑量為50－1000萬μW·s/cm
文檔編號A61K35/16GK1480155SQ0213678
公開日2004年3月10日 申請日期2002年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月4日
發(fā)明者何紅兵 申請人:上海松力生物技術(shù)有限公司